Maladies infectieuses
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Étude de la dissémination métastatique dans le cancer gastrique : niches, cinétiques et partenaires
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Gavées trois jours de suite pour être infectées par une bactérie qui transforme leur estomac, puis injectées dans l'abdomen, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur décrit une perte de poids, des lésions gastriques et une souffrance visible sous forme de prostration, d'isolement et de mauvais toilettage. Le projet cherche à établir à quel moment les cellules d'un cancer gastrique se dispersent vers d'autres organes et vers la moelle osseuse. Sur la conduite à tenir face à cette souffrance, le porteur renvoie à une grille de score et à des "mesures conservatoires bien déterminées" qu'il ne décrit pas, et justifie l'usage des deux sexes par le fait de "réduire la production de moitié".
Objectifs
Le cancer gastrique présente un taux de rechute élevé même en cas de prise en charge précoce de la maladie. Ces rechutes seraient en partie liées à la capacité des cellules tumorales à coloniser rapidement d’autres organes et potentiellement la moelle osseuse. De plus, des cellules cancéreuses s’associent avec des cellules immunitaires encore non identifiées favorisant ce phénomène de dispersion. Nos principaux objectifs sont : - De déterminer à quel moment et où les cellules cancéreuses de l'estomac se dispersent dans le corps. - D’identifier les partenaires cellulaires associés aux cellules cancéreuses pendant ce processus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra : - De valider un nouveau modèle pré-clinique de développement du cancer gastrique, plus proche des patients, pour tester des méthodes de détection précoce et des traitements ciblant les interactions avec les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses. - De déterminer à quel moment les cellules cancéreuses se propagent dans la moelle osseuse, ce qui pourrait expliquer les rechutes. En étudiant ce processus, nous espérons développer de nouveaux traitements pour cibler ces cellules et diminuer les rechutes chez les patients. - D’identifier les cellules immunitaires associées aux cellules cancéreuses pour cibler leurs interactions dans les différents organes et ouvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Gavage sur animal vigile : 900 souris, 1 fois par jour pendant 3 jours, durée moins d’une minute. Injection dans le ventre sur animal vigile : 900 animaux, 1 fois, durée moins de 30 secondes. Prélèvement sanguin sous anesthésie générale : 900 souris, 1 fois en fin d’expérimentation, durée moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Irritation liée au gavage, perte de poids liée à l’infection à H. felis et/ou au traitement menant au développement de lésions gastriques et à la transformation de l’estomac. Souffrance observée (prostration, isolement, mauvais toilettage).
Devenir
Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.
Remplacement
Nous souhaitons découvrir comment le cancer de l'estomac se propage à d'autres organes et à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus ce qui rend le modèle animal indispensable.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser les 2 sexes dans cette étude afin de réduire la production de moitié. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des études statistiques ; pour cela, d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles de souris qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis. Selon les résultats de la première expérience des conditions expérimentales et/ou des points de cinétique pourront être supprimés avant de réitérer l’expérience 2 fois de façon indépendante pour la reproductibilité et les statistiques.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids, maisonnettes). Les souris seront suivies en suivant les critères de poids, le comportement, l’apparence, la présence d'une blessure, la mobilité. Ce suivi est réalisé à l’aide d’une grille permettant de définir des critères d’arrêt des souffrances et de proposer des mesures conservatoires bien déterminées. Une analgésie sera également appliquée en cas de souffrance animale. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur.
Choix des espèces
Le modèle d’infection à H. felis a été mis au point chez la souris. De plus, plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour ce projet qui nous permettront de répondre aux objectifs fixés. Au début du projet, les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. felis. Après ce stade l’infection ne se met pas en place ce qui est assez représentatif de ce qu'il se passe chez l'homme.
Analyse par imagerie du rôle de l’Angiopoiétine-like 4 (ANGPTL4) dans la fuite capillaire dans un modèle de choc septique (2/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de toxines bactériennes qui provoque un choc septique, avec chute de la pression artérielle, insuffisance circulatoire puis troubles de la conscience allant jusqu'au coma, avant un scanner sous anesthésie précédé d'une injection de produit de contraste derrière l'œil. Le bénéfice avancé, de nouveaux traitements contre la fuite capillaire chez des patients dont la mortalité atteint 60 %, reste au stade de l'hypothèse, l'objectif immédiat étant de tester une protéine repérée chez 19 patients. Le porteur indique avoir mené des études in vitro préliminaires, les juge incapables de reproduire les voies physiologiques en jeu et conclut au recours à un modèle animal.
Objectifs
Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Notre projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (l'un pour les injections et l'autre pour les imageries).
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (dans le premier établissement utilisateur). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute). Les animaux recevront du produit de contraste par voie rétro-orbitale après anesthésie générale pour limiter l'inconfort. Les animaux subiront un scanner d'une durée totale de 5 minutes sous anesthésie générale (dans le second établissement utilisateur).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma).
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.
Raffinement
Les doses de toxines bactériennes utilisées dans notre projet peuvent engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques chez l'animal. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation (scorée par une grille d'évaluation adaptée aux points limites spécifiques du projet), une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance (scorée par une grille d'évaluation adaptée aux points limites spécifiques du projet), des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort.
Choix des espèces
Les souris âgées de 10 semaines ont été choisies car le protocole précis d'induction du choc septique avec des toxines bactériennes est bien établi et décrit dans la littérature chez ce modèle animal. De plus, de précédentes études menées au laboratoire sur des souris de cet âge ont déjà démontré que le modèle était pertinent. Ces expériences permettront de définir si la protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du choc septique chez l'Homme.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 30000
Créées sur place ou reçues d'autres établissements, des lignées de souris et de rats génétiquement modifiés sont élevées, tatouées et biopsiées pour vérifier qu'elles portent bien la mutation commandée. 320 000 souris et 30 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, ceux qui ne partent pas vers un autre projet d'expérimentation étant tués, sans placement possible puisqu'ils appartiennent au scientifique commanditaire. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et quatre prélèvements sanguins par jour, et exprimer du seul fait de sa mutation un phénotype douloureux tel qu'une arthrite. Le porteur ajoute que la mise à mort peut être programmée à un âge précis pour éviter que l'animal n'exprime ce phénotype, et que les scientifiques "s'engagent par écrit" à ce qu'il n'existe pas de solution de remplacement à leur lignée.
Objectifs
Ce projet a pour premier objectif le maintien de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des modifications/symptômes physiques ou cliniques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes, et l’évaluation de l’impact de ces caractéristiques sur leur bien être ; comme deuxième objectif la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée génétiquement modifiées, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Ce test est important car dans l’élevage de lignée génétiquement modifiées, tous les animaux nés ne sont pas porteurs de la mutation, il est donc primordiale de le vérifier pour pouvoir utiliser les animaux d’interet uniquement et donner des résultats fiables. Enfin, certaines mutations génétiques ne font effet qu’après l’injection d’une hormone ou d’un antibiotique. Pour induire cette mutation d’interet et que l’animal exprime physiologiquement cette mutation, une injection de l’hormone pourra ainsi également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 350 000 animaux (ajout de 15% dû à l’augmentation de l’utilisation de ces modèles) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement modifiés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait du être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptée à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement modifiées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le bon modèle pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : - A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute - A des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite). Dans de rare cas, l’administration de ligands peuvent être fait via des injections en intrapéritonéale ou en gavage (durée : moins de 5 minutes, fréquence peut varier d’une expérimentation à une autre, mais n’excédant pas une fois par jour pendant 7 jours, en cas de protocole nécessitant de dépasser ces limites, cela devra au préalable être valider par la SBEA) (durée et fréquences décrites dans la procédure 4, et recommandées par la littérature).
