Maladies infectieuses

80 souris et 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés jusqu'à 168 heures dans des cages à métabolisme, sur grille et exposés à la lumière, ce que le porteur décrit lui-même comme un inconfort, après administration de candidats médicaments par diverses voies. Ces études d'excrétion s'inscrivent dans le cadre réglementaire obligatoire pour la mise sur le marché d'un médicament, et les animaux sont tués pour doser ce qui reste dans leur corps. Le porteur indique qu'il n'existe "aucun modèle in vitro" applicable à l'excrétion dans un organisme vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées dans le cadre des études de pharmacocinétique réalisées chez les rat ou les souris. Chaque étude permet d’évaluer le devenir de molécules contenues dans un candidat médicament dans l'organisme. L’objectif est de récolter des données concernant la quantité des molécules excrétées par rapport aux quantités administrés ainsi que de déterminer la durée d’excrétion. Après l'administration, des recueils d’urines, fèces ou de bile pour mesure de la concentration de la molécule seront réalisés. L’objectif de ces tests n’est pas de démontrer une efficacité de la molécule ou de mettre en relief les effets secondaires possibles, mais de démontrer que le produit est bien excrété du corps après une période définie.

Bénéfices attendus

Ce type d'étude permet de comprendre comment et pendant combien de temps des molécules sont excrétées de l'organisme après leur administration et sont nécessaires pour évaluer la sécurité d'un médicament.

Procédures

Les animaux sont placés individuellement dans les cages pendant une certaine durée : Pour les études d’excrétion biliaire (procédure 1), 3 à 4 jours d’acclimatation des rats sur litière + 24h maximum dans les cages à métabolisme. Pour les animaux utilisés pour les études d’excrétion urine et fèces (procédure 2), la durée, seul dans les cages à métabolisme, est au maximum de 168h. Les administrations iv, vaginale, rectale, oculaire, intranasale, intra-auriculaire, topique sont réalisées une seule fois sous anesthésie en moins d'une minute Les administration PO sont réalisées une seule fois sur animaux vigile en moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans le cas des études pour récupérer l'urine et fèces, les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme. Les animaux sont seuls dans la cage, sur grille et plus exposé à la lumière que dans les cages classiques, ce qui provoque un inconfort chez l’animal et ne correspond pas à son environnement habituel.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’étudier l’excrétion d’une molécule dans un organisme vivant. Un autre modèle n’est pas applicable dans la mesure où ces études rentrent dans un cadre réglementaire obligatoire pour la sécurité d'un médicament.

Réduction

Pour les études réglementaires le nombre minimum utilisé est défini par les guidances. Pour les études précoces dans le développement d’un médicament, un nombre d’animaux inférieur ou égal à celui recommandé par les guidances est utilisé. Dans la mesure du possible un maximum de données est collecté sur un même animal afin de ne pas avoir à reproduire l’expérimentation.

Raffinement

Une procédure de point limite est en place au laboratoire. Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, les cages sont regroupées sur le même portoir afin que les animaux soient proches l’un de l’autre pour favoriser le lien et la communication entre animaux (instinct grégaire). Une plaque métallique finement perforée est ajoutée dans les cages afin de permettre à l’animal de se reposer. Des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites (voir annexe) basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort.

Choix des espèces

Les espèces rat ou souris seront utilisées conformément aux guidances techniques. Le choix de l’espèce pour chaque étude sera en cohérence avec les espèces utilisées pour toutes les études nécessaires pour le dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) de la molécule. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 6 à 12 semaines conformément aux recommandations de la règlementation.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le champignon Candida albicans injecté dans la veine de la queue, puis suivies pendant deux à sept jours avant une prise de sang et une mise à mort par dislocation cervicale, pour étudier le rôle du gène Card9 des neutrophiles dans la dissémination de l'infection. Le porteur qualifie la dose de subléthale et estime la souffrance modérée, l'infection pouvant entraîner une perte de poids jusqu'au point limite de 20 %. Il indique avoir mené des expériences préliminaires in vitro et s'être limité à un seul modèle d'infection pour réduire le nombre d'animaux non-humains.

