Maladies infectieuses

Immunodéprimées puis dotées d'un système immunitaire humain, 14 400 souris vont être utilisées pour produire un modèle dit humanisé, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une irradiation, des greffes de tumeurs ou de tissus humains, des infections par le VIH ou d'autres pathogènes, et jusqu'à huit prélèvements ou injections chacune. Leur immunodéficience les rend très sensibles aux infections, et l'irradiation peut provoquer des tumeurs. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non humain, jusque-là "modèle de choix" pour ces études.

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines telles que le VIH (virus de l'Immunodéficience humaine) et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité anti-infectieuse ou anti-tumorale et/ou leur impact sur le système immunitaire humain et/ou d’autres tissus humains.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie luminescente intravitale (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois) - greffe de tissus humain (1 par animal, durée 20min)

Impact sur les animaux

Du fait de leur degré d’immunodéficience et après infection par le VIH, ces animaux sont très sensibles aux infections. Après irradiation certaines souris transgéniques peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. De potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection hydrodynamique. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort. Après injection cellules tumorales humaines les souris développeront des tumeurs.

Devenir

Les animaux portant un système immunitaire humain(HIS), générés dans la procédure « génération de souris HIS » pourront être inclus dans des procédures permettant de stimuler les cellules immunitaires humaines et/ou de valider l’activité d’immuno-modulateurs. Les souris HIS dont la population de cellules immunitaires aura été augmentée, pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme dans les procédures permettant de greffer des tumeurs ou des tissus humains et/ou d’infecter les souris par des pathogènes afin d’étudier in vivo la réponse immunitaire humaine contre des pathogènes humains ou des tumeurs humaines. Ces animaux pourront également être inclus dans la procédure permettant de valider l’activité d’immuno-modulateurs ou dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet. Certaines souris issues de la procédure « génération de souris HIS » pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris HIS issues de la procédure permettant de valider, dans ce modèle de souris, l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort par analyse des différents organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

MODIFICATION texte en majuscules Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 938 souris (75SOURIS/UTILISATEUR X10UTILISATEURS X1.25 car la greffe ne prend que dans 80% de cas) par an soit un total de 4690 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme. 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé en moyenne à 10 par an. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an). LE BESOIN DE NOS UTILISATEURS EN SOURIS IMMUNODEFICIENTES A 840 CHAQUE ANNEE, EST DE 4200 SUR 5 ANS EN TENANT COMPTE DE 1. NOMBRE D’OPERATEURS DE LA PLATEFORME. 2. NOMBRE D’UTILISATEURS INTERESSES PAR LES MODELES ESTIME A 8 PAR AN. 3. CE QUE LA PLATEFORME FOURNIRA 105 SOURIS IMMUNODEFICIENTES PAR UTILISATEUR ET PAR AN (15 POUR ETUDE PILOTE 30 POUR EXPERIENCE PRINCIPALE, 1 ETUDE PILOTE ET 3 EXPERIENCES PRINCIPALES /UTILISATEUR/AN). Pour produire ces souris POUR NOS COLLABORATEURS, nous maintenons, en continu, un élevage de 8 LIGNEES DE SOURIS immuno-déficientes. Les souris immunodéficientes seront hébergées en groupe dans un environnement protégé pour assurer leur bien-être, NOUS ESTIMONS POUVOIR FOURNIR 4690 SOURIS HIS ET 4200 SOURIS IMMUNO-DEFICIENTES ET MAINTENIR LES LIGNEES. NOUS UTILISERONS UN TOTAL DE 14400. Nous aurons 3 trios reproducteurs de chaque lignée en continu pendant les 5 années. Ce nombre est le minimum possible pour maintenir un élevage sans croiser les frères/sœurs EN TENANT COMPTE QUE CES LIGNEES PRODUISENT PEU DE PETITS. En partant du fait que chaque femelle d’un trio produit 5 petits par mois, chaque trio produit 10 petits/mois soit 10x12 = 120 petits/an. Ainsi pour chaque lignée, 120x3trios= 360 animaux seront produits chaque année. Pour chaque lignée, il y aura donc une production de 360x5ans = 1800 animaux/lignée sur 5 ans. Nous produirons donc, pour les 8 lignées, 1800x8 = 14400 animaux produits en 5ans. Parmi ces 14400 animaux produits en 5 ans, environ 3600 animaux (25%) seront sacrifiés pour mauvais génotype, 4690 seront humanisés, 4200 SERONT UTILISES POUR TESTER LES NOUVEAUX TRAITEMENTS DE NOS COLLABORATEURS, les 1910 animaux restants assureront le maintien des colonies.

