Maladies infectieuses

46 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever et analyser leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection d'antibiotique dans la veine de la queue, puis subit sous anesthésie une ponction de liquide cérébrospinal et un prélèvement de sang, après quatre séances d'habituation au tube de contention. Le porteur signale que l'injection provoque une perte d'équilibre et une attitude prostrée. Tout tient à une mesure de concentration, et les résultats attendus "constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement" de l'antibiotique, formule qui tient le bénéfice pour les patients à bonne distance.

Objectifs

Les infections neuroméningées sont difficiles à traiter de par la présence de barrières physiologiques dans l'organisme protégeant le cerveau. De plus, l'émergence de résistance aux antibiotiques actuels accentuent cette problématique. La recherche de nouveaux antibiotiques pouvant traiter ces infections devient donc un enjeu majeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer la capacité d'un nouvel antibiotique à passer la barrière qui protège le cerveau et à pénétrer dans le liquide cérébrospinal et dans le cerveau. L'antibiotique choisit a fait ses preuves dans des infections rénales ou pulmonaires compliquées.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de cette étude chez l'animal constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement de cet antibiotique dans l’indication des infections neuro-méningées chez l'homme.

Procédures

Tous les animaux recevront au cours du projet une injection d'antibiotique de 30 secondes environ, et 2 prélévements (liquide cérébrospinal et sang) seront réalisés sous anesthésie. La durée de l'anesthésie sera de 5 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Injection caudale :légère douleur, brève et transitoire. Injection antibiotique : Perte d'équilibre et attitude prostrée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse de cerveaux

Remplacement

Dans les premières phases de développement d'un médicament à visée cérébrale, il est possible d'utiliser des cultures de cellules. Cependant ces cultures ne reproduisent pas la complexité des barrières protégeant le cerveau et elles ne prennent pas en compte l'existence d'autres organes dans lequel le médicament se distribue via la circulation sanguine. Les modèles animaux restent donc nécessaires avant de tester le médicament chez l'Homme.

Réduction

L'étude sera faite en deux étapes ; la première permettra de trouver les conditions optimales d'administration sur un rat par condition. Les résultats seront confirmés dans la seconde étape sur des lots de plusieurs d'animaux. En se basant sur des données de la littérature, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux par lot permettant d'obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 10 jours. Une habituation au tube de contention qui permettra l'injection est prévue : 4 séances de 5 min sur 4 jours différents précédents l’administration . Les prélèvements seront faits sur des animaux anesthésiés sous couverture antalgique. Des points limites gradés ont été établis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations ce qui permettra d'agir sans délai.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats agés de 8 semaines ayant atteint la maturité physiologique, modèle couramment utilisé en pharmacologie. Il s’agit d'une lignée consanguine qui présente une certaine variabilité génétique entre les individus ce qui permet de mieux refléter la diversité génétique observée dans les concentrations d'antibiotiques dans la population humaine. De plus, leurs paramètres physiologiques, métaboliques et anatomiques sont bien connus, cela permet une interprétation fiable des données chez le rat et donc une extrapolation des résultats à l'homme plus robuste.

Injectées de plasmides par voie hydrodynamique, soumises à des prélèvements sanguins répétés puis infectées par le virus de la fièvre jaune, 1 000 souris, dont des lignées immunodéficientes et des lignées humanisées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'injection de plasmides provoque des hématomes, des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l'état général, et que l'infection peut entraîner perte de poids, hypothermie, paralysie des membres postérieurs et mort. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique : il est estimé à partir du nombre d'études des années précédentes et d'une croissance anticipée, "en accord avec le plan commercial". Deux cents souris pourront être transférées vers un protocole de formation interne aux gestes techniques, à condition de n'avoir pas été infectées, les autres étant tuées en atteignant les points limites ou sur décision du vétérinaire.