Objectifs

La présence de champignons dans les différents microbiotes de nos muqueuses, et notamment de l’intestin, est associée à diverses pathologies. Parmi les champignons intestinaux, le plus connu est Candida albicans. C'est une espèce pathogène opportuniste, c'est-à-dire qu'elle est la plupart du temps inoffensive, mais qu’elle peut déclencher une infection dans certaines circonstances, comme après un traitement antibiotique, une chimiothérapie intense ou dans le cas des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. En effet, un échec des cellules immunitaires à contrôler les champignons intestinaux, et notamment C. albicans, peut mener à ce type d’inflammation sévère et chronique de l'intestin. Il est ainsi important de comprendre le rôle des gènes de susceptibilité aux MICI également impliqués dans la réponse aux champignons. Par exemple, une mutation ponctuelle (appelé polymorphisme) dans le gène Card9 est associé au développement de MICI, et les mutations plus importantes entraînant une perte de fonction de la protéine CARD9 sont quant-à-elles associées à des infections fongiques invasives, notamment à C. albicans. CARD9 est exprimé dans les cellules de l'immunité innée, mais les types cellulaires impliqués dans la pathologie et les mécanismes en jeu ne sont pas connus. Nous avons montré in vitro que les neutrophiles mutés pour le gène Card9 ont une capacité réduite à éliminer C. albicans. Cependant, le rôle des neutrophiles, cellules immunitaires innées en première ligne de défense contre les envahisseurs, reste très peu compris. Les patients dont les neutrophiles ne sont pas fonctionnels peuvent développer différentes formes d'inflammation intestinale et les neutrophiles des patients atteints de MICI présentent des défauts fonctionnels. Ainsi, l’utilisation d’un modèle d'infection systémique nous permettra de mieux comprendre le rôle des altérations génétiques liées aux MICI, et notamment de CARD9, dans la réponse contre les champignons. Nous étudierons aussi d’autres gènes en lien avec CARD9 impliqués dans la reconnaissance des champignons par les neutrophiles.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances précieuses sur le rôle de Card9 et des neutrophiles dans le développement d'infections fongiques invasives, telles que celles causées par Candida albicans. Le modèle d'infection à Candida albicans par voie intraveineuse est un modèle très bien caractérisé, reproductible et qui permet de mimer les infections invasives humaines dues aux cathéters, notamment. Candida albicans est une levure naturellement présente dans l’organisme mais qui peut causer des infections graves chez des personnes immunodéprimées ou avec une mutation génétique dans CARD9 par exemple. En effet CARD9 est protecteur dans le sens où il permet de protéger l’organisme contre ces infections en éliminant le champignon. CARD9 est principalement exprimé sur les cellules de l’immunité innée, mais son rôle dans les différents types cellulaires (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques, monocytes…) reste inconnu. Ici, nous nous intéressons aux neutrophiles, d’où l’intérêt de la lignée mutée pour CARD9 dans les neutrophiles. Cependant il est important de comprendre comment CARD9 est activé, si cela passe par les récepteurs de surface aux champignons de type Dectin, ou pas ; et si les cellules de l’immunité adaptative ont effectivement aucun rôle dans le phénotype protecteur de CARD9, ou pas. Comprendre les mécanismes en jeu, et surtout les types cellulaires impliqués, permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives aux patients souffrant de ce type d'infection chronique et invasive.

Procédures

L'infection à C. albicans sera réalisée par injection intraveineuse dans la veine caudale, en une dose subléthale et unique, sur animal vigile. Le poids corporel sera suivi quotidiennement le jour d'avant et après l'infection, soit pendant 2 ou 7 jours (quelques secondes sur la balance). Les fèces seront prélevées quotidiennement, pendant 2 ou 7 jours. Pour cela, les souris sont délicatement déposées dans des pots en plastique. Lorsqu'elles ont fait 1-3 crottes (au bout de quelques minutes), elles sont rentrées dans leur cage. Le jour de la fin de l'expérimentation, 2 ou 7 jours après l'infection, nous réaliserons le prélèvement sanguin juste avant l’euthanasie de l’animal (300ul, 30 secondes environ).

Impact sur les animaux

La douleur imposée aux animaux est d'origine infectieuse. Du fait de l'utilisation d'une dose subléthale, c'est-à-dire ne menant pas à la mort de l'animal, on peut estimer que son intensité sera modérée. La douleur de la piqure est une douleur seuil considérée comme légère en expérimentation animale. Les animaux seront également pesés quotidiennement pendant 2 ou 7 jours, et placés quelques minutes dans des pots en plastique afin de prélever leurs fèces. Un prélèvement sanguin juste avant l’euthanasie de l’animal sera également réalisé.

Devenir

La méthode de mise à mort prévue à l'issue de chaque procédure est la dislocation cervicale. Celle-ci est réalisée dans une pièce dédiée (pièce de manipulation post-mortem) par des personnes formées et autorisées.

