Maladies infectieuses

Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.

Objectifs

L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Immunisés à l'adjuvant de Freund par quatre à sept injections transdermiques, quatre lapins subissent aussi quatre à six prises de sang sur animal vigile, puis une anesthésie de quinze minutes suivie d'une ponction fémorale. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce que le projet produit est un réactif de laboratoire, des anticorps polyclonaux dirigés contre deux protéines de Pseudomonas aeruginosa, qui serviront à purifier ces protéines dans des extraits bactériens. L'adjuvant peut provoquer des douleurs articulaires et une forte inflammation aux points d'injection, et le lapin est retenu parce que sa taille moyenne donne beaucoup de sérum en consommant peu de protéine.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est devenue l'une des plus grandes menaces pour la santé mondiale. De plus en plus de bactéries sont résistantes, rendant ainsi ces molécules moins efficaces voire totalement inefficaces pour traiter les infections bactériennes. Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste responsable d'infections nosocomiales touchant principalement les patients immunodéprimés, les brûlés, ou encore les patients sous ventilation mécanique. Aujourd’hui, la lutte contre les souches de P. aeruginosa multi-résistantes aux antibiotiques, représente un enjeu sanitaire et médical important, enjeu souligné par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les modifications post-traductionnelles (PTM) constituent une piste de recherche innovante. Ce sont des ajouts de groupements chimiques qui s’effectuent notamment sur les protéines. Elles impactent alors les interactions, les structures et donc la fonction de ces protéines. Leur importance est clairement établie chez les eucaryotes puisqu’elles sont la cible de traitements contre certains cancers ou maladies neurodégénératives. En revanche chez les bactéries, leur mise en évidence est relativement récente et leur rôle reste encore à être déterminé. Si de nombreuses études ont été menées pour identifier les résidus modifiés, très peu d’entre elles, malheureusement, se focalisent sur leur rôle. Pourtant leur rôle, lors de la formation de biofilm, la résistance, la virulence ou la persistance bactérienne, semble important. Notre hypothèse est que cibler les PTMs bactériennes impliquées dans la pathogénèse, pourrait être utilisée comme une stratégie de lutte contre les infections causées par les pathogènes. Nous avons d’ores et déjà identifié de nombreux facteurs de virulence sécrétés par P. aeruginosa qui sont modifiés, parmi eux deux proteine B et D sont deux facteurs majeurs. Notre étude consiste donc à évaluer l’implication des différentes modifications dans l’acquisition de résistances aux antibiotiques, dans l’augmentation de la virulence et dans la formation de biofilms chez P. aeruginosa. La production d’anticorps polyclonaux chez le lapin pour chacune de ces protéines nous permettra d’isoler et de purifier B et D sous toutes leurs formes dans chacune de nos différentes souches cliniques de P. aeruginosa et ainsi de trouver le relationnel entre les modifications post-traductionnelles et l’augmentation de la pathogénicité chez cette bactérie.

Bénéfices attendus

L’obtention de ces anticorps polyclonaux ciblant B et D permettra de capturer et purifier ces deux protéines dans des lysas bactériens issus de différentes souches cliniques. Chaque souche ayant des particularités différentes de virulence de résistance aux antibiotiques ou de « culture » (planctonique ou en biofilm) nous effectuerons une cartographie des modifications post-traductionnelles de chaque protéine en corrélation avec son activité clinique. Le but final étant de cibler la ou les modifications pour développer un anticorps thérapeutique ou une stratégie antibactérienne sans utilisation d’antibiotique.

Procédures

4 à 6 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (5 minutes chacun)et 4 à 7 injections transdermiques (5minutes chacune). Une anesthésie générale de 15 minutes puis une ponction fémorale de 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’utilisation de l’adjuvent de Freund peut induire des douleurs articulaires et provoque une forte inflammation au niveau des points d’injection. La réaction immunitaire peut aussi induire une hausse de la température.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Des méthode de production d'anticorps recombinant existent mais ils ne permettent en aucun cas d'obtenir une polyclonalité aussi élevé que chez l'animal. Un système immunitaire mature et actif est indispensable pour la production de cet outil biologique fondamental dans nos travaux de recherche

Réduction

Nous avons utilisé les données de la littérature pour calculer de façon théorique les capacités moyennes de production d'anticorps pour chaque lapin. Nous avons donc pu déterminer que 2 lapins par protéine seraient nécessaires pour obtenir la quantité d'anticorps indispensable à nos études. Pour chaque protéine cible, deux lapins seront immunisés avec 15 jours de décalage ceci permettra d’évaluer la toxicité intrinsèque de la protéine recombinante et de ne pas immuniser le second lapin si la protéine était mal supportée par le premier lapin.

Raffinement

Afin de diminuer au maximum toute douleur articulaire et toute douleur due à l’inflammation des sites d’injection, les animaux recevront un patch transcutané de d'analgésique. Ce patch sera changé toutes les 72 heures. Le suivi sérologique de l’immunisation nous permettra de limiter au strict minimum les rappels d’immunisation et de mettre fin à la procédure au plus vite. L’observation des animaux au quotidien basée sur le score grimace scale permet d’établir un point limite précoce qui mettrait fin immédiatement à la procédure. Afin de limiter au maximum le stress des animaux pendant les manipulations, ils seront légèrement anesthésiés au masque.

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. Sa taille moyenne permet d’obtenir une bonne quantité de sérum riche en anticorps tout en utilisant peu de protéine pour l’immunisation. La longueur des CDRs des IgG de lapin leur confère une excellente affinité, de plus ces IgG sont facilement purifiable. Les animaux seront des jeunes adultes de 1,5 à 2 kg (30 à 45 jours) car ils possèdent un taux maximum d’anticorps circulant et un système immunitaire mature.

100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leur microbiote intestinal est d'abord éliminé par quatre gavages d'une solution purgative à vingt minutes d'intervalle, ce qui provoque des diarrhées, puis remplacé par un microbiote humain administré en trois gavages espacés de trois jours, avant des injections d'anticancéreux et d'antibiotique dans l'abdomen. Elles passent huit jours isolées, cage par cage, pour éviter que les bactéries ne circulent entre elles. Le porteur écrit qu'un placement auprès d'une association de protection animale ne semble pas approprié vu l'état de santé de l'animal, et que le recours aux souris est "indispensable" faute de méthode reproduisant un microbiote humain in vitro.

