Maladies infectieuses

Jusqu'à 40 ml de sang prélevés chaque mois sur animal conscient, ou une heure de contention sous des cages de moustiques qui se gorgent directement sur leurs oreilles, jusqu'à trois fois par semaine : 44 lapins vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur sang entretient des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques, et alimente les tests d'insecticides et de répulsifs menés en santé publique. Le porteur indique que la contention peut mettre les lapins en état de stress, avec yeux exorbités, râle et souffle court, et que des lésions aux oreilles apparaissent quand les tentatives de prélèvement échouent. Ceux qui atteignent quatre ans sont proposés à l'adoption, soit la moitié de l'effectif, les autres restant en vie pour la reconduction du même projet. L'espèce a été retenue notamment parce que les lapins cessent vite de réagir aux piqûres de moustiques, à la différence de l'être humain.

Objectifs

Nos travaux portent sur les insectes et arachnides responsables de la transmission de maladies infectieuses. De ce fait, nous avons des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques. Nous avons besoin d'avoir accès à une source de sang pour maintenir ces élevages car cela permet à ces animaux de produire leurs œufs ou de croître. De plus, les moustiques, phlébotomes et tiques sont également utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines. Ainsi, les prélèvements sanguins peuvent également servir pour infecter ces insectes et archnides avec des virus ou des parasites et ainsi simuler la transmission de maladies. Egalement, dans le cadre des évaluations d’insecticides et/ou répulsifs utilisés en santé publique, l'efficacité de ces produits peut être démontré parce qu’ils empêchent la piqûre ou permettent de contrôler la population de vecteurs. L’objectif global de ce projet est le gorgement des moustiques, pblébotomes, tiques : - à des fins de production - à des fins d’expérimentations

Bénéfices attendus

La reproduction des insectes et archnides effectuée en laboratoire permet de maintenir les souches et ainsi de les utiliser dans les différents projets. Les élevages sont utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines : 1. évaluation des insecticides utilisés en santé publique dans le cadre d’expertise ou de recherche. 2. évaluation de nouvelles formules d’insecticides pouvant donner lieu à des dépôts de brevets 3. recherche sur les maladies infectieuses transmises par ces insectes et arachnides 4. études sur le comportement de ces insectes et arachnides 5. autre objectif : fournir d'autres laboratoires et instituts pour des expérimentations et/ou des modules d'enseignement. Ces axes de recherche sont des voies importantes pour mettre en œuvre des moyens de protection efficaces contre les maladies transmissibles via ces insectes et archnides, tel le paludisme, transmis par les moustiques, qui fait chaque année de 1 à 3 millions de morts.

Procédures

Un prélèvement sanguin régulier sur animal conscient sera effectué sur une partie des lapins. Ils seront prélevés entre 1 à 2 fois par mois selon les demandes. Généralement, les lapins seront prélèvés mensuellement de maximum 40 ml de sang puis mis en repos pour 4 semaines. La durée du prélèvement en lui-même est d’une dizaine de minutes. L’autre partie des lapins sera mis régulièrement en contention pendant 60 min maximum afin que les moustiques (disposés en cages) puissent se gorger directement sur les oreilles des lapins. La fréquence sera entre 0 et 1 fois/semaine pour les gorgements simples (annuel) et entre 1 à 3 fois/semaine pour les gorgements liés aux évaluations insecticides utilisés en santé publique (entre 3 à 6 mois d’évaluation/an maximum). Il n’y a pas de gorgement direct pour les phlébotomes et tiques.

Impact sur les animaux

Pour les procédures de gorgement direct sur lapin, celui-ci peut être en situation de stress (yeux exorbités, râle, souffle court…). De plus, la piqûre par des moustiques en direct représente également une nuisance, même sans effet visible d’inflammation ou de grattage. Les lapins prélevés, quant à eux, peuvent présenter des lésions au niveau des oreilles si les tentatives de prélèvements sont infructueuses.

Devenir

les animaux ayant atteint environ 4 ans seront mis à la retraite et proposés à l’adoption soit la moitié de l'effectif prévu. Les animaux ayant moins de 4 ans seront maintenue en vie en vue d'un nouveau dépôt du même projet scientifique (utilisation continue).

