Maladies infectieuses

2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On les infecte par le virus de la grippe puis, au septième jour, par le pneumocoque, une surinfection qui provoque troubles respiratoires, perte de poids et prostration et tue en deux à trois jours si elle n'est pas arrêtée, les instillations se faisant sous anesthésie parfois par incision de la trachée. Le porteur cherche à comprendre pourquoi les macrophages pulmonaires réagissent différemment chez la souris et chez l'humain, et à tester des molécules immunomodulatrices dont un brevet est en cours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la tolérance d'un "organisme entier", tout en décrivant des travaux sur tranches de poumon humain censés réduire le recours aux animaux.

Objectifs

Chaque année, la grippe saisonnière infecte plus d'un milliard de personnes (environ 20 % de la population mondiale). La versatilité de l’efficacité vaccinale, et l’absence d’antiviraux efficaces, peine à juguler les 500 000 décès annuels dus à la grippe. Cependant, lors d’une infection grippale, la morbi-mortalité n’est pas attribuée seulement au virus influenza, mais aussi à des co-infections bactériennes (40% dans notre service de réanimation). Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque) est le principal agent de ces co-infections, responsable de la sévérité de l’infection et de décès potentiels. Les macrophages alvéolaires (MAs) sont essentiels dans la défense contre les infections à pneumocoque. Une déplétion des MAs chez des souris avant une infection par le pneumocoque entraîne une multiplication bactérienne dans les poumons 100 fois plus élevée par rapport au groupe témoin. Pourtant, une infection grippale chez les souris diminue la population des MAs d’environ 80%. Nous avons mené une étude observationnelle chez l’homme pour confirmer et quantifier la déplétion des MAs après une infection grippale (étude multicentrique). Surprenamment, la quantité de MAs reste stable lors d’infections grippales chez l’homme, remettant en question nos connaissances actuelles sur le rôle des MAs. Notre objectif est de comprendre cette différence souris-homme. Nous souhaitons étudier des modèles de souris plus proches de la réalité humaine : dose virale faible, souris plus âgées, souris avec expérience d’infections antérieures. L’exposition à des composés microbiens façonne le développement et la fonctionnalité du système immunitaire, influant sur la réactivité des MAs aux défis ultérieurs par un phénomène appelé immunité entraînée. Nous avons récemment découvert qu'une reprogrammation métabolique des MAs pouvait altérer leurs propriétés immunitaires, et nous souhaitons étudier ce phénomène chez la souris (et chez l’homme) lors d’une surinfection grippale à pneumocoque. Enfin, nous avons démontré que certaines modifications métaboliques induites par le virus influenza pouvaient être inversées, notamment par l’ajout de succinate ou d’autres molécules immunomodulatrices (Demande de brevet en cours). Nous souhaitons évaluer si ces molécules pourraient représenter une nouvelle piste thérapeutique pour lutter contre les surinfections grippales à pneumocoque.

Bénéfices attendus

L’infection grippale est un problème de santé publique majeure ; chaque avancée dans notre compréhension est importante. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle préférentiel pour l’étude des pathologies respiratoires humaines. Nous avons récemment mis en évidence que l’une des faiblesses de ce modèle réside dans la différence entre les macrophages alvéolaires (MAs) murins et humains. Les MAs sont l’une des cellules les plus impliquées dans l’immunité pulmonaire, notamment dans les co-infections bactériennes, responsables de la gravité des présentations cliniques chez l’homme lors d’une infection grippale. Cette différence peut biaiser les recherches effectuées dans ce domaine et limiter la translation souris-homme des thérapies. Ainsi, nous proposons d’améliorer le modèle murin d’infection grippale et de surinfection bactérienne en nous rapprochant de la relevance humaine. Nous espérons que les résultats issus des expériences décrites ici vont faire rapidement progresser nos connaissances et fournir de nouvelles pistes de compréhension sur le rôle des MAs dans cette pathologie. Ce projet permettra d’améliorer la translationalité des recherches dans le contexte des pathologies respiratoires, et notamment des thérapies antigrippales. De plus, nous possédons déjà des molécules immunomodulatrices qui ont démontrées leur intérêt thérapeutique sur un modèle de cellules épithéliales infectées par le virus de la grippe, ainsi que sur un modèle murin d’infection in vivo. Certaines de ces molécules ont notamment un effet protecteur sur les MAs infectés par le virus de la grippe. Ces molécules proviennent d’un nouveau concept de défense immunitaire, l’immunometabolisme ; présentant plusieurs bénéfices attendus : Ces molécules naturelles et endogènes de l’homme (et non des drogues de synthèse), ont des propriétés antivirales à large spectre ainsi qu’un potentiel anti-inflammatoire puissant. Cette double action diminue le risque de résistance ; et permet de conserver un effet thérapeutique protecteur même dans le cas d’une instillation tardive, à l’inverse des molécules antivirales actuellement sur le marché. Pour l’ensemble de ces raisons, l’étude des MAs représente une avancée majeure pour lutter contre la grippe, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement efficace.