Objectifs

Le traitement des cancers solides consiste fréquemment en l’utilisation de médicaments cytotoxiques (chimiothérapies) lesquels ciblent l’ADN des cellules cancéreuses, dont la prolifération est rapide. Les très nombreuses bactéries du microbiote digestif du patient sont des cellules à prolifération rapide et il a récemment été montré qu’elles sont aussi la cible des médicaments cytotoxiques. L’altération de l’ADN bactérien par les molécules antimitotiques strese les bactéries et favorise l’émergence de mutants in vitro. Dans le tube digestif des patients traités par anticancéreux, ces mutants résistants pourraient être ensuite sélectionnés par un traitement antibiotique (très fréquemment prescrite en traitement des complications infectieuses en cours de chimiothérapie), et ainsi augmenter le risque d'infections nosocomiales à bactéries résistantes aux antibiotiques, plus difficiles à traiter. Les résultats obtenus jusqu’à présent résultaient d’expérimentations in vitro, qui confrontaient une molécule anticancéreuse à une seule espèce bactérienne, ne tenant compte ni de la composition en nutriments du système digestif, ni de la complexité du microbiote digestif. Il est en effet établi que la communauté bactérienne digestive (composée d’environ 500 espèces) protège de la colonisation par les bactéries résistantes en raison de compétition pour les nutriments chez des individus sains. Dans ce projet, nous souhaitons de manière inédite mesurer l’influence d’un traitement par des molécules anticancéreuses connues pour stresser les bactéries sur l’émergence de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques dans le microbiote digestif d’un modèle murin de microbiote humanisé par greffe fécale. Nous souhaitons ainsi démontrer que les traitements anticancéreux favorisent l'apparition de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques (objectif principal). Nous explorerons aussi les mécanismes sous-jacents à cette émergence, en mesurant les modifications de la composition et des fonctions biologiques des microbiotes soumis à des doses thérapeutiques d’anticancéreux (objectif secondaire).

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le modèle murin et combinées à celles d’une étude clinique qui sera réalisée en parallèle, permettront de générer de nouvelles hypothèses d’optimisation des stratégies thérapeutiques des cancers chez l’Homme.

Procédures

Tous les animaux auront les interventions suivantes : gavage (4 fois avec une solution purgative à 20 min d’intervalle, 3 gavages de greffon, à 3 jours d’intervalle, durée de gavage < 1 min) ; injections intra-péritonéales (1 fois l’anticancéreux/sérum physiologique, 3 fois l’antibiotique, durée d’injection < 10 s).

Impact sur les animaux

Des nuisances d'intensités légères dues aux injections intra-péritonéales des chimiothérapies/sérum physiologique et de l’antibiotique ainsi que des douleurs au niveau des points d’injection peuvent être attendues. Par ailleurs, même si l’expérience montre que l’injection de molécules anticancéreuses est bien tolérée par les souris, des effets indésirables liés à l’administration d’agents cytotoxiques ne peuvent pas être exclus (nuisances modérées). Le mode d’élimination du microbiote naturel de la souris par une solution purgative (préalable à l’installation du microbiote humain) risque de causer des diarrhées ainsi qu’un inconfort de courte durée (< 30 min) et le gavage oro-gastrique peut induire du stress responsable d’une augmentation de la morbidité et mortalité des souris (évèvements rares, nuisances modérées). Les implantations de microbiote humain ne présentent a priori aucune implication pathologique pour les animaux. En effet, l'introduction d'un microbiote particulier n'induira pas le développement de maladies. Cependant les souris seront étroitement surveillées par un vétérinaire en cas de survenue de diarrhées (nuisance modérée).

Devenir

Les animaux seront mis à mort car il ne sera pas possible de réutiliser ces animaux pour une autre expérimentation en raison de l’administration d’anticancéreux notamment. Un placement de l’animal auprès d’une association de protection animale ne semble pas non plus appropriée en raison de l’état de santé de l’animal qui ne peut être garanti à l’issue de l’expérimentation.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable un microbiote intestinal humain in vitro d’autant plus qu’une partie du microbiote est constitué de bactéries viables mais non cultivables. Les modèles les plus fiables requièrent l’humanisation, partielle et temporaire, du microbiote d’animaux. Actuellement, il est impossible de ne pas recourir à des modèles animaux. Le recours aux souris est donc indispensable pour ce projet qui utilisera le minimum de souris nécessaire en respectant le plus possible le bien-être animal.

Réduction

Cette étude comportera des petits groupes animaux (n=10) pour pouvoir faire des tests statistiques validant les résultats. Un support en biostatistique est apporté par un expert de la spécialité, afin d’optimiser les méthodes expérimentales. L’utilisation de 10 souris par lot permet de lisser les variations interindividuelles. Les souris utilisées pour l’étude pilote des points limites pourront entrer dans les statistiques finales, réduisant ainsi le nombre de souris par lot dans l’étude principale.

Raffinement

L'hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignées de souris. La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), et maintien des animaux en groupes de 5 afin d’éviter le stress de l’isolement jusqu’à l’administration des antibiotiques (J8). Ensuite les souris devront impérativement être hébergées individuellement pour éviter les contaminations croisées par les bactéries du microbiote digestif (objet de l’étude). Nous limiterons l’hébergement individuel à 8 jours (entre J6 et J14) pour réduire l’inconfort des souris. Pendant cette période, les animaux garderont un contact visuel et olfatif avec leurs congénères et l’enrichissement dans leur cage sera augmenté et varié. Les conditions d’hébergement seront optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), En rapprochant les cages au maximum, nous nous assurerons que les animaux puissent communiquer. Les Souris pourront voir leurs congénères (cages transparentes) et les sentir (pas de couvercle filtrants). L’enrichissement sera renforcé (tubes en Plexiglas, billes de bois à ronger). La durée maximale de leur vie solitaire sera de 8 jours (J6 à J14). Une surveillance attentive est assurée quotidiennement, y compris les week-ends et les jours fériés. Une intervention immédiate et appropriée sera entreprise dès l'apparition de tout signe de détresse selon les scores des points limites fixes dans la procedure.

Choix des espèces

En plus des avantages pratiques liés à l’élevage ainsi qu’à l’expérimentation sur ce modèle animal parmi toutes les possibilités qu’offre l’expérimentation animale, la Souris est celui le plus utilisé dans les études sur le microbiote intestinal en général et plus particulièrement sur la greffe de microbiote fécal. En utilisant des souris, nous pouvons bénéficier des retours d’expérience d’autres équipes et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés pour la mise au point des protocoles. De plus, les résultats obtenus pourront être comparés aux études précédentes et permettre une analyse plus fine. Le protocole que nous allons suivre utilise des souris adultes de 8 semaines. Nous n’avons pas de raison de modifier ce paramètre dans notre étude.

Chacun des 8 singes verts d'Afrique utilisés subit environ quinze anesthésies, quinze prélèvements de sang, quatre ponctions de moelle osseuse et sept retraits chirurgicaux de ganglions lymphatiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont d'abord infectés par le virus de l'immunodéficience simienne, l'espèce étant choisie parce qu'elle héberge naturellement ce virus sans développer le sida. Le porteur annonce comme effets possibles une perte de poids, des diarrhées, une baisse sévère des lymphocytes, des lésions cutanées, une anémie transitoire, des hématomes, et un stress lié à l'hébergement individuel des animaux qui présentent des symptômes. Tous seront tués en fin de projet pour accéder à l'ensemble de leurs organes lymphoïdes, les tissus prélevés étant ensuite "mis à disposition pour d'autres études".