Remplacement

Les élevages de moustiques, phlébotomes et tiques nécessitent du sang pour produire des œufs ou leur croissance. À ce jour, il n’existe pas d’alternative totalement sans sang ou utilisant un sang artificiel, bien que des projets soient en cours pour explorer d’autres options, notamment pour les moustiques. Gorgement sur lapin : Les signaux émis par un animal permettent de reproduire les conditions naturelles et d’assurer un gorgement efficace. Les systèmes de gorgement artificiel (sang prélevé) ne conviennent pas toujours, notamment pour des études comportementales ou des tests de répulsifs/insecticides, car ils ne reproduisent pas tous les facteurs naturels nécessaires (comme le CO₂ ou l’acide lactique). Gorgement artificiel : Le sang acheté auprès de fournisseurs externes comporte un faible risque de contamination par des pathogènes ou des molécules (médicaments, vermifuges), ce qui peut nuire aux élevages. En revanche, le sang prélevé sur des lapins dans l’animalerie est contrôlé, exempt de pathogènes et sécurisé. Lors de traitements, les lapins concernés sont temporairement exclus. De plus, le sang prélevé destiné aux infections expérimentales doit être prélevé dans les 24 heures avant l’expérimentation.

Réduction

Pour les gorgements direct de moustiques avec lapin en contention, nous avons optimisé l'utilisation des lapins en limitant à deux lots de trois lapins, chaque lot utilisé une seule fois par semaine (lundi et vendredi). Nous n'utilisons qu'un lapin par insectarium (souches sensibles et résistantes), soit deux lapins, avec un troisième en réserve en cas d'agitation. Cela minimise le nombre de lapins. Nous avons également adopté des pratiques pour réduire le nombre de prélèvements. Pour les moustiques sains, le sang est réutilisé une seconde fois, diminuant les prélèvements. Bien que cela ne soit pas applicable aux repas infectieux, cela réduit la fréquence d’utilisation des lapins. Nous privilégions le gorgement artificiel sur membrane lorsque possible, réduisant ainsi le besoin de lapins en contention chaque semaine. Nous jugeons que le stress hebdomadaire de la contention est plus important que celui d’un prélèvement mensuel, d’où notre effort de réduction. Trois lapins par semaine suffisent pour obtenir 120 ml de sang, avec un roulement de 12 lapins pour leur repos et un lapin en cas de prélèvement infructueux, soit un lot total de 13 lapins. Pour l’évaluation des insecticides sur moustiques, trois lapins sont utilisés par lot : un pour les moustiques témoins, un pour les moustiques traités, et un troisième en réserve. Chaque lapin peut être utilisé une à trois fois par semaine, réduisant ainsi la nécessité d'en introduire de nouveaux. De plus, après deux jours, la majorité des résidus absorbés est excrétée, permettant de réutiliser les mêmes lapins sans risque de contamination. Enfin, l'expérience montre que les lapins peuvent être utilisés pour les prélèvements et les piqûres de moustiques jusqu'à un âge avancé (mais nous procéderons à une mise à la retraite aux alentours des 4 ans). Cela prolonge leur utilisation et évite le renouvellement fréquent des lots, participant ainsi à la réduction globale du nombre de lapins utilisés pour nos élevages et études.

Raffinement

Cliquez ou appuyez ici pour entrer du texte. Bien-être des lapines en animalerie : Des enrichissements comme des rondins de bois et blocs de sel (moins appréciés) ont été introduits pour permettre aux lapines de jouer ou ronger. Deux parcs ont été installés, offrant à chaque lapine une sortie hebdomadaire d'une demi-journée en rotation. Les lapines, hébergées par deux, sont regroupées dès leur arrivée, mais en cas d’agressivité, elles sont logées individuellement tout en pouvant se voir et se sentir à travers des parois en plexiglas. Dans ce cas, des enrichissements variés et des sorties fréquentes au parc favorisent leur sociabilisation. Gorgement direct : Les lapines destinées au gorgement direct sont installées dans une pièce calme, éloignée des bruits et du passage du personnel. Des panneaux signalent leur présence pour limiter les perturbations. Les gorgements se déroulent dans une pièce sombre afin de maintenir leur calme, et des friandises leur sont offertes après la contention. Prélèvements sanguins : Les prélèvements se font sur des animaux conscients, évitant l'anesthésie générale. Un délai de récupération de 2 à 4 semaines est respecté entre chaque prélèvement, selon la quantité de sang prélevée. Une crème anesthésiante (lidocaïne) est appliquée sur leurs oreilles 15 à 30 minutes avant le prélèvement. Après l’intervention, les oreilles sont nettoyées avec un antiseptique, puis une crème cicatrisante est appliquée avant de replacer les lapins dans leur hébergement. Retraite et adoption : Une mesure de raffinement envisagée est de fixer une mise à la retraite des lapines à l’âge de 4 ans, avec une proposition pour leur adoption

