Maladies infectieuses

8500 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, soit environ 146 composés testés chaque année. Chaque animal peut recevoir une injection du virus de l'hépatite B, des administrations quotidiennes de composés pendant 28 jours par voies orale, veineuse ou rétro-orbitale, et des prélèvements sanguins répétés jusqu'à une ponction terminale du cœur. L'injection hydrodynamique peut provoquer une distension abdominale et une baisse de mobilité, et le porteur reconnaît que des effets imprévisibles peuvent survenir à ce stade précoce. Une partie des souris sont "humanisées" par greffe pour reproduire le cycle du virus, et toutes sont tuées, leur état infecté interdisant toute réutilisation.

Objectifs

Malgré l’existence d’un vaccin pour lutter contre le virus de l’hépatite B (Hepatitis B virus ; HBV), cette infection virale reste un problème majeur de santé publique mondial. Il est important de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant l’élimination complète du virus. Ce projet, vise à évaluer l’activité de composés sur la prévention et l’élimination du HBV, en ciblant le virus à différents stades de son cycle, que ce soit dans ses phases de réplication active, d’infection chronique ou sous sa forme de cccDNA nucléaire pouvant persister chez les patients. Nous pourrons également étudier l’immunité de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale et potentiellement chercher si ces composés ont la capacité de la moduler et ainsi d’accélérer l’élimination complète du virus (disparition des HBsAg et du cccDNA).

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet vise à tester de futurs traitements contre l’hépatite B afin de vérifier leur efficacité. Pour cela, nous utiliseront différents modèles de souris spécialement conçus pour reproduire l’infection humaine par le virus : certains modèles permettent d’étudier comment le virus se réplique, d’autres comment il interagit avec le système immunitaire, et d’autres encore comment les cellules infectées du foie réagissent aux traitements. Ces modèles permettent de tester plusieurs types de candidats médicamenteux comme des anticorps, protéines, petites molécules, vaccins ou encore siRNA. Ils aident aussi à déterminer les meilleurs moments pour traiter, et à repérer les éventuels effets toxiques. Les souris « humanisées » sont particulièrement utiles car elles imitent très fidèlement le cycle du virus chez l’humain. A long terme, ce travail permettra d’accélérer l’arrivée de nouveaux traitements contre l’hépatite B. Les données obtenues aideront à comprendre comment le virus et le système immunitaire interagissent et comment éliminer plus efficacement l’infection. L’objectif est de développer des thérapies plus ciblées, notamment en visant différentes protéines virales, capables de réduire la persistance du virus dans l’organisme et de limiter les complications graves liées à l’hépatite B, au bénéfice de la santé publique. Le projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité d'environ 146 composés par an en 24 études maximum.