Impact sur les animaux
EExpression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité inatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dûs à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit en utilisation continue dans des projets d’expérimentation, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, ne sont utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypag. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européenes (au moins 7 animaux de chaque sexes et génotypes, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Dans le cas de lignées pouvant présenter un phénotype dommageable, si le phénotype le requiére, des observations cliniques plus fréquentes et plus spécifiques avec des points limites et des raffinements précis seront mise en place. Afin de limiter la douleur pour l’animal, une euthanasie pourrait être demandé en automatique à un point limite ou âge précis afin d’éviter que l’animal n’exprime le phénotype. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5jours après la fécondation.
Evaluation pharmacologique de molécules anti-virales et de vaccins pour le traitement de la Covid-19 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Infectées par le SARS-CoV-2, 3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont soit maintenues immobiles quarante minutes dans une chambre de contention, le nez dans le flux d'air, soit anesthésiées pour une instillation nasale, puis reçoivent chaque jour pendant dix jours un composé ou un vaccin avant le prélèvement des organes. Le projet est vendu comme prestation de service : doses, voie d'administration et fréquence sont fixées avec le client, académique ou privé, ce qui empêche le porteur d'annoncer le nombre et la durée des interventions. Le virus se multiplie dans les poumons et provoque inflammation, lésions et difficultés respiratoires, et le porteur revendique un "besoin urgent d'études in vivo" pour "pérenniser la plateforme technologique".
Objectifs
Le SARS-CoV2 est le virus responsable de la maladie appelée COVID-19. Le manque d'antiviraux a révélé un besoin urgent d'études in vivo pertinentes afin d'évaluer de nouveaux vaccins et de nouvelles molécules potentiellement anti-SARS-CoV2. Différents modèles de souris dont un modèle de souris génétiquement modifiées pour être sensibles au virus SARS-CoV2 est décrit dans la littérature. Ces souris sont un outil de choix pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 et pour évaluer les vaccins et les produits thérapeutiques COVID-19. L’ambition de ce projet est de péréniser la plateforme technologique, à destination de futurs clients, académiques ou privés, où des souris sensibles au virus sont utilisées pour tester de nouveuax vaccins et de nouvelles molécules antivirales pour le traitement de la COVID-19. Pour comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus, il est en effet crucial à ce stade, d’utiliser un organisme vivant dans son ensemble. Différentes techniques in vitro ont déjà été utilisées en amont. Nous avons donc pour objectif de continuer à contribuer au développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est l'épidémie de Covid-19.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un modèle souris pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 contribue à comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus. Ce modèle préclinique in vivo permet d’évaluer des vaccins et des produits thérapeutiques Covid19.
Procédures
Les animaux seront infectés 1) soit par voie aérosol, les animaux vigiles sont maintenus immobiles dans des chambres de contention avec le nez pointant vers le flux d’air (durée d’environ 40 minutes) 2) soit par voie nasale, les souris seront anesthésiées/analgésiées une fois (durée d’environ 1 minute). Les nouveaux vaccins et les nouvelles molécules potentiellement antivirales seront testés selon la voie d’injection définie en accord avec le client fournisseur. Les doses et la fréquence d’administration dépendent des composés et de l'étude. Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée. Pour des procédures dites « classiques », les animaux reçoivent une infection, une administration de molécules ou vaccins tous les jours pendant maximum 10 jours avant prélèvement d’organes
Impact sur les animaux
L’infection des souris peut se faire soit : - Par instillation intranasale, des nuisances modérées, (durée 1 minute), sont présentes au moment de l’anesthésie (préhension, contention piqûre). - Par nébulisation, les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres pendant 40 min et induit un stress modéré. La préhension et la contention afin de procéder aux diverses injections ou gavage engendre un stress modéré (durée 1 minute). La pesée des animaux (durée 1 minute) entraine un stress léger. Suite à l’infection des souris, le virus se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Les effets attendus sont : altération de l’état général et difficultés respiratoires. L’effet cumulatif de ces actes sur un même animal (infection, injections et développement de l’infection, pesée) entraine des nuisances sévères
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort. Il n’y a pas de possibilité de replacement, vu le contexte hautement pathogène
Remplacement
L’amplitude de l'épidémie de Covid-19 ainsi que l'absence de traitement de référence rend urgente la découverte de nouveaux vaccins ou de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de l'étude de l’efficacité in vivo d’un composé sou d'un vaccin sur une infection, qui résulte non seulement de l’effet de ce composé sur le virus mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur cet agent pathogène. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances et de vaccins, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies sont incontournables. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie
Réduction
Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre calculé de souris nécessaires sera au maximum de 3000 sur 5 ans. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules antivirales/vaccins à tester, doses différentes de la molécule antivirale/vaccins). Le nombre d'études variera en fonction de la demande des utilisateurs. Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre de souris requises pour une année.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l’angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée à la procédure expérimentale par l'utilisation d'anesthésique pendant l’infection, lors des différentes injections des traitements potentiels. Pour l’infection des souris par nébulisation les souris sont mises en place dans les tubes de contention par du personnel habitué à l’utilisation de l’appareil ce qui réduit le stress des animaux. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation et des points limites précoces seront mis en place. Les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Plusieurs modèles animaux d'infection au Sars-CoV-2 sont actuellement utilisés par la communauté scientifique : les primates non humains, les chats, les furets, les hamsters et les souris. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie. Des souris adultes si possible, âgées entre 5 à 10 semaines seront utilisées pour ce projet.
Evaluation de l’efficacité de molécules pour lutter contre la toxi-infection provoquée par certaines Escherichia coli entérohémorragiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Insuffisance rénale, diarrhée, perte de poids, symptômes neurologiques pouvant aller jusqu'à la mort : les atteintes attendues servent à la fois de résultat expérimental et de critère de mise à mort anticipée. 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une instillation intra-rectale de shigatoxine ou de lysat bactérien sous anesthésie, puis jusqu'à sept prélèvements de sang à la mandibule. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable" pour observer à l'échelle d'un individu les répercussions de la toxine sur les différents organes.
Objectifs
Certaines souches d’Escherichia coli pathogènes, appelées EHEC (pour E. coli Entérohémorragique) sont responsables d’infection d'origine alimentaires graves, du fait de leur implantation dans le côlon des personnes infectées et de la production d’une toxine, la shigatoxine. Cette toxine est excrétée à la fois sous forme libre ou encapsulée dans des vésicules extracellulaires bactériennes. L’activité de la shigatoxine provoque la mort ces cellules hôtes ciblées, à savoir les cellules endothéliales au niveau du rein, du côlon et de l’encéphale, à l’origine de lésions sévères et potentiellement mortelles. Il est à noter que ces infections affectent majoritairement les jeunes enfants. Ces infections sont particulièrement difficiles à traiter car l'utilisation d'antibiotique est contre indiquée car elle entraine une lyse des bactéries et un choc endotoxique avec le relargage massif de la shigatoxine, à l’origine des formes graves de la maladie. Ainsi, il est nécessaire de (i) comprendre l’impact des modes de sécrétion des shigatoxines (libre ou encapsulée dans des vésicules extracellulaires) sur leur activité biologique, (ii) évaluer les médiateurs de la toxicité de la shigatoxine dans les cellules endothéliales et (iii) développer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour lutter contre les effets cellulaires de ces toxines. Les objectifs de ce projet sont donc d'évaluer l’importance des vésicules bactériennes contenant des shigatoxines dans la pathogénie des EHEC et d’évaluer l'efficacité d’une nouvelle molécule contre l'effet des shigatoxines en absence ou en présence de vésicules bactériennes.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des vésicules extracellulaires dans l’aggravation des infections par des EHEC et ses conséquences néfastes à court et moyen terme. De plus, les infections par les EHEC sont difficiles à traiter même une fois l'agent infectieux identifié. En effet, le traitement par des antibiotiques entraine un relargage massif des toxines (choc endotoxique) avec une aggravation de l'état de santé du patient. Le traitement antibiotique est donc déconseillé conduisant à une impasse thérapeutique. L'administration de molécules pharmacologiques capables d’inhiber l’activité de la toxine, qui pourrait donc représenter une approche thérapeutique bénéfique en combinaison de traitement par les antibiotiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une instillation intra-rectale sous anesthésie fixe (injection intra-péritonéale qui prendra quelques minutes) ou gazeuse une seule fois au début de la procédure (durée totale de quelques minutes). Tous les animaux seront soumis à des prélèvements de sang à la mandibule 2 fois par semaine sous anesthésie gazeuse, soit 7 prélèvements maximum (durée totale du prélèvement de 1 minute). Pour les animaux qui seront inclus dans l’étude de test du traitement inhibiteur recevront deux injections sous-cutanées à 10h d’intervalle. L’injection prendra quelques minutes. Tous les animaux recevront une injection intra-péritonéale de réaliser un prélèvement à la veine cave.