Choix des espèces

Cette espèce a été choisie pour sa taille et facilité de manipulation. Les lapins sont suffisamment gros pour supporter la prise de sang par les femelles moustiques contrairement aux petits rongeurs et sont plus faciles à manipuler et élever que des gros mammifères. De plus, ils permettent des prélèvements sanguins d'un volume plus important par rapport aux rongeurs. Leur facilité de mise en contention évite également le recours à l'anesthésie. Il est également à noter que les lapins ne présentent rapidement plus de réaction inflammatoire suite aux piqûres de moustiques (désensibilisation rapide), contrairement à l'Homme. Les lapins arrivent généralement à l'animalerie lorsqu’ils sont agés de 19 semaines. Ils ne sont utilisés que lorsqu'ils atteignent le poids de 3,5kg.

Injectées de toxines bactériennes qui font chuter leur pression artérielle puis les plongent dans le coma, 810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi une IRM de trente minutes sous anesthésie générale. Le projet cherche des cibles thérapeutiques contre la fuite capillaire du choc septique, à partir de protéines repérées chez dix-neuf patients. Le porteur présente le coma comme une limitation de l'inconfort, tout en indiquant que les doses plus importantes retenues ici peuvent engendrer des douleurs physiques et psychologiques avant qu'il ne survienne.

Objectifs

Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (EU1). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute) (EU1). Les animaux subiront une IRM d'une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale (EU2). Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). L'imagerie IRM sera réalisée sous anesthésie générale uniquement pour éviter les mouvements de l'animal, et ne sont pas une source de douleur pour la souris. Tout au long du protocole, une administration d’analgésique pourra être réalisée en cas de signes de douleur.

Impact sur les animaux

L’induction d’un syndrôme de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection toxines bactériennes. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer ce syndrôme L’injection entraine une baisse de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). Ce modèle a déjà été testé et mis au point précédemment au laboratoire. Les examens d'imagerie réalisés, quant à eux, sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique.

Devenir

Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.

Remplacement

Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.

Raffinement

À la dose utilisée, le choc septique induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation, une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort. Enfin, le transport entre sites sera assuré par un prestataire agréé et durera environ 30 minutes. Les animaux auront accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages seront ventilées et enrichies avec du coton. Un délai entre le transport et l'imagerie sur site sera mis en place pour diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car le protocole précis de syndrome de réponse inflammatoire systémique induit par des sucres mimant des toxines bactériennes est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de cette protéine d'intérêt dans ce modèle de sepsis. Ce projet permettra de visualiser les effets protecteurs de cette protéine sur la fuite capillaire associée au choc septique. Ces expériences permettront de définir si cette protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du syndrome de réponse inflammatoire systémique chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de syndrome de réponse inflammatoire systémique étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de toxines bactériennes provoque une chute de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec troubles de la conscience allant jusqu'au coma, suivie d'une IRM de trente minutes sous anesthésie. Le porteur présente ce coma comme limitant l'inconfort, tout en indiquant que les doses employées ici peuvent engendrer des douleurs physiques et psychologiques avant son installation. Les essais préliminaires sur cellules sont écartés, le porteur concluant à la "nécessité" d'un modèle animal pour intégrer les voies physiologiques du choc septique.

Objectifs

Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (EU1). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute) (EU1). Les animaux subiront une IRM d'une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale (EU2). Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). L'imagerie IRM sera réalisée sous anesthésie générale uniquement pour éviter les mouvements de l'animal, et ne sont pas une source de douleur pour la souris. Tout au long du protocole, une administration d’analgésique pourra être réalisée en cas de signes de douleur.

Impact sur les animaux

L’induction d’un syndrôme de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection toxines bactériennes. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer ce syndrôme L’injection entraine une baisse de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). Ce modèle a déjà été testé et mis au point précédemment au laboratoire. Les examens d'imagerie réalisés, quant à eux, sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique.

Devenir

Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.

Remplacement

Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.

