Maladies infectieuses

Pour valider une méthode mesurant si des œufs d'Echinococcus prélevés sur des aliments restent infectieux, 90 souris reçoivent ces œufs en injection sous la peau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une masse parasitaire se développe au point d'injection sur une période allant jusqu'à quatorze semaines, avec possibles lésions ou abcès. La mise à mort est requise pour observer le développement du parasite par identification moléculaire. Le porteur signale qu'une méthode in vitro est en cours de développement au laboratoire, mais qu'elle n'est pas encore comparable.

Objectifs

Contexte : Les échinococcoses sont des maladies parasitaires transmises par les aliments d’importance majeures au niveau européen et mondial. Deux formes de ce parasite sont décrites en France, l'échinococcose alvéolaire (EA) et l'échinococcose kystique (EK). Chez l’Homme, les deux maladies ont une localisation principalement au niveau du foie mais également des poumons pour l’EK. Elles se caractérisent toutes deux par une longue période asymptomatique pouvant atteindre 15 ans, rendant presque impossible l’identification précise des sources individuelles de contamination. L'Homme se contamine par ingestion accidentelle d’œufs microscopiques du parasite disséminés dans l’environnement (aliments non cuits, sol, eau, etc…) via des selles de carnivores (essentiellement renards et chiens contaminés). En Europe, dans les salades et les baies, les taux de contamination de ces parasites sont estimés entre 0 et 7%, avec une moyenne de 1 à 5 œufs détectés. La viabilité d’œufs provenant d’aliments de consommation humaine n’a jamais pu être démontrée directement faute de méthode adaptée. Une seule étude, datant de 2015, a démontré un développement dans 100% des souris (4/4) après une inoculation en sous-cutanée de 20 œufs de parasites. Ainsi, aucune donnée n’est existante pour une quantité inférieure à 20 œufs, ni avec des œufs isolés à partir d’aliments de consommation humaine. L’objectif de l’étude : Valider la méthode de viabilité chez des souris, utilisée dans une publication de 2015, pour deux espèces principales d’échinocoques. Les œufs seront inoculés en sous-cutanée avec et sans débris d’aliments afin de reproduire les conditions de la publication et d’adapter la méthode pour répondre aux enjeux. Perspectives et enjeux globaux : L’étape suivante sera donc d’évaluer la sensibilité de cette même méthode pour de faibles quantités de parasites (5 à 1 œuf), représentatives des taux moyens retrouvés sur des aliments contaminés (salades, baies, etc…). Ainsi, cette méthode de viabilité pourrait être utilisée à partir d’aliments collectées sur le terrain pour contribuer à l’évaluation du risque de contamination alimentaire pour l’Homme.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote permettra d’évaluer pour la première fois la sensibilité de l’approche in vivo en sous-cutanée sur deux espèces d’échinocoque en présence et absence de matrice alimentaire. Les données produites serviront ensuite à mettre en place des études visant à évaluer la pertinence de l’approche in vivo pour prouver la contamination de matrices alimentaires par des œufs viables d’échinocoques pour la première fois et d’en estimer la proportion. En effet, la viabilité d’œufs d’échinocoques sur des matrices alimentaires n’a encore jamais été démontrée alors que pourtant admise d’où la classification comme parasites transmis par les aliments. Disposer de données sur la proportion d’échantillons de type salades, fraises ou myrtilles contaminés par des œufs infectieux d’échinocoques permettrait de préciser la contribution relative des aliments parmi les sources de contamination humaine et de fournir des valeurs chiffrées pour l’évaluation du risque pour l’échinococcose alvéolaire (EA) et kystique (EK).

Procédures

Identification par puce électronique et injection d'œufs de parasites pour voie sous-cutanée - anesthésie générale légère - 1 seule fois - durée =1 minute. Prise de sang totale intracardiaque par voie intercostale - anesthésie générale par voie intrapéritonéale - 1 seule fois - 5 minutes

Impact sur les animaux

Le développement d’une petite masse parasitaire sous-cutanée (au site d’injection) est attendu avec une possible faible prise de poids sur une période maximale de 14 semaines. Des lésions ou abcès transitoires peuvent être observés au site d’injection durant les semaines suivant l’injection.

Devenir

L’objectivation du développement du parasite nécessite une observation macroscopique combinée à une identification moléculaire nécessitant la mise à mort de l’animal au préalable. De plus, les animaux témoins, bien que non infectés, seront trop âgés pour être réutilisés dans d’autres procédures.

Remplacement

Une méthode alternative via la culture de cellules (in vitro) est en cours de développement au sein de notre laboratoire afin d’essayer de pallier à l’utilisation d’animaux (in vivo). Toutefois, comme il n’existe pas de bibliographie permettant de comparer les deux méthodes de viabilité (in vitro et in vivo) pour de faible quantité d’œufs d’échinocoques sur matrice alimentaire, il est nécessaire de tester parallèlement la sensibilité de la méthode de viabilité in vivo. Ainsi, nous pourrons statuer sur la méthode la plus adaptée pour répondre à nos problématiques afin d’améliorer les connaissances et la prévention.

Réduction

Le projet utilisera 90 souris sur 3 ans. En raison du manque de données dans la littérature et en se basant sur un test statistique, des hypothèses formulées et des efficacités fixées, 8 souris seront utilisées par groupe pour les modalités tests et 5 souris pour les modalités témoins. Ces effectifs ont été réfléchis pour que les résultats obtenus soient recevables statistiquement tout en utilisant un minimum de souris.

