Maladies infectieuses

Une greffe chirurgicale de cellules tumorales dans le foie, sous anesthésie, de cinq à dix minutes, est pratiquée sur des souris dont une partie a déjà reçu une injection à quinze jours de vie. 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie et leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de mesurer l'effet d'une protéine du virus de l'hépatite B sur les cellules immunitaires qui entourent la tumeur, à un stade précoce de cancer du foie. Le porteur annonce des douleurs de suture et des complications per-opératoires possibles, hypothermie et saignement, et mentionne l'injection pratiquée à quinze jours de vie sans jamais dire ce qu'elle contient.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) se développe souvent sur un terrain cirrhotique associé à une inflammation chronique. Le virus de l’hépatite B (VHB) est le facteur de risque majeur du CHC. Le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Des travaux de recherche ont montré une corrélation entre certaines formes virales du VHB et la sévérité de l’atteinte hépatique jusqu’au cancer du foie. Ce projet a pour objectif de développer des travaux, portant sur l'impact de ces formes virales, via la modulation de la réponse immunitaire, au cours de la carcinogenèse hépatique. L’un des mécanismes semble passer par la modulation de l'infiltration immunitaire intratumorale. L'objectif est de caractériser la composante immunitaire dans le microenvironnement tumoral (TME) en présence de ces différentes formes virales. A l'aide de nouvelles approches et modèles expérimentaux, le mécanisme de l'impact pro-tumoral de ces formes virales du VHB à un stade cancer du foie précoce sera étudié. Ce projet présente l'avantage d'étudier spécifiquement le stade précoce du CHC établi (3 semaines post-transplantation)

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes associés à la modulation de la carcinogenèse hépatique liée à l’infection par le virus de l'hépatite B (VHB), qui pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques améliorant la prise en charge de carcinome hépatocellulaire de patients. La principale hypothèse est qu'une protéine du VHB module le micro-environnement tumoral facilitant l’activité pro-tumorale de certaines sous populations immunitaires. Grâce aux modèles murins, la modulation de l'activité et/ou du recrutement de l'infiltrat immunitaire intra/péritumoral par cette protéine virale, exprimée dans les hépatocytes, sera déterminée. À terme, ces travaux de recherche pourraient permettre de bloquer ces interactions intercellulaires et, en conséquence, la progression du carcinome vers un stade tardif.