Raffinement

À la dose utilisée, le choc septique induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation, une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort. Enfin, le transport entre sites sera assuré par un prestataire agréé et durera environ 30 minutes. Les animaux auront accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages seront ventilées et enrichies avec du coton. Un délai entre le transport et l'imagerie sur site sera mis en place pour diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car le protocole précis de syndrome de réponse inflammatoire systémique induit par des sucres mimant des toxines bactériennes est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de cette protéine d'intérêt dans ce modèle de sepsis. Ce projet permettra de visualiser les effets protecteurs de cette protéine sur la fuite capillaire associée au choc septique. Ces expériences permettront de définir si cette protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du syndrome de réponse inflammatoire systémique chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de syndrome de réponse inflammatoire systémique étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.

Produire des sérums sur commande, un par animal, pour équiper en anticorps polyclonaux les services de diagnostic de l'établissement : 300 souris, 75 cobayes et 50 lapins vont être utilisés sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections intrapéritonéales d'antigènes inactivés avec adjuvants, deux prélèvements sanguins à la lancette au niveau de la jugulaire pour les souris et les cobayes, puis une injection létale avant les prélèvements post-mortem. Aucun n'est gardé vivant ni placé, le porteur invoquant l'immunisation avec des agents pathogènes de classe 2 ou 3, même inactivés. Il indique que les méthodes existantes, phage display, fusion cellulaire, puces, in vitro, servent la production d'anticorps monoclonaux et ne visent pas "l'ensemble des anticorps ciblant le maximum d'épitopes d'un antigène ou d'un organisme entier", d'où le caractère "incontournable" du recours aux animaux.

Objectifs

De nombreux et nouveaux agents biologiques voire pathogènes sont découverts régulièrement dans le monde entier chaque année. L’intérêt de ce projet est de développer des outils de recherche et de diagnostic afin de détecter et suivre ces agents en recherche médicale humaine et/ ou vétérinaire. Nous avons besoin pour cela de produire des anticorps dirigés contre ces agents biologiques après une immunisation effectuée soit chez la souris soit chez le lapin ou le cobaye. Le choix de l’espèce se fait en fonction de l’affinité et de la quantité souhaité ainsi que de l’agent biologique étudié. Tout agent pathogène sera inactivé avant injection afin de préserver l’animal. Des adjuvants pourront être utilisés pour favoriser les réponses immunitaires. Le nombre de sérum obtenu dépendra du nombre d’antigène à tester dans l’année. Nous évaluons nos besoins sur 5 ans pour la production d’anticorps polyclonaux : entre 24 à 60 souris par an, 5 à 10 lapins par an et 5 à 15 cobayes par an et autant de sérum. On peut ainsi produire 300 sérums avec les 300 souris pour 60 à 100 Antigènes qui nous seraient fournis. Pour les cobayes, 75 sérums pour 25 à 75 antigènes et pour le lapin : 50 sérums pour 25 à 50 antigènes, le tout sur 5 ans.

Bénéfices attendus

De nombreux et nouveaux agents biologiques voire pathogènes sont découverts régulièrement dans le monde entier chaque année. L’intérêt de ce projet est de développer des outils de recherche et de diagnostic afin de détecter et suivre ces agents en recherche médicale humaine et/ ou vétérinaire.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront les 3 injections en IP pour l'immunisation, l'injection en IP des solutions d'anesthésiant avant les 2 prélèvements (préimmuns et intermédiaires). Puis, in fine, l'injection en IP d'anesthésiant/euthanasiant avant les prélèvements post-mortem. La durée de chaque injection contenant des adjuvants est d'environ 2 minutes maximum par animal. Pour les prélèvements intermédiaires à l'aide des lancettes au niveau des jugulaires pour les souris et les cobayes, le geste est rapide (1 minute environ par animal). Pour les lapins, une attente de 20-30 minutes pour s'assurer de l'effet de la crème lidocaïne avant le prélèvement dont la durée variera en fonction du débit sanguin (soit 2-3 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles potentiellement dûes aux injections en IP pour les immunisations puis des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements finaux.

Devenir

Euthanasie. Les animaux sont majoritairement immunisés avec des agents pathogènes de classe 2 ou 3 qui même inactivés ne sont pas compatibles avec la possibilité de réutiliser ces animaux dans une autre procédure ou d’envisager un placement.