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Un outil informatique de randomisation sera utilisé en amont des expériences pour garantir la répartition équilibrée entre les groupes de souris de variables susceptibles d'interférer (biais) avec la mesure ou l'analyse des résultats de l'essai. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de dermatite, les animaux seront placés sur une litière à base de cellulose et les lésions traitées avec un désinfectant. Après chaque intervention chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages chauffées pendant la phase de réveil, et auront du gel hydrique à disposition pendant plusieurs jours. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. MODIFICATION texte en majuscules Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines dans des souriceaux nouveau-nés (

Environ 3 000 de ces souris sont maintenues en vie pour la reproduction des lignées, les surnuméraires et celles au mauvais génotype étant tuées. 5 000 souris au total vont être utilisées, dans des procédures classées légères à modérées, pour l'élevage et le génotypage de lignées transgéniques. Chaque animal subit au sevrage une biopsie de la queue et la pose d'une bague auriculaire, certaines lignées développant un prolapsus anal ou des troubles respiratoires à l'âge adulte. Le porteur décrit ces lignées comme "indispensables" et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les défenses des muqueuses à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les souris sont utilisées pour le maintien et l’amplification de lignées transgéniques, y compris des lignées présentant ou susceptibles de présenter un phénotype dommageable. Elles sont identifiées au sevrage par pose de bague auriculaire et, lorsque nécessaire, par génotypage à partir d’une biopsie de queue.

Bénéfices attendus

Les lignées transgéniques sont indispensables pour des projets visant à démontrer le rôle d’une famille de gènes fortement conservée entre l’Homme et la souris dans la protection des muqueuses. Elles permettent également de mieux comprendre les relations entre la variabilité de ces gènes et les altérations des mécanismes de défense des muqueuses sécrétrices. Ces modèles contribuent au développement de stratégies thérapeutiques et, à terme, à la mise en place de méthodes alternatives à l’expérimentation animale pour des études mécanistiques. Le projet permet également de maintenir un noyau de lignées transgéniques et de fournir des animaux à des laboratoires partenaires dans le cadre de collaborations scientifiques.

Procédures

La biopsie de queue (< 1 mm) est réalisée au sevrage sur des animaux vigiles, sous contention, pour le génotypage, concomitamment à la pose d’une bague auriculaire pour l’identification. Dans de rares cas, un génotypage complémentaire peut être réalisé à l’âge adulte par prélèvement au poinçon auriculaire sur animal vigile, sous contention.

Impact sur les animaux

Certaines lignées présentent un phénotype dommageable avéré ou potentiel. Des souris d’une lignée peuvent développer un prolapsus anal associé à une inflammation colorectale, tandis que des troubles respiratoires peuvent apparaître dans une autre lignée. Ces phénotypes sont observés uniquement chez des souris homozygotes âgées de plus de 5 mois. Sur la base de l’expérience acquise sur ces deux lignées, suivies depuis plusieurs années chez des souris âgées de moins de 6 mois, le phénotype dommageable reste peu fréquent (

Devenir

Les souris avec des génotypes requis sont maintenues en vie pour l’établissement et l’entretien des lignées ainsi que pour leur utilisation dans les protocoles expérimentaux du présent projet ou de projets associés. Les souris ne présentant pas de génotype requis (souris surnuméraires ou non nécessaires) sont mises à mort, soit dans le cadre de la gestion des colonies, soit en fin d’utilisation expérimentale. Les souris présentant un phénotype dommageable sont également mises à mort en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses sécrétrices, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions au niveau de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme restent limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension approfondie des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour étudier des gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Certaines lignées utilisées dans ce projet contribueront également au développement d’approches complémentaires visant à réduire à terme le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

La production de souris est planifiée en fonction des besoins expérimentaux, estimés à partir d’approches statistiques et de l’expérience acquise. Les schémas d’accouplement sont optimisés afin de produire le nombre nécessaire de souris présentant les génotypes requis. Le maintien de certaines lignées par accouplement d’animaux homozygotes permet de limiter le recours aux prélèvements invasifs pour le génotypage. Les lignées qui ne seront plus utilisées sont conservées par cryoconservation.