Procédures

Une injection unique à 15 jours de vie (une fois par animal concerné, d'une durée de 5 secondes) sur souris vigiles. Une injection de cellules tumorales du foie murin sera réalisée par greffe : cette transplantation chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et couverte par des antalgiques en pré-opératoire, et en post-opératoire. Cette intervention ne sera réalisée qu'une fois par animal et sa durée est évaluée entre 5 à 10 minutes. Une euthanasie sera réalisée à la fin du projet de recherche à l'aide d'une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et une douleur de courte durée au site d’injection ou encore une inflammation locale. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. La greffe au niveau du foie implique une chirurgie, les souris pourront donc éprouver de la douleur au niveau des sutures des plans cutanés et musculaires, ainsi que les complications per-opératoires (hypothermie, saignement) malgré une prise en charge médicamenteuse adaptée.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié sous anesthésie afin de prélever le foie et la rate et permettre de réaliser de nombreuses analyses post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) pour répondre à la question scientifique. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux en utilisant une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous avons précédemment réalisé des cultures cellulaires en utilisant des modèles 2 et 3 dimensions de différentes lignées cellulaires et d'hépatocyes primaires afin d'étudier in vitro l'impact de l'expression de protéines du virus de l'hépatite B (VHB) sur la progression tumorale. Nous avons développé un modèle de co-culture en transwell permettant d'étudier les interactions entre les cellules d'hépatome exprimant ou non ces protéines du VHB et une sous-population immunitaire. Cependant, la mise en place d'un modèle in vitro récapitulant l'ensemble de la réponse immunitaire innée et acquise hépatique n'est pas encore disponible, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi nous nous sommes tournés vers le modèle in vivo pour étudier l'impact de la présence d'une des protéines du VHB sur l'activation des différents acteurs du système immunitaire au cours du carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Un total de 840 animaux seront inclus dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Des souris contrôles seront réutilisées, si possible, entre différentes procédures afin de réduire le nombre d'animaux. A l'issue des procédures, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate, éventuelles métastases tumorales) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle murin génétiquement identique (syngénique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons explorer. Les animaux seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie soit de 7 à 10 semaines de vie. L'établlissement d'un cancer du foie au stade précoce nécessitera une période allant de 3 semaines à 6 mois de suivi selon les différents modèles expérimentaux.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est hébergée seule pendant toute l'expérience, pour l'empêcher de manger les excréments de ses congénères, et déplacée dans une cage neuve dix à quatorze fois pour recueillir ses selles. Une instillation intragastrique sous anesthésie leur inocule une bactérie résistante aux antibiotiques ou une levure, le protocole comparant 38 combinaisons d'expositions et de traitements. Le porteur affirme que la complexité du microbiote rend l'expérience irreproductible en laboratoire et conclut que le recours à ce modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le microbiote intestinal est un des principaux réservoirs de micro-organismes responsables de maladies comme des bactéries résistantes aux antibiotiques ou des levures. La colonisation digestive par un de ces micro-organismes est leur présence prolongée dans l'intestin, détectable dans les selles. Nous avons précédemment démontré qu’un traitement composé d’une fibre alimentaire et d’un médicament anti-acide réduisait la concentration de bactéries résistantes aux antibiotiques dans les selles de souris exposées à un antibiotique. Le traitement n’était efficace cependant que chez une moitié des souris. Nous faisons l’hypothèse que l’efficacité du traitement pourrait dépendre de l’alimentation des souris. Par ailleurs, afin de confirmer l’efficacité du traitement du traitement chez la souris avant d’envisager son étude chez l’Homme, nous devons démontrer que ces résultats s’appliquent à la colonisation digestive par un autre micro-organisme, comme une levure. Les objectifs de ce projet sont les suivants : 1° décrire l’effet de l'anti-acide seul, de la fibre alimentaire seule, et de leur association sur le microbiote intestinal. 2° mettre au point un modèle de colonisation digestive par une levure chez des souris exposées à un antibiotique 3° évaluer l’impact de l'anti-acide seul, de la fibre seule et de leur association sur la colonisation digestive par la levure 4° évaluer l’impact d’un régime occidental sur le microbiote intestinal et sur la colonisation intestinale par une bactérie résistante aux antibiotiques ou par une levure, chez des souris exposées ou non à un antibiotique.

Bénéfices attendus

La colonisation digestive par une bactérie résistante aux antibiotiques ou une levure ne provoque pas de symptôme, tant que le microorganisme reste à l’intérieur de l’intestin. Cependant, le micro-organisme peut finir par passer dans le sang ou les urines et provoquer une infection difficile à traiter. Par ailleurs, l'élimination du microorganisme lors de la défécation peut contaminer l’environnement et d'autres personnes qui vont devenir à leur tour colonisées. Il n’y a actuellement pas de traitement efficace de la colonisation digestive par une bactérie résistante aux antibiotiques ou une levure. Dans nos travaux antérieurs, nous avons identifié un traitement capable de limiter le niveau de colonisation digestive par une bactérie résistante aux antibiotiques. Ce traitement, basé sur deux composés bien tolérés par l’Homme et peu onéreux, serait facile à utiliser chez l’Homme dès le début d’une antibiothérapie. Avant d’envisager un essai clinique chez l’Homme, les mécanismes d’action de ce traitement chez la souris doivent être compris, y compris en cas d’alimentation de type occidental. Par ailleurs, l’efficacité de ce traitement sur la colonisation par une levure doit également être évaluée chez la souris. Ce projet vise à traiter en premier lieu un problème de santé chez l’Homme. Cependant la colonisation digestive par des bactéries résistantes aux antibiotiques existe également chez des animaux d’élevage et les petits animaux domestiques, avec un risque potentiel de transmission à l’Homme. Enfin, la diminution de l’élimination de bactéries résistantes aux antibiotiques dans les selles pourrait limiter la contamination des eaux usées, et donc la dissémination de la résistance aux antibiotiques dans l’environnement. La prévention de la colonisation digestive par des bactéries résistantes aux antibiotiques, cible de ce projet, a donc un impact potentiel positif sur les 3 composants d’une santé globale - humaine, animale et environnementale. Si ce projet expérimental conforte les résultats antérieurs, et si des études observationnelles humaines en cours laissent envisager l’extrapolabilité de ces résultats à l’Homme, un essai clinique pourra être débuté chez l’Homme, dont nous sommes en droit de prévoir la fin d’ici 10 ans. Les bénéfices de ce projet animal doivent donc être envisagés à moyen terme, et nous n’en identifions pas à court terme.