Remplacement

A ce jour, seul l’utilisation d’animaux permet la production d’anticorps polyclonaux sur la totalité de l'antigène afin d'obtenir des tests de diagnostic et des outils de recherches efficaces et fiables (Immunofluorescence en particulier) utilisés dans les services concernés dans notre établissement sur des microorganismes identifiés ou pas encore, pathogènes ou non. Les méthodes alternatives existantes à ce jour telles que Phage display ou fusion cellulaire, puces, in-vitro ou ex vivo, sont des méthodes développées et utilisées à des fins de production d’anticorps monoclonaux ou test thérapeutiques ou pharmacologiques. Ils ne sont pas adaptés à nos besoins qui sont de viser l’ensemble des anticorps ciblant le maximum d’épitopes d’un antigène ou d’un organisme entier. L’utilisation des animaux reste alors incontournable pour nous.

Réduction

Un minimum d’animaux est utilisé pour des productions polyclonales ciblant la totalité de l’antigène. Chaque animal est son propre témoin : avant l’immunisation, du sérum pré-immun est prélevé pour s’assurer de la réponse immunitaire attendue. Nous évaluons nos besoins sur 5 ans pour la production d’anticorps polyclonaux : entre 24 à 60 souris par an, 5 à 10 lapins par an et 5 à 15 cobayes par an. Au total nous aurions au maximum : 300 souris, 50 lapins et 75 cobayes sur 5 ans.

Raffinement

Chaque groupe ou animal sera stabulé dans une cage dans un même portoir ou armoire ventilé durant la totalité de l’expérimentation. Chaque groupe ou animal sera suivi de manière quotidienne, un enrichissement approprié (en fonction de l’espèce : igloos, matériel de nidification) sera disposé dans chaque cage. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel compétent et expérimenté (pelage, respiration et mobilité) et pesés (2 fois par semaine) afin de relever tout signe d’anormalité. Une grille de Morton et Griffits adaptée sera utilisée pour suivre les animaux immunisés. Tout signe de douleur et/ou souffrance entraînera l’arrêt de la procédure et les animaux seront euthanasiés par injection de surdosage de produit létal précédée d’une sédation profonde. Lors de procédures de prélèvements des anesthésies générales et/ou locales seront réalisées en fonction de l’animal.

Choix des espèces

Les espèces choisies (souris, lapin et cobaye) sont celles retenues pour la production d'anticorps avec un titre relativement élevé en fonction de l'affinité du microorganime pour son hôte. Des souris âgées de 4-6 semaines seront utilisées. Des lapins âgés de 3 mois seront utilisés. Des cobayes âgés de 5-6 semaines seront utilisés. Le jeune âge de chaque espèce est favorable à une bonne réponse immunitaire.

Trois lignées de souris, dont une modifiée pour ne plus produire le sucre alpha-Gal, et des lapins blancs de Nouvelle-Zélande retenus parce qu'ils fournissent de gros volumes de sang : 300 souris et 9 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les souris portent sur le dos une capsule contenant des tiques qui se nourrissent sur elles, ce qui impose un hébergement individuel puisqu'elles arrachent les capsules de leurs congénères et mangent les tiques. Les lapins reçoivent deux immunisations, puis un prélèvement dans la veine de l'oreille et enfin un prélèvement intracardiaque sous anesthésie. Toutes et tous sont tués pour récupérer sang et organes, alors que le calcul de puissance annonçait 33 souris par groupe et que le porteur en retient cinq.