Objectifs

Actuellement, il n'existe ni vaccin, ni traitement curatif contre le VIH. Pour avancer dans ce domaine, nous utilisons le singe vert africain (AGM) comme modèle. Ces singes, hôtes naturels d’un virus proche du VIH appelé SIV (virus de l'immunodéficience simien) ne développent pas le SIDA malgré une charge virale élevée. Cette résistance remarquable est due à leur capacité à éviter l’activation immunitaire chronique et à contrôler efficacement le virus dans les ganglions lymphatiques, des organes clés du système immunitaire. Un acteur essentiel de cette défense est un type de cellules immunitaires appelées cellules NK (Natural Killer pour tueuses naturelles), capables de reconnaître et de détruire rapidement les cellules infectées. Ces cellules jouent un rôle déterminant dans le contrôle du virus au tout début de l’infection. Nous pensons qu’une sous-population spéciale de cellules NK, dites adaptatives, acquiert directement cette capacité dans les ganglions lymphatiques. Nos recherches visent à comprendre comment ces cellules NK adaptatives se développent et agissent. Nous cherchons à : 1. Identifier les mécanismes qui rendent ces cellules si efficaces. 2. Étudier l’environnement des ganglions avant et après l’infection pour découvrir les signaux qui les activent. 3. Tester leur capacité antivirale en laboratoire. Ces recherches pourraient offrir de nouvelles pistes pour le développement de traitements contre le VIH.

Bénéfices attendus

Cette étude sur les singes verts africains vise à mieux comprendre comment certaines cellules immunitaires, appelées cellules NK adaptatives, parviennent à contrôler l'infection par le virus SIV, un équivalent du VIH chez ces animaux. En combinant des expériences en laboratoire et des observations directes sur les singes, nous cherchons à découvrir comment ces cellules se développent et comment elles parviennent à supprimer l'infection. Pour cela, nous utilisons des techniques de pointe, comme la cytométrie de flux et le séquençage de l'ARN à l'échelle d'une seule cellule, afin d'analyser en détail les cellules NK durant l'infection. Ces méthodes nous fourniront des informations précieuses sur la diversité et le rôle de ces cellules chez les singes verts, qui ne développent pas de maladie malgré la présence du virus. L'objectif à long terme est d'identifier les facteurs qui rendent ces cellules NK particulièrement efficaces chez le singe vert pour éliminer les cellules infectées. Ces découvertes pourraient aider à développer de nouvelles stratégies de traitement pour le VIH chez l'humain, en ciblant les réservoirs du virus dans le corps et en contribuant à une rémission durable de l'infection.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus SIV (une fois, 5 min, tous les animaux) - Anesthésie des animaux (15 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) - Prélèvements de sang (15 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait chirurgical de ganglions lymphatiques périphériques (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection (peu attendu car les AGM sont les hôtes naturels du virus) : Perte de poids, diarrhée, baisse sévère des lymphocytes, observation de nodules à la palpation, lésions cutanées Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entraîner un stress. Nuisances possibles suite à l’exérèse de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin d’avoir accès à tous les organes lymphoïdes primaires et secondaires où l’activité des NK pourrait être essentielle au contrôle du virus

Remplacement

Les expériences uniquement in vitro ne peuvent pas refléter le comportement de la cellule dans son contexte physiologique, ni mimer les conditions de fonctionnement d’un organisme entier. C’est pourquoi les études in vivo sont nécessaires. Le primate est, pour toutes ses proximités avec l’humain, le plus adapté aux études physiopathologiques. Par ailleurs, pour le SIDA, il n’existe pas d’autre modèle animal que le primate non humain. Par opposition aux études menées chez l’humain infecté par le VIH, l’utilisation des modèles primates où l’infection est non-pathogène nous permet d'analyser et de comprendre, en absence de traitement les réponses cellulaires efficaces dans différents tissus en plus du sang, notamment les ganglions lymphatiques, l’intestin et la rate qui jouent un rôle essentiel dans l’infection SIV/VIH. L’analyse des interactions hôte/virus chez l’hôte naturel nous permet d’identifier les facteurs d’hôte qui pourraient aboutir à l’élimination des réservoirs viraux (et qui ne sont pas atteints par les traitements antirétroviraux actuels).

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude sont réalisées en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique . Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (monkey dough, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Les animaux sains seront hébergés en groupe; les animaux chroniquement infectés seront hébergés en groupe sauf en cas de symptômes ou avis contraire des vétérinaires de l’installation: dans ce cas, ils seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté. Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Les singes d'Afrique, comme le singe vert possèdent une protection naturelle unique contre le SIDA. Ces singes sont les porteurs naturels des virus de l'immunodéficience simiens (SIV), qui ont donné naissance au VIH chez l'humain. Ils ne développent jamais la maladie malgré la présence du virus en grandes quantités dans le sang. Cela fait d'eux un modèle précieux pour étudier comment le système immunitaire peut se défendre efficacement contre le SIDA. Les recherches se concentrent sur les singes adultes, car leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de protection. En étudiant ces animaux, les scientifiques espèrent découvrir des pistes pour renforcer la réponse immunitaire contre le VIH chez l'humain.

Anesthésiés une heure trente, cathétérisés dans une veine et une artère, équipés d'un bouton fixé à travers la peau, 20 rats sont ensuite perfusés en continu pendant trente heures, seuls dans leur cage. Neuf prélèvements sanguins de 250 microlitres sont effectués pendant cette perfusion, sur animal éveillé. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, l'isolement de trente heures étant lui-même compté par le porteur comme facteur de stress. Le projet cherche à reproduire chez le rat sain des concentrations d'antibiotiques comparables à celles obtenues chez l'humain, étape présentée comme intermédiaire avant une étude d'efficacité. Tous les rats sont tués à la fin, pour vérifier post-mortem l'état du système de perfusion.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est un problème de santé majeur. Bien que de nouvelles options de traitement pour les infections graves causées par des bactéries résistantes aient émergé récemment, les résistances continuent d’apparaître. Il est donc essentiel d’étudier de nouvelles combinaisons d’antibiotiques et d’optimiser les traitements pour mieux combattre ces infections. Ce projet vise à tester une combinaison prometteuse d’antibiotiques, identifiée pour son efficacité contre des bactéries résistantes en laboratoire. Avant d’envisager des essais chez l’homme, il est nécessaire de vérifier son efficacité chez l’animal infecté. Une première étude a permis de développer un modèle d’infection rénale fiable chez le rat. Cette nouvelle phase se concentre sur la mise en place des meilleures modalités d’administration de ces antibiotiques. Traditionnellement, les études sont menées sur des souris avec des doses souvent supérieures à celles utilisées chez l’homme, ce qui limite leur pertinence. Ce projet cherche donc à créer un modèle plus réaliste chez le rat, où les concentrations d’antibiotiques ressemblent à celles obtenues chez l’homme. Pour cela, les rats reçoivent une perfusion continue d’antibiotiques à des débits ajustés, afin de compenser l’élimination plus rapide des médicaments chez eux par rapport aux humains. Ce modèle pourrait rendre les études sur l’efficacité des traitements plus proches de la réalité clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pilote permettra d'evaluer les conditions de perfusion continue (débits, durée de perfusion à un débit donné) chez l'animal sain afin de mettre en place une étude de pharmacocinétique humanisée chez le petit animal. Ce projet est une étape intermédiaire nécessaire intervenant dans une étude pharmacocinétique -pharmacodynamique in vivo évaluant de nouveaux schémas posologiques de la combinaison d’antibiotiques qui pourront être, par la suite testés en clinique, afin d’améliorer la prise en charge d' infections sévères chez les patients.