Procédures

Selon les procédures appliquées : - Infection par l’hépatite B des souris: Injection rétro-orbitale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Administration intraveineuse à haut débit (Injection hydrodynamique par la veine caudale) : vigile, 1 fois par animal, 1 minute OU Injection sous cutanée de cellules : sous anesthésie générale, 1 fois par animal, 1 minute - Administration de composés thérapeutiques sur une durée max de 28 jours. Par voie orale, vigile, 1 à 4 fois par jour par animal, durée 1 minute Ou Par voie sous-cutanée : vigile, 2 fois par jour maximum, durée 1 minute ou par voie intramusculaire : sous anesthésie, 1 fois par jour maximum, durée 1 minute ou par voie intrapéritonéale : vigile,1 fois par jour maximum, durée 1minute ou par voie intraveineuse : sous anesthésie, 1 fois par jour par voie caudale ou par voie rétro-orbitale, avec une alternance de l’œil droit et gauche avec un minimum de 48h entre 2 injections au même œil et un maximum de 4 injections seulement sur toute la durée de l’étude, durée 3 minute - Suivi clinique et pondéral : pesée et bilan clinique 1 fois par semaine minimum par animal sur la durée de l’étude, vigile, 2 minutes - Prélèvements sanguin : Par la veine submandibulaire : vigile, 1 fois tous les 15 jours, pour une durée maximale de 8 semaines, durée 2 minutes. Par micro-sampling à la queue : vigile, exclusivement au cours des semaines sans prélèvement submandibulaire, 1 fois par semaine, durée 2minutes. Dans le cadre spécifique des études de pharmacocinétique (PK) : par micro-sampling répétés à la queue, sans aucun prélèvement submandibulaire, 7 prélèvements sur 24h, vigile, durée 2minutes. Par prélèvement terminal, sous anesthésie profonde, par ponction intracardiaque, 1 fois en fin de procédure, pour une durée estimée à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des souris seront utilisées pour étudier l’infection par l’hépatite B et tester de futurs traitements antiviraux. Les interventions prévues peuvent entraîner des gênes légères à modérées, selon la technique employée. Lors de l’injection du virus (AAV/HBV), les souris peuvent ressentir un stress momentané lié à la manipulation, ainsi qu’une légère douleur ou une petite inflammation au point d’injection, qui disparaît généralement rapidement. Les injections hydrodynamiques peuvent provoquer une gêne plus marquée juste après la procédure, comme une sensation de ventre distendu et une baisse temporaire de la mobilité, mais ces effets s’estompent en quelques heures. Dans les modèles transgéniques, humanisés ou ceux impliquant l’implantation de cellules, les interventions consistent surtout en des injections ou des prélèvements sanguins, ce qui peut entraîner un stress bref ou une réaction légère au point d’injection. Aucun effet grave n’est attendu avec les candidats médicaments testés, mais comme il s’agit d’étapes précoces de recherche, certains effets imprévisibles peuvent parfois survenir, tels qu’une perte de poids, des variations de température ou un comportement inhabituel. Pour préserver le bien-être des animaux, une surveillance quotidienne sera assurée afin de repérer tout signe de douleur, de stress ou d’inactivité anormale. Leur poids sera contrôlé au moins une fois par semaine et plus fréquemment si nécessaire. En cas de problème, des mesures adaptées seront mises en place avec l’aide d’un vétérinaire pour réduire au maximum l’inconfort des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d’étude, car les procédures expérimentales nécessitent le prélèvement d’organes et d’échantillons biologiques incompatibles avec le maintien en vie des animaux. De plus, l’état physiologique des animaux (infectés par HBV) ne permet pas leur réutilisation.

Remplacement

Avant d’avoir recours aux animaux, toutes les solutions permettant de les remplacer seront examinées. Des tests in vitro permettront d’évaluer d’abord si les traitements envisagés sont efficaces contre le virus, ce qui évitera d’utiliser des animaux pour des molécules qui ne fonctionneraient pas. Lorsque des tests sur animaux sont indispensables, des modèles de souris spécialement développés pour reproduire l’infection par l’hépatite B seront utilisés, car ils offrent des résultats plus fiables tout en limitant le recours à d’autres espèces. L’ensemble de ces démarches assure que les animaux ne sont utilisés que lorsque cela est réellement nécessaire pour faire avancer la recherche..

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum grâce à plusieurs actions. Les quatre méthodes de recherche prévues sont complémentaires : elles permettront de choisir, pour chaque question scientifique, le modèle le plus adapté, évitant ainsi de répéter inutilement les expériences. Chaque souris servira également à recueillir plusieurs types d’informations (comme le suivi du virus, la mesure de différents marqueurs dans le sang ou les tissus, ou encore l’analyse de la réponse immunitaire), ce qui permet d’obtenir un maximum de données sans augmenter le nombre d’animaux. De plus, les traitements potentiels seront d’abord testés in vitro, sans animaux, afin de ne retenir que les candidats les plus prometteurs. Le nombre final d’animaux sera déterminé à partir de calculs statistiques rigoureux pour s’assurer que les groupes ne sont ni trop grands ni trop petits. Sur l’ensemble des cinq années du projet, au maximum 8500 souris seront utilisées pour toutes les études prévues. Ce total se répartit de la façon suivante : environ 3 200 souris pour les modèles AAV/HBV, 2 000 pour la technique dite d’hydrodynamie, 2 400 pour les modèles utilisant des cellules tumorales exprimant le virus ou des particules virales, et environ 900 pour les souris humanisées. Chaque procédure correspond à un certain nombre d’études par an et à une taille d’échantillon adaptée à chaque méthode scientifique.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera une priorité tout au long du projet. Les expériences seront conçues pour être les moins douloureuses et les moins stressantes possible, et les animaux ne seront manipulés que lorsque cela est réellement nécessaire. Chaque fois que c’est possible, les interventions seront réalisées sous anesthésie afin de réduire l’inconfort. Un suivi attentif et régulier permettra de repérer rapidement tout signe de douleur ou de détresse, grâce à une grille d’observation adaptée, et des mesures appropriées seront prises en concertation avec le vétérinaire. Les interventions seront organisées pour limiter leur durée et éviter la répétition de procédures invasives. Les prélèvements seront effectués avec des méthodes qui réduisent au maximum la souffrance, et, lorsque c’est possible, avec des techniques non létales permettant d’utiliser le même animal pour plusieurs mesures sans augmenter son stress. Enfin, toutes les personnes impliquées dans les expérimentations seront formées et qualifiées, garantissant des pratiques soigneuses et respectueuses du bien-être animal.