Raffinement

Les souris sont élevées et utilisées dans des locaux agréés disposant d’un statut sanitaire « exempt de pathogènes spécifiques » (EOPS). Elles sont hébergées en cages enrichies, par groupes de 2 à 5 individus, avec accès ad libitum à une alimentation standardisée stérile et à de l’eau de boisson stérile. Le personnel en charge de l’élevage et des manipulations est formé et habilité conformément à la réglementation en vigueur. Les souris font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Les procédures réalisées dans le cadre du projet sont peu invasives et associées à une douleur de faible intensité. L’identification par bague auriculaire et le prélèvement d’une biopsie de queue (< 1 mm) pour le génotypage sont réalisés par du personnel formé, selon des gestes rapides et standardisés. Le poinçon auriculaire réalisé à l’âge adulte est effectué par du personnel formé, sur animal correctement maintenu, avec une contention brève et un geste rapide limitant le stress et permettant une lésion de petite taille à cicatrisation rapide. Les conditions d’hygiène sont adaptées afin de limiter tout risque de complication locale. Une anesthésie locale peut être envisagée en cas de sensibilité accrue ou d’évolution des pratiques. Les animaux susceptibles de développer un phénotype dommageable sont identifiés afin de permettre un suivi adapté. En cas d’apparition de signes cliniques évocateurs d’un phénotype dommageable, ils sont soumis aux points limites définis dans le protocole et retirés de l’étude si nécessaire.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions à l’échelle de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme sont limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension détaillée des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent de recherche, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour l’étude de gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Tous les stades de développement postnataux peuvent être concernés, dans le cadre du maintien et de l’amplification des lignées utilisées pour les besoins de projets de recherche faisant l’objet d’autorisations spécifiques.

Générées pour créer des lignées transgéniques, 26 300 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère à modérée. Les femelles donneuses reçoivent des injections d'hormones, les receveuses une chirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie, et les souriceaux de moins de huit jours sont identifiés par prélèvement de phalanges. Ce nombre, le plus élevé du lot, tient à la production en série d'animaux génétiquement modifiés. Les femelles fécondées sont tuées, les souris transgéniques transférées vers des partenaires et les non fécondées réutilisées pour de la formation.

Objectifs

Génération de souris génétiquement modifiées par des différentes techniques de transgénèse additive ou ciblée et validation génotypique

Bénéfices attendus

Les projets de transgénèse de cette demande vont contribuer à l’élargissement des connaissances scientifiques à partir de résultats ciblés liées aux différents modèles souris créés pour une vaste variété de sujets de recherche dans multiple domaines (immunologie, cancérologie, audition, développement, infectiologie, etc.). Les modèles murins de nouvelle création, seuls ou en combination avec d’autres déjà existants contribueront ainsi au progrès de la recherche fondamentale et/ou appliquée

Procédures

-Pour les femelles donneuses : injection d’hormones 2 fois à 46 heures d’intervalle. Durée 1-2 minutes -Pour les femelles receveuses, chirurgie bilatérale de réimplantation avec anesthésie chimique/gazeuse avec analgésie complémentaire. Intervention: 1 fois, 15 minutes d’intervention/femelle -Pour les animaux nés des femelles receveuses/accouplements, Identification des souriceaux par prélèvement de phalanges distales

Impact sur les animaux

-Douleur et inconfort légers de courte durée (1 min) liés à l’injection des hormones. -Douleur et inconfort modérés de durée de 3 jours, liés à la chirurgie. -Douleur et inconfort léger de courte durée liée à l’introduction de la aiguille (quelques sec-quelques min) liés à un putatif prélèvement sanguin (le cas échéant)