Remplacement

Des expériences préliminaires in vitro, sur neutrophiles murins de la moelle osseuse, ont été réalisées afin de remplacer des expériences in vivo et de ne réaliser qu'un seul modèle infectieux chez la souris pour ce projet. Par exemple, un « endpoint dilution assay » (dilution au point limite, où l'on compte grâce à un microscope le nombre de colonies de C.albicans ayant résisté aux neutrophiles) a permis de mettre en évidence que les neutrophiles mutés pour Card9 sont moins capables d'éliminer C. albicans in vitro. Ces résultats obtenus par expérimentation in vitro auraient pu faire l'objet d'expérimentation in vivo, par exemple par des modèles complémentaires d’infection à C. albicans par voie orale chez la souris. Nous avons décidé de nous limiter à ce modèle in vivo par voie intra-veineuse, pour réduire l’expérimentation animale tout en assurant une compréhension optimale de la maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux est basé sur le rapport de biostatisticiens. 20 souris par groupe sont nécessaires à l’obtention de différences statistiquement significatives pour l’étude de la résistance à l’infection et de la dissémination dans les organes à 2 ou 7 jours. Cela prend en compte un effet attendu de ±60% (hypothèse nulle moyenne de 1500 cfu C. albicans/organe dans le groupe contrôle, hypothèse nulle alternative de 2400 cfuC. albicans/organe dans le groupe expérimental), une P-value de 5%, puissance de 80%, déviation standard Sigma de 0,5, et test 2-sided. Nous utiliserons des groupes de mâles et de femelles afin d'optimiser l'utilisation des souris générées pour ce projet, tout en veillant à ce que les souris mutées et leurs contrôles soient du même sexe, afin de pouvoir conclure quant à l’importance de la mutation sur le contrôle de la dissémination du champignon.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions standard. Nous veillerons à enrichir le milieu de vie par l’ajout de feuille de cellulose dans les cages et d’un abri prévu à cet effet. Les souris seront au maximum 5 par cage. Les souris seront observées quotidiennement afin de surveiller leur état de santé et bien-être. Si un animal des signes liés à la perte de poids et à la déshydratation (sans atteindre une perte de 20% correspondant au point limite), du Diet Gel sera placé dans la cage afin de faciliter l’accès pour l’animal à une source d’hydratation. Si la perte de poids atteints 20% du poids initial, l’animal sera mis à mort par limiter sa souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé dans le cadre de l'étude de pathologies intestinales humaines. Le modèle d'infection à C. albicans par voie intraveineuse est un modèle très bien caractérisé, reproductible et qui permet de mimer les infections invasives humaines dues aux cathéters notamment, dans le contexte nosocomial. Les lignées utilisées sont déjà en élevage. Aucun de ces génotypes n'est dommageable. Nous utiliserons des souris de fond génétique C57BL/6, âgées au début de chaque expérimentation de 7 à 11 semaines, mâles ou femelles, afin d'optimiser l'utilisation des animaux. A chaque fois, les souris mutées et leurs contrôles seront du même sexe. Les souirs utlisées seront âgées d'au minimum 7 semaines, soit à partir du moment où le système immunitaire est mature. L'utilisation de l'espèce Mus musculus pour l'étude des infections fongiques invasives à Candida albicans est cruciale pour mieux en comprendre le mécanisme infectieux dans un organisme complexe. Cela permettra de développer des solutions préventives et thérapeutiques innovantes pour les patients souffrant d'un affaiblissement immunitaire, soit causé par une mutation génétique, soit par un contexte fragilisant comme les séjours prolongés à l'hôpital.

12 singes verts vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés en vie à l'issue de ce projet. Ils reçoivent deux injections d'un candidat vaccin contre le virus Nipah et des prélèvements sanguins réguliers, puis une chirurgie abdominale d'une heure pour poser un implant de télémétrie et cathétériser l'artère fémorale. Le porteur agit comme fournisseur d'animaux et prépare ces primates pour une épreuve infectieuse ultérieure menée sur un autre site en laboratoire de haute sécurité. Il affirme que le recours à une espèce de primate sur "organisme entier" ne peut être remplacé.

Objectifs

Le projet consiste en deux phases : - Immunisation des animaux avec un candidat-vaccin contre le virus Nipah en vu d’un challenge infectieux quelques semaines plus tard pour mesurer l’efficacité de ce candidat-vaccin; - La pose d’implant de télémétrie. Elle pour but d’assurer une meilleure surveillance des animaux lors du challenge vaccinal dans un but de raffinement de la sévérité de la procédure finale. La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle, activité). Cela permet d’obtenir des données physiologiques continues sans stresser les animaux (pas de contention); de plus, cela permet des mesures en temps réel à distance, afin d’être le plus prédictif possible d’un changement d’état physiologique de l’animal et une intervention rapide du personnel (atteinte de point-limite….)