Raffinement

Afin de limiter les anesthésies, les souris subiront le même jour l’injection sous cutanée décrite dans les procédures, ainsi que la pose du transpondeur. Le transpondeur permet d’identifier l’animal mais également la prise de température simplifiée en limitant le stress. Selon les résultats de la première étape, un antibiotique dans l’eau de boisson sera utilisé dans la procédure suivante afin d’éviter une infection de type abcès suite à l’injection de matrice alimentaire. En plus de limiter la gêne de l’animal cela améliorerait les chances de développement parasitaire puisqu’un abcès pourrait nuire ou éliminer les parasites injectés. Afin d’améliorer leur bien-être, les souris seront hébergées par groupe (8 pour les tests et 5 pour les témoins) et bénéficieront d’un enrichissement (carton, abris, cellulose et bâton de bois) dans les cages. L’utilisation d’anesthésique et d’un antidouleur seront employés afin de limiter la douleur et le stress des souris lors des actes opératoires. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraînera la mise à mort compassionnelle de l'animal.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires du parasite responsable de l’échinococcoses alvéolaire (EA) sont les rongeurs sauvages mais plusieurs études ont déjà utilisé des souris comme modèle de viabilité. S’agissant du parasite responsable de l’échinococcose kystique (EK), le mouton est l’hôte intermédiaire principal. Toutefois des rongeurs, dont les souris, ont déjà été utilisés pour étudier la viabilité des œufs de ce parasite. Ainsi, pour ces deux espèces parasitaires, la souris est sensible au développement parasitaire et constitue donc le modèle de choix. De plus, pour des raisons de reproductibilité de la seule publication ayant injecté un faible nombre d’œufs d’échinocoques, les souris utilisées seront des femelles et auront entre 6 à 8 semaines. Le stade de développement des animaux n'aurait pas d'influence sur la sensibilité au parasite et le développement de la forme larvaire. Toutefois, pour des raisons de reproductibilité de la seule publication avec un faible nombre d’œufs, les souris utilisées auront 6 à 8 semaines.

2608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection reproduisant une infection bactérienne, qui déclenche un état proche du choc septique humain, avec isolement, faiblesses locomotrices, perte de poids et hypothermie dans les heures précédant la mise à mort. D'autres subissent des prélèvements sanguins par voie rétro-orbitale, dont un prélèvement terminal, pour récupérer leurs neutrophiles. Le porteur précise n'utiliser que des mâles, afin d'écarter la variabilité liée au cycle des femelles.

Objectifs

Le sepsis est une pathologie grave caractérisée par une réponse inflammatoire généralisée consécutive à une infection non contrôlée, responsable de plus de 11 millions de décès par an dans le monde. Malgré la mise en œuvre de recommandations internationales, les progrès médicaux et les milliards investis chaque année, le traitement du sepsis reste essentiellement symptomatique, en raison d’une compréhension encore incomplète des mécanismes impliqués. Les neutrophiles, acteurs centraux du système immunitaire, constituent la première ligne de défense contre les infections. Ils ont la capacité de se déplacer rapidement vers les sites infectieux, d’ingérer les agents pathogènes et de libérer des substances toxiques pour les détruire. Plus récemment, il a été montré que les neutrophiles peuvent également produire des pièges extracellulaires constitués de leur propre ADN associé à des composés microbicides, capables de capturer et de tuer les pathogènes. Ce mécanisme est essentiel pour contrôler la propagation des infections. Lors d’un sepsis, les fonctions des neutrophiles sont profondément perturbées, ce qui contribue à l’aggravation de l’état clinique. Ils ne se développent pas correctement, se déplacent moins efficacement et produisent en excès des substances toxiques et des pièges extracellulaires. Ces mécanismes, normalement protecteurs, deviennent alors délétères : ils aggravent les lésions des organes et augmentent le risque de mortalité. La complexité du sepsis, impliquant des interactions entre cellules immunitaires, vaisseaux sanguins, coagulation et organes, ne peut être reproduite fidèlement in vitro. Les modèles animaux, notamment murins, permettent de reproduire les principales caractéristiques du sepsis humain et restent nécessaires pour évaluer l’effet de candidats traitements dans un organisme vivant. Notre laboratoire a démontré le bénéfice de certains candidats thérapeutiques sur la survie et l’état clinique d’animaux septiques, souvent associé à une modulation de l’activité des neutrophiles. Nous cherchons désormais à mieux comprendre les mécanismes responsables de la dérégulation des neutrophiles au cours du sepsis et l’impact de différents candidats traitements.

Bénéfices attendus

La dysfonction des neutrophiles au cours du sepsis est décrite comme un phénomène aggravant les symptômes et contribuant à la sévérité de la maladie chez les patients septiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer l’effet de différents candidats traitements sur différentes fonctions des neutrophiles dans le contexte du sepsis, afin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles d’améliorer la prise en charge de cette pathologie.

Procédures

Une partie des animaux inclus dans cette étude pourra subir une ou plusieurs injections de molécules thérapeutiques avant la mise à mort. Les nuisances associées à ces procédures sont considérées comme légères, car elles n’entraînent que le stress lié à la manipulation des animaux et une douleur limitée à celle induite par l’introduction d’une aiguille, sans douleur persistante. Certains de ces animaux pourront également faire l’objet de prélèvements sanguins, notamment par voie rétro-orbitale. Dans ce cas, une anesthésie locale sera systématiquement mise en place, en complément de l’anesthésie générale, afin d’éviter toute douleur inutile lors du prélèvement. Par ailleurs, certains animaux recevront une injection permettant de mimer une infection bactérienne, induisant des symptômes proches de ceux observés lors du sepsis humain, sur une durée maximale de 48 heures avant l’euthanasie. Ces animaux recevront un analgésique systémique permettant d’éviter toute souffrance inutile. Au cours de cette études les animaux pourront recevoir jusqu’à 2 injections (l’injection d’une solution se fait en moins de 5 min) et pourront subir jusqu’à 3 prélèvements sanguins dont un terminal juste avant l’euthanasie (le temps de manipulation des animaux pour ces prélèvements et également estimé à 5 min). Ces prélèvements seront espacés d’au moins 6 heures.