Objectifs

La fièvre jaune est une maladie virale transmise par les moustiques, principalement dans les régions tropicales. Elle peut causer de la fièvre, des douleurs musculaires et des nausées. Dans 15% des cas, la maladie évolue vers une forme grave, caractérisée par une jaunisse et des hémorragies pouvant entraîner le décès du patient. Il n’existe pas de traitement antiviral pour soigner cette maladie, mais la vaccination est efficace pour la prévenir. Le vaccin est préparé à partir d’un virus vivant atténué. Les objectifs de ce projet sont multiples : - Modéliser et caractériser l’infection par le virus de la fièvre jaune dans des souris - Evaluer l’innocuité de composés de recherche à visée prophylactique ou thérapeutique (traitements ou vaccins) - Caractériser les réponses immunitaires induites par ces composés de recherche - Evaluer l’efficacité antivirale de ces composés de recherche chez des souris infectées par le virus de la fièvre jaune Pour répondre à ces objectifs, nous utiliserons des souris conventionnelles non-humanisées (immunocompétentes ou immunodéficientes), ou des souris dites humanisées (système immunitaire ou foie), ou doublement humanisées (système immunitaire + foie).

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle préclinique prédictif permettant d'étudier le virus de la fièvre jaune ainsi que l’efficacité de composés de recherche innovants.

Procédures

Des administrations de composés à visées thérapeutiques seront réalisées avec une fréquence définie par le protocole d’étude. Leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

-Injection de plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements ou de virus : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). L’infection par le virus de la fièvre jaune peut entraîner une perte de poids, une hypo-activité, une diminution de la température corporelle, une paralysie des membres postérieurs traduisant une atteinte neurologique, et la mort. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés soit parce qu’ils atteignent les points limites, soit par décision du vétérinaire. Certains animaux pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve que les souris n’aient pas subit de geste plus sévère qu'une injection hydrodynamique et qu’elles n’aient pas été infectées avec le virus. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la Formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.

Remplacement

Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et le virus de la fièvre jaune, permettant de reproduire l’infection du virus tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés de recherche destinés à son traitement ou sa prévention. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 1000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 20 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études, ou pour le nombre total d’animaux dans le projet, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus maximum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Le modèle murin a été choisi en raison de sa capacité à reproduire des aspects clés de la pathogénie de l’infection par le virus de la fièvre jaune, notamment en conditions d’immunodéficience ou après adaptation virale. Certaines souches ou lignées modifiées permettent de mimer la susceptibilité humaine (atteinte hépatique, réponse inflammatoire), ce qui en fait un modèle pertinent pour l’évaluation de composés antiviraux ou prophylactiques. Pour les souris non humanisées et humanisées avec des cellules sanguines provenant du sang périphérique, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées avec des cellules souches issues de cordons ombilicaux humains, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang. Pour les souris humanisées au niveau du foie ou double-humanisées (foie + système immunitaire), les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 13 semaines, première apparition des hépatocytes dans le foie.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes, chacune portant sur le dos une capsule où se nourrissent jusqu'à trente tiques. Elles reçoivent neuf gavages, puis trois à quatre prélèvements sanguins dont certains par ponction du sinus de l'œil, et passent cinq jours isolées en cage individuelle pour que leurs congénères ne mangent pas les tiques. Une partie d'entre elles est génétiquement modifiée pour ne pas produire le sucre alpha-Gal, molécule sur laquelle repose la piste vaccinale testée contre la maladie de Lyme. Le porteur explique qu'il faut cinq souris par groupe parce que la plupart des tiques se détachent ou meurent avant d'avoir fini leur repas, cinq à dix seulement arrivant gorgées par animal.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de tester une stratégie visant à protéger contre la maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia, transmise par les tiques. Cette approche consiste à administrer des bactéries non pathogènes (comme E. coli) modifiées pour exprimer une molécule appelée α-gal (un type de sucre). L'objectif est d'induire la production d'anticorps spécifiques contre α-gal, qui pourraient aider à prévenir l'infection par Borrelia. Les étapes spécifiques du projet sont les suivantes : Induction d'anticorps anti-α-gal : En administrant oralement ces bactéries aux animaux, nous espérons stimuler la production d'anticorps spécifiques (IgM et IgG) contre α-gal. Évaluation de la réponse immunitaire et de la protection contre l'infection : Nous mesurerons si la réponse immunitaire induite permet de réduire la charge de Borrelia dans les tiques parasitant les animaux immunisés. Analyse de la charge bactérienne de Borrelia : Après infestation par des tiques infectées, nous analyserons la présence de Borrelia dans les tiques et dans divers tissus des animaux immunisés. Étude de la mortalité et du comportement des tiques : Nous observerons le comportement alimentaire des tiques et leur taux de mortalité afin d'évaluer si l'immunisation a un impact sur leur cycle de vie. Ce projet vise à déterminer si cette méthode peut non seulement protéger contre l'infection, mais également avoir un effet sur les tiques elles-mêmes