Bénéfices attendus

- La phase d’immunisation a pour but de tester l’efficacité d’un nouveau candidat-vaccin contre le virus Nipah. Le virus Nipah est un virus zoonotique émergent ; il est classé comme maladie prioritaire par l’Organisation Mondiale de la Santé, n’ayant à ce jour pas de traitement ni de vaccin agréé. Le candidat vaccin que nous proposons se base sur la technologie du ciblage des cellules présentatrices d’antigènes (cellules dendritiques) à l’aide d’anticorps monoclonaux associés aux antigènes vaccinaux. Il a été démontré dans des modèles animaux (souris humanisées, singes) que cette approche permet d’induire une réponse immunitaire forte et protectrice contre différentes maladies infectieuses, notamment contre le VIH-1 (virus du SIDA) ou le SARS-COv2 (virus de la COVID-19). Des candidats vaccins pour le SARS-Cov2 et le VIH ont pu être produits avec des premiers essais cliniques débuté en 2021. Une approche identique mais appliquée au virus Nipah a été développée. Les premières données obtenues sur souris, en lien avec nos observations précédentes chez le primate dans d’autres pathologies, laissent présager une bonne capacité des animaux immunisés avec ce vaccin à pouvoir se protéger contre l’infection Nipah, et de pouvoir ensuite développer ce vaccin pour l'Homme. - La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle, activité). En phase d'essai vaccinal, il est important de pouvoir suivre les animaux en continu car le virus Nipah peut être responsable de formes sévères/suraiguës. De plus cette phase se déroule dans un laboratoire biosécurité niveau 4 en raison de l’infectiosité du virus, les conditions d’accès en sont très restreintes. Cela permet de raffiner la procédure avec l’obtention de données physiologiques continues sans stresser les animaux, et en étant plus prédictif « en direct » sur toute modification de l’état de l’animal pour une intervention plus rapide en cas d’atteinte de points-limites plus précoces (monitoring avec système d’alerte possible).

Procédures

Le projet se développe en deux phases : - La phase d’immunisation consiste en l’administration d’un candidat-vaccin ou d’un placebo selon les groupes d’études (2 injections par voie sous-cutanée à 4 semaines d’intervalle) associée à un suivi de la réaction immunitaire par des prélèvements sanguins réalisés environ toutes les 2 semaines au cours de l’étude. Les manipulations pour cette phase prennent environ 15 minutes pour chaque manipulation par animal (capture, contention et injection et/ou prélèvement sanguin) - La phase de télémétrie consiste en la réalisation, sous anesthésie générale et analgésie, d’une chirurgie abdominale pour la pose d’un implant intra-abdominal et une cathérisation vasculaire de l’artère fémorale sur les animaux de l’étude ; la chirurgie dure environ une heure par animal, et la convalescence complète 5 à 7 jours.

Impact sur les animaux

Phase d’immunisation : Le protocole d’immunisation est constitué de 2 injections à 1 mois d’intervalle par voie sous-cutanée et constitue donc juste la nuisance de l’introduction d’une aiguille et l’injection d’un faible volume (1mL) de solution. Les études précédentes n’ont pas montré d’effets indésirables sur les animaux, hormis des réactions locales mineures. L’essai clinique de Phase I en cours du vaccin DC/VIH n’a montré aucune réaction adverse à ce jour. Comme pour tout élément d’essai, des effets secondaires peuvent survenir. Les risques les plus probables sont : réaction locale (douleur, inflammation transitoire) au point d’injection, baisse transitoire de l’état général, hyperthermie/syndrome fébrile transitoire. Des soins vétérinaires appropriés seront apportés aux animaux si besoin ; Cette phase inclut également des prélèvements sanguins réguliers. L’acte de prélèvement sanguin entraine une légère douleur chez l’animal (introduction d’une aiguille), et peut potentiellement entrainer des hématomes post-prélèvements. Tous les prélèvements sont effectués par du personnel expérimenté au geste technique. La majorité des prélèvements sont faits sous anesthésie générale pour réduire l’inconfort et le stress des animaux pendant l’acte, et des soins adaptés sont mis en place en cas de petit saignement ou hématome post-prélèvement. Phase de télémétrie : Les animaux devant subir une chirurgie, les effets probables sur les animaux seront ceux inhérents à une telle intervention : - de la douleur per et post-opératoires. Cela peut entrainer secondairement une baisse de l’activité et une diminution de l’appétit transitoire pendant quelques jours après la chirurgie. La douleur sera gérée par une anesthésie et une analgésie per et post-opératoires adaptées. De plus, inhérent à toute intervention de ce type, les risques possibles sont : - risque anesthésique, - risque d’infection, - risque hémorragique per-opératoire, - risque vasculaire sur le membre postérieur cathétérisé. Tout est mis en oeuvre pour que ces risques soient limités au maximum. Une prise en charge vétérinaire rapide sera mise en place si besoin.

Devenir

L’ensemble des animaux de l’étude participe à la phase immunisation et à la phase télémétrie de l’étude. Tous les animaux sont gardés en vie en fin d’étude, le projet s’inscrivant comme phase de préparation des animaux en vue d’une étude de challenge vaccinal sur un autre site.