Objectifs

Objectif 1 : Infection des souris pour obtenir des tiques infectées par Borrelia spp. La maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia spp., est une maladie transmise aux animaux et aux humains qui est en pleine expansion, notamment en Europe, où son incidence a considérablement augmenté ces dernières années, en particulier en France. Comprendre comment les tiques, principaux transmetteurs de cette maladie, sont infectées et comment la bactérie se transmet des animaux ou des humains aux tiques est essentiel pour développer des stratégies de prévention. En infectant des souris avec Borrelia spp., ce projet cherche à générer des tiques infectées de manière contrôlée, afin de mieux comprendre le cycle de transmission et d’examiner les interactions animaux/humains-Borrelia et les tiques. Cette connaissance est cruciale pour identifier de nouvelles cibles permettant d'interrompre la transmission de Borrelia spp. Objectif 2 : Induction d'anticorps spécifiques contre le sucre α-Gal pour protéger contre l'infection par Borrelia spp.Des études antérieures ont démontré que les anticorps contre le sucre α-Gal, générés naturellement en réponse à certains stimuli, peuvent offrir une protection contre divers pathogènes, y compris ceux qui exposent ce sucre à leur surface, comme Borrelia spp. La vaccination avec le sucre ou avec des variantes de la bactérie E. coli qui ne causent pas de maladies et exprimant ce sucre pourrait induire la production de ces anticorps protecteurs. L'objectif de cette partie du projet est de tester cette approche innovante. Si elle s'avère efficace, elle pourrait ouvrir une nouvelle voie pour la prévention de la maladie de Lyme, représentant ainsi une avancée majeure, car aucun vaccin n’est actuellement disponible pour les animaux ou les humains. Objectif 3 : vaccination des lapins pour des études in vitro. Les lapins seront utilisés pour produire des volumes importants de sérum riche en anticorps contre α-Gal et contre E. coli, ce qui est crucial pour les expérimentations complémentaires. Ce sérum permettra de tester en laboratoire, à plus grande échelle, l'efficacité des anticorps produits par les vaccins expérimentaux, garantissant ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande précision dans les résultats. L’utilisation des lapins, qui permettent de récolter un plus grand volume de sérum que les souris, réduit le nombre total d’animaux nécessaires et améliore la qualité des études futures.

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris recevront deux injections sous-cutanées et un maximum de trois prélèvements sanguins ; ces prélèvement dureront 10 minutes, anesthésie comprise.. Les lapins seront immunisés par voie souscutanée avec des variantes d'E. coli qui ne causent pas de maladies ou avec le sucre α-Gal, avec deux injections. Les jours 0 et 14 après la première vaccination, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; le prélèvement durera 8 minutes, anesthésie comprise. Le jour 30 après la vaccination de rappel, un prélèvement sanguin intracardiaque sera réalisé sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

L'alimentation des tiques pourrait provoquer un inconfort modéré chez les animaux, et ceux-ci pourraient également ressentir un léger inconfort en raison de la pose de la capsule sur leur dos. Aucune souffrance particulière n'est attendue en raison de l'infection, car les souris sont les transmetteurs naturels de Borrelia et ne présentent pas de symptômes. La pose des capsules a été optimisée pour minimiser l'inconfort tout en maximisant les résultats expérimentaux. Cependant, l'expérience sera interrompue en cas d'événements indésirables tels que : (i) un choc anaphylactique dû aux piqûres de tiques ou à l'infection bactérienne ; (ii) une réaction cutanée généralisée affectant les voies respiratoires ou gastro-intestinales après l'immunisation ; (iii) des blessures auto-infligées par les animaux tentant de retirer la capsule ; (iv) des signes graves après l'exposition aux micro-organismes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et, si nécessaire, l'expérience sera arrêtée. Les critères d'évaluation incluent une échelle de 3 niveaux, et tout animal atteignant un score de 3 sera mis à mort : (1) infecté sans signe visible ; (2) poils hérissés, activité réduite, légère posture voûtée ; (3) posture voûtée, difficulté à maintenir la position, prostration, respiration superficielle ; (4) décès.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet consiste à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec E. coli ou α-gal-BSA afin d'évaluer les effets protecteurs des anticorps anti-α-Gal contre Borrelia spp., ainsi que la survie des tiques et l'acquisition de Borrelia spp. par ces dernières. Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de reproduire la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne, ce qui empêche d'analyser adéquatement les effets protecteurs et la colonisation de Borrelia spp. chez les tiques. Pour obtenir un plus grand volume de sérum destiné à des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation supplémentaire de souris. L'immunisation des lapins permettra d'obtenir du sérum anti-α-Gal ou anti-E. coli, offrant un meilleur contrôle sur la qualité, la spécificité et l'affinité des anticorps, ce qui garantit la cohérence et la reproductibilité des expériences. De plus, elle permettra la production d'anticorps à plus grande échelle, répondant ainsi aux besoins expérimentaux spécifiques.