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris seront immunisées par voie orale. Elles recevront 9 administrations et subiront un maximum de 3 prélèvements sanguins. Aux jours 0, 14, 30 et 51, des prélèvements sanguins seront effectués par ponction du sinus, en alternant les côtés à chaque fois, sous anesthésie locale et générale. Une ponction dure 8 minutes, anesthésie comprise. L'administration des probiotiques se fera par gavage. Cette méthode sera appliquée pendant 3 jours consécutifs, avec une pause de 5 jours entre chaque session, sur une période de 3 semaines, soit un total de 3 cycles (une fois par semaine). Chaque gavage durera entre 3 et 5 minutes, anesthésie comprise. Les jours 0,14 et 30 après l’administration orale, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; ce prélèvement durera environ 8 minutes, anesthésie comprise. Le prélèvement du jour 14 permettra de suivre la production normale des anticorps induits par l’immunisation. Le jour 51, après la dernière administration orale, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale. Après la fixation des capsules, les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée de 5 jours. Elles bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement que dans les cages collectives. Et afin d’atténuer les effets de l’isolement, des enrichissements supplémentaires seront ajoutés pour favoriser leur bien-être

Impact sur les animaux

Les tiques sont placées sur le dos des souris au sein d'une capsule. Les souris peuvent se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. les rongeurs sont un réservoir naturel de Borrelia spp, ce qui signifie qu'ils peuvent porter l'infection sans montrer de symptômes graves ou évidents, contribuant ainsi à la transmission de la bactérie par les tiques. D'autre part, l'immunisation peut causer une inflammation et une douleur au site d'injection, ou des réactions allergiques. Le prélèvement sanguin peut provoquer du stress lié à la manipulation ou de la douleur. Pour minimiser ces effets, les procédures sont effectuées sous anesthésie et un suivi constant est assuré afin de détecter tout symptôme indésirable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l’effet protecteur des anticorps anti-α-gal contre Borrelia, en nourrissant des tiques sur des souris immunisées oralement avec différentes souches non pathogènes d'E. coli exprimant α-gal sur leur membrane. Les objectifs incluent l’évaluation de la survie des tiques et de la transmission de Borrelia, par ces dernières. Actuellement, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire avec précision la réponse immunitaire induite par voie orale chez les souris en réponse à une infection bactérienne. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle animal est essentiel pour analyser l’effet protecteur des anticorps et la colonisation des tiques par Borrelia.

Réduction

Chaque souris peut nourrir jusqu'à 30 tiques, mais entre 20 et 25 tiques se détachent sans avoir terminé leur repas ou meurent. En moyenne, nous pouvons obtenir 5 à 10 tiques gorgées par souris. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser 5 souris par groupe pour obtenir entre 25 et 50 tiques gorgées, ce qui est le nombre requis pour nos analyses. Le nombre total d'animaux a été calculé afin de minimiser leur utilisation tout en garantissant le nombre de tiques gorgées nécessaire à la réalisation des analyses.

Raffinement

Les souris seront logées par groupes de 5 dans des conditions standards, avec l'enrichissement nécessaire à leur bien-être, notamment des carrés de coton et des maisons en plastique. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter d’éventuels signes cliniques. Lorsque les souris porteront des capsules sur le dos pour nourrir les tiques, elles seront placées en cages individuelles, car elles pourraient retirer les capsules des autres souris ou manger les tiques. Malgré leur isolement, elles bénéficieront des mêmes conditions d'hébergement, avec les enrichissements nécessaires pour leur bien-être. Pour les souris hébergées en cages individuelles des mesures seront prises le temps de leur hébergement individuel afin de garder un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter l'apparition d'éventuels signes cliniques. Des points limites ont été défini pour décider de la mise à mort des animaux en cas d'atteinte sévère de leur état de santé. Par ailleurs afin de limiter la douleur et l'anxiété des souris des protocoles d'anesthésie sont prévus pour certains actes pouvant engendrer une anxiété ou une souffrance.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne produisent pas le sucre α-Gal ; elles peuvent toutefois produire des anticorps spécifiques contre celui-ci. Ces lignées sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Nous utiliserons également des souris non modifiées génétiquement. Elles seront utilisées comme groupe contrôle pour comparer les résultats avec ceux des souris génétiquement modifiées et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge. Ce stade de développement (7 à 8 semaines) correspond à une maturité immunologique optimale chez la souris, ce qui est essentiel pour évaluer efficacement la réponse immunitaire induite par l’immunisation avec l’α-Gal. Il s’agit également d’un âge standard dans les modèles d’infection par Borrelia, permettant la comparaison avec des études antérieures et garantissant la reproductibilité des résultats. Par ailleurs les souris âgées de 7 à 8 semaines sont des souris adultes ce qui facilite les actes de prélèvements sanguins car elles sont plus grosses.