Impact sur les animaux

Une partie importante du projet sera réalisée sur des animaux sains, afin d’obtenir des neutrophiles matures et pleinement fonctionnels. Ces animaux ne seront soumis qu’aux manipulations nécessaires à l’euthanasie et, éventuellement, à une injection sous-cutanée réalisée environ deux heures avant celle-ci, dans le but d’augmenter la concentration de neutrophiles circulants. Ces interventions sont considérées comme faiblement invasives et génèrent un stress limité et transitoire. L’autre partie du projet sera effectuée sur des animaux traités par une injection intrapéritonéale (i.p.) d’une molécule permettant de mimer une infection bactérienne, administrée 24 heures avant les prélèvements, afin de reproduire un état physiopathologique proche du choc septique humain. Les animaux développent certains des signes cliniques se rapprochant du sepsis humain : modification du comportement (isolement), altération de l’état général (faiblesses locomotrices), perte de poids et hypothermie. Dans l’ensemble des protocoles, les manipulations nécessaires (capture, contention, injection de molécules, prélèvements sanguins, anesthésie à l’isoflurane) sont susceptibles d’engendrer un stress temporaire pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure

Remplacement

La dysfonction des neutrophiles au cours du sepsis résulte d’une dérégulation systémique du système immunitaire. Par exemple, la molécule, que nous utilisons pour induire un choc endotoxinique chez les animaux, provoque in vivo une augmentation significative de la production de pièges extracellulaires, alors que cette même molécule n’en induit aucun mesurable in vitro. Ces dysfonctions résultent de mécanismes complexes, dépendant de l’activation simultanée de multiples populations cellulaires immunitaires et non immunitaires, et demeure difficile à reproduire fidèlement in vitro. Le remplacement des neutrophiles primaires par des lignées cellulaires n’est pas envisageable dans ce contexte. Bien que certaines lignées myéloïdes différenciées présentent des similarités avec les neutrophiles, elles demeurent imparfaites, ne reproduisant pas de manière fiable le comportement de neutrophiles primaires dans l’organisme. L’utilisation de neutrophiles primaires isolés à partir d’animaux reste donc nécessaire pour évaluer l’effet des traitements dans un contexte physiopathologique pertinent.

Réduction

Pour les études in vitro, la collecte d’un nombre suffisant de neutrophiles nécessite l’utilisation de plusieurs animaux, car la proportion de neutrophiles circulants chez la souris est naturellement faible, ce qui limite la quantité de cellules obtenues pour les différentes conditions expérimentales. Afin de pallier cette contrainte, nous avons récemment mis en place, sur la base de données issues de la littérature, un prétraitement des animaux par une molécule mobilisant les neutrophiles de la moelle osseuse vers le sang périphérique en quelques heures. Ce prétraitement, consistant en une unique injection par voie sous-cutanée, permet d’augmenter significativement le nombre de neutrophiles récupérés et ainsi de réduire de manière importante le nombre d’animaux nécessaires par expérience. Pour les études in vivo, le nombre d’animaux utilisés a été défini à partir des résultats préliminaires déjà obtenus au sein du laboratoire, où la dérégulation des neutrophiles est de plus en plus étudiée. Cette approche permettra d’éviter les répétitions inutiles et de limiter le nombre d’animaux aux effectifs strictement nécessaires à la validation statistique des résultats . Parallèlement, les organes et tissus prélevés sur les animaux sains ou septiques seront mutualisés et utilisés pour d’autres projets en cours au sein du laboratoire, afin d’optimiser l’utilisation de chaque individu et éviter toute expérimentation redondante.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au bien-être animal à travers un suivi régulier des animaux et ce afin de déceler tout excès de douleur, ce qui introduirait un biais dans nos recherches. Plus particulièrement chez les animaux septiques, le bien-être sera mesuré en évaluant les 5 paramètres standardisés suivants, afin de déterminer un score global sur 20 (chaque paramètre étant noté de 0 à 4) : le suivi de l’état physique, du comportement et des sécrétions seront réalisées par un examen visuel. Cette surveillance commencera dès 6h suivant l’induction du modèle de sepsis et sera renouvelé à 16h puis toutes les 8h. Le suivi du poids de l’animal sera réalisé à l’aide d’une balance et le suivi de la température sera réalisée à l’aide d’un thermomètre rectal pour souris. Les animaux ne devront pas atteindre un score global≥17 pour les paramètres standardisés. Ce score est prédictif d’un risque de décès élevé sous 4 heures et de dysfonctions d’organes généralisées. Ces critères seront résumés sous forme d’un tableau et ont été définis à partir des données de la littérature. Les animaux seront placés dans une armoire ventilée dont la pression et la température sont contrôlables. Les animaux septiques étant hypothermiques, la température de l’armoire sera augmentée de 3 degrés par rapport à la température standard de l’animalerie, afin de facilité la régulation de la température de ces animaux (les animaux contrôles seront hébergés dans les mêmes conditions). Ils auront un accès constant à l’eau, à la nourriture, au matériel pour leur nid et à des activités de jeu. Aucun rongeur ne sera seul, sauf en cas d’agressivité ou de soins particuliers. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anésthésie générale à l’isoflurane pour la voie intracardique et sous anesthésie générale à l’isoflurane avec l’addition 2 minutes avant le prélèvement d’un collyre anésthésique en locale au niveau de l’œil.

Choix des espèces

L’étude du sepsis, à travers l’utilisation de souris comme modèle animal, a fait l’objet de plus de 10 000 publications au cours des 40 dernières années. Utiliser la souris facilitera la mise en perspective de nos résultats. Un large éventail de techniques sont adaptées au modèle souris pour étudier différents paramètres et mécanismes, dont celles décrites dans cette saisine. Les souris auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation, soit l’âge de leur maturité sexuelle (naissance > 1 mois). Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prépubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. Nous avons choisi de travailler avec des souris mâles, afin de nous affranchir du cycle oestrien des femelles, qui peut induire de la variabilité dans nos résultats et modifier notre interprétation.

4000 souris vont être utilisées, chacune gardée au moins douze mois puis tuée, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est infecté par la bactérie de la lèpre dans le coussinet plantaire, puis reçoit des antibiotiques par voie orale une à cinq fois par semaine, jusqu'à cent vingt administrations sur la durée de l'expérience. À l'issue, les souris sont tuées pour prélever leurs coussinets et analyser l'effet des molécules testées. Le porteur affirme que Mycobacterium leprae ne se cultive pas hors de l'animal et juge de ce fait "impossible" de remplacer la souris.