Procédures

Toutes les souris seront anesthésiées, par injection intrapéritonéale, 3 ou 4 fois selon les groupes, pour une durée quelques minutes à chaque fois, durant lesquelles elles recevront soit une instillation intranasale soit une instillation intra-trachéale. Cette dernière nécessite une petite incision en haut de la trachée. Ces instillations ne durent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale nécessite une contention pour l’injection intrapéritonéale ce qui peut engendrer du stress pour les animaux ainsi qu’une légère douleur au niveau du site d’injection. Cette anesthésie peut également entrainer un refroidissement de l’animal. Les instillations pulmonaires intranasales et intratrachéales provoquent un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. L’instillation intratrachéale nécessite une petite incision en haut de la trachée. Notre modèle d’infection grippale à faible dose virale entraîne des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal à partir du 7ème jour post-infection. La surinfection bactérienne a lieu au 7ème jour chez la souris et provoque une infection qui, si elle n’est pas contrôlée, aboutie à la mort des animaux en 2 à 3 jours. Le cumul de ces infections va induire une altération modérée de longue durée, affectant le bien-être et l'état général des animaux (troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité, température corporelle abaissée, prostration, fermeture totale ou partielle des yeux).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe est bien établi et maîtrisé par l’équipe. Par contre, un effort important est fait pour remplacer certaines explorations in vivo par la mise en place de différents modèles de macrophages alvéolaires in vitro et ex vivo (macrophages alvéolaires), pour étudier les altérations immunométaboliques induites par le virus de la grippe. Enfin, certaines explorations sont directement faites chez l’homme quand cela est possible (culture ex vivo de macrophage alvéolaire humain, coupe de poumon issue de pièce opératoire).

Réduction

Premièrement, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition, nous allons utiliser une technique d’instillation par la trachée. Cette technique permet une instillation dans seulement l’un des deux lobes pulmonaires. De fait, la souris représente son propre contrôle, divisant ainsi par deux le nombre d’animaux requis. Cette technique a été apprise lors d’un séjour d’étude à l’étranger et nous souhaitons la mettre en place dans notre laboratoire pour limiter le nombre d’animaux et les variations interindividuelles. Secondairement, nous allons récupérer les macrophages alvéolaires issus des souris entraînées ou traitées par des métabolites pour les cultiver en laboratoire. Cela permet de réaliser plusieurs types de tests sur des MAs issue d’une seule souris, limitant ainsi l’utilisation des animaux. Ajouté à cela, nous développons actuellement des modèles de tranches de poumons humains et murins. Cette technique, permet de réaliser un grand nombre de tranches de poumons à partir d’un seul donneur (environ 20 tranches par poumon de souris). Ce modèle permet à la fois de conserver la structure pulmonaire et la diversité cellulaire. Ainsi, cela permet la réalisation d’un grand nombre de tests au plus proche de la physiologie pulmonaire, réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …).

Raffinement

Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. A l’arrivée des souris dans l’établissement d’hébergement, une habituation de 7 jours sera réalisée avant toute manipulation. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Toutes procédures d’instillation intranasale ou intra-trachéale seront précédées d’une anesthésie des souris par voie intrapéritonéale ou gazeuse pour les animaux déjà infectés. L’état de sédation de l’animal suivant ces anesthésies sera de maximum 20 minutes. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les animaux ayant atteint le point limite seront euthanasiés.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris. Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris. Cette espèce est la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires, réduisant le besoin d'animaux pour des études préliminaires. Les souris sont facilement infectables par des souches adaptées de virus de la grippe humaine et présentent des symptômes cliniques similaires à l'homme (anorexie, hyperinflammation pulmonaire, perte de poids et mortalité). Les souris sont les plus couramment utilisées dans les études de physiopathologie et mécanistiques, mais également pour le développement d’outils thérapeutiques. Cette souche est appropriée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires et est un modèle bien établi d’infection grippale. Les MAs de ces souris semblent plus résistants à l’infection grippale, se rapprochant de la réponse des MAs humains. Enfin, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 semaines pour avoir un système immunitaire mature. Afin d’avoir des souris correspondant à l’âge moyen humain de notre étude (64 ans), des souris agées de 24 mois seront également utilisés.