36 souris Swiss femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections sous-cutanées d'antibiotique en trois jours consécutifs, puis un gavage oral unique d'une suspension d'Enterococcus faecalis, avant que leur tube digestif soit prélevé pour dénombrement bactérien. Le porteur affirme qu'aucune alternative in vitro ou ex vivo ne reproduit la complexité d'une infection gastro-intestinale, et attend du modèle qu'il éclaire la persistance de la bactérie après une endocardite. L'âge et le sexe des souris sont fixés "à la demande du client", ce qui situe le projet du côté de la prestation.

Objectifs

Les entérocoques sont des bactéries ubiquitaires, naturellement présents dans le microbiote intestinal humain. Parmi eux, Enterococcus faecalis est l'espèce majoritairement responsable des infections humaines. Historiquement considérés comme des bactéries opportunistes, les entérocoques suscitent aujourd’hui une inquiétude croissante en raison de leur capacité à développer une résistance aux antibiotiques et à persister dans des environnements hospitaliers hostiles. E. faecalis est impliqué dans diverses pathologies, telles que les endocardites (infections du cœur), les infections urinaires, les bactériémies, et plus rarement les infections gastro-intestinales. La rechute fréquente de certaines infections laisse supposer une tolérance ou une persistance bactérienne qui échappe aux traitements classiques. Dans ce contexte, le projet vise à développer un modèle d’infection gastro-intestinale permettant d’évaluer le comportement infectieux de deux souches mutées en comparaison d’une souche non mutée. L’objectif est de déterminer si ces mutations influencent la capacité de la bactérie à établir ou maintenir une infection différente de la souche parentale.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle murin standardisé permet de reproduire les conditions d'une colonisation intestinale par Enterococcus faecalis et d'étudier son comportement in vivo, dans un environnement contrôlé et reproductible. En comparant la souche parentale à deux mutants identifiés chez des patients ayant rechuté d’endocardite, le projet permet d’explorer les déterminants bactériens responsables de la persistance, de la tolérance aux antibiotiques, et potentiellement de la rechute infectieuse.

Procédures

- 3 injections sous cutanée (de 10 secondes (aiguille 26G) à raison d’une injection quotidienne 3j consécutifs - 1 administration unique par gavage oral de 10 secondes (0,9 x 25 mm)

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur : - La première phase consistera à administrer par voie sous cutanée un antibiotique. La nuisance principale sera liée ici au geste de l’injection sous cutanée. Des expériences de décontamination digestive menées par le passé et utilisant un cocktail de plusieurs antibiotiques n’ont pas montré d’effets secondaires de type intolérance digestive/diarrhée. - Dans la phase 2, les nuisances attendues seront liées à l’administration de l’antibiotique (comme dans l’étape 1) et de la suspension bactérienne par gavage oral. De la même façon, des effets digestifs à type de diarrhée ne sont pas attendus suite l’administration orale de cette bactérie (un protocole similaire a déjà été testé par l’équipe de recherche avec laquelle nous menons ce projet).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes du tube digestif pour dénombrement bactérien

Remplacement

Le recours à un modèle animal, en l’occurrence la souris, se justifie par l’absence d’alternative in vitro ou ex vivo permettant de reproduire de manière réaliste la complexité d’une infection gastro-intestinale impliquant l’interaction dynamique entre le microbiote, la barrière intestinale, le système immunitaire et la bactérie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été soigneusement calculé pour permettre une analyse statistique robuste (ANOVA) tout en limitant au maximum le nombre de souris par groupe : 6 souris par groupe et 3 pour le groupe véhicule. De plus, une phase de validation est effectuée sur un très petit nombre de souris (n=3), ce qui permet d’optimiser les conditions expérimentales avant le test à plus grande échelle, évitant ainsi des utilisations inutiles d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 3 ou 6 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Tous les animaux sont suivis quotidiennement pour détecter tout signe de souffrance ou de détresse. Les antibiotiques sont administrés par voie sous-cutanée ou dans l’eau de boisson pour éviter des manipulations trop invasives et le gavage oral est réalisé avec précaution, par du personnel formé, pour limiter le stress et les complications.