Procédures

Tous les animaux auront des prélèvements de selles à l'état vigile (1 par jour). Pour ce faire, chaque souris sera installée dans une nouvelle cage, le temps d'émettre une nouvelle selle (temps généralement inférieur à 30 minutes). Selon les groupes, 10 à 14 prélèvements de selle seront réalisés. Le seule procédure invasive sera une instillation intragastrique (une par animal) sous anesthésie, pour 17 groupes de souris (durée avec anesthésie, 5 minutes). Les autres procédures seront une modification du régime alimentaire, et l’administration dans l’eau de boisson de médicaments ou d’une fibre alimentaire, tous bien tolérés.

Impact sur les animaux

La seule procédure invasive prévue dans le protocole est une instillation intra-gastrique, réalisée au maximum une fois par souris. L’instillation intragastrique consiste à poser sous anesthésie une sonde dans l’estomac, en passant par la bouche, pour administrer le micro-organisme destiné à coloniser le microbiote intestinal. Notre expérience avec ce modèle montre que les souris souffrent peu tout au long de l’expérience : pas de douleur, pas de perte de poids, pas de limitation de l’activité ou de la mobilité, pas de comportement anormal. Les souris ont des selles molles au cours du traitement antibiotique, mais nous n’avons pas observé de diarrhée ni de déshydratation. De même, notre expérience montre que les traitements par anti-acide ou par fibre alimentaire n’induisent pas de signe clinique. Notre protocole induit une source de stress : l’isolement en cage seule, nécessaire par le fait que les souris mangent naturellement leurs selles et celles des autres souris présentes dans la cage. Ce comportement est en effet susceptible de modifier les microbiotes digestifs et de gommer les différences entre les souris, que nous avons identifiées dans nos travaux antérieurs, et qui permettent de modéliser une approche de type médecine personnalisée. Afin de limiter ce stress lié à l’isolement, nous enrichirons l’environnement des cages individuelles.

Devenir

Les interventions de la procédure expérimentale (traitement antibiotique ou par anti-acide, administration d'une fibre alimentaire, inoculation intragastrique d’une bactérie ou d'une levure) modifient durablement le microbiote des souris. L’âge des souris impacte également sa composition et ses fonctions. De ce fait, les souris ne sont pas réutilisables pour une nouvelle étude. De ce fait, toutes les souris seront mises à mort à la fin de l'expérimentation.

Remplacement

Les expérimentations animales prévues dans ce projet ne peuvent pas être remplacées par des expériences en éprouvette. En effet, celles-ci ne permettent pas d’obtenir des données fiables sur l’activité d’un anti-acide et/ou d'une fibre alimentaire sur le microbiote intestinal. L'étude chez l’Homme devant être précisément préparée par ces études animales, le recours à ce modèle animal est indispensable. En effet, le microbiote digestif est un écosystème complexe comprenant plusieurs centaines d’espèces bactériennes différentes (dont la grande majorité n’est pas cultivable au laboratoire), interagissant avec l’alimentation et l'hôte (ici, la souris). Cette complexité rend impossible la reproduction au laboratoire ce qui se passe dans l'intestin des souris. Le recours aux modèles animaux est aujourd'hui la règle dans les études expérimentales sur le microbiote digestif.