Procédures

Tous les animaux recevront 3 injections sous cutanée d'analgésique et une injection sous cutanée d'anesthésique local . Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale pendant 60 à 90 minutes pour l'implantation de cathéters veineux et artériel et pour la pose d'un bouton transcutané permettant de connecter les cathéters de prélèvements . Les animaux vigiles seront perfusés en continue d'une solution d'antibiotique pendant 30h . Au cours de la perfusion, 9 prélèvements de 250µL de sang sur 30 secondes seront réalisés sur l'animal vigile et libre de ses mouvements .

Impact sur les animaux

- Chirurgie : inconfort transitoire au réveil - Implantation de cathéters intraveineux et artériel à demeure : gêne légère pendant la durée de la perfusion intraveineuse et pendant les prélèvements - une légère perte de poids inférieure à 5 pour cent attendue au lendemain de la chirugie. - Douleur minimisée par traitement antalgique pendant et après la chirurgie et pendant toute la durée de l'étude pharmacocinétique - Isolement de l'animal pendant 30h qui engendre un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort pour évaluation post-mortem du système de perfusion.

Remplacement

Des résultats préliminaires in vitro ont montré l’efficacité de la combinaison d’antibiotiques étudiée à des schémas posologiques innovants. A notre connaissance, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet aujourd'hui de reproduire ce type d'outils d'évaluation des médicaments incluant la variabilité pharmacocinétique mais aussi dans la réponse aux traitements que l'on va observer avec ce modèle in vivo à terme.

Réduction

Ce projet in vivo a nécessité au préalable de réaliser des simulations nous permettant de déterminer de manière fiable des débits de perfusion ainsi que les durées de perfusions visant à reproduire de manière la plus exacte possible les concentrations humaines chez le rat. En effet, l'élimination des médicaments est plus rapide chez les rats que chez les humains. Des perfusions continues successives à des débits de perfusion variables d'antibiotiques doivent être réalisées afin de compenser cette perte. Ces simulations sont basées sur des données pharmacocinétiques chez le rat et chez l'homme de ces antibiotiques retrouvés dans la littérature, ce qui fait que une idée très précise des débits est connue pour être au plus près des concentrations attendues. A ce titre, le nombre de rats utilisés pour chaque lot (6 au total, dont 3 males et 3 femelles) est le nombre minimal d'animaux permettant de décrire de manière fiable la pharmacocinétique humanisée de chacun des antibiotiques en monothérapie et de leur combinaison en tenant compte d'une éventuelle variablité intersexe qui pourrait être observée, sachant qu'au vu de la pharmacocinétique et notamment de l'élimination exlcusivement rénale de ces médicaments, aucune influence du sexe n'est attendue dans les résultats. Deux animaux supplémentaires ont été ajoutés pour prévenir les éventuels problèmes techniques comme un cathéter qui se bouche, ne permettant pas de réaliser l'expérimentation.

Raffinement

Les rats sont élevés dans des cages standards sur portoir ventilé avec enrichissement (tunnels pour se cacher et des batonnets à ronger) limités à 2 animaux par cage jusqu’à l’étape de la chirurgie. La souffrance des animaux sera évitée ou réduite au maximum. Les techniques chirurgicales seront réalisées sous conditions aseptiques et thermorégulées sous anesthésie générale avec analgésie opératoire et postopératoire. Cette couverture antalgique sera maintenue en continu sur toute la durée du projet. Une grille de suivi du bien-être animal est mise en place pour suivre les animaux tout au long du projet. Des points limites strictes et bien identifiés ont été établis. Le système de perfusion utilisé au cours de cette procédure est un système commercial, validé, sécurisé er robuste permettant à l’animal de se mouvoir librement dans sa cage-bol avec accès à l’eau et nourriture. Il permet une perfusion continue et la réalisation de prélèvements sanguins sans toucher l’animal, réduisant ainsi son stress.

Choix des espèces

La lignée "Sprague-Dawley" est une lignée de rats non-consanguins permettant d’obtenir une variabilité génétique inter-individuelle qui permet de se rapprocher de la variabilité inter-individuelle présente lors d'études cliniques. Cette lignée, qui n'est pas une lignée génétiquement modifiée, est la plus utilisée dans le domaine biomédical et sera donc utilisé dans le cadre de ce projet.

Les souris de ce projet ont un système immunitaire partiellement déficient, ce qui permet de leur greffer des cellules cancéreuses humaines sans rejet et les rend plus vulnérables aux infections. 600 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tumeurs et des organes. La tumeur est implantée sous la peau du dos ou dans la glande mammaire, puis chaque souris reçoit trois traitements par semaine, par injection ou par gavage, pendant quatre à six semaines, avec une ponction sanguine hebdomadaire à la veine de la joue sans anesthésie. La croissance de la tumeur peut s'accompagner de prostration, de poil hérissé et d'ulcération, et c'est l'atteinte d'un score limite sur la grille d'évaluation qui déclenche la mise à mort.