Impact sur les animaux
L'administration de lysat bactérien ou de shigatoxine par voie intra-rectale contenant la shigatoxine reproduit la physiopathologie observée chez l'homme. En effet, la shigatoxine est sécrété par la bactérie dans l’intestin et les cellules qui y sont réceptives sont présente dans la partie la plus distale de celui-ci. L’instillation intra-rectale permet donc d’avoir une dose connue directement en contact avec les cellules cibles. Ces lésions pourraient entrainent une défaillance des fonctions vitales de l'animal, et notamment une insuffisance rénale, de la diarrhée, une perte de poids, des symptômes neurologiques, une dégradation de l’état général pouvant aller jusqu’à la mort de l’animal. C'est pourquoi des points limites seront définis et évalués à partir du suivi clinique des animaux (réalisé 2 fois par jour et des pesées des animaux (réalisée 3 fois par semaine). Ils serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant impact des vésicules extracellulaires bactériennes et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer les lésions éventuelles.
Remplacement
Des modèles cellulaires ont permis de mettre en évidence le mode d’action de la shigatoxine sous forme libre et encapsuler dans des vésicules extracellulaires bactériennes et de valider l’efficacité des molécules que l’on souhaite utiliser contre la shigatoxine. Cependant, le recours à l’animal est irremplaçable car aucun autre modèle ne permet d’évaluer, au niveau d’un individu, les répercussions de la shigatoxine au niveau global avec les conséquences sur les différents organes et les répercussions cliniques.
Réduction
Des expériences préalablement réalisées avec ce modèle permettent d'estimer de manière optimale le nombre d'animaux requis. L’innocuité et la dose de la molécule à tester a déjà été validée. Nous utiliserons 10 animaux par groupes (et 5 animaux pour le groupe contrôle). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Plusieurs paramètres seront analysés et suivis dans le temps sur le même animal tout au long de l’expérimentation et après le sacrifice notamment grâce à des analyses histologiques.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages avec une taille et un environnement convenant aux respects des besoins des souris. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Des enrichissements seront fournis pour permettre aux souris d’exprimer les comportements propres à son espèce. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Pour l’ensemble des procédures, l’état clinique sera suivi deux fois par jour selon la grille présenté en annexe. La mesure du poids sera effectuée 3 fois par semaine. Cette surveillance servira d’une part comme paramètres expérimentaux validant l’efficacité du traitement et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer des points limites. Le dépassement de ces points limites conduira à l’euthanasie de l’animal concerné selon le décret N°2013-18 du 1er février 2013 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Lors des instillations transrectales une anesthésie gazeuse ou fixe sera mis en place pour la contention pendant et de la lidocaïne sera ajouté en local pour augmenter l’analgésie. Lors des prélèvements sanguins, une contention chimique sera effectuée pour augmenter le confort de l’expérimentateur et de la souris. Les injections sous-cutanées seront réalisées avec les souris tenues par la peau du cou et l’injection effectuée dans le pli ainsi formé. Au moment de la mise à mort des animaux, les animaux recevront une injection d’un mélange anesthésique suivie d’une prise de sang à la veine cave, suivie d'une dislocation des vertèbres cervicales. L’animal subissant une chirurgie ante mortem, une analgésie supplémentaire sera ajoutée en local pour l’incision de la paroi abdominale. Tous les prélèvements seront réalisés par une personne correctement formée et ayant l’habitude de ce type de prélèvement.
Choix des espèces
La diversité des modèles utilisés dans les infections à Escherichia coli entérohémorragique (EHEC) des invertébrés comme Caenorhabditis elegans a fourni à la communauté scientifique un grand nombre de modèles animaux permettant d’étudier les différents aspects de l’infection humaine. Néanmoins, les modèles mammifères et parmi eux, le modèle souris est le plus représentatif de la pathophysiologie observée durant une infection. L’utilisation de souris présentant une mutation pour une kinase nous permettra d’évaluer la contribution de cette kinase sur la médiation des effets des shigatoxines notamment dans les cellules endothéliales car ce sont elles qui sont le plus sensible à la toxine. Souris âgées de 6 semaines. L’utilisation de jeunes souris se justifie par le fait que dans un contexte clinique, les personnes les plus sensibles chez lesquelles le développement d’un syndrome hémolytique et urémique (SHU) est le plus fréquent suite à une infection par des EHEC sont les jeunes enfants.
Role de l’oxygène dans le processus de pathogénicité de Clostridioides difficile
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Toutes tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage unique de Clostridioides difficile et une à deux injections intrapéritonéales, puis leurs selles sont recueillies chaque jour. Le porteur décrit des diarrhées de deux à trois jours et une perte de poids de 5 à 15 %, avec un retour au poids initial généralement observé trois jours après l'infection. Il conclut que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider in vivo ce que des tests in vitro ont déjà montré sur l'effet de l'oxygène sur la croissance de cette bactérie.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie impliquée dans la plupart des cas des infections associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (24000 cas par an dont 14% de formes compliquée en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3%. Les ICD représentent également un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts associés à leur prise en charge particulière. C. difficile a ainsi été classée comme « menace urgente» dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. Il est donc urgent de mieux comprendre les différentes étapes de développement de la bactérie dans le tube digestif. Ces dommages intestinaux causés par C. difficile peuvent varier en fonction du niveau d'oxygène disponible dans le tube digestif. Dans ce projet, notre but est d’étudier l’influence de l’oxygène sur C. difficile et les troubles intestinaux induits par cette bactérie pathogène.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de pathogénicité de cette bactérie permettrait de développer et de proposer des stratégies thérapeutiques plus adaptées aux patients et limiter le risque de récidives et de dissémination de bactéries dans l'environnement.
Procédures
Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches de C. difficile (un gavage unique durant la procédure qui dure moins de 10 secondespar animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection durant la procédure, anesthésie locale par pommade 10 min avant l'injection qui dure moins de 10 secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum) ce recueil dure moins d'une minute, sur la durée de l'essai.
Impact sur les animaux
Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches de C. difficile et 1 ou 2 injections intrapéritonéales (une automatique d’antibiotique et éventuellement une autre 2h avant l'euthanasie des souris prévue à J-7, J0 et J2). Cette 2ème injection intra-péritonéale est dépendante du kit commercial qui sera utilisé pour l'analyse des coupes histologiques. Dans la mesure du possible, nous privilégierons le protocole ne nécessitant pas cette injection. Les nuisances induites par ces injections sont qualifiées de légères. Suite à l’infection, le modèle peut induit des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui vairent entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poid initial est généralement observé 3 jours après l'infection.