Réduction

Ce projet évaluera 38 combinaisons différentes d’expositions (antibiotique, régime alimentaire, inoculation par une bactérie ou une levure) et de traitements (anti-acide et/ou fibre alimentaire). Par ailleurs, nos travaux antérieurs ont montré la forte variabilité des effets des traitements d'une souris à l'autre. Cette forte variabilité interindividuelle offre l’opportunité de comprendre la variation de l'efficacité des traitements entre les souris, et de modéliser une médecine personnalisée chez l’Homme. Pour ce faire, nous avons besoin des comparer des sous-groupes de souris, par exemple comparer le sous-groupe des souris chez lesquelles un traitement donné est efficace au sous-groupe de souris chez lesquelles le traitement ne l’est pas. Pour ces comparaisons, les effectifs des sous-groupes doivent être suffisants, impliquant un nombre de souris dans chaque groupe qui peut paraître élevé. Néanmoins, nous avons limité le nombre de souris au strict minimum, tout en tenant compte des objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Les animaux auront un niveau de souffrance minimisé. L’administration dans l’eau de boisson de l’antibiotique et des traitements (anti-acide et fibre alimentaire) sera privilégiée pour le confort des animaux. L’instillation intragastrique de la bactérie ou de la levure reste cependant nécessaire pour contrôler le nombre de micro-organismes inoculés. La colonisation digestive par ces micro-organismes chez nos animaux en bonne santé ne provoquera pas de symptôme ni de souffrance. Les souris sont hébergées dans des cages individuelles de taille suffisante dont la litière est changée régulièrement (une fois par semaine) avec accès libre à l’eau et à la nourriture (alimentation spécifique pour rongeur). Les analyses de microbiote réclament des hébergements en cage individuelles afin pourvoir étudier la variabilité du microbiote d'une souris à l'autre. Les cages seront enrichies d'abris (tunnels ou dômes), de carrés de coton et de frisottis. Les animaux bénéficieront d'une semaine d'habituation avant le début des expérimentations.

Choix des espèces

Le modèle de colonisation digestive chez la souris est un modèle de référence, simple et facilement reproductible. Notre équipe maîtrise parfaitement ce modèle pour tous les types d’analyses prévues pour cette étude. Les animaux seront des souris albinos de 5 semaines de vie. Les souris auront donc 6 semaines de vie après habituation. Cette souche de souris a déjà été utilisée dans des modèles d'études du microbiote, en particulier dans notre laboratoire. L'âge de 6 semaines après habituation autorise l'instillation de volumes satisfaisants lors de l’instillation intragastrique ainsi qu'une manipulation plus aisée.

Identifiées par une puce sous la peau, anesthésiées, puis infestées dans l'abdomen par la forme larvaire d'Echinococcus multilocularis, 500 souris voient la masse parasitaire grossir pendant cinq mois au moins, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont pesées chaque mois puis chaque semaine jusqu'à un poids limite de 65 grammes, et le porteur indique que la masse abdominale finit par gêner leur locomotion. Une ulcération de la peau du ventre frottant contre la cage entraîne la mise à mort immédiate. Les autres sont tuées pour récolter le parasite, qui servira à infester des renards en captivité et à produire des œufs.

Objectifs

L’échinococcose alvéolaire due à une infection par le parasite Echinococcus multilocularis est une maladie rare en France. Cependant, elle est fatale si non traitée et nécessite un traitement quotidien à vie qui peut entrainer des effets secondaires importants. La longue période asymptomatique (5-10 ans) rend extrêmement difficile l’identification des sources de contamination (contact avec carnivore, sol, aliments souillés, …) par ingestion accidentelle d’œufs microscopiques excrétés dans l’environnement par les carnivores infestés. La disponibilité de matériel biologique du stade larvaire du parasite permet notamment l’infestation de renards. La production de fèces de renards contenant des œufs est indispensable pour la mise au point, validation et matériel de référence pour la réalisation d’analyses de diagnostic chez l’animal dans le cadre de la surveillance du parasite mais aussi la détection de la contamination environnementale et alimentaire ainsi que l’évaluation de la viabilité des œufs dans ces matrices ou le test de molécules en vue d’améliorer le traitement chez l’humain. L’objectif du projet est de maintenir au laboratoire un isolat du parasite Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires afin de pouvoir disposer facilement d’un matériel parasitaire de bonne qualité. La maîtrise de l’infection des hôtes intermédiaires en captivité permettra : 1/ De fournir du matériel larvaire de référence pour la mise au point de nouveaux outils diagnostiques. 2/ De produire des larves parasitaires pour les infestations de renards (hôtes définitifs).

Bénéfices attendus

L’ensemble des prélèvements récoltés permettra de produire du matériel de référence pour le développement d’outils de diagnostic qui contribueront à une meilleure connaissance de la répartition/ circulation des pathogènes étudiés et à une meilleure compréhension des mécanismes qui aboutissent à la contamination de l’homme par ce parasite. Les larves de parasite produits permettront de compléter, suite à l’infestation des renards en captivité, le cycle parasitaire d’Echinococcus multilocularis pour obtenir des vers adultes et des œufs de parasite.