Remplacement

Ce projet a pour objectif de fournir des animaux immunisés et « équipés » en télémétrie pour la réalisation d’une étude ultérieure. Ce projet est un service réalisé dans le cadre de notre activité de fourniture d’animaux. La nécessité scientifique de l’utilisation d’animaux est faite en amont par les utilisateurs des animaux ; Leur projet de recherche est déclaré et agréé par les autorités compétentes selon la règlementation en vigueur. Ce projet doit se faire sur un organisme entier et sur une espèce Primate, et ne peut pas être remplacé par d’autres modèles in silico, in vitro ou in vivo sur autres espèces pour des résultats scientifiques équivalents.

Réduction

Le nombre d’animaux a été étudié par l’utilisateur final pour réduire au maximum le nombre d’animaux en garantissant que son étude de challenge vaccinal permette une analyse statistique pertinente de l’efficacité de son candidat-vaccin.Les douze animaux seront divisés en 2 groupes. Le groupe non-immunisé a été réduit ad minima (3 animaux) car les données collectées dans ce groupe seront associées à celles déjà acquises lors d’études précédentes (n=5) ; cela permet de réduire le nombre d’animaux total pour le projet. Afin de respecter une représentativité en male/femelle et de pouvoir avoir une comparaison statistiquement correcte, 9 animaux seront vaccinés.

Raffinement

Phase immunisation : La phase d’immunisation se déroule dans notre établissement. Cela permet de garder les animaux plus longtemps dans des conditions d’hébergements optimisées et moins contraignantes que dans l’Etablissement Utilisateur final où aura lieu le challenge vaccinal, et où les conditions d’hébergement sont plus contraintes pour des raisons de biosécurité. L’immunisation, bien que se limitant à l’introduction d’une aiguille et à l’injection d’un faible volume, est réalisée sous anesthésie générale légère pour limiter le stress et l’inconfort de l’animal au moment de l’injection. Raffinement des procédures de prélèvements sanguins : les volumes et les procédures de laboratoire ont été optimisées pour réduire au maximum les volumes prélevés sur les animaux pendant l’étude. Tous les gestes de prélèvements sanguins sont réalisés par des personnes formées et expérimentées sur ce geste. La majorité des prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie générale légère pour limiter l’inconfort des animaux lié ce geste. Phase télémétrie : La réalisation de ce projet s’inscrit pleinement dans un objectif de raffinement puisque cela permet une meilleure surveillance des animaux per-étude lors du challenge vaccinal : acquisition de mesures physiologiques sans intervention sur les animaux ; cela a pour but de pouvoir intervenir le plus tôt possible en anticipant les points-limites de l’étude concernée (système d’alerte lors d’atteinte de paramètres limites) dans un contexte d’une étude en infectiologie avec modification rapide possible de l’état physiologique des animaux (formes suraigüe de la maladie). Dans un but de raffinement de la technique elle-même pour ce projet, la chirurgie sera réalisée par un.e chirurgien.ne expérimenté.e dans cette technique d’implantation afin d’optimiser la réussite du projet et encadrée par une équipe vétérinaire formée à l’anesthésie.

Choix des espèces

La pertinence de l’utilisation du singe vert pour le projet de recherche a été établie par l’utilisateur final. Le Singe vert est une espèce phylogéniquement proche de l’homme et particulièrement sensible au virus Nipah considéré dans le projet. Le modèle d’infection par le virus Nipah du Singe vert est un modèle complexe qui a été parfaitement établi par d’autres équipes de recherche françaises, avec notamment un descriptif complet de la physiopathologie, de la réplication virale de la survie, selon le mode et la dose d’infection. Le choix du stade physiologique et du sexe des animaux est décidé dans le cadre de l’étude finale. Le contexte actuel d’approvisionnement en primates permet d’avoir essentiellement des juvéniles, on veillera que les animaux soient assez gros pour la réalisation technique de la chirurgie. Le modèle d’infection du Singe vert par Nipah ne montre pas de différences notables entre les mâles et les femelles. Les animaux des deux sexes seront donc utilisés (6 mâles et 6 femelles).

73 macaques à longue queue vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est infecté par le virus de la grippe puis par la bactérie Streptococcus pneumoniae pour reproduire une surinfection pulmonaire, avec prélèvements sanguins répétés, puce implantée sous la peau, imagerie scanner et PET, et parfois biopsies de ganglions, de moelle osseuse et de poumon. Le porteur indique que les animaux infectés seront tués pour analyse et que douze animaux non infectés pourront être réutilisés dans d'autres procédures. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire ne peut être étudiée in vitro et conclut qu'un modèle animal est "nécessaire".