Objectifs

La lèpre est la deuxième maladie mondiale due à une mycobactérie après la tuberculose. De nombreux pays dans le monde sont encore touchés par la maladie et plus de 172 000 nouveaux cas ont été reporté en 2024. Les séquelles physiques et psychologiques ainsi que la stigmatisation des lépreux restent conséquentes. Le traitement de la lèpre est long (de 12 à 24 mois), contraignant pour les patients (plusieurs antibiotiques à prendre) et l’observance des traitements est difficile à vérifier par le personnel soignant du fait de l’éloignement des centres de soins dans les régions d’endémie (difficultés d’accès aux soins). De plus, la mauvaise observance des traitements a entraîné l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques. Il est donc nécessaire de trouver un traitement avec une durée plus courte, ce qui permettrait d’améliorer son adhésion par les patients. Afin de trouver un schéma thérapeutique permettant de réduire la durée de traitement de la lèpre et sa fréquence, il est nécessaire de tester les nouvelles molécules mises sur le marché sur la bactérie responsable de la lèpre (Mycobacterium leprae). M. leprae a la particularité de ne pas être cultivable in vitro mais seulement in vivo. Le modèle utilisé pour les études précliniques avant administration des traitements chez l’homme est le modèle murin. Notre projet a pour objectif d’étudier l’activité de nouvelles molécules ou d’associations de molécules (nouvelles ou existantes), ayant préalablement démontré des activités bactéricides sur d’autres bactéries.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à trouver de nouvelles molécules ou de nouvelles associations de molécules existantes dans le traitement de la lèpre. Ce nouveau traitement permettra une meilleure prise en charge des patients dans les zones d'endémie ainsi qu'une meilleure obervance du traitement par ceux -ci.

Procédures

Pour induire la lèpre, les animaux vigile seront infectés par la bactérie responsable de la maladie (moins d'une minute par animal). Les animaux vigiles seront ensuite traités par voie orale par des antibiotiques entre 1 à 5 fois par semaine (moins d'une minute par animal) (120 traitements au maximum sur la durée de l'expérience). Les animaux seront etuhanasiés en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les manipulations des animaux lors des contentions effectuées pourraient induire un stress de courte durée. Les injections pourraient induire une douleur de courte durée aux animaux. Les traitements effectués par voie orale pourraient induire des microlésions, des irritations ou une fausse route. Pour l’administration des traitements par l'alimentation, une baisse de la consommation alimentaire peut intervenir de manière transitoire en raison du changement d’aliment. Le développement de la maladie n’entraine pas de douleur chez les animaux. En effet, la lèpre est une maladie cutanée et l'injection en sous cutanée dans le coussinet plantaire permet un développement localisé des bactéries sans autres signes cliniques. Dans le cas d’un fort inoculum chez les animaux non traités, un gonflement des pattes arrières peut survenir, indolore pour la souris. Les souris sont gardées minimum 12 mois en stabulation et les signes de vieillissement inhérents à ce statut peuvent apparaître tels que perte de poids ou problèmes neurologiques. Le phénotype dommageable de la lignée immunodéficiente, plus sensible aux infections, peut se traduire par de possibles infections locales suite à des lésions cutanées causées par des bagarres entre congénères ou lors de la stabulation.

Devenir

Afin d'évaluer l'efficacité des molécules dans le traitement de la lèpre, tous les animaux seront euthanasiées à l'issu de la procédure afin de récupérer les tissus des coussinets plantaires pour analyse microscopique et moléculaire.

Remplacement

Mycobacterium leprae n’est pas cultivable in vitro et le modèle murin est donc le seul permettant une évaluation de l’activité des antibiotiques avant un essai clinique chez l’homme. Il est dans ce cas impossible de remplacer l’expérience sur l’animal par une expérience in vitro.

Réduction

4000 animaux seront utilisés dans ce projet. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les souris seront inoculées dans les deux pattes arrières afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et de pouvoir avoir du matériel suffisant pour effectuer toutes les analyses nécessaires. Les suspensions bactériennes seront partagées au sein des différents projets avec les collaborateurs concernés afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et les animaux ont un accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Tout le matériel utilisé est stérile et/ ou à usage unique. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum sous forme de coton de nidification et de bâtons à ronger ou de croquettes déposées en fond de cage. Les animaux sont vérifiés quotidiennement et des points limites précoces ont été définis. Le matériel a été choisi afin qu'il soit le plus adapté à la taille des souris (le plus petit possible). Pour les traitements, la voie d'administration a été choisie afin d'être la plus physiologique possible. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Mycobacterium leprae, bactérie responsable de la lèpre, n'est à ce jour pas cultivable in vitro et se développe de manière lente (12 mois chez la souris). Le modèle murin est actuellement le modèle de référence pour l’évaluation de l’activité des antibiotiques avant un essai clinique chez l’homme. Les animaux arriveront dans l’établissement à l’âge de 4 semaines, entreront en procédure à 5 semaines après une semaine d’acclimatation et seront gardés 12 mois afin de laisser le temps à la maladie de se développer et au traitement d'être efficace.

Infectées par le virus de la fièvre jaune dans un modèle décrit comme "à forte morbidité", 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Ces souris génétiquement modifiées ont des défenses immunitaires désactivées pour devenir sensibles au virus et développer la maladie. La liste des signes attendus comprend perte de poids, prostration, difficultés respiratoires, tremblements et convulsions, encadrés par des points limites. Le classement en souffrance seulement "modérée" contraste avec un tableau clinique aussi lourd et une visée assumée de forte morbidité.