Objectifs

Malgré les avancées thérapeutiques majeures de ces 10 dernières années, avec notamment la génération d'anticorps permettant de cibler la tumeur ou de restaurer les fonctions immunitaires anti-tumorales, le pronostic de certains cancers reste sombre voire incertain. C'est le cas pour certains cancers de la peau et du sein. Ce mauvais pronostic résulte essentiellement de la survenue de résistances ou de rechute en cours de traitement ou après traitement, ce qui rend nécessaire la génération de nouveaux agents thérapeutiques ou l'amélioration des thérapies existantes. Dans cette optique, nous avons identifié de nouvelles molécules soit exprimées spécifiquement à la surface des cellules tumorales soit sécrétées par la tumeur et capables d’inhiber le système immunitaire. Les anticorps reconnaissant ces molécules sont d'ores et déjà disponibles au laboratoire et ont montré une efficacité anti-tumorale dans des modèles cellulaires au laboratoire (in vitro). Le projet vise à valider dans un organisme vivant (in vivo) l’efficacité anti-tumorale de ces anticorps, utilisés seuls ou en combinaison avec des thérapies existantes, dans des modèles murins de cancers cutanés ou mammaires bien établis et largement utilisés par la communauté scientifique. La réalisation de ce projet devrait permettre de déterminer si un gain thérapeutique pourrait découler de l’utilisation des anticorps testés en combinaison avec des thérapies ciblées ou des immunothérapies actuellement utilisées pour le traitement des patients.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet doit permettre de valider les résultats obtenus sur des modèles cellulaires in vitro, à savoir la génération d'une réponse immunitaire anti-tumorale efficace en présence des anticorps testés. Les expériences envisagées établiront si l'utilisation d'anticorps thérapeutiques dirigés contre des marqueurs spécifiques des cellules cancéreuses que nous avons identifiés est en mesure de promouvoir une élimination tumorale et/ou de renforcer l'action d'agents thérapeutiques utilisés en clinique (thérapies ciblées et immunothérapies). La validation du mode d'action de ces anticorps dans un modèle murin devrait conduire au développement d'anticorps injectables chez l'Homme et à la conduite d'essais cliniques pour évaluation de leur efficacité anti-tumorale en conditions pathologiques réelles. En cas de résultats probants, ces anticorps représenteraient une nouvelle alternative (ou un complément) thérapeutique pour le traitement des cancers cutanés et mammaires étudiés, cancers pour lesquels les traitements actuels restent peu ou partiellement efficaces

Procédures

Afin de mettre en place le modèle expérimental, les souris seront soumises à une greffe des cellules tumorales en sous-cutanée (sous la peau du dos, sous anesthésie; durée 3 minutes) ou au niveau de la glande mammaire (sous anesthésie; durée: 3 min). Les essais thérapeutiques seront administrés aux animaux non anesthésiés par injection et/ou gavage (3 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines; durée du geste: 1 min). Le suivi de l'effet thérapeutique sera évalué par des mesures de la taille des tumeurs et un prélèvement sanguin au niveau de la veine de la joue (sans anesthésie; 1 fois par semaine pendant 4 à 8 semaines; durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront obtenues par une greffe sous-cutanée ou intra-mammaire de cellules tumorales. Du fait de la croissance de la tumeur, une perte de poids, , , une altération des fonctions physiologiques normales de l’animal ou de son activité (mobilité, nourrissage, toilettage) ou des signes de douleur (prostration, poil hérissé) pourraient apparaître. Les agents thérapeutiques seront administrés par injection et/ou gavage Elles sont par conséquent susceptibles d'induire stress et/ou agitation pendant la durée de manipulation et d''immobilisation de l'animal. Une ulcération/infection à l'emplacement de la tumeur ou du site d'injection pourrait survenir mais n'est que rarement observée. Enfin, du fait de leur système immunitaire partiellement déficient, les souris utilisées présentent une susceptibilité plus grande aux agents pathogènes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de protocole. Les tumeurs et les organes pourront être prélevés afin de faire des analyses post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative non animale car le but de ce projet est de tester l’activité anti-tumorale d'anticorps dont le mode d'action repose sur la présence de cellules immunitaires fonctionnelles en périphérie d’une tumeur en croissance. Il est par conséquent nécessaire d'utiliser un modèle animal permettant le suivi de la croissance tumorale mais aussi la mobilisation et l'activation des cellules immunes en présence d'anticorps. De plus, un aspect de notre étude requiert de reproduire le microenvironnement créé par la tumeur et impactant l'activité des cellules immunitaires (sécrétion de molécules immunosuppressives) afin de se rapprocher le plus possible du contexte pathologique rencontré chez les patients. Le modèle murin est le seul permettant de reproduire ces caractéristiques spatio-temporelles associées à la présence d’une tumeur solide et à son influence sur la réponse immunitaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé par groupe correspond au minimum nécessaire et suffisant pour valider la significativité des résultats sur le plan statistique pour un modèle tumoral. Il prend en compte la variabilité de la prise de greffe et de l'intensité de la réponse immunitaire entre individus au sein d'un même groupe. De plus seuls des anticorps ayant préalablement montré une efficacité dans des tests vitrosur des lignées cellulaires, au laboratoire, seront utilisés afin de limiter les risques de non réponse aux traitements. Un maximum de conditions sera réalisé au sein d’une même expérience afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. De même, les expériences visant à tester les combinaisons anticorps/thérapie ciblée ou immunothérapie ne seront entreprises que si des résultats probants auront été obtenus lors de l'utilisation de l'anticorps seul.

Raffinement

Du fait de leur immunodéficience partielle, les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et en portoir ventilé afin de limiter les contaminations avec des organismes pathogènes. Elles auront à disposition des outils de nidification ou d’occupation ainsi qu’eau et aliments à volonté. Dès la greffe tumorale et tout au long du traitement,, les souris seront suivies 3 fois par semaine par l’expérimentateur (mesure de la tumeur, pesée, observation du comportement des animaux et absence de signes douloureux). L'administration des traitements aura lieu 3 fois par semaine et sera précédée par une évaluation de l’état physique et du comportement de chaque animal selon une grille d’évaluation préétablie. Chaque animal se verra ainsi attribuer un score reflétant des dégradations, son inconfort ou tout signe de douleur. L’atteinte d’un score limite conduira à l'euthanasie de l’animal. En marge de la surveillance réalisée par l'expérimentateur, une surveillance quotidienne sera assurée par les animaliers. L’expérimentateur pourra intervenir dans la journée en cas de modification ou d'aggravation de l’état général de l’animal. En cas d'apparition de signe de douleur sans atteinte d'un score limite, la surveillance de l’animal sera augmentée à 2 fois par jour avec une mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage et l'injection d'un analgésique une fois par jour afin de soulager la douleur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de recherche sur le cancer et la réalisation d’expériences thérapeutiques. En effet, c’est un mammifère dont les mécanismes associés à la réponse anti-tumorale sont bien connus et décrits. Le modèle murin est aussi le modèle le plus adéquat pour l’étude du microenvironnement tumoral. Il permet d’avoir recours à des animaux partiellement immunodéficients pouvant développer des tumeurs humaines sans risque de rejet, et une réponse immunitaire médiée par des anticorps. De plus, le système immunitaire de la souris étant proche de celui de l’Homme, l’utilisation de ce modèle permet d’avoir une première preuve de concept pour l’utilisation de nouveaux agents thérapeutiques impactant positivement la réponse anti-tumorale en vue de leur développement clinique pour les patients. Enfin, la souris est un petit mammifère dont le comportement est bien connu ce qui permet une évaluation simple et efficace des modifications physiques et/ou comportementales symptomatiques de souffrance ou de mal-être pouvant être engendrées par la présence de la tumeur ou l’administration des traitements. Des souris adultes âgées de 5 à 6 semaines seront utilisées (âge standard pour l’établissement de modèles murins en oncologie).