960 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal est infecté par le virus de la grippe ou par la bactérie Pseudomonas aeruginosa par voie intranasale sous anesthésie, puis traité ou non par une molécule, l'infection pouvant provoquer perte de poids, hypothermie et léthargie pendant plusieurs jours. Le projet évalue l'efficacité antivirale et antibactérienne de cette molécule déjà active in vitro. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la tolérance d'un "organisme entier" et pourrait ramener le nombre de 960 à 384 souris si la première modalité fonctionne.

Objectifs

Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l’efficacité antivirale et antibactérienne d’une molécule que nous appelerons M, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées. Cette demande d’autorisation de projet est couplée avec une première demande qui évaluera au préalable la tolérance de la molécule M, in vivo, chez la souris saine.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à évaluer l’effet antiviral et antibactérien d’une nouvelle molécule prometteuse ayant une activité in vitro contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Avant d’être évaluées in vivo la molécule M a démontré son efficacité contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa in vitro à des doses non cytotoxiques. Au préalable, une étude de toxicité/tolérance sera réalisée (autre demande d'autorisation de projet). La dose la plus appropriée sera ensuite utilisée pour déterminer l’efficacité antivirale et antibactérienne, dans un modèle murin d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa, en traitement curatif. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa.

Procédures

Les souris seront infectées par le virus de la grippe ou P. aeruginosa, par voie intranasale, sous anesthésie générale, puis traitées ou non par la molécule M, administrée 1 à 3 fois, par voie intranasle, également sous anesthésie générale.La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes par souris jsuqu’à son réveil.

Impact sur les animaux

Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces. Par ailleurs, pour étudier l’efficacité de la molécule M vis-à-vis du virus de la grippe ou de P. aeruginosa, les souris seront infectées et feront donc l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids de chaque souris. Ces deux modèles d’infection peuvent conduire aux effets secondaires suivants : perte de poids, température, perte d’appétit, inactivité ou encore létargie, sur une durée allant jusqu’à 6 ou 7 jours post-infection pour la grippe. Le modèle d'infection pour P. aeruginosa est beaucoup plus court (48h). Afin d’éviter d’infliger une douleur et une souffrance à l’animal, nous avons établi plusieurs critères d’évaluation afin de déterminer très rapidement les points limites.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance et d'efficacité.

Remplacement

Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que les modèles murins d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa sont bien établis et maîtrisés par l’équipe. De plus, nous tenons à souligner que dans notre étude, la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antivirale contre le virus de la grippe et antibactérienne vis-à-vis de P. aeruginosa, à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.

Réduction

Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques. Ainsi, pour évaluer l’efficacité de la molécule M, vis-à-vis du virus de la grippe et de P. aeruginosa, un total de 960 souris au maximum sera nécessaire. Cependant, ce nombre sera réduit puisque 3 modalités de traitement sont envisagées, mais si la première modalité montre une efficacité antimicrobienne, les 2 autres modalités ne seront pas réalisés, réduisant le nombre de 960 à 384 souris.

Raffinement

Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.).

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous utiliserons des souris parce qu’il s’agit d'une espèce animale appropriée pour étudier l’inflammation, les réponses immunitaires et qu’il s’agit d’un modèle bien établi pour l'infection par le virus de la grippe et pour l'infection par P. aeruginosa. D’autre part, le modèle d’infection grippale et le modèle d'infection par P. aeruginosa sont pleinement maîtrisés, chez la souris, au laboratoire et les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Il existe également de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, le choix de cette espèce limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant, et nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles pour rechercher un éventuel "effet sexe".

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris reçoit une greffe de peau humaine sur le dos sous anesthésie, puis une injection de méningocoques qui déclenche une septicémie, évoluant selon le porteur d'une baisse d'activité vers la prostration puis la mort. Elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées car greffées et infectées, et sont tuées à la fin de chaque procédure. Le porteur décrit son modèle humanisé comme "le seul et unique" reproduisant ces infections chez la souris, pour étudier la résistance de la bactérie aux antibiotiques.