Objectifs

Le virus de la fièvre jaune est responsable d’une maladie grave qui reste une menace dans certaines régions du monde, malgré l’existence d’un vaccin. Il n’existe actuellement aucun traitement spécifique permettant de réduire la quantité de virus ou d’améliorer l’état des personnes infectées. Le développement de nouveaux traitements est donc un enjeu important. Ce projet a pour objectif de mettre en place et de caractériser des modèles d’infection murin au virus de la fièvre jaune dans le but, de tester secondairement l’efficacité de candidats antiviraux contre le virus de la fièvre jaune dans ces modèles. L’objectif est d’identifier les molécules les plus prometteuses afin de préparer, à terme, leur évaluation chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements antiviraux contre l’infection par le virus de la fièvre jaune. À terme, le bénéfice attendu est de contribuer au développement de futurs médicaments qui pourraient être mis sur le marché pour améliorer la prise en charge de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront infectés en dose unique. Les animaux traités recevront le traitement à tester soit en une seule dose, soit en plusieurs doses, tout en respectant les volumes d’injection recommandés. En cas d’administration répétée, un maximum de 6 injections par animal pourra être réalisé. Chez les animaux non anesthésiés, une injection dure seulement quelques secondes (moins d’une minute). Sous anesthésie, la procédure dure environ 5 minutes. Des prélèvements sanguins pourront être effectués sous anesthésie, au maximum deux fois par semaine (jusqu’à 8 prélèvements au total). Chaque prélèvement dure en moyenne 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différentes procédures, avec ou sans anesthésie (infection, pesées, suivi clinique, administration du traitement, prélèvements sanguins…). Ces manipulations peuvent entraîner un certain stress. En lien avec l’objectif du projet — qui comprend d’une part la mise en place d’un modèle d’infection à forte morbidité par le virus de la fièvre jaune et, d’autre part, l’évaluation de nouveaux traitements — les animaux peuvent présenter différents signes liés à la maladie : perte de poids, variations de température, baisse d’activité, prostration, déshydratation, difficultés respiratoires, tremblements, convulsions, diarrhée ou modifications des paramètres sanguins (comme une baisse de la proportion de certaines cellules). Des points limites précoces et adaptés seront définis afin d’assurer une prise en charge rapide et appropriée des animaux présentant des signes cliniques. L’intensité et la durée de ces signes pourront varier selon les groupes, en fonction du modèle utilisé et de l’efficacité des traitements testés.

Devenir

Le projet ayant pour but, dans un premier temps, la caractérisation de nouveaux modèles murins d’infection au virus de la fièvre jaune puis dans un second temps l’utilisation de ces modèles pour l’évaluation de l’efficacité de traitements curatifs ou prophylaxiques, l’euthanasie des animaux est nécessaire pour récupérer des organes en vue de la réalisation de différentes analyses (dosage de la charge virale, évaluation de l’état inflammatoire, etc).

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative capable de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Pour évaluer l’efficacité d’un traitement contre le virus de la fièvre jaune, il est nécessaire d’observer l’infection dans son ensemble : la façon dont le virus se multiplie, comment l’organisme réagit, et comment le traitement agit sur les fonctions essentielles du corps. À ce jour, seul un modèle animal permet de reproduire l’infection complète et les signes cliniques caractéristiques de la fièvre jaune. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour comprendre l’effet du traitement dans un organisme vivant et vérifier son efficacité globale.

Réduction

Pour obtenir des résultats fiables et interprétables, il est nécessaire d’inclure au minimum six animaux par groupe. Dans le cadre de l’étude d’efficacité, un groupe infecté et non traité sera systématiquement inclus afin de servir de référence pour évaluer l’effet du traitement. Par ailleurs, chaque animal servira de contrôle pour lui même grâce aux mesures réalisées avant l’infection, ce qui évite de recourir à un groupe contrôle non infecté supplémentaire et permet ainsi de réduire le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée avant le début du projet, portée à 7 jours en cas de transport aérien. Les animaux seront hébergés ensemble en cages tout au long de l’étude, avec un enrichissement adapté pour favoriser leur bien être. Ils feront l’objet d’une observation quotidienne afin de détecter rapidement tout signe anormal et mettre en place les mesures nécessaires : soins de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement…), ou, si leur état l’exige, une euthanasie. Après l’infection, le poids des animaux sera suivi au minimum une fois par jour. Un scoring clinique sera également réalisé à partir d’une grille d’évaluation simple. Celui ci prendra en compte l’état général (activité, aspect du pelage, écoulements nasales et/ou oculaires…) ainsi que d’éventuels signes plus spécifiques (difficultés respiratoires, troubles neurologiques…). L’ensemble permettra d’obtenir un score global reflétant leur état de santé et d’orienter les décisions de prise en charge. Des examens cliniques plus approfondis pourront être réalisés si nécessaire, et toute anomalie sera signalée au vétérinaire responsable. Lors des anesthésies, des mesures seront prises pour éviter toute hypothermie, notamment l’utilisation d’un tapis chauffant ou d’une lampe chauffante pendant toute la procédure.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle préclinique de référence pour l’étude du virus de la fièvre jaune, car elles permettent d’observer la maladie dans un organisme vivant et de tester de nouveaux traitements. Ce modèle est bien établi, largement utilisé et reconnu par la communauté scientifique. Cependant, les souris classiques ne développent que très peu de symptômes lorsqu’elles sont exposées au virus. Pour pouvoir étudier réellement la maladie, des souris génétiquement modifiées dont certaines défenses immunitaires ont été désactivées sont donc utilisées. Ces animaux deviennent alors sensibles au virus et présentent des signes de la maladie similaires à ceux observés chez l’être humain, ce qui permet d’évaluer plus efficacement les mécanismes de l’infection et les traitements potentiels. Grâce à leur âge, leur sexe et leur état sanitaire standardisés, les souris offrent des conditions très homogènes. Cela permet d’obtenir des résultats fiables et comparables entre les animaux, notamment pour suivre l’évolution de l’infection, la réponse du système immunitaire et l’effet du traitement testé. Ce modèle permet également de mesurer de manière précise différents paramètres importants, comme la quantité de virus, les signes cliniques, l’état général ou la survie, tout en maintenant un bon équilibre entre les aspects scientifiques, éthiques et pratiques. Leur taille et leurs caractéristiques biologiques sont adaptées aux volumes de traitement et aux prélèvements nécessaires pour ce type d’étude. Dans ce projet, des souris âgées d’au moins 6 semaines (stade jeune adulte/adulte) seront utilisées afin d’éviter la phase de forte croissance et de travailler avec des animaux d’environ 20 g, ce qui assure une meilleure stabilité des mesures.

Pour mettre au point un modèle d'infection sur un dispositif implanté sous la peau, 49 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour mesurer la charge bactérienne. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation, deux anesthésies générales et des prélèvements à travers la peau. L'objectif est de calibrer une infection à staphylocoque doré et la formation d'un biofilm. Hébergées à plusieurs, les souris peuvent arracher leurs points de suture et rouvrir les plaies, ce qui accroît la douleur.