Devenir

-Toutes les femelles qui ont été fécondées devront être mises à mort (au moment du prélèvement d’embryons ou du sevrage des souriceaux). -Les souris mâles et femelles transgéniques positives identifiés seront utilisées pour la suite de l’établissement des modèles de souris génétiquement modifiée chez nos partenaires -Les souris mâles et femelles non fécondées peuvent être re-utilisés dans le cadre de formations sur animaux

Remplacement

Malgré le développement actuel croissant de différents modèles ex vivo incluant des modèles organoïdes, le modèle souris continue à être essentiel en recherche afin d’avoir accès à toutes les régulations dans le cadre de l’organisme entier. L’intérêt et besoin de recourir à l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées dans les projets scientifiques de nos collaborateurs est évalué et justifié dans le cadre de chacun des projets autorisés. Toutefois, nous avons réussi à remplacer un nombre important de nos femelles grâce à des embryons fertilisés congelés commerciaux capables de remplacer les embryons frais avec efficacité pour leur modification par transgénèse. Ainsi des embryons frais seront seulement nécessaires en cas de superovulation de souris génétiquement altérées précédemment et/ou fonds génétiques particuliers.

Réduction

-Le nombre de souris femelles donneuses vient principalement de notre longue expérience et est dépendant principalement du fonds génétique des embryons à modifier et du type de manipulation. Pour chaque fonds génétique de femelles donneuses, nous essayons d’optimiser l’âge et les conditions de d’injection afin d’obtenir un maximum d’embryons par femelle et réduire ainsi le nombre de femelles donneuses. -La technique montre une viabilité plus élevée des embryons modifiés et permet une réduction des femelles donneuses requises. -Le nombre de souris receveuses à réimplanter est en fonction du nombre d’embryons qui auront survécu à la manipulation. -Pour chaque transgène ou chaque clone de cellules injecter, nous arrêtons les séries de manipulation dès que nous arrivons dans un premier temps à une dizaine de femelles réimplantées. Nous attendons ensuite la naissance des souriceaux afin de décider, à partir du nombre de petits obtenu, de la reprise ou pas de nouvelles séries de micromanipulation. Ce qui nous permet encore de réduire le nombre de femelles donneuses et receveuses utilisées. -Le fonds génétique choisi pour les femelles receveuses (excellentes mères et capables de donner naissance à de grandes portées de nouveau-nés) permet aussi d’optimiser le nombre de femelles mères-porteuses utilisées par rapport à l’utilisation d’un autre fonds génétique moins « efficace » -Le renouvellement de la batterie de mâles reproducteurs et vasectomisés environ chaque 6-9 mois permet d’améliorer leur performance quant aux capacités d’accouplement et de fécondation permettant à son tour d’optimiser le nombre de femelles donneuses et receveuses et réduire son nombre.

Raffinement

Le souris injectées et les femelles ayant subi la chirurgie seront surveillées quotidiennement. Les femelles receveuses reçoivent un traitement antalgique avant et après l'acte chirurgical et sont surveillées soigneusement pour assurer la bonne cicatrisation pendant au moins les 5 premiers jours après-chirurgie. Nous serons toujours particulièrement attentifs à tout signe de détresse (signes cli-niques externes, prostration, poils hérissés évaluation du Body Condition Score-BCS) afin de réduire/éliminer la souffrance des animaux transgéniques fondateurs et leurs descendants. En cas de souffrance et avant la mise à mort au plus tard au bout de 24h après con-firmation des signes cliniques externes, nous aurons recours au besoin de la nourriture humidifiée / gel hydrique, la réhydratation sous-cutanée ou le chauffage des animaux si hypothermie associée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui montre 90% d’homologie avec le génome humain, d’où l’intérêt majeur de la création de souris gé-nétiquement modifiées pour la découverte de mécanismes globaux en recherche fon-damentale ainsi que pour la modélisation de maladies humaines. La pertinence du choix de la souris pour ces projets est justifiée dans les projets scientifiques des parte-naires demandeurs. -Les mâles et femelles reproducteurs sont des adultes matures sexuellement (2-12 mois), les femelles receveuses sont des adultes (matures sexuellement, âgées de 8-12 semaines). -Les femelles donneuses d’embryons sont des jeunes, généralement prépubères âgées de 3-4 semaines, pour bien répondre au traitement hormonal de superovulation (âge dépendant du fonds génétique). -Les souris transgéniques positives seront des jeunes remises aux entités de recherche peu de temps après le sevrage une fois caractérisés génétiquement (pour avancement du projet)