Procédures

identification par puce sur animaux anesthésiés par voie sous-cutanée :

Impact sur les animaux

L'infection par le parasite, entraine une prise de poids progressive des souris, en raison du développement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion. En cas d’ulcération cutanée lié aux frottements de l’abdomen sur les parois de la cage les animaux seront immédiatement mis à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux sont mis à mort afin de récolter la masse parasitaire.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour produire des protoscolex en laboratoire, en dehors de l’infestation des hôtes intermédiaires.

Réduction

Le projet utilisera environ 100 souris par an, soit 500 sur 5 ans. Cela se justifie par un temps de développement de la forme larvaire qui est de 5 mois minimum et par un succès du maintien de la forme productrice de larves parasitaires qui est d’environ 66%. Ces paramètres nous obligent pour assurer le maintien des trois souches larvaires de répéter l’infestation tous les trois/quatre mois sur des lots d’environ 15 souris. Aucune analyse statistique n'est prévue.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères. Les souris sont dans un environnement avec un cycle d’éclairage de 12h par jour. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de carton, abris plastique et cellulose, bâton de bois dans les cages... Les animaux sont surveillées tous les jours et seront pesés mensuellement jusqu’à 3 mois, puis à partir du 4eme mois les pesées seront hebdomadaires afin de contrôler si les animaux atteignent le poids limite de 65 gr. De la nourriture et de l'hydrogel seront disposés au sein même de la cage en cas de problème d’accès à la mangeoire située sur la grille. Une anesthésie par isoflurane est assurée pour les infestations par voie intra-péritonéale. Une grille de score est mise en place pour vérifier l'atteinte des points limites définis dans le projet, et l'atteinte d’un score supérieur ou égal à 60, entrainera l’administration d’un analgésique dans l’eau de boisson.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires du parasite Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement les campagnols. Comme il n'existe pas de méthode alternative pour produire des parasites, il est nécessaire d'utiliser le modèle souris, pour obtenir du matériel parasitaire larvaire utilisable pour le développement des outils diagnostiques et pour l’infestation des hôtes définitifs en captivité. Notre expérience a montré que le stade de développement n'avait pas d'influence sur la sensibilité du parasite et le développement de la forme larvaire. Les animaux seront commandés au stade adulte et au poids de 30-35 gr.

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever foie et rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral porteur du génome de l'hépatite B leur est injecté dans une veine, puis, selon les groupes, elles reçoivent deux fois par semaine pendant quatre semaines un produit provoquant une fibrose du foie, une injection unique déclenchant un cancer du foie, ou des anticorps détruisant une partie de leurs cellules immunitaires. Certaines subissent ces injections dès quinze jours de vie. Le porteur écrit que ces atteintes hépatiques entraînent des nuisances "inexistantes ou minimes", et affirme que le modèle murin est "indispensable" puisque aucun modèle in vitro, même un organoïde multicellulaire, ne reproduit les échanges entre le foie et le système immunitaire.

Objectifs

L'infection par le Virus de l'hépatite B (VHB) a touché plus d'un milliard de personnes dans le monde et est responsable d'infection chronique pour 250 millions de personnes, aujourd'hui. Ces infections chroniques peuvent conduire à la cirrhose et au cancer du foie. Environ un million de personnes décèdent tous les ans de cette infection virale. Il est donc essentiel de comprendre cette maladie virale afin de développer de nouvelles approches théraputiques. Notre projet de recherche basé sur nos précédents travaux, porte sur l'impact de l'expression d'un des gènes du VHB sur la pathogenèse hépatique et notamment en modulant la réponse immunitaire. Nous souhaitons évaluer le rôle de ce gène viral et les mécansimes associés en utilisant des virus complets ou délétés sur ce gène. Le modèle murin est indispensable pour évaluer les nombreuses interactions existantes entre les cellules du foie infectées et les cellules de l'environnement hépatique dont les cellules immunologiques. Cependant, le modèle murin n'étant pas infectable par le VHB. C'est pourquoi, nous avons généré des vecteurs viraux modifiés génétiquement qui sont d'une part, capables d'infecter le foie des souris et d'autre part, d'exprimer soit le génome complet soit un génome partiel du VHB. Ces vecteurs viraux et les modèles murins nous permettront ainsi d'évaluer l'impact d'une des protéines virales sur la pathogenèse hépatique et de déterminer le rôle de la réponse immunitaire dans cette progression.