Choix des espèces

La souris Swiss est un modèle de choix répandue dans la greffe d’infection gastro intestinale à Enterococcus faecalis. Des souris femelles âgées de 8 semaines seront utilisées dans cette étude à la demande du client et selon les données de la littérature.

Deux injections, une incision de la peau sous anesthésie, la pose d'un implant de titane recouvert d'un polymère, deux points de suture, puis une plaie inspectée chaque jour pendant trois jours et deux fois par semaine jusqu'à la mise à mort. 27 souris femelles de huit semaines suivent ce parcours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour un prélèvement de tissu. Le porteur attend surtout des effets locaux, retard de cicatrisation, nécrose, infection, œdème ou hématome, et indique avoir réduit les groupes de cinq à trois animaux au vu de l'homogénéité des résultats antérieurs. Le choix de l'espèce vient d'une commande, le RNT précisant que "la demande de l'industriel a porté sur l'utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines".

Objectifs

Les infections bactériennes associées à la présence d’un biofilm représentent l'une des complications les plus graves suite à l'implantation de dispositifs médicaux. En particulier, les infections sur prothèse orthopédique sont particulièrement redoutées en clinique car elles sont associées à des échecs thérapeutiques et une morbi-mortalité importante. En effet, le biofilm qui recouvre ces prothèses est une matrice composée d’exopolysaccharides et de bactéries en dormance, présentant une sensibilité réduite aux antibiotiques et une faible accessibilité mécanique, ce qui donne lieu à des infections chroniques, extrêmement difficiles à combattre. Ainsi, l’inhibition de la formation de biofilm est un élément clé de la prévention des infections ostéoarticulaires sur matériel. Dans ce cadre, différents matériaux constituant les prothèses et présentant des caractéristiques antibactériennes sont actuellement à l’étude. Plusieurs polymères ont déjà montré des résultats intéressants in vitro. Toutefois, des essais doivent maintenant être conduits chez l’animal pour en vérifier la tolérance locale (et par la suite l’activité antibactérienne, en fonction des résultats obtenus). L’objectif du présent projet vise donc à évaluer la tolérance locale d’implants en titane, recouverts de différents polymères antibactériens, chez la souris, après implantation sous-cutanée.

Bénéfices attendus

A long terme, le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir développer un matériel innovant, permettant de d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme (ex : dispositifs médicaux ou prothèses). Avant cela, il est nécessaire d’en vérifier l’innocuité. Aussi, à court terme, le bénéfice attendu est de pouvoir sélectionner un ou plusieurs polymères antibactériens n’ayant pas de toxicité chez la souris parmi plusieurs candidats.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Deux injections (durant 2 secondes chacune) avant le geste chirurgical - Incision cutanée et suture sous anesthésie fixe

Impact sur les animaux

S’agissant d’un matériel étranger implanté en sous-cutané, les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaire (retard de cicatrisation, nécrose ou infection au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire). Les implants en titane sont déjà largement utilisés en pratique clinique et sont parfaitement tolérés. L’atteinte tissulaire chez les animaux serait davantage due au polymère recouvrant le titane mais les essais in vitro ne montrent pas de toxicité particulière de ces différents polymères. Par ailleurs, des essais similaires ont déjà été réalisés (implant titane recouverts d’autres polymères) et aucun effet indésirable n’a été enregistré.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (27). Un prélèvement tissulaire sera réalisé post-mortem.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité des différents polymères de cette étude a déjà fait l’objet d’investigations menées in vitro sur des modèles cellulaires. Également, l’environnement complexe (tissu sous-cutané, cellules immunitaires …) est difficilement modélisable dans un autre système que le modèle animal. Aussi, l’utilisation du modèle animal est requise.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé pour établir la preuve de concept et discriminer rapidement un échantillon relevant de polymères. Les travaux précédents sur un modèle similaire avait requis l’utilisation de 5 animaux par groupe ; les résultats de l’analyse histopathologique ont montré une très bonne homogénéité et de ce fait, il a été décidé de n’utiliser que 3 animaux par groupe dans cette nouvelle étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 3 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Lors de la mise en place de l’implant, les souris recevront une analgésie de palier 2 et une anesthésie fixe. Après l’incision, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant du début de la chirurgie jusqu’à leur réveil. La plaie sera observée quotidiennement et désinfectée sur les 3j suivant la chirurgie puis 2 fois par semaine jusqu’à la mise à mort. Nos expériences précédentes nous informent que les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Toutefois, une grille de score nous permet de suivre individuellement chaque animal et d’établir un point limite défini par un score égal ou supérieur à 8.