6 570 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le paludisme et développer un vaccin. Chacune peut recevoir des infections par Plasmodium, par injection ou par piqûres de moustiques infectés, des prélèvements sanguins quotidiens sur près de trois semaines, et pour certaines des chirurgies comme l'implantation d'un anneau de titane, une ablation de la rate ou une greffe de peau humaine. Le RNT classe ces manipulations répétées en souffrance légère. Les souris sont mises à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme, que le porteur cherche à devancer.

Objectifs

Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de la phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.

Bénéfices attendus

Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.

Procédures

[MODIFICATION] IMMUNISATIONS POUR VOIE INTRANASALE et DUREE DU PROJET Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou plateformes d’administration et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles avec des sporozoïtes, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée par ponction de la veine caudale de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection les prélèvements seront réalisés quotidiennement. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive par bioluminescence, ou par microscopie/ RT-PCR dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de P. falciparum – peau).

Impact sur les animaux

Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements d’un volume sanguin de 25 µL à 50 µL au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera 20 µL par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par la dislocation cervicale ou par exposition au CO2, avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les réutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité étique seront utilisées.

Remplacement

Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.

Réduction

Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide d'un logiciel développé à l'Institut Pasteur (shade.pasteur.fr) qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test paramétrique ANOVA non jumelé, si nécessaire, ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.

Raffinement

Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Nous utiliserons la grille comportementale/clinique de la SBEA pour évaluer l'état de santé des souris. Les souris avec plus de 1% de parasitémie seront observées quotidiennement, les autres seront suivies hebdomadairement. Les animaux obtenant un score de deux points (ex : poil hérissé, prostration) bénéficieront de mesures d'amélioration des conditions d'hébergement (enrichissement, chaufferette), de l'aliment (gel diététique) ou de traitements médicamenteux (analgésie). Les souris présentant un score supérieur à deux seront mises à mort par exposition au CO2.

Choix des espèces

Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou présentent des troubles neurologiques sont tuées. 7 800 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes mises à mort à l'issue. Infectées par le virus de la dengue, certaines très sensibles faute de défenses immunitaires, elles peuvent développer fièvre, paralysie ou tremblements avant l'atteinte du point limite. Le prélèvement final se fait par ponction intracardiaque sous anesthésie, pour tester de nouveaux composés antiviraux.