Objectifs

Les infections invasives à méningocoques sont causées par le méningocoque, une bactérie pathogène à Gram-négatif responsable de méningites et de chocs septiques. Ces infections restent malheureusement encore trop souvent létales malgré l’existence d’un traitement antibiotique. En effet, in vitro dans une boite de pétri, la bactérie est très sensible aux antibiotiques. Cependant, in vivo dans le corps humain, cette bactérie résiste aux traitements antibiotiques efficaces in vitro pour des raisons encore inconnues. L’objectif de ce projet est d’étudier les causes de cette antibiorésistance et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pour la contrer.

Bénéfices attendus

Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoques observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins entrainant le déclenchement d’une septicémie. A court et moyen terme, ce projet nous permettra : • D’étudier les déterminants impliqués dans la mise en place du phénomène de résistance aux antibiotiques • De tester et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrer la résistance aux antibiotiques A long terme nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme.

Procédures

Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 2 types d’expériences : 1. Des expériences où les animaux seront infectés par l’injection intraveineuse de bactéries. Les injections se feront via la veine caudale sur des animaux vigiles placé dans un tube de contention pendant 2min. Les animaux seront infectés pendant 3, 6 ou 16 heures puis seront mis à mort. 2. Des expériences d’imagerie intravitale pour l’étude de l’infection via des observations en microscopie réalisée in vivo, chez l’animal anesthésié. À la suite de l’infection des animaux par l'injection intraveineuse de bactéries, les observations seront réalisées pendant une période maximale de 6h00.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : • L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection intraveineuse de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.

Remplacement

Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilisent des cultures in vitro de cellules humaines infectées, notamment des cultures de cellules endothéliales ou épithéliales, les deux types cellulaires sur lesquels la bactérie peut se fixer. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoques.

Réduction

Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude où nous avons pu identifier plusieurs causes potentielles de perte d’animaux lors de nos expériences : 1. Une mort prématurée lors de la chirurgie de greffe de peau : hémorragie, non réveil de l’animal… 2. Une mauvaise évolution du greffon au cours du temps conduisant à l’exclusion de l’animal : lésions de grattage, diminution importante de la taille… 3. Une mauvaise qualité du greffon : présence de peu de vaisseaux humains 4. Une mort prématurée de l’animal lors des infections

Raffinement

Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ceux-ci seront hébergés dans une animalerie au statut SPF (specific pathogen free). Une inspection quotidienne permettra de vérifier qu’il n’y a aucune détérioration de leur état due à une potentielle infection. 30 minutes avant le début de la chirurgie, les animaux sont prémédiqués avec l’injection sous cutanée d’un antalgique et d’un anti-inflammatoire non stéroïdien. La chirurgie (~30 min) est réalisée sur des animaux anesthésiés,. Avant de placer les animaux greffés dans leur cage de réveil, ceux-ci sont réhydratés par une injection sous-cutanée de sérum physiologique. Les animaux sont ensuite placés dans une cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont observés quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie pendant le port de leur bandage afin de détecter des signes éventuels de souffrance et vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l’évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Les animaux sont placés après infection dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichi en sucres et dont la moitié du sol de la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux infectés. Lors des expériences d’exploration par microscopie optique confocale, les animaux reçoivent un traitement préopératoire analgésique 30 min avant le début de l’anesthésie et la chirurgie permettant d’exposer le greffon pour l’observation des vaisseaux humains. Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 3 par cage dans des cages contenant du coton et un igloo. Des points limites sont établis pour chacune des procédures expérimentales et associés à des interventions pour réduire leur impact sur le bien-être animal.

Choix des espèces

Cette étude utilise des souris car le système vasculaire et immunitaire de la souris est proche du système vasculaire et immunitaire humain. De plus les modèles immunodéficients disponibles chez cette espèce en font le modèle le choix pour la xénogreffe de peau humaine. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentions sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.

12 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent un cathéter par chirurgie, sont immunodéprimés, puis infectés aux poumons par une bactérie résistante aux antibiotiques, une infection que le porteur décrit comme pouvant provoquer une détresse respiratoire et la mort avant la mise à mort programmée. Les poumons et la rate sont ensuite prélevés pour analyse. Le porteur indique que cette étude prolonge des travaux déjà menés sur la souris et affirme qu'un "second modèle animal est nécessaire" pour confirmer les résultats, le lapin permettant selon lui d'humaniser le traitement antibiotique.