Mesurer combien de nouveaux antibiotiques passent dans le liquide cérébro-spinal, en vue d'ouvrir la voie à un essai clinique : 848 souris femelles vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées pour analyser leur cerveau. Elles reçoivent dans le ventre un lipopolysaccharide destiné à mimer une inflammation infectieuse, puis un inhibiteur de transporteurs, puis l'antibiotique. Le crâne est rasé et la peau incisée sur un centimètre pour ponctionner cinq microlitres de liquide cérébro-spinal, avant un prélèvement de sang à la veine de la queue. Le porteur qualifie le recours aux souris d'"indispensable" et décrit un effectif calculé "au plus juste", qui comprend 10 % de souris supplémentaires prévues en cas de mortalité.

Objectifs

Les infections bactériennes au niveau cérébral sont des pathologies graves, avec un taux de mortalité élevé. Le traitement de ces infections repose sur un traitement antibiotique adapté. Cependant, en cas de résistance des bactéries, les options thérapeutiques peuvent être limitées. A l’heure actuelle, plusieurs molécules sont recommandées dans les infections cérébrales cependant ces antibiotiques peuvent présenter des effets indésirables sévères et générer des résistances bactériennes. De nouveaux antibiotiques, actifs sur les bactéries résistantes, possèdent de plus longues durées d'action et moins d'effets indésirables. Cependant, il n’existe pas de donnée à l’heure actuelle sur leur diffusion au niveau cérébral. L’inflammation, qui peut être présente en situation infectieuse a également une influence sur la diffusion au niveau cérébral. Il est donc primordial d’étudier la diffusion de ces molécules en conditions saine et inflammatoire. Ainsi, l’objectif de notre travail est d’étudier la diffusion dans le système cérébral de ces nouveaux antibiotiques dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

La possibilité d’usage de ces nouveaux antibiotiques pour lutter contre les infections cérébrales par des bactéries résistantes est un chalenge. Les données de diffusion de ces nouvelles molécules dans le système cérébral de la souris pourront ouvrir les portes à un essai clinique chez l’Homme.

Procédures

Nous administrerons aux souris, par voie intra-péritonéale en 10 à 15 secondes : des antibiotiques, du lipo-poly-saccharide (afin de mimer une inflammation liée à une infection), ainsi que des molécules inhibitrices des transporteurs de médicaments afin d’explorer les mécanismes de passage des antibiotiques au niveau cérébral. Nous réaliserons des prélèvements de sang (200µl) et de Liquide Cérébro-Spinal (5µl) sur ces animaux. Un seul prélèvement de chaque liquide biologique sera réalisé par animal. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal, le liquide cérébro-spinal puis le sang seront prélevés. Pour prélever le liquide cérébro-spinal, le crâne de l'animal, placé sur un tapis chauffant (37°C), est rasé et la peau incisée sur 1cm après injection sur le site de prélèvement d'un anesthésiant 10 min avant l'intervention. Le prélèvement lui-même prend environ 5 min. Puis, le sang sera prélevé dans la veine caudale de l'animal. Pour se faire, l'animal aura au préalable reçu une injection d'antalgique 30min avant l'acte et ce afin de diminuer la douleur liée à ce prélèvement. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipo-poly-saccharide par voie injectable en 10 à 15 secondes. L’administration des antibiotiques aura lieu 30 minutes après l’administration de lipo-poly-saccahride et 2 heures après l'administration de la molécule inhibitrice.

Impact sur les animaux

Douleur légère lors de l’injection intraveineuse d’antibiotiques sans effet secondaire. Douleurs légères à modérées suivant l’administration intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés, afin de pouvoir réaliser l’étude histologique et pharmacocinétique au sein des tissus cibles (cerveau).

Remplacement

L'utilisation des animaux est indispensable en raison des nombreux mécanismes impliqués dans la diffusion du médicament. L'approche in vitro qui permet l'analyse de paramètres définis ne peut pas remplacer l'utilisation des animaux car elle ne prend pas en compte le devenir du médicament dans l'organisme ou des effets comme l'inflammation. Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système cérébral de cette espèce est assez proche de celle de l'Homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum. Le nombre de souris (n = 24) par groupe de traitement a été calculé pour avoir un nombre minimum de points de dosage des médicaments (8 points) permettant de réaliser une courbe des concentrations du traitement testé en fonction du temps, dans le plasma et dans le liquide cérébro spinal. Afin d'obtenir un résultat statistique cohérent, un minimum de 3 animaux par point de dosage est nécessaire. Des analyses statistiques des résultats sont réalisées. Le nombre de 848 souris nécessaires au total (8 groupes de traitement + 10% de souris supplémentaires en cas de mortalité) a été calculé au plus juste afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Les prélèvements du liquide cérébro spinal (5µl) et du sang (200µl) se font sous anesthésie. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal : le liquide cérébro spinal, puis le sang seront prélevés après injection d'un antalgique général 30 min avant le prélèvement sanguin à la veine caudale et d'une anesthésie locale par voie injectable 10min avant prélèvement du liquide cérébro spinal. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipopolysaccharide, et les souris recevront un traitement antidouleur par voie injectable 30 minutes avant l’injection du lipopolysaccharide. La douleur de l’animal sera suivie toutes les heures suivant l’administration du lipopolysaccharide. Réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse : les animaux sont hébergés à raison de 5 souris par cage de type 2L)). Ils seront expérimentés par du personnel formé et qualifié. Ils seront surveillés quotidiennement et auront en permanence accès à l'eau et à la nourriture. Durant les périodes d'expérimentation, ils seront anesthésiés sous isoflurane. Des points limites précis de douleur ressentie par les animaux (cf partie suivante) sont définis et les animaux seront euthanasiés si on ne peut soulager leur douleur. L'estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. SURVEILLANCES REALISEES: Une surveillance quotidienne du poids des animaux sera effectuée. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères prépondérant sont les suivants selon les critères de : - Perte de poids des animaux par rapport au poids initial>20%

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines). Le choix d’une souris adulte est nécessaire pour pouvoir étudier les concentrations des médicaments dans le sang et le liquide cérébro spinal.