Objectifs

Streptococcus pneumoniae (ou S. pneumoniae) est une bactérie pathogène qui provoque des pneumonies pouvant évoluer en bactériémie (présence de bactéries dans le sang). Le plus souvent, chez l’adulte, l’infection à S. pneumoniae a lieu à la suite d’une infection pulmonaire par des virus, comme le virus de la grippe. Cette surinfection est responsable d’une augmentation significative de la morbidité et de la mortalité chez les patients doublement infectés, notamment lors d’épidémie de grippe. Les souches cliniques de S. pneumoniae sont souvent résistantes aux antibiotiques, ce qui complique la prise en charge des patients. A ce titre, S. pneumoniae fait partie de la liste émise par l’OMS en 2017 des 12 agents pathogènes prioritaires contre lesquels il est urgent d'avoir de nouveaux antibiotiques. En l'absence de nouveaux antibiotiques à moyen terme, une des voies de recherche pour combattre ces infections est l'activation de la réponse immune par des traitements immunostimulants. Plusieurs études montrent que la flagelline (une protéine du flagelle d'une autre catégorie de bactéries) peut activer la réponse inflammatoire. L'action adjuvante de la flagelline en supplément d'un antibiotique a été démontrée dans le cas d'infection à S. pneumoniae chez la souris, avec une augmentation de la résistance à la pneumonie aiguë grâce à une réponse immunitaire stimulée. Dans ce projet, nous étudierons l'action de la flagelline sur les infections à S. pneumoniae chez le primate non-humain, pour confirmer l'intérêt de cette protéine comme adjuvant dans ce type d'infection avant les études cliniques chez l'Homme.

Bénéfices attendus

L’augmentation de souches résistantes aux antibiotiques de S. pneumoniae rend urgente la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet doit déterminer le potentiel thérapeutique de la combinaison d'un traitement antibiotique avec une molécule immunostimulante, la flagelline. Les résultats, obtenus dans un modèle animal proche de l’Homme, fourniront les informations réglementaires nécessaires pour envisager de rendre ce nouveau traitement disponible chez l’Homme. À terme, l'objectif est de mettre en place des traitements similaires contre d’autres bactéries résistantes aux antibiotiques.

Procédures

Toutes les interventions et prélèvements sur animaux seront réalisés sous anesthésie. Tous les prélèvements et interventions réalisés le même jour seront effectués au cours de la même anesthésie. Les animaux seront exposés au virus de la grippe et à la bactérie S. pneumoniae au début de l’étude, pour reproduire la surinfection observée chez les patients. Pour cette exposition, les animaux seront anesthésiés pendant 30-45 min. Des prélèvements sanguins seront effectués régulièrement tout au long de l’étude, qui durera environ 1 mois. Les premiers animaux seront prélevés 1-2 fois avant l’infection grippe puis tous les 1-3 jours à partir de l’infection grippe jusqu’à la fin de l’étude (20 jours), afin de suivre au plus près la progression de l’infection . Pour les animaux suivants, la fréquence des prélèvements sera ajustée grâce aux données obtenues sur les premiers animaux, afin de limiter les interventions sur l’animal tout en assurant un bon suivi de l’infection. Pour chaque prélèvement, les animaux seront anesthésiés 10-15 min. Des puces de suivi de la température seront implantées en sous-cutané au début de l’étude, en même temps que les prélèvements. Ceci rajoutera environ 30-45 min d’anesthésie. Elles seront extraites à l’euthanasie des animaux. Des séances d’imagerie (scan des poumons aux rayons X (CT), tomographie par émission de positons (PET)) seront réalisées en baseline, juste après l’infection grippale (J-3), au pic de l’infection bactérienne et plus tardivement , en même temps que les prélèvements. Les séances de CT rajouteront 30-45 min d’anesthésie et les séances de PET-CT environ 2h. Certains animaux recevront un traitement antibiotique par injection intramusculaire ou intraveineuse une fois par jour tout au long de l’infection bactérienne . Pour chaque traitement, l’anesthésie durera entre 5 et 10 min par animal. En cas de résultats inattendus lors des premières infections, des biopsies tissulaires (ganglions, moelle osseuse, biopsie pulmonaire) pourront être mise en place lors des infections suivantes pour approfondir l’étude de la réponse immunitaire. Dans ce cas, chaque type de biopsie sera réalisée deux fois : une fois avant l’étude et une fois au cours de l’étude. Ces interventions rajouteront environ 30 min à 1h d’anesthésie.

Impact sur les animaux

L’infection grippale peut causer de la fièvre, de la toux et un encombrement bronchique. La surinfection par S. pneumoniae exacerbe ces symptômes. L’état des animaux sera observé quotidiennement, les signes cliniques seront suivis à chaque intervention grâce à une grille de scoring et des critères d’arrêt sont prévus dans le projet en cas de progression de la maladie ou d’éventuels effets inattendus du traitement. Les animaux non-infectés seront hébergés en groupe. Afin d’éviter des contaminations croisées, les animaux infectés seront hébergés en cages individuelles dans des modules contigus permettant des interactions sociales. Ils bénéficieront d’un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie, qui sera renforcé lors des phases d’hébergement individuel.