Objectifs

Staphylococcus aureus représente la cause la plus courante d’infection bactérienne de la peau et des tissus mous. Cette bactérie infecte généralement la peau d'individus en bonne santé à la suite d'un traumatisme, de brûlures ou d'interventions chirurgicales, ainsi que la peau de patients atteints de maladies chroniques caractérisées par des démangeaisons ou encore des patients atteints de diabète. Les bactéries du genre Staphylococcus sont très efficaces pour créer des amas structurés adhérent à une surface. Cette formation appelée biofilm, leur permet de survivre dans des conditions environnementales hostiles et les rend plus résistantes à la réponse immunitaire de l’hôte ainsi qu’aux traitements antibactériens. L’objectif de ce projet dans un premier temps est d’évaluer la charge bactérienne adéquate permettant une infection stable, localisée et la formation d’un biofilm mature dans un modèle d’infection de « tissu cage » chez la souris.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de déterminer le meilleur inoculum permettant d’avoir une charge bactérienne stable sur 21 jours avec la formation d’un biofilm localisée. De plus, avec ce dispositif (cage perforée de 130 trous), le prélèvement du liquide interstitiel est possible sans mise à mort de la souris, une fois la mise au point réalisée, ce qui permettra de réduire significativement le nombre d’animaux dans la phase suivante. A terme, ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de plusieurs bactériophages sur la formation d’un biofilm à Staphylococcus aureus.

Procédures

- 2 injections (anesthésie) : 3 sec - 10 injections (analgésie) : 3 sec - 1 procédure chirurgicale correspondant à ouverture cutanée et à la pose du dispositif en sous cutanée et à la fermeture de l’incision sous anesthésie : 10 min - 1 injection (5 sec) et 6 prélèvements (30sec) sous anesthésie - 1 nouvelle ouverture du site chirurgicale pour mimer la mise en place du médicament dans le dispositif (10 min)

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue sera une douleur liée à l’incision permettant la mise en place du dispositif en sous cutanée. Les animaux subiront également deux anesthésies générales. Le liquide interstitiel se trouvant dans le dispositif de certains animaux seront prélevés sous anesthésie volatile à travers la peau et le dispositif. La préhension, l’injection et le prélèvement peuvent entrainer un stress chez la souris. Le dispositif peut également créer une gêne. Durant la phase de mise au point, les animaux seront hébergés à 3 ou 5 par cage. Dans ces conditions, des évènements d’arrachage de points de suture peuvent être observés et abimer les plaies, augmentant ainsi la douleur des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecter la cage et évaluer la charge bactérienne au cours du temps.

Remplacement

Un gros travail a été réalisé in vitro sur l’efficacité du cocktail de bactériophages sur un grand nombre de souches de S. aureus ainsi que dans des modèles de biofilm. Toutefois, l’efficacité de tels composés in vivo peut s’avérer très différente de celle obtenue in vitro tant sur le plan de l’efficacité elle-même que sur la cinétique des phages dans un organisme vivant au niveau du site de l’infection. Enfin, les modèles pré-cliniques sont règlementaires pour le développement de ces nouvelles alternatives thérapeutiques, au vu du peu d’informations existantes sur ce sujet.

Réduction

La phase de mise au point consiste à évaluer le meilleur inoculum permettant la formation de biofilm et une charge bactérienne stable sur 21j. Le dispositif « tissus cage » grâce à ses 130 trous permet de prélever les animaux à différents temps sans mise à mort de l’animal. Cette phase de mise au point participera à la réduction globale du nombre d’animaux sur l’ensemble du projet. De plus cette étude se déroulera de façon séquentielle. Un inoculum sera évalué et s’il permet d’atteindre l’objectif souhaité, le deuxième ne sera pas testé ce qui permettra une réduction de 23 animaux. Le nombre d’animaux a été réduit à 5 par point, le minimum nécessaire pour une évaluation statistique de la charge bactérienne et de la formation du biofilm.

Raffinement

L’acte chirurgical d’incision cutanée sera réalisé sous anesthésie générale. Une couverture analgésique sera mise en place 30min avant la chirurgie et pendant 72h. Les animaux seront suivis quotidiennement dans les 5 jours suivant la chirurgie puis tous les 2 jours. Une fois infectés, les animaux seront de nouveau suivi quotidiennement. Les animaux seront hébergés par trois ou cinq. Pour limiter le stress et pour le bien-être des animaux, les cages seront enrichies de jouets et de matériaux de nidation. Des critères d’arrêt de l’étude ont été mis en place pour assurer le bien-être animal.

Choix des espèces

Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour les modèles infection ainsi que pour l’évaluation de nouvelles molécules. Cette espèce a pour intérêt d’avoir un système immunitaire et une physiologie proche de ceux de l’homme, ce qui permet d’étudier au mieux le comportement de molécules qui sont destinés à la clinique humaine. Les souris représentent dans la littérature une référence pour le modèle « tissu cage ». Des souris adultes (10 semaines) seront utilisées de façon à avoir un poids corporel d’environ 25g et un système immunitaire mature.

3 080 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections et neuf gavages, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent des prélèvements de sang, une incision de la queue et, pour certaines, une infection virale destinée à déclencher un diabète de type 1. L'étude cherche à comprendre le rôle de cellules immunitaires et l'effet d'un régime enrichi en fibres et acides gras sur la maladie. Le porteur affirme que ce projet est associé à des travaux visant à réduire le recours à l'expérimentation animale, sans le détailler.

Objectifs

Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle les cellules du pancréas, qui produisent de l’insuline, sont détruites par le système immunitaire. Sans insuline, le corps ne peut plus réguler correctement la glycémie (concentration du sucre dans le sang). L’objectif du projet est d’identifier des facteurs responsables de cette destruction et d’étudier les anomalies observées sur les cellules immunitaires. En effet, des facteurs environnementaux comme une infection virale et le changement de microbiote intestinal influencent le système immunitaire et favorisent la maladie. De plus, certaines études montrent les effets bénéfiques de certains régimes alimentaires. C’est pourquoi, le projet portera aussi sur l’impact d’une modification de l’alimentation, notamment dans la diminution du risque ou la sévérité de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre les mécanismes d'action des cellules immunitaires qui participent à l'apparition du diabète de type 1 chez la souris et plus généralement aux complications causées par une infection virale ou par un microbiote modifié. Enfin l’impact d’un régime enrichi en fibres et en acides gras sera évalué sur le développement du diabète. Comprendre l’action de ces cellules immunitaires dans différents contextes permettra d’envisager de nouveaux traitements thérapeutiques contre le diabète de type 1.