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Les souris blanches sont retenues pour leur capacité à supporter des parasitémies de 50 à 60 % tout en affichant un tableau clinique facile à suivre. 114 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, infectées par une souche léthale de paludisme murin, avec un risque de mort que le porteur reconnaît en cas d'inefficacité du traitement. Chaque jour, elles reçoivent le candidat médicament par gavage ou par injection dans le ventre, sont maintenues contentionnées jusqu'à vingt minutes et subissent une piqûre à la queue pour un frottis, deux d'entre elles étant saignées à l'œil sous anesthésie. Toutes sont ensuite tuées après sédation, pour récupérer leurs organes et notamment le cerveau à l'état frais.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à confirmer ou non l'activité antipaludique d'un candidat dans un modèle de paludisme murin. Ce candidat antipaludique a déjà été testé sur des cultures cellulaires pour déterminer ses différentes caractéristiques biologiques. Il s'agit également de savoir si ce candidat antipaludique améliore l'activité d'un antipaludique déjà connu et servant de référence. La voie d'administration et la fréquence seront également testées afin d'analyser l'effet de la molécule sur la parasitémie. Ce projet est l'étape consécutive aux différents tests réalisés sans animaux tels que la sélection des composés les plus efficaces parmi les différentes molécules produites.

Bénéfices attendus

Le bénéfice espéré reste toujours le même : celui de trouver un nouveau candidat antipaludique ou une nouvelle famille chimique candidate à développer dans un contexte ou l'espèce pathogène responsable du paludisme développe de plus en plus vite des résistances au traitements actuels et devient également moins facile à détecter en raison de modifications génétiques, tout en se propageant dans des zones où il avait soit disparu soit n’existait pas.

Procédures

Les interventions de ce modèle sont les suivantes : l'infection des souris par l'injection au niveau du ventre d'une souche léthale de paludisme murin (1 fois, moins de 2 min). Le prélèvement de sang au niveau de l'oeil, sous anesthésie pour 2 souris (8 min en moyenne sous anesthésie un seul prélèvement). La manipulation et à la contention (inférieure à 20 min par souris par jour pendant 4 jours et 10 min par souris et par jour tous les jours à partir du 5ème jour), La prise de médicament sous contrainte (inférieur à 5 min, par souris par jour hors temps d'observation après la prise, pendant 4 jours), l'injection du médicament au niveau du ventre (3 minutes par souris par jour, pendant 4 jours). La piqure nécessaire à la réalisation de frottis une fois par jour au niveau de la veine de la queue (moins de 2 minutes, sur animal vigile, 1 fois par jour pendant 4 jours puis tous les 2 jours après les 4 jours de traitement). Les injections au niveau de la peau, ou de l'abdomen pour les analgésies et anesthésies et enfin la pesée sur balance (moins de 2 minutes, sur animal vigile, 1 fois par jour pendant 4 jours puis tous les 2 jours après les 4 jours de traitement)

Impact sur les animaux

Nous choisissons une combinaison entre la souris et le pathogène où l'infection se réalise à bas bruit et de façon continue. Les effets vont de la perte d’appétit entrainant une perte de poids et des phases de prostration transitoires. Les souris auront le dos rond et en fonction de la parasitémies l’apparition de poils hérissés. Les souris seront infectées par une souche léthale du paludisme murin, il y a donc un risque de mort en cas d'inefficacité du traitement. Il y a la réalisation de frottis par prélèvement d'une goutte de sang à la queue. Ce prélèvement n'est pas indolore mais équivaut au test de glycémie chez l'adulte diabétiques et il est réalisé sans contention pour la souris.

Devenir

Conformément à l'Annexe IV de l'Arrêté du 1er février 2013 les souris seront toutes euthanasiées après sédation afin de récupérer tous les organes et notamment le cerveau dans un état frais et correct pour les lots expérimentaux.

Remplacement

Cette procédure permet de poursuivre nos travaux à la suite des différentes expériences déjà réalisés in vitro. En absence de système complet permettant de reproduire l'infection et le métabolisme des médicaments nous nous tournons vers le modèle animal. Les Organes sur puces et Organoïdes ne sont pas encore complets concernant les maladies infectieuses de façon générale et plus précisément dans le cas du paludisme, où toutes les formes et étapes du cycle ne sont pas reproduites ou assurées.

Réduction

Notre projet utilise le nombre minimal mais significativement déterminant pour conclure sur l'efficacité ou non de notre candidat. Notre demande est en revanche complété par une démarche de publication où l'expérience doit être reproduite 3 fois (triplicate) dans un Journal repondant au standart des recommandations ARRIVE. Mâles et femelles sont utilisées dans cette étude mais le sexe est pris en compte comme facteur non bloquant et il n'est donc pas nécessaire d'augmenter les effectifs.

Raffinement

Il s'agit d'un test d'efficacité antipaludique in vivo où seule compte l'activité antipaludique du médicament. L'ensemble des mesures permettant de raffiner les différentes procédures expérimentales seront prises. La nourriture et l'eau seront disposées à volonté, de la nourriture hydratée mais aussi des tétines plus longues seront mises à disposition lors des phases de prostration précédemment définies. L'utilisation de coussin chauffé est préconisée dans notre unité permettant de chauffer non seulement la cage investiguée mais aussi l'ensemble de l'armoire ventilée. En cas de douleur chez les animaux des analgésiques et des soins particuliers permettant d’atténuer la douleur seront mis en place. Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Ils bénéficieront d’une période de repos de 5 jours après livraison dans l’animalerie de l’établissement utilisateur, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. Les médicaments anti-douleur seront utilisés afin de limiter l'inconfort des souris suivant les différentes procédures. Systématiquement, nous utiliserons un analgésique si les sites d’injection deviennent sensibles pour les souris. Les sites d'injection sont sensibles quand la souris montre une agitation même après avoir été saisie pour l'injection au niveau du ventre, la peau s'est épaissie (car la souris s'est grattée). Enfin les injections au niveau de l'abdomen et les prélèvements au niveau de l'œil seront atténués par l'ajout d'analgésique et d'anesthésiant.

Choix des espèces

Le modèle murin est choisi car il est un support idéal pour l'infection par le parasite murin du paludisme. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris blanches pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 50 à 60%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. La simplicité et l'efficacité du modèle en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique. Ce modèle existe depuis plus de 60 ans et il a permis la protection d'animaux sauvages, initialement capturés pour de la recherche antipaludique. Les souris blanches seront des animaux adultes âgés de 6 à 7 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 8 à 9 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond également à la maturité sexuelle (adulte) mais aussi à la maturité du système immunitaire.

120 macaques crabiers vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et pour 96 d'entre eux le protocole prévoit une quarantaine d'anesthésies par animal. S'y ajoutent, toujours par individu, une quarantaine de prises de sang, sept ponctions de moelle osseuse, neuf biopsies, vingt-huit écouvillonnages, douze lavages broncho-alvéolaires et l'implantation d'une puce de télémétrie. Infectés par la grippe une ou deux fois, ils sont isolés en cage individuelle jusqu'à huit semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress et d'ennui. 38 macaques sont tués pour le prélèvement de leurs organes, les 82 autres restent en vie afin d'être réutilisés dans d'autres projets.

