Maladies infectieuses

Les souris dont le score d'encéphalite atteint 4, ou qui perdent plus de 20 % de leur poids, sont mises à mort. 1 474 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une partie reçoit des Listeria directement dans le cerveau sous anesthésie, une autre subit l'induction d'une encéphalite auto-immune qui peut la paralyser sept à quinze jours, et un troisième groupe passe tous les quinze jours pendant sept mois un test de mémoire dans un labyrinthe et un test d'équilibre sur cylindre rotatif. L'identification de cibles thérapeutiques contre les troubles cognitifs qui suivent une infection cérébrale reste annoncée au conditionnel, quand la paralysie des membres et la perte de poids figurent, elles, au protocole.

Objectifs

Nous cherchons à définir l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur la santé cérébrale après l’infection. En effet, les altérations du système immunitaire cérébral sont susceptibles de favoriser ou au contraire protéger le cerveau contre des dommages ultérieurs, notamment les maladies neuronales et neurodégénératives telles que la sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. Ce projet permettra à la fois d’étudier comment s’effectue la réparation du système immunitaire cérébral après la résolution d’une infection ainsi que les mécanismes menant à une sensibilité accrue ou diminuée aux futurs dommages neuronaux.

Bénéfices attendus

Sur un plan des connaissances scientifiques, nous chercherons à déterminer les rôles respectifs du système immunitaire cérébral (microglie) et périphérique (monocytes provenant du sang) dans la réponse aux infections du système nerveux central, ainsi que leur rôle dans l’apparition de troubles cognitifs après l’infection. La comparaison des séquelles neurologiques induites en présence ou absence de la microglie et/ou des monocytes permettra de mettre en évidence le rôle de chacune de ces populations immunitaires dans les séquelles neurologiques apparaissant après la guérison de l’infection. Nous chercherons à mettre en évidence les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’apparition de ces troubles cognitifs, pour comprendre comment les cellules immunitaires ayant joué un rôle dans la résolution de l’infection cérébrale (microglie ou monocytes recrutés) peuvent ensuite adopter un phénotype dommageable pour le bon fonctionnement cérébral. L’identification de ces mécanismes permettrait de mettre en évidence des cibles thérapeutiques utiles dans le traitement des séquelles neurologiques post-infectieuses.

Procédures

Procédure 1 : les animaux seront soumis soit à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), soit à une injection intracérébrale (Y COMPRIS UNE INJECTION DANS LE CERVEAU) sous anesthésie générale (durée d’environ 10 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Procédure 2 : les animaux seront soumis à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils subiront 1 injection cutanée et intrapéritonéale sous anesthésie gazeuse (générale, durée des 2 injections : environ 5 minutes) pour induire la réponse auto-immune, et une dernière injection intrapéritonéale (durée d’environ 30 secondes) pour achever l’induction de la réponse autoimmune, sur animal vigile. Procédure 3 : les animaux seront soumis à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils seront soumis à des tests cognitifs tous les 15 jours pendant 7 mois, consistant en un test de mémoire (trouver la bonne sortie parmi plusieurs qui se ressemblent, un test durant environ 30 minutes) et un test moteur (rester le plus longtemps possible sur un cylindre rotatif, durée d’environ 15 minutes).

Impact sur les animaux

Dans l’ensemble des procédures l’infection induit un degré de souffrance : perte de poids, « sickness behaviour » et atteinte cérébrale qui peut parfois induire des paralysies des pattes des souris. Dans la procédure n°1, un niveau de douleur modéré sera à prendre en compte suite à l’inoculation intracraniale de bactéries, qui sera pris en charge par antalgiques. L'INJECTION DE LISTERIA MONOCYTOGENES DANS DES REGIONS CEREBRALES SPECIFIQUES PEUT INDUIRE DES TROUBLES NEUROLOGIQUES LIE AU SITE D'INJECTION. LES SOURIS SERONT SURVEILLEES QUOTIDIENNEMENT AFIN DE DETECTER TOUT SYMPTOME NEUROLOGIQUE GRAVE. Dans la procédure n°2, l’induction d’encéphalite autoimmune est susceptible d’engendrer une perte de mobilité par paralysie des membres, d’une durée variable entre 7 et 15 jours selon la littérature. Dans la procédure n°3, au cours du vieillissement des souris de souche 5xFAD on notera l’apparition de signes associés à la maladie d’Alzheimer tels qu’une perte de mémoire et des capacités d’interaction sociale diminuée. Ces troubles apparaissent progressivement, à partir de 6 mois d’âge environ.