Réduction

Nous utiliserons 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux sera calculé pour être le minimum requis afin d'obtenir les tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Pour développer un test de puissance statistique robuste permettant d’analyser la relation entre les anticorps anti-alpha-gal et la protection, nous avons fixé le niveau de confiance à 5%, en nous basant sur les données publiées disponibles. Nous avons ciblé une puissance statistique de 0,8, en supposant un effet de taille modérée, ce qui indiquait un besoin de 33 souris par groupe pour un test ANOVA. En appliquant le principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), nous avons réduit la taille de l’échantillon à 5 souris par groupe afin de minimiser l'utilisation des animaux tout en maintenant des résultats significatifs.Chaque souris peut nourrir jusqu'à 100 larves ou 30 nymphes. Comme les larves sont plus petites et nécessitent moins de ressources que les nymphes, il est possible d'utiliser 100 larves et 20 nymphes par souris, sans affecter leur santé, tout en garantissant un nombre suffisant de larves et de nymphes infectées pour mener à bien les études expérimentales. Environ 30 % des tiques se détacheront sans avoir pris un repas complet ou mourront, ce qui nous permettra d'obtenir 70 larves ou 20 nymphes gorgées par souris. Parmi les 350 larves obtenues, 200 seront élevées jusqu'au stade de nymphe pour obtenir des nymphes infectées par Borrelia, utilisées dans des études in vitro. Les 150 larves restantes seront réparties de la manière suivante : 75 pour la quantification de Borrelia et 75 pour les études d'immunité des tiques, en lien avec l'immunisation des souris et l'infection. Pour les 100 nymphes, 50 seront dédiées à chaque type d'étude similaire. Par conséquent, il faut prévoir 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux a été calculé pour être le minimum nécessaire à l’obtention des tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Les souris seront gardées un maximum de 6 jours, temps nécessaire pour que les nymphes complètent leur repas. Nous avons également calculé le nombre minimal de lapins requis pour obtenir le volume de sérum nécessaire à nos futures expérimentations in vivo.

Raffinement

Souris : Les souris seront hébergées en groupes de 5 dans leurs conditions habituelles, avec un enrichissement nécessaire à leur bien-être (carrés de coton, maison en plastique). Elles seront surveillées quotidiennement pour détecter tout signe de malaise ou de symptôme. L’application des capsules contenant les tiques sur le dos des souris se fera sous anesthésie pour minimiser le stress et l'inconfort associés à cette manipulation. Une fois les capsules fixées, les souris seront placées dans des cages individuelles, car elles ont tendance à retirer les capsules des autres et à consommer les tiques. Malgré cet isolement, elles continueront de bénéficier des mêmes conditions d'enrichissement (carré de coton, maison en plastique), et, pour pallier leur isolement, des enrichissements supplémentaires, tels que des bâtonnets à ronger, seront ajoutés. Des points limites stricts seront appliqués pour identifier rapidement toute détérioration de leur état de santé, et les souris présentant des signes de douleur ou de détresse inhabituels seront retirées de l'expérimentation et recevront des soins appropriés. Lapins : À leur arrivée, les lapins seront logés dans des cages équipées de plateformes de repos et d’enrichissements spécifiques à leur bien-être, comme des balles, des branches en bois à ronger et des végétaux. Ils seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation pour garantir leur santé et leur confort. Étant sensibles aux manipulations, les lapins seront régulièrement contrôlés et manipulés par le personnel soignant et les expérimentateurs afin de les habituer à la présence humaine et aux différentes interventions. Avant les prélèvements sanguins, les lapins seront familiarisés avec les expérimentateurs pour réduire leur stress, et des techniques de contention douce seront appliquées pendant les prélèvements. L'anesthésie sera utilisée si nécessaire pour toute intervention susceptible de causer de la douleur ou un inconfort important. Des points limites spécifiques seront appliqués pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Si un lapin montre des signes d'inconfort significatif, il sera retiré de l’étude et recevra des soins adaptés

Choix des espèces

On utilisera trois variantes de souris et une de lapins : Souris très sensibles aux germes, comme la bactérie Borrelia spp, transmise par les tiques. Elles sont donc utilisées pour produire des tiques infectées par cette bactérie. Souris génétiquement modifiées pour qu'elles ne puissent pas produire le sucre α-Gal, mais elles peuvent créer des anticorps spécifiques contre celui-ci. Elles sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Souris non modifiées génétiquement. Elles sont utilisées comme groupe de contrôle pour comparer les résultats avec ceux des autres souris et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Lapins blancs de Nouvelle-Zélande : Ils sont utilisés car ce sont les meilleurs animaux pour prélever de grandes quantités de sang en une seule expérience, permettant d'obtenir suffisamment d'anticorps contre l'α-Gal pour les recherches. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge, et les lapins entre 4 et 5 semaines. Avant de commencer les expériences, une semaine d'adaptation sera accordée aux animaux pour qu'ils s'habituent à leur environnement.