Bénéfices attendus

Nos données acquises nous éclairerons sur la pathogenèse hépatique et le risque de développement du cancer du foie associé à une infection par le virus de l'hépatite B (VHB). Elles pourraient conduire à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant l'infection par le VHB et des complications hépatiques associées chez les patients infectés par le VHB.

Procédures

Le transfert du génome du virus de l'hépatite B (VHB) sera réalisé après anesthésie (par injection pendant 5-10 secondes par voie intra-péritonéale) sur l'ensemble des souris incluses. Ce transfert sera réalisé par une unique injection par voie intra-veineuse (injection de 5-10 secondes). Parmi ces animaux, un groupe de souris vigiles sera soumis à une injection intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 4 semaines d'un réactif générant une fibrose hépatique. Un autre groupe également vigile sera soumis à une injection unique intra-péritonéale (5 à 10 secondes) d'un réactif générant un cancer du foie. Un troisième groupe de souris vigile aura été pré-immunisé par une injection intra-veineuse unique (de 5 à 10 secondes). Un dernier groupe de souris vigiles subira une déplétion de sous-population de cellules immunitaires par injections d'anticorps par voie intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 1 à 2 semaines. Au cours de cette étude, nous serons également amenés à prélever du sang (1 à 5 minutes). Le nombre de prélèvement de sang varie de 1 à 2 selon le temps d'expérimentation (de 7 semaines à 6 mois) de chaque procédure. Les animaux seront anesthésiés avant ce prélèvement de sang. A la fin de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L'anesthésie des animaux pourrait engendrer un stress thermique. L’induction des pathologies hépatiques sont bien connues et ont montré des nuisances légères ou modérées de l'atteinte hépatique. La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et pourraient conduire à une douleur légère de courte durée au site d'injection au moment du geste. L'administration de différentes drogues pourrait induire une inflammation, une fibrose et un cancer hépatique. Néanmoins, compte tenu des court temps expérimentaux effectués et/ou du faible impact de certaines des drogues utilisées, les nuisances cliniques seront inexistantes ou minimes. Ils pourraient éventuellement générer quelques troubles digestifs transitoires et rapidement réversibles. Les prélèvements sanguins pourraient être source de stress au moment de l’anesthésie et conduire à des saignements/hématomes.

Devenir

Pour l’ensemble des animaux inclus dans ce projet, l'euthanasie est requise afin de prélever des échantillons biologiques (foie, rate,...) pour permettre de réaliser de nombreuses analyses expérimentales post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) et, ainsi, répondre à la question scientifique posée. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

De précédents résultats effectués sur des hépatocytes primaires humains (PHH) in vitro suggèrent un rôle du VHB dans le recrutement et l'activation des différents intervenants du système immunitaire intra-hépatique. La mise en place d'un modèle in vitro récapitulant la réponse immunitaire innée et acquise, le recrutement des cellules de la moelle osseuse, ainsi que les interactions entre le foie et le système digestif (interactions essentielles à la pathogenèse hépatique) n'est pas réalisable à ce jour in vitro, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi il est nécessaire de réaliser ces travaux dans un modèle in vivo afin étudier l'impact du VHB sur le recrutement et l'activation des différents acteurs du système immunitaire, par interaction directe et/ou indirecte avec les hépatocytes infectés.

Réduction

La réduction de l'échantillonnage d'animaux est liée à l'approche statistique qui nécessite 30 souris par condition afin d'évaluer une différence significative entre les groupes par des tests statistiques. Le nombre total d'animaux sera de 1050 souris. Ce nombre a été évalué selon un calcul de puissance adapté en prenant la somme de toutes les expérimentations prévues dans ce projet de recherche. A l'issue de ces expérimentations, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate...) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris et ainsi de répondre aux questions scientifiques soulevées.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle murin syngénique (de génome identique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons étudier ici. Les animaux nés dans notre établissement seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie pour l'initiation du cancer du foie, soit au moment ou quelques semaines après le sevrage pour les autres types d'expérimentation. Les souris adultes provenant de notre fournisseur seront de même fond génétique que les souris provenant de notre établissement. Ces souris seront acclimatées à notre environnement expérimental au moins une semaine avant inclusion dans une de nos procédures. Ces souris seront identifiées à l'inclusion dans une de nos procédures.