Devenir

Les procédures nécessitent toutes une mise à mort des animaux à la fin de la procédure afin d’étudier leurs organes par diverses techniques. Il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin du projet.

Remplacement

L’étude de l’interaction entre le système immunitaire et le fonctionnement du système nerveux central nécessite un hôte animal car les mécanismes d’interaction entre ces 2 systèmes cellulaires complexes ne peuvent pour l’instant pas être modélisés in vitro. En particulier pour comprendre les séquelles induites par une infection et les conséquences à long terme, il est absolument nécessaire de mener les études dans un hôte animal qui est capable de régénérer les tissus altérés.

Réduction

Pour l’observation du comportement des animaux, nous suivrons dans le temps les mêmes individus, ce qui permet 1) d’augmenter la puissance statistique de l’étude et 2) éviter de mettre à mort un animal après un unique test comportemental (sauf pour le test du labyrinthe de Barnes car les animaux s’habituent à ce test au fil du temps) . Pour les études de la réponse immunitaire au sein du cerveau, le cerveau des souris disséquées sera séparé en 2 hémisphères, un hémisphère étant utilisé pour l’analyse histologique par immunofluorescence et l’autre pour la cytométrie en flux. Cela permettra de diminuer par 2 le nombre de souris nécessaire pour ces expériences. Afin de vérifier que les 2 hémisphères cérébraux ne réagissent pas de manière différente à l’infection nous vérifierons l’absence de différence entre les analyses effectuées sur les hémisphères droits et gauches. Nous utiliserons également des souches de Listeria monocytogenes dites « fortement neuroinvasive » qui induisent de manière très reproductible une infection du système nerveux central après gavage. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux inoculés par rapport à l’inoculation des classiques souches de laboratoire de Listeria qui n’induisent une infection du système nerveux central que dans une petite proportion des animaux inoculés. Les effectifs des populations de souris auxquelles nous aurons recours sont établis en tenant compte des tests statistiques permettant d’obtenir une significativité du résultat obtenu (test de Mann-Whitney (deux groupes non appariés), Wilcoxon (deux groupes appariés) ou ANOVA (plus de deux groupes) pour les comparaisons de valeur avec faible effectif, se basant sur une distribution non gaussienne des résultats).

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. L’état général des animaux sera suivi. Les paramètres observés seront : poil ébouriffé, apparence corporelle/body condition, expression faciale/mouvement. Une aide à la thermorégulation sera mise en place dans toutes les cages pour éviter l’hypothermie : abri en carton, matériel de nidification (coton/papier) et chaufferettes. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) et mise à disposition d’eau gélifiée sera entreprise pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané). Les animaux présentant un état pathologique trop avancé (score de 2 pour un paramètre de la grille proposée par le comité d’éthique, ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou un score d’encéphalite ≥ 4) seront mis à mort. LES ANIMAUX SERONT EGALEMENT MIS A MORT EN CAS D'APPARITION DE SYMPTOMES NEUROLOGIQUES GRAVES SUITE A UNE INJECTION CEREBRALE STEREOTAXIQUE ET CEUX POUVANT AUSSI EMPECHER UNE ALIMENTATION ET UN ABREUVEMENT EFFICACES. La douleur induite par l’injection intracrâniale sera limitée en injectant les souris avec un antidouleur (buprénorphine) avant et après l’injection, qui se fera sous anesthésie gazeuse et en appliquant un anesthésique local sur la zone à injecter. Le stress induit par l’encéphalite autoimmune (paralysie → difficulté d’accès à la nourriture, de thermorégulation, de nettoyage) sera limité en multipliant les source d’accès à la nourriture et à de la gélose hydratante au niveau du sol de la cage, ainsi qu’en chauffant les cages avec des chaufferettes pour aider la thermorégulation des souris. Les animaux seront pesés le jour précédant l’infection puis, au minimum, à partir du jour 3 quand les animaux commencent à perdre du poids du fait de l’infection. La pesée aux deux premiers jours ne sera pas systématique et dépendra de l’état apparent de l’animal. Cela permettra de limiter les manipulations à un moment où les animaux ne perdent pas de poids d’après notre expérience.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, un grand nombre d’outils et de lignées transgéniques ayant été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Il s’agit également d’un bon modèle en neurosciences, les souris ayant certaines capacités cognitives suffisamment développées pour étudier l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur des fonctions neuronales ciblées pour ce mammifère. Nous utiliserons des souris adultes, pour ne pas interférer avec les phénomènes de neurodéveloppement dans notre étude. Les souris adultes seront âgées de 2 à 9 mois, les plus âgées (6 à 9 mois) seront utilisées pour 1) le suivi à long-terme des conséquences de l’infection, et 2) pour étudier le phénomène de neurodégénerescence dans les souris 5xFAD qui commencent à développer des troubles à partir de l’âge de 6 mois.