Choix des espèces

Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 22g (+/- 2g) et un système immunitaire mature. Également, dans un souci de comparaison avec les résultats antérieurs d’une autre étude, la souris sera choisie comme modèle dans cette étude.

Tués au bout de quatre-vingt-quatre jours pour prélever une grande quantité de sang et en extraire des anticorps, 36 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une puce sous-cutanée, quatre injections d'un candidat vaccin contre Klebsiella pneumoniae dans la cuisse, puis quatre prises de sang à l'oreille, cinq minutes de contention par prélèvement, sur animal vigile et sans anesthésie. Le porteur attend une inflammation au site d'injection, une hausse de la température corporelle et des hématomes. Ce protocole est mené pour un commanditaire qui réalise lui-même les dosages d'anticorps de manière confidentielle, si bien que le porteur écrit ne pas connaître les tests statistiques qui fondent les douze animaux par groupe.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie (infection généralisée). Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin à usage humain, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées (bactéries inoffensives dont tous les facteurs de virulence ont été retirés) et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae, a déjà montré une protection significative dans un modèle de septicémie à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Des études préliminaires ont déjà été menées chez le lapin. L’objectif est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin en testant un nouveau protocole de vaccination (plus d’immunisation, sur une durée plus longue avec des volumes injectés plus importants) dans le but de déterminer quel schéma vaccinal est capable d’entrainer la plus grande production d’anticorps spécifiques.

Bénéfices attendus

Le nouveau schéma vaccinal devrait entrainer une meilleure réponse immunitaire. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - Pose d’un puce de relevé de température 3 secondes - 4 injections sur animal vigile 3 secondes par injection - 4 prélèvements sanguins sur animal vigile 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale suivie d’un prélèvement sanguin terminal (2 minutes) qui se terminera par une injection d’un euthanasiant (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire individuellement un stress ou une douleur légère : - Mise en place d’une puce de température - 4 injections de vaccin dans la cuisse : peuvent induire une légère inflammation et une gêne au site d’injection ainsi qu’une augmentation de la température corporelle. - 4 prélèvements sanguins à l’oreille sur animal vigile en cage de contention : le prélèvement peut entrainer la formation d’un hématome. - 1 anesthésie générale directement suivi d’un prélèvement sanguin terminal.

Devenir

Les 36 animaux de l’étude seront mis à mort à l’issue des 84 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Leur mise à mort est justifiée par la nécessité de récupérer suffisamment d’anticorps pour les analyses complémentaires ce qui implique le prélèvement d’une grande quantité de sang.

Remplacement

La production d’anticorps est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour l’étude de la production d’anticorps suite à une vaccination.

Réduction

Le nombre de 12 animaux par groupe a été défini en fonction de la variabilité de la quantité d’anticorps déjà observée lors de précédentes études par le commanditaire de l’étude. Ce dernier réalisant ses propres dosages d’anticorps et ses propres analyses de manière confidentielle, nous n’avons pas d’information sur les tests statistiques utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la phase d’immunisation. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations des traitements et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Le suivi de la température sera effectué grâce à une puce placée en sous cutané ce qui évitera l’utilisation d’un thermomètre rectal souvent stressante pour l’animal. L’administration des traitements n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. Grace à des séances d’habituation à la contention et à la manipulation, les injections et prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles et ne nécessiteront pas d’anesthésie ou d’analgésie particulière dans la plus part des cas (comme chez l’homme). Si malgré tout, un animal est particulièrement stressé ou agité lors du prélèvement sanguin, un tranquillisant pourra lui être administré.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Également, l’efficacité du candidat vaccin sera ultérieurement testé dans un modèle d’infection chez le lapin. Des lapins mâles et femelles de 3-4 mois seront utilisés de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.