Devenir
Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro ont permis d'évaluer l'impact de l'oxygène sur la croissance de C. difficile. L'étape de vérification de ces résultats obtenus in vitro par un modèle in vivo est indispensable afin de tenir compte de l'environnement complexe du tube digestif et notamment le microbiote impliqué dans le taux d'oxygène présent. Le recours à l'animal est indispensable pour valider les résultats obtenus in vitro. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre maximun d'animaux utilisés au nombre de 384 , tout en préservant la validité statistique de l'étude. Afin de pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 12 animaux par groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites définis éthiquement non acceptables.
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.
Analyse par imagerie du rôle de l’Angiopoiétine-like 4 (ANGPTL4) dans la fuite capillaire dans un modèle de choc septique (1/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectées avec des toxines bactériennes qui font chuter leur pression artérielle jusqu'à l'endormissement puis le coma, 324 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et sont toutes tuées pour récupérer leur sang et leurs tissus. Elles reçoivent aussi un produit de contraste par voie rétro-orbitaire sous anesthésie, avant un scanner de cinq minutes réalisé dans un second établissement. Le porteur cherche à savoir si une protéine repérée chez 19 patients de réanimation peut limiter la fuite de plasma hors des vaisseaux. La rubrique consacrée aux effets sur les animaux tient en une phrase et ne dit rien du délai entre l'injection et le coma.
Objectifs
Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Notre projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (l'un pour les injections et l'autre pour les imageries).
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (dans le premier établissement utilisateur). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute). Les animaux recevront du produit de contraste par voie rétro-orbitale après anesthésie générale pour limiter l'inconfort. Les animaux subiront un scanner d'une durée totale de 5 minutes sous anesthésie générale (dans le second établissement utilisateur).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma).
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.
Raffinement
Les doses de toxines bactériennes utilisées dans notre projet peuvent engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques chez l'animal. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation (scorée par une grille d'évaluation adaptée aux points limites spécifiques du projet), une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance (scorée par une grille d'évaluation adaptée aux points limites spécifiques du projet), des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort.
Choix des espèces
Les souris âgées de 10 semaines ont été choisies car le protocole précis d'induction du choc septique avec des toxines bactériennes est bien établi et décrit dans la littérature chez ce modèle animal. De plus, de précédentes études menées au laboratoire sur des souris de cet âge ont déjà démontré que le modèle était pertinent. Ces expériences permettront de définir si la protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du choc septique chez l'Homme.
Evaluation de l’innocuité, de la tolérance locale et de l’efficacité de produit dans un modèle d’infection oculaire bactérienne chez le lapin.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Les deux yeux de chaque lapin sont infectés par une bactérie après scarification de la conjonctive sous anesthésie, puis reçoivent jusqu'à soixante-dix administrations de collyre en deux semaines, avec des prélèvements par coton-tige et un examen oculaire chaque jour. 210 lapins subissent ces procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, avec conjonctivite attendue, œdème des paupières et inflammation de l'iris, et sont hébergés seuls dès l'infection. Le projet teste cinq à dix candidats médicaments pour un donneur d'ordre, en vue d'une mise sur le marché. 195 lapins sont tués, leur infection rendant selon le porteur toute réutilisation impossible, tandis que dix lapins de réserve non infectés seront réutilisés pour la formation du personnel et cinq proposés à l'adoption.
Objectifs
Les infections oculaires (conjonctivites, kératites et uvéites) sont un motif fréquent de consultation en ophtalmologie. Elles peuvent entrainer une gêne et des douleurs significatives mais également des complications sévères, jusqu’à la perte de la vision, si elles ne sont pas traitées correctement. Il est donc primordial de traiter rapidement et efficacement ces infections afin d’éviter des complications pouvant conduire à des interventions médicales ou chirurgicales. La multiplication des résistances aux antibiotiques nécessite constamment le développement de nouveaux médicaments offrant des traitements plus efficaces et mieux tolérés. L’objectif du projet est d’évaluer l’innocuité, la tolérance locale et l’efficacité de différents candidats médicaments (tel que des collyres) dans un modèle d’infection bactérienne oculaire chez le lapin. Entre 5 et 10 traitements à des posologies différentes pourront être testés au cours de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera aux développements et éventuellement à la mise sur le marché de nouveaux produits ophtalmiques offrant des traitements plus efficaces et mieux tolérés contre les infections bactériennes oculaires.
Procédures
Les animaux subiront une intervention afin de réaliser l’infection des 2 yeux sous anesthésie et analgésie. La procédure d’infection durera en moyenne 30 minutes (anesthésie comprise). Les animaux vigiles recevront dans les 2 yeux les produits tests, références ou contrôles. Ces produits seront administrés entre 1 et 5 fois par jour. L’administration des traitements commencera le lendemain de l’infection et se poursuivra jusqu’à 7 ou 14 jours post-infection (en fonction de la durée de l’étude). Les animaux recevront donc au maximum 70 administrations oculaires. Ces administrations dureront environ 5 minutes. Des examens spécifiques oculaires des 2 yeux seront réalisés quotidiennement de l’infection jusqu’à la fin de l’étude (soit 8 ou 15 examens en fonction de la durée de l’étude post-infection). Ces examens dureront environ 10 minutes. Des prélèvements oculaires à l’aide d’un coton-tige seront réalisés sous anesthésie locale au niveau des 2 yeux avant l’infection (baseline), environ 12h après l’infection puis à 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11 et 14 jours après l’infection (soit 8 ou 11 prélèvements en fonction de la durée de l’étude post-infection : 7 ou 14 jours). Ces prélèvements dureront environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle d’infection oculaire, une conjonctivite est attendue chez les animaux ce qui entrainera l’apparition de différents signes cliniques tels qu’une hyperémie palpébrale et bulbaire (accumulation de sang au niveau des paupières ou du bulbe oculaire), exsudation, chémosis (gonflement de la conjonctive), œdème des paupières, blépharite (inflammation de la paupière), iritis (inflammation de l’iris). La sévérité et la durée de ces signes pourront varier entre les animaux traités et non traités. Les animaux seront manipulés régulièrement (jusqu’à 5 fois / jour) pour différents actes susceptibles d’induire un stress : examen oculaire, examen clinique, pesée, administration des traitements, réalisation des prélèvements oculaires.
Devenir
Les animaux inclus dans les études seront euthanasiés à la fin du protocole car ils seront entrés dans une procédure infectieuse rendant leur réutilisation impossible. De plus, des prélèvements des yeux pourront être réalisés pour analyse histologique. Dans la mesure du possible, les animaux réserves qui n’auront finalement pas été inclus dans les études pourront être réutilisés pour de la formation continue du personnel ou adoptés selon la procédure d’adoption de l’EU.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs de ce projet ainsi qu'à des exigences réglementaires, le recours à l'expérimentation animale est nécessaire car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode alternative in vitro ou in silico permettant de modéliser la réponse d’un organisme entier vivant à une infection bactérienne locale (modélisation d’une situation clinique). En effet, cette réponse dépend d’un très grand nombre de facteurs impliquant notamment l’ensemble du système immunitaire. Une sélection in vitro des candidats les plus prometteurs pourra être réalisée en amont des études précliniques par le donneur d'ordre.
Réduction
Dans un premier temps, des études sur un nombre restreint d’animaux (3 animaux par conditions expérimentales) pourront être réalisées afin de valider l’établissement d’un modèle de conjonctivite et/ou d'ajuster différents paramètres tels que la concentration et la fréquence d’administration des traitements. Une fois les conditions optimales définies et afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur l’innocuité, la tolérance locale et l’efficacité des produits testés, des études avec des groupes d’au moins 6 animaux seront réalisées. Un groupe contrôle traité avec le placebo/véhicule sera systématiquement inclus dans les études.