Infectées par des bactéries pathogènes dans les poumons, l'intestin ou la vessie, puis soumises à des gavages et à des instillations intranasales et intratrachéales jusqu'à deux fois par jour, 16 984 souris vont être utilisées, 12 712 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 4 272 un niveau léger. Certaines subissent des prélèvements fécaux deux à trois fois par semaine pendant soixante jours. Le porteur décrit des atteintes brèves, difficultés respiratoires pendant 24 heures au plus, diarrhée pendant 48 heures, "gêne limitée" pour les infections urinaires, tout en prévoyant la mise à mort de toute souris prostrée, ayant perdu plus de 20 % de son poids ou diarrhéique au-delà de deux jours. Aucune ne sort vivante du projet, le porteur indiquant qu'elles sont devenues porteuses potentielles de la bactérie et que la plupart doivent être tuées pour l'analyse de leurs organes vitaux.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries et qui peuvent être utilisés pour traiter des patients infectés par des bactéries résistantes aux antibiotiques. De plus, les bactériophages font partie de la flore microbienne naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, ce projet nous permettra d’étudier les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans trois organes cibles : les poumons, les intestins et la vessie. Les connaissances qui seront acquises permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont directement liés à l’utilisation thérapeutiques des bactériophages. Aujourd’hui le nombre de personnes en situation d’impasse thérapeutique et qui ont accès à titre compassionnel à la phagothérapie augmente faiblement car nous manquons de données expérimentales pour soutenir les meilleures conditions d’utilisation. Ce projet permettra à terme de fournir les éléments de compréhension sur les mécanismes impliqués dans l’efficacité de la phagothérapie. Nous apporterons aussi des informations relatives à la dose, la fréquence et la voie d’administration les plus appropriées. De même, nous appréhenderons le rôle du système immunitaire dans l’efficacité des traitements. A terme, le déploiement à plus grande échelle de la phagothérapie repose sur les données que nous pourrons obtenir au cours de ce projet.

Procédures

Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes) au maximum d’une fois par semaine sur 25 jours, ou des prélèvements fécaux deux à trois fois par semaines pendant 60 jours au maximum avec parfois un suivi plus fréquent jusqu’à deux fois par jour pendant 5 jours (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes pour collecter les feces). Les administrations par gavage (quelques secondes) ainsi que les instillations intranasales et intratrachéales seront limitées à 2 par jour.

Impact sur les animaux

Les animaux qui seront infectés par des bactéries pathogènes subiront un stress en relation avec l’organe étudié. Lors d’infections pulmonaires les animaux présenteront des difficultés respiratoires pendant une durée maximale de 24h. Lors d’une infection intestinale, des signes de diarrhée peuvent persister pendant 48h au maximum. Ces situations peuvent provoquer un défaut d’alimentation induisant une baisse de la mobilité. Les infections urinaires seront quant à elles d’une courte durée (24h au plus) et induiront une gêne limitée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptibles de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.

Remplacement

L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbiennes d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.

Réduction

L’ensemble de ces études s’appuient sur des données préliminaires obtenus in vitro et dont les résultats permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés puisque seuls les éléments les plus pertinents, au regard de la question scientifique posée, sont évalués chez l’animal. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’imagerie sera utilisée pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les animaux infectés seront évalués 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 attribué aux animaux présentant une perte de poids supérieure à 10% et ayant une mobilité réduite, déclenchera l’ajout d’un gel hydrique pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avec le SBEA avant d’être mise en place.

Choix des espèces

A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Enfin les données et les outils disponibles sur le système immunitaire murin sont aussi une raison justifiant le recours à ces animaux. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.