Procédures

Les animaux peuvent recevoir entre 0 et 12 injections (durée 10 secondes par injection). Les animaux peuvent recevoir entre 0 et 9 gavages (durée 1 minute par gavage). Les animaux peuvent être anesthésiés 1 fois pour un prélèvement sanguin (30 secondes). Certains animaux auront une petite incision à la queue pour une micro-goutte de sang (durée 5 secondes)

Impact sur les animaux

Les souris utilisées peuvent développer une hyperglycémie. Le prélèvement d'urine peut induire un stress de courte durée. Les injections et les gavages peuvent générer un stress modéré et de courte durée. La petite incision de l'extrémité de la queue peut induire une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent générer un stress modéré de courte durée. L'infection virale peut induire un état fébrile modéré et transitoire. Les différents traitements peuvent induire une perte de poids légère.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour les analyses des tissus.

Remplacement

Le recours à l'animal est indispensable car les cellules immunitaires étudiées sont localisées essentiellement dans les muqueuses et le pancréas. Néanmoins ce projet est associé à des études visant à remplacer le maximum d'expérimentation animale possible.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour valider les données est calculé sur la base d'un plan expérimental élaboré et maîtrisé permettant d'obtenir une puissance statistique nécessaire à l'obtention de conclusions biologiquement pertinentes. La stratégie mise en place vise à obtenir le maximum de résultats significatifs en utilisant différents tests statistiques pour assurer la pertinence des résultats de manière à utiliser le moins d’animaux possibles. En amont des expériences, des analyses en laboratoire sur cellules seront effectuées afin d’optimiser la sélection des échantillons de microbiote à tester ultérieurement chez l’animal.

Raffinement

Le bien-être des animaux est surveillé par le personnel compétent ainsi que les responsables du projet. De l’enrichissement est ajouté dans leurs cages de façon systématique et les animaux sont regroupés en groupes sociaux. Les gestes techniques sont maîtrisés par les porteurs de projet ce qui limite le stress et l’inconfort des animaux. Toute souris diagnostiquée prédiabétique a une attention plus poussée. Une échelle avec les points limites adaptés est mise en place pendant les manipulations expérimentales. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge selon le score de points limites.

Choix des espèces

Le modèle de souris est adapté à l’étude immunitaire de cette pathologie : - Il permet d’avoir accès à de multiples modèles génétiquement modifiés pour permettre d’isoler des paramètres biologiques importants dans le développement de la pathologie. -Le système immunitaire de la souris est très proche de celui de l’Homme, ce qui est important pour l’étude d’une pathologie auto-immune et également facile à étudier par diverses techniques cellulaires ou biochimiques. Les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines d’âge (jeunes adultes), stade duquel sont observées les premières anomalies du système immunitaire chez la souris.

Anesthésiées puis injectées dans la trachée avec des bactéries, des cellules immunitaires ou une chimiothérapie, 356 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Un sepsis pulmonaire leur est provoqué, avec hypothermie, gêne respiratoire et perte de poids attendues. L'objectif déclaré est de comparer les sous-types de sepsis humains à ce modèle murin. Le porteur reconnaît lui-même que la souris pourrait ne représenter qu'une partie des malades, ce que le projet vise justement à vérifier.

Objectifs

Le sepsis est une infection grave qui touche 50 millions de personnes par an dans le monde. Il est responsable de >10 millions de décès par an. Les infections respiratoires sont la première cause de sepsis.Malgré sa gravité, les traitements n’ont guère évolué depuis 30 ans, en partie parce que les patients atteints de sepsis sont très différents les uns des autres. Des chercheurs ont identifié chez certains patients des « sous-types » de sepsis basés sur le niveau de certains marqueurs de l’inflammation dans le sang. Ces sous-types permettent de regrouper les patients plus uniformément et pourraient aider à mieux cibler les traitements. Comprendre comment ces sous-types fonctionnent est donc essentiel pour développer de nouvelles thérapies. Chez la souris, ces sous-types n’ont pas encore été étudiés, il est possible que la souris ne représente qu'une seule partie des malades. D'autre part , Le sepsis modifie profondément le système immunitaire, créant ce qu’on appelle une « mémoire immunitaire », qui peut être bénéfique ou au contraire délétère. Le projet vise à reproduire un modèle de sepsis pulmonaire chez la souris. L’objectif est de décrire l’évolution spatiale et temporelle des principales cellules immunitaires pulmonaires chez l’animal afin de le comparer aux sous types de sepsis observés chez l'homme.Dans un second temps, nous cherchons à connaître le rôle des sous-types cellulaires dans la cicatrice immunitaire laissée par le sepsis en injectant à des souris des macrophages porteurs de cette mémoire immunitaire.

Bénéfices attendus

Jusqu’à présent, les traitements visant à réguler le système immunitaire chez les patients atteints de sepsis ou de syndrome de détresse respiratoire n’ont pas donné de résultats efficaces, et seuls les corticoïdes sont parfois utilisés en pratique. Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire réagit dans ces maladies. À terme, il pourrait permettre de repérer quels patients sont les plus susceptibles de bénéficier des traitements existants et d’aider à développer de nouvelles thérapies.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de bactéries, de cellules immuniatires ou de chimiothérapie dans la trachée sous anesthésie générale. L'administration de la bactérie dure 30 secondes sous anesthésie générale. L'administration des cellules immunitaire dure 30 secondes sous anesthésie générale. L'administration de la chimiothérpaie dure 30 secondes sous anesthésie générale. Cette administration est répétée une fois 5 jours après.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une injection intratrachéale de bactéries, de cellules immunes ou de chimiothérpie sous anesthésie générale. Ce geste n’est pas douloureux. Il en découlera une hypothermie, une gène respiratoire et une perte de poids transitoire qui est récupérée très rapidement