Raffinement
Une période d’acclimatation de minimum 8 jours sera respectée pour les lapins. Les animaux seront hébergés avec les enrichissements appropriés (plateforme et cachette, bâtonnet de bois à ronger, balles (jeux) et galet de foin, autant que possible en groupe sociaux en parcs ou en cages durant la période d’acclimatation puis en individuel après l’infection afin d’éviter tout risque de bagarre pouvant engendrer des blessures au niveau des yeux ne permettant plus de répondre à l’objectif de l’étude (innocuité et tolérance locale). Les animaux seront observés quotidiennement, à l’aide d’une grille de scoring permettant d’observer à la fois leur état général et leur mobilité, afin de déceler précocement tout signe clinique anormal et mettre en place des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien de type désinfection de plaies, hydratation, isolement etc. ou bien mise à mort en cas d'état de santé considérablement dégradé et irréversible). Des pesées seront réalisées quotidiennement. De plus, un vétérinaire ophtalmologue spécialisé réalisera quotidiennement un suivi clinique oculaire. Lors de l’anesthésie, une attention particulière sera portée pour éviter l'hypothermie : mise en place de tapis chauffant et/ou réveil des animaux sous lampe chauffante. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux de l’animal pendant l’anesthésie pour éviter le dessèchement cornéen. Un protocole analgésique sera mis en place avant et aprés la scarification de la conjonctive et un anesthésique local sera appliqué avant la scarification de la conjonctive et avant chaque prélèvement oculaire permettant la quantification de la charge bactérienne. Les lapins seront habitués à entrer dans la boite à contention. Pour cela, il seront placés plusieurs fois dans la boite en amont de l’étude sans réalisation de geste technique. Une récompense alimentaire (boulette croquante au fruit) leur sera alors donnée à ce moment-là.
Choix des espèces
Le lapin est l’espèce privilégiée dans les modèles d’infection oculaire. Sa taille permet une observation confortable des signes cliniques oculaires. De plus, cette espèce est très bien caractérisée et présente des similarités anatomiques avec l’homme permettant une transposition des résultats. Les lapins seront utilisés entre 10 et 12 semaines afin d’avoir des animaux d’environ 2-3 kg au moment de l’infection. Les animaux seront donc réceptionnés à partir de 8/9 semaines (pour prendre en compte la période d’acclimatation de minimum 8 jours). Il n’y a pas de contraintes spécifiques liés à l’âge pour ce type d’étude, cependant des animaux de 2-3 kg permettent une manipulation facile et le système immunitaire du lapin aura atteint une maturité fonctionnelle complète à partir de 8 semaines.
Évaluation de Nouvelles Formulations Inhalées d’un Antibiotique pour le Traitement d’Infections Pulmonaires
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Immunodéprimés par deux injections à cinq jours d'intervalle, habitués progressivement à la contention dans un tube d'aérosol de 2 à 10 minutes, puis infectés aux poumons par intubation sous anesthésie, 448 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une perte de poids inférieure à 15 %, une prostration et une mobilité réduite pendant les 24 heures suivant l'infection, avec une antalgie morphinique toutes les six heures. Quarante-huit rats reçoivent l'antibiotique de référence par injection, les 384 autres par aérosol pendant dix minutes. Tous sont tués pour prélever les tissus et mesurer la prolifération bactérienne.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques est un problème mondial qui cause de nombreux décès chaque année, dont plus de 25 000 en Europe et 1,3 million dans le monde en 2019. Certaines bactéries sont particulièrement préoccupantes et reconnue par l’Organisation mondiale de la santé comme un danger prioritaire. Ces bactéries sont particulièrement problématiques, car elles peuvent survire longtemps sur les surfaces et développe facilement des résistances en échangeant des gènes avec d’autres bactéries. Elles causent souvent des infections graves dans les hôpitaux, surtout en soins intensifs. Pour combattre cette menace, un projet européen développe des versions inhalables d’un antibiotique actuellement testé en clinique par injection. Cinq formulations différentes de cet antibiotique sont à l’étude pour renforcer son efficacité contre ces infections graves. L’avantage de cet antibiotique est de provoquer moins de résistances que d’autres antibiotiques inhalés tout en étant plus efficace. En l’administrant directement dans les poumons, on atteint une forte concentration au niveau de l’infection, en limitant la diffusion dans le reste du corps et en réduisant ainsi les risques de toxicité. Les premiers tests en laboratoire sont encourageants. La prochaine étape consiste à tester ces formulations chez des rats infectés pour voir si cette administration directe est plus efficace qu’une injection.
Bénéfices attendus
Des tests in vitro de stabilité, d'aérosolisation, de toxicité pour les cellules humaines et d'efficacité antimicrobienne ont été réalisés dans un premier temps, avec des résultats prometteurs. La prochaine étape cruciale consiste à mener des expériences in vivo pour faire progresser le projet vers l'utilisation chez l'humain. Les études in vivo sont indispensables, car aucun modèle in vitro ne peut reproduire intégralement l'ensemble complexe des facteurs influençant l'efficacité et la tolérance d'un antibiotique administré par inhalation. Les études in vivo sur des modèles animaux offrent une évaluation exhaustive de l'administration de médicaments par voie pulmonaire, englobant tant les considérations d'efficacité que de sécurité. Ces études permettent de vérifier la distribution du médicament dans les tissus et d'identifier d'éventuels effets secondaires ou toxicités non détectables in vitro, assurant ainsi une compréhension plus approfondie et une optimisation de la thérapie avant les essais cliniques sur l'homme.
Procédures
Tous les animaux vigiles recevront deux injections à 5 jours d’intervalle dans le cadre d’un traitement immunosuppresseur (durée : 30 secondes par injection). Ils participeront également à des séances d’habituation au maintien en contention dans le dispositif utilisé pour l’administration par aérosol. Ces séances, réalisées quotidiennement sur 5 jours, verront leur durée augmenter progressivement de 2 à 10 minutes maximum. Tous les rats seront soumis à une infection bactérienne pulmonaire induite par intubation sous anesthésie gazeuse, effectuée une seule fois (durée : 10 minutes). Une couverture antalgique sera administrée à tous les rats, soit par des injections en condition vigile toutes les 6 heures (1 à 4 administrations, durée : 30 secondes par injection), soit via l’eau de boisson. Une partie des rats vigiles (48 animaux) recevra un traitement antibiotique de référence par injection (durée : 5 minutes), tandis que les 384 autres recevront l’antibiotique par voie d’aérosol (durée : 10 minutes). Un lavage pulmonaire et un prélèvement sanguin seront réalisés sous anesthésie et antalgie à des moments définis. Chaque rat subira un seul prélèvement (durée : 2 minutes).
Impact sur les animaux
- Injections: légère douleur, brève et transitoire. - Induction et réveil de l’anesthésie : inconfort mineur et éphémère. - Injection de l'immunosuppresseur : perte de poids liée à une diminution de l'appétit et à des troubles gastro-intestinaux. - Induction de l’infection pulmonaire : inconfort modéré pendant et après l’induction, atténué par l’administration d’antalgiques. Une perte de poids inférieure à 15 % est attendue, accompagnée de prostration et d’une réduction de la mobilité pendant les 24 heures suivant l’infection. - Traitement : inconfort léger pendant les 10 minutes d’exposition au système d’inhalation, réduit grâce à une phase d’habituation progressive.