Une injection de bactéries tuées par la chaleur, puis un prélèvement de sang à quinze minutes, un autre à vingt-quatre heures, un autre à quarante-huit heures, jusqu'à cinq en dix jours, chacun sur souris vigile maintenue à la main. 2 496 souris passent par là, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'autre moitié un niveau modéré. Le porteur souligne comme raffinement qu'aucun pathogène vivant ne sera injecté, ce qui n'empêche pas une perte de poids liée à la réponse immunitaire déclenchée. Elles sont tuées en fin de procédure pour prélever moelle osseuse, sang et rate.

Objectifs

Staphylococcus aureus (staphylocoque doré) et Escherichia coli (E. coli) sont deux bactéries opportunistes pathogènes, parmi les plus fréquemment isolées à partir de prélèvements sanguins et d’infections invasives. C’est en raison de leur forte présence chez les patients à l’hôpital que ce projet de recherche s’intéresse à la réponse immunitaire induite par ces deux pathogènes. Malgré les avancées récentes dans la compréhension des mécanismes de réponse de l’hôte aux pathogènes, plusieurs aspects restent à élucider. Cela inclut notamment l’origine des cellules immunitaires retrouvées dans la circulation sanguine, leur processus de sortie de la moelle osseuse, ainsi que leur devenir dans les organes (multiplication, fonctions immunitaires). Dans le cadre de ce projet, nous avons identifié des marqueurs cellulaires exprimés par certaines sous-populations immunitaires de la moelle, potentiellement impliquées dans la réponse de l’hôte. L’expression de ces marqueurs semble modulée en fonction du type de pathogène rencontré. L’objectif de ce projet est donc de valider ces observations, initialement réalisées sur des cellules immunitaires dérivées de la moelle osseuse de souris, et de mieux comprendre comment ces cellules adaptent leur survie et l’expression de marqueurs de leur origine en réponse à des éléments bactériens.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes mis en œuvre par l’organisme en réponse à deux pathogènes impliqués dans la majorité des infections sanguines observées chez les patients à l’hôpital. Le modèle murin permet d’étudier de manière précise, dans différents niveaux du système immunitaire (moelle osseuse, sang, rate), les différences de réponse, tant au niveau cellulaire que moléculaire. Cela offre la possibilité de mieux comprendre la dynamique des réactions immunitaires et de mettre en évidence de nouveaux outils diagnostiques applicables en milieu clinique. Face à l’augmentation des infections causées par des bactéries multirésistantes, il est essentiel de pouvoir caractériser les étapes de l’infection et de la réponse immunitaire pour adapter rapidement la prise en charge du patient.

Procédures

Nous injecterons les bactéries inactivées ou les éléments bactériens mimant une infection en une seule injection par animal, d'une durée inférieure à 30 secondes. Des prélèvements sanguins de 50 microlitres seront réalisés chez les souris vigiles à 15 minutes, 24 heures, 48 heures, 7 jours, et jusqu’à un maximum de 10 jours après l’injection. Chaque animal fera l’objet d’au maximum cinq prélèvements, chacun d’une durée de 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux seront au cours de ce projet, injectés en intraveineuse ou en intra-péritonéale afin d’introduire les bactéries inactivées ou les motifs bactériens pouvant entrainer une douleur de courte durée et un stress dû à la contention. Les prélèvements réalisés pourront également induire un stress court lié à la contention ainsi qu’une douleur légère due au prélèvement. Nous utiliserons des doses de bactéries inactivées ou les motifs bactériens non léthales qui pourront induire une perte transitoire de poids induite par l’initiation d’une réponse immunitaire.

Devenir

Mise à mort des animaux ayant été infectés en fin de procédure.