Devenir

Tous les animaux infectés seront euthanasiés afin de réaliser une analyse histopathologique et des dosages sur les tissus. Les animaux non-infectés pourront être inclus dans d’autres procédures compatibles avec l’historique de l’animal, après récupération complète de l’animal et sur avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l’apport d’une molécule immunomodulatrice au traitement contre les infections à S. pneumoniae résistantes aux antibiotiques. Ceci nécessite un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires et les changements induits suite à l’infection et aux traitements. A ce jour, ces différents éléments ne peuvent pas être étudiés in vitro puisque la mise en place de la réponse immunitaire a lieu dans différents organes (ganglions, organes lymphoïde secondaire) et son évaluation se fait à la fois au niveau systémique et au niveau local (muqueuse). De plus, pour des raisons éthiques, les évaluations de nouveaux traitements thérapeutiques ne peuvent avoir lieu directement chez l'Homme. L’utilisation de modèles animaux est donc nécessaire pour ce projet.

Réduction

Lors des étapes de mise au point (du modèle d’infection, du traitement), les différents paramètres seront testés sur un petit nombre d’animaux, suffisant pour faire des comparaisons qualitatives. Les conditions seront testées séquentiellement afin d’ajuster les protocoles des expériences suivantes en fonction des résultats obtenus. Le raffinement de la dose de bactérie se fera selon un procédé itératif déjà publié dans la littérature scientifique, ce qui nous permettra d’optimiser l’utilisation des animaux et donc de réduire les effectifs. Pour l’évaluation de l’efficacité du traitement, le nombre d’animaux par groupe est le minimum permettant une analyse statistique fiable des résultats (cliniques, hématologiques, réponse humorale, réponse cellulaire).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes avant exposition aux pathogènes et en hébergements individuels contigus permettant des interactions sociales pendant la phase d’infection (conservation du contact sensoriel avec plaques translucides entre les cages latérales, et cages face à face séparées par 2 m). L’enrichissement sera augmenté pour les animaux hébergés individuellement (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles au lieu d’une fois). Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température par puces électroniques implantées en sous-cutané dans le dos de l’animal (diurne et nocturne) et pour éviter les contaminations croisées amenant à une surexposition virale ou bactérienne. Les prélèvements et interventions sur les animaux seront effectués sous anesthésie pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs. L’état général des animaux sera observé quotidiennement, les signes cliniques seront suivis à chaque intervention grâce à une grille de scoring, et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Le recours à des techniques d’analgésie et d’antalgie pourra être envisagé si nécessaire. Les points limites seront raffinés en fonction des résultats obtenus au cours de la mise en place du modèle.

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle primate non-humain est choisi pour sa proximité génétique et physiologique avec l'Homme, ce qui en fait le modèle le plus pertinent pour l’évaluation de traitements immunostimulants. Les réponses immunitaires chez le primate non-humain sont similaires à celles de l’Homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés chez cette espèce. De plus, l’appareil respiratoire des primates non-humains est très proche de celui des hommes par sa structure et ses dimensions. Enfin, les macaques sont susceptibles aux infections par le pathogène S. pneumoniae. Ces études seront réalisées sur des animaux adultes de plus de 2 ans, d’environ 2,5 à 8 kg. Le traitement à tester étant destiné principalement à la population adulte et le système immunitaire évoluant en fonction du stade de développement et de l’âge individus, des animaux au système immunitaire mature seront donc utilisés dans ce projet.

20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit une injection de la bactérie de la syphilis directement dans les testicules sous anesthésie générale, puis des prises de sang à l'oreille deux fois par semaine pendant six semaines, jusqu'au développement d'une orchite. Les animaux sont ensuite tués pour prélever les tréponèmes présents dans le tissu testiculaire. Le porteur présente le lapin comme le seul modèle connu et affirme qu'une fois la culture en milieu axénique maîtrisée, il s'abstiendra du recours à l'expérimentation animale.

Objectifs

Notre projet a pour but l'obtention de suffisamment de matière infectieuse prélevée sur des lésions de syphilis primaire induites chez le lapin au niveau des testicules inoculé à partir de souche établit ou de prélèvements cliniques. Ce broyat testiculaire de lapin sera mis en culture dans les différents milieux mis au point par notre équipe. L’infectiosité sera suivie au cours du temps par PCR mais aussi par inoculation à d’autres lapins. Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable. Ainsi nous nous abstiendrons du recourt à l’expérimentation animale quand cette technique sera maîtrisée.

Bénéfices attendus

Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable pour l'isolement de nouvelles souches cliniques ainsi que pour leur production. L'étape d'injection des testicules de lapin est primordiale pour la mise au point de milieu de culture optimum afin de s'abstenir à terme de l'utlisation d'animaux ou d'en réduire au maximum son utilisation.