Objectifs

La dengue reste aujourd’hui un problème majeur de santé publique. Chaque année, plus de 400 millions de personnes sont infectées par ce virus transmis principalement par le moustique Aedes aegypti. Environ 100 millions développent des symptômes : fièvre, douleurs, fatigue, et parfois des formes graves comme la dengue hémorragique ou le choc dengue, qui peuvent être mortels. Le virus de la dengue existe sous cinq formes différentes (appelées sérotypes). Cette diversité complique la protection à long terme : être infecté une première fois ne protège pas toujours des infections suivantes (surtout des sérotypes différents), qui peuvent même être plus sévères. Un vaccin est disponible mais son utilisation est limitée. Il fonctionne seulement chez les personnes ayant déjà été exposées au virus et pourrait augmenter les risques chez celles qui ne l’ont jamais été. Par ailleurs, il n’existe actuellement aucun traitement antiviral spécifique contre la dengue. Les médecins peuvent seulement traiter les symptômes et surveiller les complications. Dans ce projet, nous souhaitons tester de nouveaux composés capables d’empêcher le virus de progresser. Nous chercherons à bloquer différentes étapes clés : l’entrée du virus dans les cellules, sa capacité à reproduire son matériel génétique, ou encore d’autres mécanismes essentiels à son cycle infectieux. Nous étudierons également la réponse immunitaire déclenchée par la dengue et vérifierons si des composés thérapeutiques peuvent aider l’organisme à éliminer le virus plus rapidement et plus efficacement. L’objectif final est d’identifier des pistes prometteuses pour le développement de futurs traitements contre la dengue, afin de mieux protéger les populations exposées.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de tester l’efficacité de nouveaux traitements susceptibles de bloquer le virus de la dengue ou de renforcer les défenses immunitaires chez l’homme. Pour cela, nous utiliseront différents types de souris, car chacune réagit au virus d’une manière particulière. Certaines sont très sensibles et aident à comprendre les formes les plus graves de la maladie, d’autres permettent surtout d’observer la façon dont le virus se multiplie et comment l’organisme réagit. Enfin, des souris possédant un système immunitaire complet donnent des indications précieuses sur la production d’anticorps et l’activation des cellules immunitaires. En combinant ces modèles, le projet offrira une vision plus complète de ce qui se passe lors d’une infection : l’évolution du virus, les réactions immunitaires et les effets sur l’organisme. Cette approche permettra de repérer les candidats thérapeutiques les plus prometteurs et d’évaluer leur action, que ce soit en prévention ou en traitement. À long terme, ce projet contribuera à accélérer le développement de nouvelles stratégies contre la dengue. L’utilisation de modèles variés, allant de souris très sensibles au virus à d’autres possédant un système immunitaire entièrement fonctionnel, aidera à mieux comprendre les interactions entre le virus et l’hôte. Elle permettra également d’identifier les mécanismes qui protègent l’organisme ainsi que les raisons pour lesquelles certains patients développent des formes graves. Les connaissances obtenues serviront de base pour créer des traitements plus précis et plus efficaces. À terme, ces avancées pourraient améliorer considérablement la prise en charge de la dengue et réduire son impact sur les populations exposées, en diminuant la gravité des infections et la charge que représente cette maladie dans les régions touchées.

Procédures

Selon les procédures appliquées : - Infection des souris par le virus de la Dengue : Injection rétro-orbitale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Injection Sous cutanée : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Injection Intradermique : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Injection intrapéritonéale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes - Administration de composés thérapeutiques sur une durée max de 8 jours. Par voie orale, vigile, 1 à 3 fois par jour par animal, 1 minute OU Par voie sous-cutanée : anesthésie générale, 1 fois par jour maximum, durée 1 minute OU par voie intramusculaire : anesthésie générale, 1 fois par patte arrière et par semaine, soit 2 fois par animal max, durée 1 minute OU par voie intrapéritonéale : vigile, 1 fois par jour maximum, durée 1minute (pendant 8 jours max) - Suivi clinique et pondéral : Pesée et bilan clinique tous les jours par animal sur la durée de l’étude (30 jours), sur animal vigile. La périodicité sera adaptée en fonction des signes cliniques et des recommandations du vétérinaire. - Prélèvement sanguin : A la veine submandibulaire (1x/2semaines) ou à la queue (50uL max/jour), vigile, pendant 2 semaines maximum tout du long de l’étude ; pendant 30 jours max Prélèvement terminal sous anesthésie profonde, par ponction intracardiaque, durée 2 minutes, sur tous les animaux du projet