Remplacement

Les expérimentations menées précédemment nous ont permis de mettre en évidence de nouveaux mécanismes impliqués dans la survie des cellules et leur adaptation à la présence de pathogènes ou de composants bactériens. Dans une démarche de remplacement, des travaux d’exposition de cellules immunitaires en culture à des motifs mimant la présence de bactéries ont été réalisés. Ces expérimentations ont permis de mettre en évidence l’évolution de marqueurs exprimés à la surface des cellules, essentiels à leur survie. Ces résultats nous ont également permis d’établir l’existence de différences de sensibilité selon les types de cellules immunitaires, en fonction des motifs bactériens rencontrés. Cependant, ces modèles présentent d’importantes limites, notamment en ce qui concerne la reproduction des interactions complexes entre les organes et les multiples types cellulaires.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux aussi restreint que possible, déterminé à l'aide de tests statistiques appropriés. Toutefois, si des résultats significatifs étaient obtenus avant d’atteindre l’effectif initialement prévu, la procédure concernée serait arrêtée. Nous nous limiterons au nombre d’animaux minimum nécessaire pour atteindre un seuil de significativité statistique.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, aucun pathogène vivant ne sera injecté aux animaux. Seules des bactéries inactivées par la chaleur ou des éléments de ces dernières bactériens, ce qui permet de reproduire les principales étapes de la réponse immunitaire de l’hôte sans induire de maladie. Les injections seront réalisées par voie intrapéritonéale, afin de limiter autant que possible le temps de contention et le stress généré chez les animaux. Après chaque injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter l’éventuelle apparition de symptômes tels que la prostration, la léthargie, le dos courbé ou l’isolement, considérés comme des points limites. Les animaux seront également pesés chaque jour après l’injection afin d’identifier toute perte de poids excessive pouvant également constituer un point limite.

Choix des espèces

Le modèle murin est largement décrit comme un modèle de référence pour l’étude de la réponse immunitaire. Les systèmes de défense contre les pathogènes sont en effet très conservés chez les mammifères, et les réponses immunitaires de l’hôte vis-à-vis des agents pathogènes sont très similaires entre la souris et l’Homme. Dans ce projet, nous utiliserons des souris âgées de 6 à 8 semaines, conformément aux conditions expérimentales de nos travaux antérieurs. En effet, à cet âge, nous avons observé une stabilisation des populations de cellules immunitaires dans les différents tissus étudiés. Cette stabilité nous permettra d’obtenir des résultats aussi reproductibles que possible. Nous aurons recours à des lignées de souris exprimant des rapporteurs fluorescents, permettant un suivi précis des réponses des cellules immunitaires à la présence de pathogènes ou de leurs composants. Enfin, des souris mâles et femelles seront incluses dans les expérimentations, afin d’optimiser l’utilisation des animaux et d’assurer une homogénéité avec les données obtenues lors des précédents travaux menés dans le laboratoire.

2 823 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie après avoir été infectée. 2 571 relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole commence par une encoche dans l'oreille, se poursuit par deux ou trois injections de vaccin à ARN espacées de quatorze jours et des prises de sang, puis par l'inoculation d'une mycobactérie dans la queue, qui provoque une inflammation locale. Le porteur annonce "peu d'effets indésirables" et un "inconfort léger de courte durée", et justifie l'effectif par une "vaste expérience" d'études in vivo validée par des biostatisticiens, sans donner le calcul.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester et de développer de nouveaux vaccins contre des mycobactéries. Ces agents pathogènes constituent une préoccupation croissante pour la santé mondiale en raison de leur résistance aux antibiotiques et de leur propagation continue. L'infection par ces agents pathogènes entraîne une morbidité à vie chez les personnes immunodéprimées, et leur traitement est extrêmement coûteux, long et complexe. Il est urgent de mettre en place de nouvelles stratégies pour prévenir l'infection et réduire l'impact de ces agents pathogènes sur la population mondiale, comme la vaccination. Le besoin de vaccins contre ces agents pathogènes reste non satisfait à ce jour, et il est urgent de mieux comprendre les corrélats immunologiques de protection contre chacune de ces infections. Cette demande concerne l'analyse fonctionnelle de la réponse immunitaire induite par la vaccination et la détermination de l'efficacité des vaccins à ARN contre le développement des infections mycobactériennes. Le projet a pour objectif de développer de nouveau vaccins en utilisant certains progrès technologiques permettant la découverte et la caractérisation non ciblée de nouveaux antigènes bactériens très certainement reconnus par le système immunitaire lui permettant de contrôler l’infection, et d’inclure ces antigènes dans des vaccins à base d’ARN. Le projet est donc de produire des vaccins ARN permettant l’expression des antigènes de ces mycobactéries et de tester l’efficacité de ces vaccins dans des modèles animaux. Les bénéfices du projet seront la production de vaccins protecteurs efficaces contre ces mycobactéries. Une fois défini, ces vaccins pourront être testés dans des essais cliniques chez l’Homme. Il est prévu dans le projet de tester une vingtaine de candidats vaccins pour chacun des pathogènes dans des expériences de protection chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter des bénéfices de santé publique à court et long terme grâce au développement de nouveaux vaccins à ARN ciblant trois importantes mycobactéries non tuberculeuses (MNT). Ces agents pathogènes sont responsables d'infections graves, en particulier chez les personnes immunodéprimées ne disposant actuellement pas de traitement efficace. Bénéfices à court terme : 1. Avancement scientifique dans le développement de vaccins Le projet permettra l'identification et les tests précliniques de nouvelles cibles antigéniques pour le développement de vaccins à ARN. Il favorisera également le développement d'un nouveau processus de développement de vaccins contre les agents pathogènes mycobactériens, et pourrait être appliqué à divers agents pathogènes bactériens. 2. Évaluation des réponses immunitaires et de la protection En évaluant systématiquement les réponses immunitaires et l'efficacité protectrice dans un modèle murin, le projet identifiera les antigènes des agents pathogènes mycobactériens conduisant à une immunité protectrice. Ces connaissances amélioreront également notre compréhension des interactions hôte-pathogène pour les infections étudiées. De plus, l'étude des réponses immunitaires permettra de mieux comprendre les corrélats immunitaires de la protection contre ces pathogènes. 3. Innovation collaborative L'implication de laboratoires européens de premier plan, dotés d'expertises complémentaires, garantit un échange rigoureux de méthodologies et de connaissances. Bénéfices à long terme : 1. Développement de nouveaux vaccins contre les maladies négligées L'objectif ultime d'identifier les candidats vaccins les plus performants pourrait conduire à de futurs essais cliniques et, à terme, à la mise au point de vaccins humains efficaces. 2. Impact sur la santé publique La réduction de l'incidence et de la gravité des infections à MNT grâce à la vaccination pourrait réduire le recours à des traitements antibiotiques de longue durée, souvent mal tolérés et favorisant l'apparition de résistances aux antibiotiques.