Procédures

Inoculation par injection intra testiculaire sous anesthésie générale pour une durée prévue entre 15 à 20 minutes maximum. Le prélèvement sanguin auriculaire sera effectué sur des animaux vigiles après application de crème anesthésiante locale de type EMLA 5%. Les animaux sont placés dans des boites de contention le temps du prélèvement pour une durée prévue entre 10 à 15 minutes, 2 fois par semaine pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le suivi des lapins se fera pendant les six semaines qui suivront l’inoculation. Le développement d’une orchite est attendu. D’après la littérature, les lapins sont sacrifiés dès l'apparition de l'orchite afin de prélever les treponema présents dans le tissus testiculaire. Des prises de sang auront lieu 1 fois par semaine (suivi PCR et sérologie). A l’issu, ils seront euthanasiés et prélevés.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure. En effet, les individus infectés ne peuvent pas être utilisés dans une nouvelle procédure ni proposé à l'adoption.

Remplacement

La syphilis est due à Treponema pallidium, bactérie spirochète, observée au microscope au début du siècle dernier, mais qui n’a jamais été mise en culture axénique. Depuis un an, notre équipe tente la culture ultrapure de l’agent de la syphilis (T. pallidium) dans un milieu axénique (en absence de tout autre organisme, dans un milieu stérile, exempt de tout autre agent biologique). Les résultats obtenus, s’ils montrent que des cultures restent positives au test moléculaire (détection de l’ADN) de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), ne peuvent pas objectiver la viabilité des éventuelles bactéries cultivées. Le passage à l’essai in vivo chez le lapin (seul connu pour être un bon modèle) devient une étape obligatoire d’une recherche scientifique, qui une fois que la culture axénique de T. pallidum sera maîtrisée, s’abstiendra d’avoir recours à l’expérimentation animale. Des animaux destinés à la recherche seront donc utilisés, de manière ponctuelle, dans ce projet.

Réduction

Afin d'estimer au mieux le nombre d'animaux pour l’isolement de souche clinique et leur production, nous avons utilisé le concept de l'effet de taille (effect size). On s'attend à ce que plus l'effet soit fort (donc la différence est grande), plus la taille de l’échantillon nécessaire sera petite. Pour se faire, deux moyennes ont été comparées, une moyenne théorique (mt) de 25% a été choisie en se référant aux données bibliographiques, et la comparaison a été faite pour un effet fort (80%), qui représente ici le taux d’infections réussies avec une puissance de 0,9 et un risque (alpha) de 0,05. Le nombre de lapins nécessaires pour la production est fixé à 2 lapins pour chaque inoculum bactérien, si 10 souches par an, nous aurons besoin de 20 lapins par an, soit 100 lapins sur 5 ans. En ce qui concerne l’isolement d’une souche clinique, la faible quantité et concentration de départ nous oblige à ne prévoir qu’un seul lapin par souche, ce qui correspond à 10 lapins par souche clinique par an, soit sur 5 ans: 50 lapins. Au total, sur 5 ans, nous pensons avoir recours à 150 lapins.

Raffinement

Par ailleurs, les animaux bénéficient d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin de leur assurer un bien-être optimal tout au long des études. Ce suivie est réalisé par du personnel habilité. Des éléments à ronger, de la paille à ronger et d'autres enrichissement seront fournis aux lapins afin qu’ils puissent se divertir. Les lapins seront hébergés dans des cages individuelles munies d’une plateforme non métallique répondant aux normes. Les manifestations de la douleur seront suivies rigoureusement grâce à une grille d’évaluation (voir annexe) (adaptée de celle de Morton et Griffiths 1985) et tout signe de douleur sera tout de même soulagé par une pommade anti-inflammatoire (Betneval® 0,1 %). De plus, une anesthésie profonde est préconisée avant l’euthanasie des lapins de laboratoire afin de réduire le plus possible la douleur et la détresse de l’animal. Cela est préconisé dans la directive du Parlement Européen et du Conseil relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques : (https://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=COM:2008:0135:FIN:FR:PDF ). La voie IM est la voie préconisée pour l’administration de la combinaison kétamine/xylazine chez le lapin, car elle est non douloureuse. Cela a été décrit par Lipman et al. (Lab Anim Sci. 1990, 40(4):395-8).

Choix des espèces

Le choix du lapin est basé sur les informations bibliographiques dans le domaine de laproduction et isolement d'agent de la syphilis. Le modèle lapin a déjà été prouvé et validé pour l'infection par Treponema pallidum. Nous allons utiliser des sujets adultes dont le volume des organes cibles de cette infection (testicule de lapin) est suffisant et capable de contenir l’infection sans induire de choc infectieux(septicémie) fatal.

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.