Devenir
Les animaux à la fin de chaque procédure seront tous mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer la prolifération bactérienne
Remplacement
À ce jour, il est encore impossible de remplacer complètement l’utilisation des animaux pour cette étude, car les modèles de laboratoire (in vitro) ou informatiques (in silico) ne peuvent pas reproduire tous les paramètres nécessaires pour évaluer l’efficacité et la sécurité des antibiotiques administrés par inhalation. Cependant, des progrès importants ont été réalisés sans utiliser d’animaux vivants. Des tests en laboratoire ont démontré que le nouvel antibiotique est efficace contre de nombreuses souches bactériennes cliniques. De plus, des recherches ont permis d’identifier les meilleures formulations pour une administration par inhalation. Des expériences ont ensuite été menées sur des poumons de rat isolés et perfusés, en collaboration avec un laboratoire européen. Cette méthode, qui n’implique pas d’animaux vivants, a fourni des informations essentielles sur la capacité des formulations à garantir une exposition prolongée dans les poumons, réduisant ainsi le recours aux animaux vivants. La prochaine étape sera de confirmer ces résultats sur des animaux dans un modèle d’infection pulmonaire, une validation indispensable avant de passer à des études chez l’humain.
Réduction
Pour limiter l’utilisation d’animaux dans cette étude, une seule souche bactérienne sera testée. Cette souche a déjà été validée lors d’études précédentes sur des souris. La quantité de bactéries à administrer dans les poumons a été soigneusement déterminée et optimisée grâce à ce modèle, garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum nécessaire pour détecter les différences entre les traitements. Les groupes témoins seront partagés entre les différentes formulations testées, ce qui contribuera également à réduire le nombre total d’animaux impliqués. En outre, les évaluations des différentes formulations, développées par plusieurs laboratoires européens, seront centralisées dans notre laboratoire. Cette centralisation permettra d’éviter la duplication des expériences, notamment pour les contrôles, et d’optimiser les ressources disponibles.
Raffinement
Les rats suivront une période d'acclimatation minimale de 8 jours et seront hébergés dans des cages standards installées sur des portoirs ventilés, avec un enrichissement comprenant de la sciure, des tunnels pour se cacher et des bâtonnets à ronger. Chaque cage sera limitée à deux animaux, et les groupes ne seront pas modifiés par la suite. Les rats vigiles évolueront dans un environnement ayant une température constante avec un taux d'humidité contrôlé, bénéficiant d’un accès libre à la nourriture et à l’eau. La luminosité sera régulée avec une alternance jour/nuit respectant leur cycle veille/sommeil. À partir du 9ᵉ jour, les rats seront progressivement acclimatés aux tubes de maintien du système de génération des aérosols médicamenteux. Le protocole commencera par une exposition de 2 minutes à un aérosol de solution physiologique, avec une augmentation progressive de la durée au cours des 5 jours suivants : 4 minutes au jour 10, 6 minutes au jour 11, et ainsi de suite jusqu’à 10 minutes au jour 13. Les conditions d'asepsie seront rigoureusement respectées pendant l’infection et les traitements. Les rats resteront dans leurs cages d’origine tout au long de l’étude pour éviter tout stress additionnel. Chaque animal sera surveillé au moins deux fois par jour, avec un suivi précis de son état à l’aide d’une grille d’évaluation permettant de détecter rapidement tout signe de mal-être et d’intervenir si nécessaire. Les rats seront anesthésiés et bénéficieront d’une couverture antalgique avec un dérivé morphinique tout au long des expérimentations
Choix des espèces
Les expériences seront menées chez les rats pour plusieurs raisons. Tout d'abord, leur système respiratoire présente des similitudes importantes avec celui des humains, tant par sa structure que par ses mécanismes de défense contre les infections respiratoires. Cela en fait un modèle pertinent pour étudier l’efficacité des traitements. Les rats de 7 semaines ou plus permettent également de prélever des quantités suffisantes de liquide de lavage pulmonaire, indispensable pour mesurer la concentration de l’antibiotique étudié dans les poumons. Ces mesures aident à comprendre comment le médicament agit dans les poumons et à évaluer son efficacité contre les infections. En outre, les méthodes utilisées, comme l’administration de médicaments par aérosols et le prélèvement de liquide pulmonaire, sont bien maîtrisées chez les rats.
Evaluation d’anticorps thérapeutiques ciblant des facteurs de virulence bactériens
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Infectées par la bactérie de l'anthrax puis traitées par un anticorps monoclonal, 796 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les effets attendus sont une mobilité fortement réduite, une paralysie possible et la formation d'œdèmes. Le porteur indique que toutes les manipulations susceptibles de causer des désagréments se font sous anesthésie, tout en listant parmi ces effets des douleurs lors des injections et des prélèvements. Toutes les souris sont tuées à la fin du protocole, au motif que des animaux infectés seraient eux-mêmes une source de contamination.
Objectifs
L'anthrax, maladie rare qui affecte principalement la peau et les poumons, est due à une bactérie considérée comme l'un des agents potentiellement les plus dangereux en matière de bioterrorisme. Dès les premières phases de l’infection, deux toxines se forment let sont libérées dans l’organisme de la personne infectée, pouvant entraîner rapidement son décès. Bien que les antibiotiques soient efficaces pour éliminer la bactérie, il est crucial de neutraliser rapidement ces toxines afin de diminuer le taux de mortalité, particulièrement élevé dans le cas de l'anthrax pulmonaire. Ainsi, combiner une antibiothérapie avec une immunothérapie ciblant ces toxines présente un intérêt thérapeutique notable. Dans ce contexte, nous avons déjà développé une série d’anticorps monoclonaux spécifiques des toxines qui pourraient être utilisés à cet effet. Nous les avons partiellement caractérisés et évalués pour leur capacité de neutralisation dans un modèle de cytotoxicité cellulaire in vitro, ce qui nous a permis de sélectionner un nombre restreints d’anticorps aux propriétés protectrices prometteuses. Le projet vise désormais à évaluer leur efficacité in vivo dans des modèles d’infection et à sélectionner le meilleur anticorps ou la meilleure combinaison d’anticorps protecteurs.
Bénéfices attendus
La bactérie responsable de l’anthrax est considérée comme l’un des agents biologiques les plus dangereux. Bien que les antibiotiques soient efficaces pour éliminer cette bactérie, une neutralisation rapide des toxines produites au cours de l’infection est essentielle pour réduire le taux de mortalité, particulièrement dans le cas de l’anthrax pulmonaire où le taux de mortalité approche 100% sans traitement. Le bénéfice attendu de ce projet est de rendre disponible un traitement combinant un ou des anticorps monoclonaux avec des antibiotiques pour assurer une prise en charge rapide et efficace des personnes contaminées.
Procédures
Toutes les manipulations susceptibles de causer des désagréments (prélèvements sanguins, instillation/inoculation d’agents infectieux et injection d’anticorps) seront effectuées sur des animaux sous anesthésie. Seules la pesée et l’observation de leur état général quotidiennes seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront infectés rapidement (temps de réalisation : 60 secondes) et un seul traitement anticorps sera ensuite administré par animal en 30 secondes. Un prélèvement sanguin sera réalisé 24h après infection avec un temps de réalisation de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables dans ces modèles d’infection sont une mobilité fortement réduite, une possible paralysie, la formation d’œdèmes, ainsi que des douleurs lors des injections et/ou prélèvements et le stress lors des manipulations et pesées.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le projet seront euthanasiés à la fin du protocole, le but étant d’éliminer les animaux infectés ou potentiellement infectés car ils pourraient eux-mêmes être source de contamination.