Procédures

Toutes les souris utilisées dans ce protocole seront marquées par encoche à l’oreille prenant quelques secondes. Pour les animaux vaccinés, 2 à 3 injections de vaccins prenant une dizaine de secondes par animal. Les injections sont espacées de 14 jours. Si 2 à 4 prélèvements sanguins s’avéraient nécessaires pour nos analyses à deux semaines d’intervalle, ils prendront quelques secondes par animal. Pour certains animaux vaccinés, une injection sera réalisée prenant une dizaine de seconde par animal. L’injection pour l’infection sera réalisée à l’aide d’un dispositif de contention prenant une trentaine de seconde par animal. L’imagerie sera réalisée une fois par semaine après l’infection sous anesthésie et durera une quinzaine de minutes (8 séances d’imagerie au maximum sont prévues). Une autre infection sera réalisée sous anesthésie et ne prendra que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Pour ces études, nous prévoyons peu d'effets indésirables chez les souris. Les animaux reçoivent deux ou trois doses de vaccin, ou une dose de BCG (le vaccin antituberculeux Bacille Calmette Guérin). Il est maintenant reconnu que les vaccins à base d’ARN ou l’injection du BCG n’entrainent qu’un inconfort léger de courte durée sur le site d’injection lié à l’introduction de l’aiguille lors de la vaccination. Dans certains cas rares, les souris présentent une légère réaction inflammatoire localisée au site d’injection suite à la vaccination par les vaccins ARN. Un petit volume de sang sera prélevé une semaine après chaque vaccination et une semaine après l’infection. Les processus de prélèvement sont courts et n’engendreront qu’un inconfort léger de courte durée lié à l’introduction de l’aiguille. Ces prélèvements seront espacés de deux semaines pour faciliter leur récupération. L’infection des souris par des mycobactéries par voie sous-cutanée engendrera lui aussi un inconfort léger de courte durée lié à l’introduction de l’aiguille au niveau de la queue. Une inflammation pourra être observée au niveau du site d’injection. L’infection des souris sous anesthésie n’engendrera qu’un inconfort léger de courte durée.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort car le projet nécessite de faire des analyses sur des organes vitaux. Ces organes ne pourront être prélevés qu’après mise à mort de l’animal.