Impact sur les animaux

Lorsqu’on infecte les souches de souris utilisées avec le virus de la dengue, certains effets sur leur santé peuvent apparaître. Ces souris sont très sensibles au virus parce qu’elles n’ont pas certains types de défenses immunitaires. Elles peuvent donc perdre du poids, parfois plus de 10 %, avoir de la fièvre ou au contraire une baisse de température, et montrer des changements de comportement comme une diminution de l’activité ou un état de fatigue marqué. Dans certains cas particuliers, surtout quand l’infection touche directement le cerveau, des signes neurologiques peuvent apparaître, comme des problèmes d’équilibre, des tremblements ou une paralysie. Des effets indésirables peuvent aussi apparaître selon les produits testés, en fonction de leur nature et de leur éventuelle toxicité. Pour protéger au mieux les animaux, des critères stricts sont établis afin d’arrêter l’expérience si leur état se dégrade trop fortement : par exemple une perte de poids supérieure à 20 %, l’apparition de troubles neurologiques importants ou une altération générale de leur état de santé. Une surveillance quotidienne permet de repérer rapidement tout signe inquiétant et d’intervenir si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux dans cette procédure sont euthanasiés en fin d’étude en raison des prélèvements de fin d'études nécessaires, et pour des raisons de sécurité biologique.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas de méthode entièrement alternative qui permettrait d’éviter totalement l’utilisation d’animaux pour les expériences prévues, car les exigences scientifiques et réglementaires nécessitent encore des études en organisme vivant. Les méthodes In Vitro (sur cellules cultivées en laboratoire) sont utiles pour comprendre certaines étapes du cycle du virus et tester des pistes de traitements. Toutefois, elles restent limitées : elles ne reproduisent pas toute la complexité du corps humain, par exemple la réponse immunitaire complète, les réactions entre différents organes ou encore la structure 3D d’un organisme vivant. C’est pourquoi des études In Vivo, réalisées chez l’animal, restent indispensables pour comprendre comment l’infection se développe, comment le virus se propage, comment le système immunitaire réagit, et pour évaluer la toxicité et l’efficacité de nouveaux traitements dans un organisme complet.

Réduction

Le schéma expérimental du projet repose sur des données bibliographiques robustes préalables permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Seuls les modèles et conditions présentant un intérêt scientifique clairement démontré seront retenus. Les études In Vitro réalisées en amont permettront de réduire le nombre de molécules ou approches à tester In Vivo, limitant ainsi l’utilisation d’animaux aux candidats les plus prometteurs. Le nombre d’animaux sera strictement limité grâce à plusieurs critères. Les différents modèles murins disponibles seront utilisés de manière complémentaire, permettant de sélectionner pour chaque question scientifique le modèle le plus pertinent, évitant toute expérimentation redondante. Par ailleurs, chaque animal contribuera à plusieurs types d’analyses (virologie, immunologie, histologie), maximisant l'information obtenue par individu et réduisant le recours à de nouvelles cohortes.

Raffinement

Enfin, en ce qui concerne le Raffinement pour les expériences : A. Raffinement des manipulations pour limiter le stress des animaux : les expérimentateurs sont formés afin d’appliquer les méthodes dans les conditions les moins contraignantes pour les animaux (préhension adaptée). Toute manipulation considérée comme invasive et/ou stressante pour l’animal sera faite sous anesthésie. B. Les signes cliniques seront observés quotidiennement : perte de poids, érection des poils et altération de la posture, isolement, vocalisation lors de la manipulation, positionnement des vibrisses, température. Si les animaux présentent une perte de poids jusqu’à 10% par rapport à leur poids initial, une observation renforcée sera faite et un gel nutritif sera mis dans la cage afin de faciliter l’ingestion de liquides et nutriments. Si les animaux présentent différents signes cliniques, ou une perte de poids jusqu’à 20%, l’animal sera sacrifié en accord avec les points limites définis en amont de chaque procédure.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris constitue l’option la plus appropriée pour étudier l’infection par le virus de la dengue (DENV), car elle offre un modèle fiable, bien caractérisé et largement validé dans la littérature. Les lignées transgéniques présentent des niveaux contrôlés et prédictibles de sensibilité au DENV, permettant d’explorer de manière progressive la dissémination virale, la réponse antivirale précoce et les atteintes systémiques, tout en limitant l’exposition à des procédures plus invasives. Les lignées immunocompétentes, permettent d’analyser la réponse immunitaire dans un cadre physiologique. Le recours à ces modèles établis maximise la pertinence scientifique des résultats tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires. Les procédures sont conçues pour minimiser la douleur, le stress et tout dommage durable, conformément aux exigences réglementaires, en privilégiant les conditions expérimentales les moins contraignantes compatibles avec les objectifs de recherche.