Remplacement
Des tests préliminaires in vitro utilisant des cellules en culture ont été réalisés dans le laboratoire afin de sélectionner les anticorps les plus prometteurs avant de réaliser les tests in vivo. Ces tests cellulaires permettent de réaliser un grand nombre de combinaisons, et ainsi d’éviter une utilisation importante d’animaux. Cependant, il est déjà établi que, bien que ces modèles soient utiles pour une présélection ou une pré-évaluation, des disparités subsistent entre les résultats obtenus in vitro et ceux obtenus in vivo : les mécanismes d’action des anticorps peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. Il est donc indispensable d’utiliser des modèles d’études plus complexes, tels que les modèles murins, qui prennent en compte la distribution des agents infectieux et celle de la molécule thérapeutique, ainsi que les réponses inflammatoire et immunitaire. En l’état actuel des connaissances, il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico capables de rendre compte de cette complexité.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, seul un nombre restreints d’anticorps thérapeutiques seront testés chez l’animal. Lors de travaux préliminaires, un grand nombre d’anticorps a été évalué dans un modèle cellulaire pour leur capacité à neutraliser les toxines, ce qui a permis de sélectionner les anticorps les plus prometteurs. Sur la base des analyses statistiques, le nombre d’animaux par lot a été défini de façon à recueillir suffisamment de données pour une évaluation et une comparaison fiables des anticorps thérapeutiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une maison en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront ajoutées afin d’optimiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront observés biquotidiennement tout au long des procédures par du personnel qualifié. Pour réduire le stress et la douleur dus aux expérimentations, celles-ci seront effectuées sous anesthésie. Pour éviter une déshydratation et une dénutrition possible des animaux, de l’aliment hydraté sera disposé dans les cages. Une grille d’évaluation de la douleur et de l’état de santé des animaux sera établie, décrivant les signes (physiques et comportementaux) dont l’apparition justifierait l’euthanasie de l’animal pour limiter sa souffrance.
Choix des espèces
Dans la littérature, le modèle murin est majoritairement utilisé, étant donné sa sensibilité aux toxines bactériennes. De plus, la caractérisation du système immunitaire de la souris a démontré une similitude suffisante avec celui de l’humain, permettant ainsi des conclusions pertinentes. Les animaux utilisés seront au stade adulte (22-24g), un stade où le système immunitaire est pleinement mature. Cette maturité est essentielle pour étudier les effets des toxines et des traitements administrés sur le système immunitaire.
Vaccination ciblant les composés de surface de Clostridioides difficile dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rendues sensibles par un antibiotique injecté dans l'abdomen, 300 souris de six à sept semaines sont ensuite infectées par gavage avec une souche pathogène de Clostridioides difficile. Les procédures sont classées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin. Elles reçoivent trois injections vaccinales sous la peau et deux prises de sang à la mandibule, avec un recueil de selles tous les deux jours, l'infection provoquant deux à trois jours de diarrhée et une perte de poids de 5 à 15 %. Le porteur justifie la mise à mort par l'infection elle-même et par l'analyse des tissus, et présente la vérification des candidats vaccins chez l'animal comme "exigible réglementairement" avant toute phase clinique.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. diff) est la première cause de diarrhées bactériennes associées aux soins chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l'ordre de 3%. Les ICD peuvent évoluer sur un mode épidémique avec la survenue de cas groupés d’infection voire de véritables épidémies locorégionales. Elles représentent un coût sanitaire important pour nos sociétés, en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours et des surcoûts liés à leur prise en charge spécifique. Une antibiothérapie est le plus souvent efficace pour traiter une infection liée à C. difficile, mais les rechutes sont fréquentes (environ 20% des patients). La vaccination est la meilleure approche à long terme pour réduire le nombre de ces infections. Le but de cette vaccination est de lutter contre le développement de la bactérie au niveau du tube digestif et donc de réduire les symptômes ainsi que la dissémination de la bactérie dans l’environnement. Les antigènes testés ont démontré in vitro et in silico des qualités requises pour être considéré comme un bon antigène. Il est toutefois nécessaire de réaliser des tests in vivo dans un modèle d'infection chez la souris qui permet d'étudier la réponse immunitaire induite par la vaccination. L'objectif de ce projet est d'obtenir une preuve de concept de l'efficacité in vivo de ces nouveaux antigènes. Une analyse de l’immunité des animaux sera vérifiée avant et après immunisation. L'efficacité vaccinale sera évaluée par le suivi de la présence de la bactérie pathogène dans le tube digestif (par numération de la bactérie dans les fèces des animaux), une analyse de l’inflammation intestinale et ceci sera corrélé à la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Le développement de nouvelles méthodes de prévention des infections à C. difficile permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque d’infections communautaires et nosocomiales et de diminuer la dissémination de cette bactérie pathogène dans l’environnement. Le développement d'un vaccin permettrait de prévenir les infections à C. difficile ou leur récidive. Les antigènes vaccinaux utilisés dans cette étude sont des facteurs impliqués dans la colonisation par la bactérie du tube digestif et des facteurs de virulence. Si une réponse immunitaire efficace est induite lors de ces essais de vaccination, la bacterie sera limitée dans son développement et les symptomes cliniques de l'infection ne seront donc plus visibles.
Procédures
Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir les immunisations par voie sous-cutanée, l’administration par voie orale de C. difficile (un gavage unique durant la procédure, qui dure moins de 10 secondes par animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection durant la procédure, anesthésie locale par pommade 10 min avant l'injection qui dure moins de 10 secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé tous les deux jours, sur la durée de l'essai, ce recueil dure moins d'une minute. Le prélèvement de sang sera réalisé par voie submandibulaire sur animaux vigiles mais anesthésiés localement par lidocaïne, 2 prélèvements à J-52 et J-5. Le prélèvement sera réalisé très rapidement (moins d'une minute) par une personne très expérimentée.
Impact sur les animaux
Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale de C. difficile et 3 injections par voie parentérale (sous-cutanée) pour les immunisations, 1 injection intrapéritonéale (moins de 5 secondes) d’un antibiotique et 2 prélèvements sanguins (moins de 10 secondes) par voie submandibulaire. Suite à l’infection, le modèle peut induire des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui varient entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poid initial est généralement observé 3 jours après l'infection. La procédure de gavage par voie orale occasionne pour les animaux une angoisse modérée, de courte durée (moins de 5 secondes) ; le prélèvement de fèces n’occasionne aucune douleur mais peut provoquer une angoisse légère (de très courte durée) dans la mesure où il nécessite de manipuler l’animal.
Devenir
Ayant été infectés par une souche pathogène de C. difficile, et en raison de l'interet de l'analyse des prélèvements des tissus, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro et in silico ont permis d'évaluer l'intérêt des candidats vaccins. L'étape de vérification de leurs qualités antigéniques in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. La reconstitution des interactions entre, l’hôte, son système immunitaire et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 300, tout en préservant la validité statistique de l'étude. Afin de pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 12 animaux par groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.
Evaluation du potentiel thérapeutique de molécules antigrippales administrées par différentes voies sur modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Les souris qui franchissent les points limites sont tuées avant la fin, les autres au 21e jour après l'infection ou au 4e selon la procédure. 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever tissus respiratoires et sang. Elles sont infectées par le virus de la grippe, ce qui provoque une hyper-inflammation pulmonaire, des lésions du poumon, des difficultés respiratoires, de l'hypothermie et de l'anorexie, effets qui peuvent aller jusqu'à la mort. Elles reçoivent cinq molécules candidates par instillation nasale sous anesthésie, par gavage sous contention et par injection dans la veine de la queue, la perte de poids et la mortalité servant de critères pour décider quelles molécules passent à l'étape suivante.