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer l’efficacité de la rifampicine dans un modèle d’infection pulmonaire à CRAb (Acinetobacter baumannii résistants au carbapénèmes) chez le lapin immunodéprimé. En effet les carbapénèmes constituaient la dernière ligne de traitement antibiotique efficace contre ce pathogène fréquemment associé aux infections nosocomiales (acquises en milieu hospitalier), telles que les pneumonies sévères acquises sous ventilation chez les patients de réanimation ou immunodéprimés. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude réalisée par le laboratoire ayant donnée de bons résultats avec la rifampicine chez le modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude déjà réalisée par notre équipe chez la souris où la rifampicine a entrainé une forte réduction bactérienne pulmonaire après l’infection par une souche d’Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes. La combinaison de la rifampicine avec un carbapénème (le méropénème) pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique contre les infections à A. baumannii résistant aux carbapénèmes.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de pose de cathéter veineux (30-45 min de l’anesthésie générale jusqu’au retour de l’animal dans sa cage). Ils subiront également une immunodépression via 3 injections d’un immunodepresseur par ce cathéter (1 min/ injection) puis une infection pulmonaire par inoculation intrabronchique de bactéries sous anesthésie générale (5-10 min de l’anesthésie jusqu’au retour de l’animal dans sa cage). Des traitements antibiotiques seront aussi réalisés par le cathéter (médié par une pompe pour le méropénème et effectué toutes les 8h pour la rifampicine)

Impact sur les animaux

1) Pose de cathéter : les animaux de ce projet devront subir un acte chirurgical pour la pose d’un cathéter veineux central. Cette chirurgie réalisée sous anesthésie générale et accompagnée d’une analgésie adaptée, reste un acte invasif susceptible d’entrainer une gêne ou une douleur chez l’animal. La pose de cathéter permettra de limiter l’impact (stress et douleur) des traitements répétés. 2) Immunodépression : elle peut entrainer des effets secondaires tels qu’une baisse d’activité et une diminution de la prise alimentaire témoignant d’un l’affaiblissement général de l’animal. 3) Infection : réalisée elle aussi sous anesthésie générale, l’infection par voie intra-trachéale entrainera chez les animaux témoins, une infection sévère impliquant parfois une détresse respiratoire pouvant aboutir à la mort. : Des points limites spécifiques à ces nuisances ont été mis en place afin de limiter au maximum la souffrance des animaux

Devenir

Les poumons et la rate des animaux de la procédure seront collectés pour réaliser des analyses histologiques et microbiologiques. Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure.

Remplacement

Des analyses in vitro ont déjà été réalisées sur l’efficacité de la rifampicine sur certaines souches d’Acinetobacter baumannii. Toutefois réussir à retranscrire la complexité d’une infection bactérienne pulmonaire ainsi que sa diffusion tissulaire et systémique n’est aujourd’hui possible qu’à travers les modèles in vivo. Le modèle murin a déjà apporté de précieux résultats mais un second modèle animal est nécessaire pour les confirmer. « L’humanisation » du traitement au méropénème, plus facilement réalisable chez le lapin, offrira une meilleure appréhension de ce qu’il pourrait se passer chez l’homme.

Réduction

Ce projet a pour but de compléter les effectifs de l’étude de l’efficacité de deux antibiotiques (en association ou non) dans un modèle d’infection pulmonaire chez le lapin. Les 12 lapins de ce projet nous permettrons d’augmenter nos effectifs à 6 animaux par groupe ce qui est, au vu de la variabilité déjà observée, le nombre minimum d’animaux nécessaire pour une comparaison statistique solide entre les groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés individuellement dans un environnement adapté, enrichi et seront surveillés au moins 2 fois par jour. Lors des pesées hebdomadaires précédent le projet, les animaux seront habitués à leur préhension et à leur contention. La pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie avec une analgésie. L’infection sera également réalisée sous anesthésie générale. Des critères d’arrêts de l’étude, supportés par une grille de score clinique, ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La mesure de l’efficacité de la rifampicine (antibiotique) ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal, ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique. Le lapin, de par ses similarités physiologiques et immunitaires avec l’homme, représente classiquement un des modèles de choix pour la réalisation d’infections bactériennes pulmonaires. Il est également particulièrement approprié à l’humanisation de la pharmacocinétique de traitement antibiotique. En effet, son grand volume sanguin permet de réaliser des études pharmacocinétiques précises, sur de longues périodes. Le système d’administration par des pompes contrôlées par ordinateur est difficilement adaptable à des animaux de petite taille comme la souris. L’étude débutera lorsque les lapins auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.