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser

Remplacement

Le sepsis est une réaction inappropriée d’un hôte à un pathogène qui se traduit par une défaillance d’organe. Il met en jeu une physiopathologie complexe à un niveau moléculaire, cellulaire, d’organe mais aussi de l’organisme entier. L’infection respiratoire nécessite le recrutement de cellules inflammatoires produites par la moelle osseuse, qui sont transportées par le sang jusqu’aux organes et pénètrent les organes via des signaux moléculaires. Il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro (culture cellulaire ou organoïde) qui reproduise la complexité de l’immunité innée humorale, de l’immunité adaptative (qui met plusieurs jours à se mettre en place) ou de la communication entre les organes. L’obtention de données de transcriptomique sur les cellules immunitaires pulmonaires permettra de remplacer un certain nombre d’observations chez l’animal, car ces données permettent d’étudier « in silico » les mécanismes immunitaires à l’œuvre. Ces données pourront être réutilisées pour de futurs projets.

Réduction

La première partie de l’étude consiste à observer et décrire ce qui se passe chez les animaux, sans chercher à tester un traitement particulier. Il n’est donc pas possible de prévoir exactement combien d’animaux seront nécessaires. Pour limiter leur nombre, l’équipe s’est appuyée sur des expériences similaires publiées et sur son expérience passée. Pour la deuxième partie de l’étude, le nombre d’animaux et de groupes a été calculé de manière statistique afin d’être sûr de détecter les différences importantes tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les injections intratrachéales se font sous anesthésie générale, qui apporte du confort pour l’animal et réduit son stress pendant l’intervention. Une dose d'antidouleur sera administrée en cas d’observation de souffrance de l’animal. Des points limites bien établis et suffisamment précoces permettront de minimiser la douleur de l’animal en appliquant les décisions définies.

Choix des espèces

Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle murin de pneumonie est relativement similaire à la pathologie humaine. De plus, le modèle murin pour l’étude de la réponse immunologique au sepsis pulmonaire est le plus couramment utilisé dans la littérature. Souris de 4 à 8 semaines correspondant à de jeunes adultes permettant de mimer les conditions pathologiques humaines. C’est également le stade le plus utilisé dans la littérature permettant une extrapolation et une comparaison de nos résultats avec d’autres travaux.

92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour mettre au point un modèle de pneumonie due à la bactérie Tropheryma whipplei. L'infection se fait par aspiration dans la gorge, précédée d'un prélèvement de sang à la lancette sur animal éveillé. Le porteur évoque une atteinte des voies respiratoires et une douleur transitoire après la procédure. Le texte annonce un suivi des animaux infectés sans préciser les critères d'observation ni les signes qui déclencheraient une mise à mort anticipée.

Objectifs

Tropheryma whipplei est une bactérie associée à un large spectre d’affections chez l’Homme, s’étalant d’un portage asymptomatique à des infections chroniques systémiques. Les avancées des techniques de détection et de séquençage à haut débit ont profondément modifié l’épidémiologie de ces infections. Ainsi, un nombre croissant d’études suggère que T. whipplei est un agent de pneumonies aigues. Dans ce contexte, nous souhaiterions explorer de manière exhaustive la pneumonie induite par T. whipplei afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’infection. Compte tenu des données épidémiologiques, nous devons modéliser la pneumonie d’aspiration et la pneumonie communautaire. Ce projet s’articulera donc autour de l’établissement et de la comparaison de 2 modèles de pneumonie : un modèle de pneumonie d’aspiration par aspiration oro-pharyngée de T. whipplei et un modèle de pneumonie communautaire par inhalation.

Bénéfices attendus

T. whipplei peut provoquer diverses infections qui sont relativement rares dans le monde. Avec le développement de la biologie moléculaire et si la capacité de détecter cette bactérie a augmenté ces dernières années, son importance dans les échantillons des voies respiratoires inférieures reste incertaine. Ainsi, ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place des pneumonies à T. whipplei, notamment le contexte de leur apparition (pneumonie aigue communautaire ou pneumonie d’aspiration). Il mettra également en évidence des éléments critiques dans l’établissement et la physiopathologie de l’infection pulmonaire à T. whipplei. Enfin, il permettra de définir également de développer des outils diagnostiques et éventuellement pronostiques de telles infections.

Procédures

Un prélèvement sub mandibulaire sera effectué sur souris vigile avant l'infection à l'aide d'une lancette (Golden Rod 4MM). Quelques gouttes (100 microlitres environ) de sang sera prélevé sans dépasser le rapport volume/ poids réglementaire. D'autres prélèvements seront réalisés sur animaux morts.

Impact sur les animaux

Des altérations de l'épithélium des voies aériennes peuvent être observées, bien que généralement modérées et transitoires suite à l’aspiration oro-pharyngée. Il est possible que les souris présentent une douleur transitoire post-procédure. L’infection par T. whipplei pourrait causer une pneumopathie et éventuellement conduire à une diminution de la compliance pulmonaire.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements de fluides et organes.

Remplacement

Bien que nous menons parallèlement des études in vitro visant à évaluer la capacité de T. whipplei à infecter les cellules épithéliales, Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle de souris afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de la pneumonie induite par T. whipplei et d’en comprendre les mécanismes sous-jacents.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, du fait de notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminé que 10 animaux/groupe sont nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes. D’autre part, pour la procédure 1, nous avons proposé une étude pilote sur 12 souris qui permettra de tester les paramètres utilisés et de les ajuster si besoin.

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, les animaux seront hébergés en respectant le nombre maximum d’individus par cage (5 souris par petite cage ou 10 par grande), dans des cages équipées d'igloo et matériel à ronger afin d’offrir un environnement enrichi et approprié. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint le score entre 9 et 12 la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse. Suivant notre grille de score, pour un score entre 5 et 8, un suivi et un analgésique pourra être administré. Au besoin, les souris recevront des croquettes à leur portée ou de la nourriture et de l’eau gélifiée ad libitum.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire, et les infections respiratoires chez la souris peuvent reproduire de façon fiable l’inflammation pulmonaire, la réponse immunitaire, la production de cytokines et l’évolution clinique observées chez l’homme. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.