Objectifs
Chaque année, la grippe saisonnière infecte plus d'un milliard de personnes (environ 20 % de la population mondiale). La versatilité de l’efficacité vaccinale, et l’absence d’antiviraux efficaces, peine à juguler les 500 000 décès annuels dus à la grippe. Par conséquent, des stratégies innovantes sont essentielles pour améliorer les traitements contre le virus de la grippe. La pathologie grippale est liée à la fois aux effets néfastes du virus et à la réponse immunitaire de l'hôte. Alors qu'une réponse immunitaire robuste est essentielle pour l'élimination du virus, un recrutement cellulaire excessif et la libération de certaines molécules conduisent à une hyperinflammation pulmonaire, entraînant des lésions tissulaires, la morbidité et la mort. Des recherches récentes ont misent en évidence le lien étroit entre métabolisme et immunité, aboutissant à la découverte de propriétés antimicrobiennes de certaines molécules du métabolisme. Nos études précédentes ont démontré que parmi ces petites molécules, appelés métabolites, 5 molécules possèdent des activité antigrippale. In vitro, ces composés ont démontré un double effet : inhibition de la réplication du virus de la grippe et propriétés anti-inflammatoires suffisamment puissantes pour perturber les cascades inflammatoires au cours de la grippe. Afin de confirmer le potentiel thérapeutique de ces molécules, il est à présent nécessaire de valider leur effets anti-grippaux in vivo. Pour cela, nous désirons administrer ces molécules via les différentes voies d’administrations couramment utilisés en médecines humaines (intraveineuse, per os, intranasale), à des souris atteintes d’infection grippale. Par la suite, nous comparerons l’effet anti-viral et anti-inflammatoire de ces molécules, selon la voie d’administrations choisis. Enfin, nous évaluerons le potentiel protecteur de ces molécules via des expériences de survie. Ces résultats nous permettrons de déterminer quel est la molécule la plus prometteuse pour poursuivre le développement préclinique de ce nouvel antigrippal en clinique humaine.
Bénéfices attendus
L’infection grippale est un problème de santé publique majeur ; à l’origine d’épidémies saisonnières et de pandémies de grippe, avec un impact clinique et économique considérable. Ces virus infectent entre 10 et 20% de la population mondiale et entraînent des maladies graves chez 3 à 5 millions de personnes. En conséquence, ces virus tuent entre 290 000 et 650 000 individus par an dans le monde, dont 5 à 18 000 personnes en France et jusqu’à 56 000 autres aux États-Unis. La mise au point d'agents thérapeutiques efficaces et sûrs constitue un élément important pour la gestion de la grippe saisonnière et est essentielle pour répondre aux crises épidémiques et pandémiques futures. Récemment, nos recherches ont permis de développer 5 molécules, inspiré du métabolisme cellulaire et possédant des propriétés anntivirale et anti-inflammatoire démontrée in vitro, là où les molécules antigrippales actuelles ciblent seulement le virus. La découverte est innovante et importante car : (i) elle propose l’utilisation d’un nouveau champ de molécules pour le traitement des infections virales pulmonaires, (ii) elle repose sur un mécanisme doublement bénéfique pour l’hôte (i.e. antivirale et anti-inflammatoire), (iii) elle présente une efficacité là où les médicaments actuellement « sur le marché » échouent. Ce projet vise à valider les propriétés antigrippales de ces molécules in vivo, et selon les voies d’administrations utilisées usuellement en clinique humaine. Ces données pré-cliniques seront le socle du développement de ces molécules vers un nouveau médicament antigrippal surpassant les capacités protectrices des traitements actuelles. A terme, ce projet vise à proposer un antigrippal innovant capable de diminuer l’impact sanitaire et économique considérable de la grippe dans le monde.
Procédures
Toutes les souris seront anesthésiées, 3 fois par injection intrapéritonéale pour une durée de quelques minutes, et une fois par anesthésie gazeuse pour une durée de quelques secondes, durant lesquelles elles recevront une instillation intranasale des molécules antivirales potentielles. Ces instillations ne durent que quelques secondes. Des administrations des molécules par voie orale et intraveineuses sur animal vigile seront également réalisées. Dans le cas d’une administration par voie orale, les souris sont tenues en contention permettant l’immobilisation de la souris vigile. La molécule est administrée à l’aide d’une canule de gavage. L’administration des molécules dans la veine caudale ne nécessite pas d’anesthésie. En effet, les souris sont placées 10min sous lampe chauffante afin de provoquer une dilatation de la veine. Les animaux sont ensuite placés dans un appareil de contention permettant l’immobilisation de la souris vigile. La molécule est administrée à l’aide d’une seringue.
Impact sur les animaux
L’anesthésie générale par voie intrapéritonéale, l’administration par voie orale et l’intraveineuse nécessite une contention ce qui peut engendrer du stress pour les animaux ainsi qu’une légère douleur au niveau du site d’injection pour l'intraveineuse et l'intrapéritonéale. L'anesthésie peut également entrainer un refroidissement de l’animal. Lors des anesthésies au temps le plus critique (J3) une lampe chauffante pourra être utilisée si la température des souris est faible. Une température trop faible entraînera l’euthanasie de l’animal. L’infection grippale provoque une hyper-inflammation pulmonaire aboutissant à des lésions du poumon et des difficultés respiratoires, de l’hypothermie, et de l’anorexie. Ces effets entrainent une perte de poids et peut mener à la mort de l’animal. Les instillations pulmonaires intranasales provoquent un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. L’infection grippale provoque une hyper-inflammation pulmonaire aboutissant à des lésions du poumon et des difficultés respiratoires, de l’hypothermie, et de l’anorexie. Ces effets entrainent une perte de poids et peut mener à la mort de l’animal.
Devenir
Procédure 1 « L’ensemble des animaux seront euthanasiés. Soit suite au franchissement de points limites ou en fin de procédure 1 après reprise du poids initial (21 jours post-infection)». Procédure 2 : « L’ensemble des animaux seront euthanasiés 4 jours post-infection (PROCEDURE 2). Les tissus respiratoires et sanguins seront collectés. Des analyses de charges virales, de médiateurs inflammatoires, de recrutement de cellules immunitaires et de lésions pulmonaires seront réalisés pour évaluer les propriétés protectrices de chaque traitement. »
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe est bien établi et maîtrisé par l’équipe.
Réduction
Les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, tout en permettant la réalisation de tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal. Dans cette optique, la procédure 1 sera réalisée en premier pour évaluer le potentiel protecteur de chaque molécule. Si une molécule ne permet pas de diminuer la perte de poids ou la mortalité induite par le virus grippal, elle ne sera pas incluse dans les tests de la procédure 2. Cela nous permettra de sélectionner uniquement les molécules ayant montré des effets bénéfiques visibles sur l’état général de l’hôte, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés au cours de la procédure 2. De plus, nous développons actuellement des modèles de coupes de poumons humains et murins. Cette technique permet de réaliser un grand nombre d'expériences à partir d’un seul donneur, tout en conservant la structure pulmonaire, la diversité cellulaire et l’interface air-liquide du poumon. Ainsi, nous pouvons effectuer un grand nombre de tests au plus proche de la physiologie pulmonaire, réduisant le nombre d’animaux utilisés. Les échantillons pulmonaires récupérés lors de la procédure 2 serviront notamment à consolider cette technique, qui, à terme, pourra permettre de s’affranchir d’une partie des tests animaux.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. A l’arrivée des souris dans l’établissement d’hébergement, une habituation de 7 jours sera réalisée avant toute manipulation. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Toute procédure d’instillation intranasale sera précédée d’une anesthésie des souris par voie intrapéritonéale ou gazeuse pour les animaux déjà infectés. Le réveil des animaux à lieu au maximum 20 minutes après l'anesthésie. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon quotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi des points limites, les souris présentant un de ces critères seront mises à mort.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris. Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris. Cette espèce est la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires, réduisant le besoin d'animaux pour des études préliminaires. Les souris sont facilement infectables par des souches adaptées de virus influenza humain et présentent des symptômes cliniques similaires à l'homme (anorexie, hyperinflammation pulmonaire, perte de poids et mortalité). Les de la souche selectionnée sont les plus couramment utilisées dans les études de physiopathologie et mécanistiques, mais également pour le développement d’outils thérapeutiques. Cette souche est appropriée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires et est un modèle bien établi d’infection grippale. Enfin, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 semaines pour avoir un système immunitaire mature.