Objectifs

La grippe est une maladie infectieuse et contagieuse causée par un virus influenza, affectant principalement le système respiratoire. La transmission interhumaine du virus se fait majoritairement par voie aéroportée par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration). Il existe 3 catégories de virus influenza infectant l’Homme : A, B et C. Les classes A et B du virus sont responsables des épidémies saisonnières. Les infections causées par un virus de la classe C induisent des symptômes plus faibles, s’apparentant à un rhume. Lors de la pandémie de 2009, le virus H1N1 a infecté entre 700 millions et 1,9 milliard d’individus dont environ 300 000 n’ont pas survécu. A ce jour, des traitements antiviraux administrés en prophylaxie ou en thérapeutique permettent de diminuer la sévérité des symptômes et la durée de la maladie. De plus, des campagnes de vaccination, fortement recommandée chez les personnes à risque, sont mises en place chaque année afin de limiter la propagation du virus et les formes graves de l’infection en réduisant les complications et leur incidence. En France, on estime sauver en moyenne 2 000 personnes âgées de 65 ans et plus par an grâce à la vaccination. Malgré l’application de traitements antiviraux et la vaccination, qui reste le moyen le plus efficace de se prémunir de la maladie, les épidémies saisonnières actuelles touchent encore 2 à 6 millions de personnes en France chaque année et sont responsables d’environ 10 000 décès. La constante évolution du virus rend, certaines années, l’efficacité de la vaccination insuffisante et nous oblige à ajuster la composition du vaccin en fonction des modifications génétiques identifiées. L’amélioration des vaccins, notamment en ciblant les parties conservées du virus, permettrait de cibler un spectre plus large de virus et de protéger contre les différents variants. Dans ce projet, nous prévoyons d’établir de nouveaux modèles de primates non humains d’infection pour tester de nouvelles stratégies vaccinales, .

Bénéfices attendus

Les nouveaux modèles d’infection qui auront été développés permettront d’avoir un modèle plus proche de l’infection humaine. Les candidats vaccins qui auront montré des résultats satisfaisants chez les modèles primates non-humains pourront à court terme être utilisés lors d’essai cliniques chez l’Homme. Ils pourront, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre la grippe saisonnière.

Procédures

Les différentes interventions prévues dans ce projet sont : - Anesthésie des animaux (20 fois environ (24 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Immunisation avec des candidats vaccins (3 fois environ, 5 minutes, 96 animaux) - Infection par le virus influenza (1 fois si naïfs ; 2 fois si convalescents, 15 minutes, 112 animaux) - Prélèvement de sang (20 fois environ (24 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 5 minutes) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois environ (24 animaux) ; 7 fois environ (96 animaux), 10 minutes) - Biopsie (5 fois environ (24 animaux) ; 9 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Ecouvillonnage mucosal (19 fois environ (24 animaux) ; 28 fois environ (96 animaux), 2 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (7 fois environ (24 animaux) ; 12 fois environ (96 animaux), 20 minutes) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, 120 animaux) - Imagerie in vivo (7 fois environ (24 animaux) ; 22 fois environ (96 animaux), 45 minutes) - Pléthysmographie (7 fois environ (24 animaux) ; 19 fois environ (96 animaux), 10 minutes) - Hébergement individuel (1 fois si naïfs ; 2 fois si convalescents, 8 semaines maximum, 112 animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux injections de vaccin (peu attendues) : Réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, (dysorexie) troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux vaccinés. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Trouble de l’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site de prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Certains animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt dans le but de réaliser des analyses d’histopathologie. L’accès à ces prélèvements permet d’analyser en profondeur l’impact de la vaccination ou de l’exposition sur les organes, ce qui ne serait pas possible en clinique. Les animaux qui seront gardés en vie pourront être réutilisés, sur avis vétérinaire, dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour reproduire la physiopathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par le virus influenza, notamment la réponse à l’infection et l’immunité induite par la vaccination et par l’infection dans un organisme entier, ce qui n’est pas réalisable avec les modèles ne recourant pas à l’animal de laboratoire (in vitro, in silico et ex vivo). Enfin, le primate non humain étant proche physiologiquement de l’Homme, son utilisation permet une transposition plus optimale des résultats, ce qui serait moins adapté avec une autre espèce animale.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Afin de sélectionner le meilleur modèle d’infection, des groupes de 2 individus seront utilisés. Afin de tester l’efficacité des candidats vaccins, le nombre d’animaux a été établi à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits effectifs. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche, les animaux utilisés dans les groupes non exposés permettant l’analyse métrologique du système d’inoculation, pourront être réutilisés dans les groupes exposés au pathogène. De même que les animaux convalescents pourront provenir des groupes déjà exposés dans le projet.

Raffinement

Les interventions et prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Un maximum de prélèvements et interventions seront regroupés afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation pourra être instaurée par l’apport de fruits secs, fruits frais additionnels, compléments nutritionnels Une grille de scoring a été mise au point pour évaluation de l’état de santé. Des points limites ont été définis afin de limiter l’angoisse et la souffrance. Si ces points limites sont atteints, un traitement symptomatique pourra être administré et une euthanasie sera envisagée. Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Une analgésie est systématiquement appliquée lors de la ponction de moelle osseuse. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de paramètres physiologiques peut induire une réaction au site d’incision (gonflement, suintement de la plaie). Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique est appliqué en peropératoire. Les animaux seront hébergés individuellement suite à l’exposition virale pour empêcher une surinfection liée à une contamination croisée, ce qui peut générer un stress ou de l’ennui. Le programme d’enrichissement pourra être étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. La durée de l’hébergement individuel, validée par la structure chargée du bien-être des animaux, pourra être réduite lorsque le virus ne sera plus détecté dans les fluides mucosaux. L’injection des vaccins pouvant entrainer une réaction locale (démangeaisons, douleurs) une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. Si la réaction locale est exacerbée (nécrose, suppuration) (pas attendu dans ce projet), l’euthanasie de l’animal sera envisagée. L’exposition au virus influenza peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. En cas d’apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé. En cas d’aggravation de l’état de santé des animaux (léthargie sévère, état moribond), l’euthanasie de l’animal sera envisagée.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus a été particulièrement choisi pour sa proximité phylogénétique de l’Homme, rendant la transposition des résultats plus optimale. En effet, les symptômes induits par l’infection influenza et les réponses immunitaires induites par la vaccination sont similaires à ceux qui sont observés chez l’Homme. Enfin, les outils permettant les analyses immunologiques sont développés et éprouvés. La grippe infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveaux nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum âgés de 2 ans. Enfin, les candidats vaccins pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques, donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.