Remplacement

Ce projet vise à tester l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de différentes formulations de vaccins contre divers agents pathogènes. Toutes les hypothèses pouvant être testées in vitro, telles que l'activation des cellules immunitaires ou l'expression de molécules vaccinales, seront d'abord vérifiées à l'aide de lignées cellulaires ou de cellules sanguines. En effet, ces tests invitro permettent d'analyser certaines composantes de la réponse immunitaire à la vaccination. Cependant, aucun modèle in vitro ne peut reproduire intégralement le développement de l'infection ou sa physiopathologie associée car il existe de nombreux éléments inducteurs et régulateurs impliquées dans ces réponses et certains ne sont pas encore connus. Les bénéfices potentiels des vaccins dans la prévention et le contrôle de l'infection, notamment leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice, ne peuvent être évalués de manière fiable que dans un organisme vivant, rendant ainsi l'utilisation d'un modèle animal indispensable pour leur analyse et leur validation.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans cette étude est basé sur une vaste expérience d’études in vivo pour des modèles d’infection et a été validé par des biostatisticiens. Le nombre d’animaux par groupe a ainsi été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs par l’utilisation de tests statistiques adaptés en fonction des expériences et des groupes analysés en prenant en compte la variabilité attendue de chaque paramètre et des expériences pilotes qui nous permettront d’évaluer la dispersion des valeurs individuelles au sein des groupes. Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, 6 souris par groupe seront utilisées et deux expériences indépendantes, l’une avec des souris femelles et l’autre avec des souris mâles, seront réalisées. Si des différences entre les sexes est observée, une expérience supplémentaire comprenant des femelles et des mâles sera réalisée sur les vaccins les plus efficaces. Par ailleurs, nos protocoles visent à extraire un maximum d'informations de chaque animal en utilisant plusieurs techniques. Nous prélèverons tous les organes d’intérêt et un important volume de sang de tous les animaux de l’étude pour tirer parti de toutes les informations que peuvent nous apporter les animaux utilisés. Nous utiliserons des techniques expérimentales novatrices qui nous permettront d’analyser sur un seul individu de multiples facteurs d’intérêt pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé maximisant ainsi les données tout en minimisant le recours aux animaux. Les études approfondies d'immunogénicité ne seront menées que sur les candidats vaccins les plus prometteurs afin de réduire davantage le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place pour améliorer le bien-être animal : - Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur nouvel environnement de deux semaines - Pour les souris vaccinées, après la vaccination, un léger massage est réalisé pour permettre la dispersion du vaccin. En cas de réaction inflammatoire au niveau du site d’injection, un traitement local sera réalisé. - Pour les souris infectées, l’infection va engendrer une inflammation localisée sur la queue au niveau du site d’injection. La zone inflammée sera massée avec de l’eau tiède pour soulager l’inflammation. Une litière plus douce à base de cellulose pourra être utilisée. -Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront réhydratés avec une solution de sérum physiologique pour faciliter leur récupération. - Nous avons choisi les temps d’expérience suite à l’infection pour que les animaux ne développent pas la pathologie associée et qu’ils ne soient pas susceptibles de développer des signes d’inconfort et de souffrance. Néanmoins, les animaux seront évalués une à deux fois par semaine. En cas d’apparition de signes d’inconfort des croquettes humides et du gel hydrique seront ajoutés et la surveillance renforcée à trois visites par semaine. Si des signes de souffrance sont détectés, l’animal sera réhydraté avec du sérum physiologique par voie sous-cutané et surveillé une fois par jour. Si les signes persistent pendant plus de 24h, l’animal sera mis à mort. - Si nécessaire, d’autres moyens de raffinement pourront être utilisés pour améliorer le bien-être des animaux comme une augmentation de l’enrichissement et le chauffage des cages.

Choix des espèces

Le modèle murin représente le meilleur compromis éthique parmi les modèles mammifères, avec des résultats proches de ceux de l'homme. Le système immunitaire de la souris est bien caractérisé et largement comparable à ceux de l'homme. De plus, le modèle murin a été largement utilisé pour la recherche sur les réponses immunitaires aux mycobactéries et sur les vaccins. Chacun de ces modèles d'infection a été précédemment publié dans d'autres laboratoires. Par conséquent, les résultats obtenus peuvent être facilement mis en contexte avec la littérature existante et avec nos connaissances préalables sur ces agents pathogènes. Le modèle murin, largement utilisé dans la recherche sur les maladies infectieuses, présente également l'avantage de disposer d'un large éventail de techniques adaptées et de réactifs. Cela nous permet de réaliser des analyses sur un plus large éventail de facteurs, avec un faible échantillonnage de souris. Des souris adultes âgées de 2 mois seront utilisées. À ce stade, le système immunitaire est pleinement développé et nous permet d'évaluer la réponse vaccinale.