Choisies parce que le modèle reproduit "de façon rapide et reproductible" la colite à Clostridioides difficile, 300 souris de six à sept semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la bactérie par gavage, deux injections d'antibiotique, puis sont isolées chaque jour jusqu'à émission d'une selle, avec un massage abdominal quand rien ne vient. Le porteur indique que l'infection provoque des diarrhées, des déshydratations de 24 à 48 heures et des pertes de poids. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et mesurer la réponse inflammatoire déclenchée par dix souches mutantes de la bactérie.

Objectifs

Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie anaérobie stricte (nécessitant une atmosphère sans oxygène pour survivre et se développer), première cause de diarrhées et de colites associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (plus de 24 000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées, en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3 %. La contamination se fait à partir de formes de résistance hautement contagieuses de la bactérie, appelées spores, largement présentes dans l’environnement des services de soins hospitaliers. Les ICD représentent un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts des soins associés. Malgré des traitements antibiotiques généralement efficaces, les réapparitions des infections à C. difficile sont fréquentes (environ 20 %) et des résistances aux antibiotiques surviennent. Il est donc primordial de mieux comprendre les mécanismes contrôlant les principales étapes de l’infection, dans le but de pouvoir développer des traitements alternatifs pour éviter que la bactérie ne colonise l’intestin. Un de ces mécanismes régulateurs chez les bactéries fait intervenir des petites molécules d’acides ribonucléiques (ARN) qui, au lieu de coder des protéines, régulent l’expression d’autres gènes ; ils sont ainsi appelés ARN non codants (ARNnc). Dans ce projet, notre objectif est d’évaluer le rôle des ARNnc de C. difficile dans le processus pathologique des infections (succession d’évènements conduisant à cette infection) afin d’identifier de nouveaux mécanismes de régulation basés sur ces ARNnc et de développer de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques dans la lutte contre les ICD.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d’évaluer à court terme le rôle des ARN non codant de C. difficile dans le processus pathologique des infections à C. difficile et permettra à moyen terme de développer de nouvelles stratégies de lutte contre ce pathogène.

Procédures

Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale de la souche de C. difficile (un gavage unique durant la procédure, d’une durée maximale d’une dizaine de secondes) et 2 injections d’antibiotique (d’une durée maximale d’une dizaine de secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum), sur la durée de l'essai. Chaque animal sera isolé jusqu’à émission d’une selle. Dans la plupart des cas, l’émission de selle est spontanée et intervient dans les 2 à 3 minutes. Dans le cas contraire, une stimulation par un massage abdominal léger d’une dizaine de secondes sera effectué. Si aucune selle n’est émise dans les 2 à 3 minutes suivant cette stimulation, l’animal sera libéré et remis dans sa cage d’origine. Aucune procédure chirurgicale n'est nécessaire dans le cadre du projet.

Impact sur les animaux

Le gavage nécessite une contention de courte durée (une dizaine de secondes) qui peut entrainer un stress léger. La piqûre d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale entraine une douleur et un stress légers et de courte durée. Le prélèvement de selles nécessite une manipulation et peut donc engendrer un stress léger. Pendant l’infection, le modèle induit des diarrhées résolutives en quelques jours qui peuvent occasionner des troubles intestinaux désagréables pour les animaux et être associées à des déshydratations transitoires (24 à 48 heures maximum) et des pertes de poids légères.

Devenir

Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales, nécessaire à l’analyse de la réponse inflammatoire induite par les différentes souches de la bactérie C. difficile, et donc du rôle des ARNnc dans la pathologie, nécessite l'euthanasie des animaux.

Remplacement

Plusieurs tests réalisés précédemment in vitro ont permis de sélectionner les 10 molécules (ARNnc) présentant un rôle potentiel dans le processus pathologique et la virulence les plus prometteuses, et donc les 10 souches mutantes de la bactérie (C. difficile), qui ne produisent plus ces molécules, qui seront utilisées dans ce projet. Bien que des études in vitro se poursuivent en parallèle (tests sur modèles cellulaires), le recours à l'animal est indispensable pour étudier les processus de colonisation et la virulence. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.

Réduction

Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 300, tout en préservant la validité statistique de l'étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace et enrichissement (tunnel de carton et papier pour construction de nids). Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Une procédure d’euthanasie anticipée sera ainsi mise en place si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation et de virulence par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation et de virulence par C. difficile.