Choix des espèces

Les tests réalisés uniquement en laboratoire (in vitro) ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’une infection réelle. Pour étudier le virus de l’hépatite B et développer des traitements capables de l’éliminer complètement, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux. La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce type de recherche : elle dispose de nombreux modèles bien établis qui reproduisent les différentes étapes de l’infection et permettent d’évaluer à la fois l’action du traitement sur le virus et la réponse du système immunitaire. Sur le plan pratique et éthique, la souris est un petit animal facile à héberger et à suivre, ce qui réduit le stress et les souffrances. Son utilisation respecte les principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) : elle évite de recourir à des espèces plus sensibles, limite le nombre d’animaux nécessaires et permet d’adapter les protocoles pour améliorer leur bien-être. Enfin, la souris est déjà largement utilisée dans la recherche sur l’hépatite B, ce qui garantit des résultats fiables et comparables pour la suite du développement des traitements. Les souris sont âgées de 5-7 semaines à la livraison avec un poids autour de 20 grammes afin de permettre des infections et des traitements homogènes des lots d'animaux. Les souris humanisées auront quant à elles 6-7 mois à réception pour permettre une bonne humanisation de leur foie (et de leur système immunitaire le cas échéant). Il s’agit donc de rongeurs matures et adultes.

8 800 souris vont être utilisées sur quatre ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées et 200 réutilisées dans d'autres projets. On remplace leurs cellules hépatiques par des cellules humaines pour tester des candidats médicaments, après des injections détruisant leurs propres hépatocytes. Le porteur présente ce modèle comme plus acceptable que le recours aux primates non-humains. Il reconnaît n'avoir mené aucun calcul statistique, l'effectif reposant sur le nombre d'études des années précédentes et sur un plan commercial de croissance.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.

Procédures

4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Produites pour être vendues à des chercheurs et à des entreprises, 72 000 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dans la méthode principale, les nouveau-nés de moins de cinq jours reçoivent une irradiation de trois minutes puis une injection de cellules souches humaines dans le foie, avant un transport de quarante-cinq minutes en camion vers un éleveur professionnel. Le porteur explique que seules les femelles sont humanisées, "car il n'existe pas de demande du marché pour les mâles", et que la production est ajustée chaque semaine aux besoins prévus. Aucune de ces souris n'est tuée dans le cadre du projet, toutes étant gardées vivantes pour être utilisées ensuite par les clients, ce qui laisse leur devenir réel hors du champ de ce résumé.

Objectifs

Depuis plusieurs années, certaines souris spéciales, dites « immunodéficientes », sont utilisées comme modèles pour étudier le système immunitaire humain. Ces souris n’ont pas de défenses immunitaires propres, ce qui permet d’y greffer des cellules humaines. On leur injecte notamment des cellules souches du sang humain, capables de reconstruire un système immunitaire complet. L’objectif est de créer des souris dont le système immunitaire est en grande partie humain, afin de mieux comprendre les maladies, tester des traitements ou développer des vaccins. Le but de ce projet est de produire ces souris « humanisées » et de les mettre à disposition de chercheurs et d’entreprises pour enrichir la connaissance et développer les médicaments de demain.

Bénéfices attendus

Les souris dotées d’un système immunitaire humain sont des modèles essentiels pour la recherche médicale, car elles reproduisent des caractéristiques proches de celles de l’être humain. Elles permettent de tester des médicaments dans des conditions plus réalistes, notamment pour des maladies liées au système immunitaire, au cancer, à l’inflammation ou au métabolisme. Ces modèles améliorent la qualité des recherches en offrant des résultats plus fiables et reproductibles. Cela contribue à réduire les échecs lors des essais cliniques et à accélérer le développement de nouveaux traitements. En utilisant des modèles adaptés, la recherche gagne en pertinence et limite le recours à des approches moins efficaces.

Procédures

Deux méthodes sont utilisées pour humaniser le système immunitaire humain chez les souris. Méthode 1, la plus courante, concerne les nouveau-nés âgés de moins de 5 jours. Ils reçoivent une irradiation unique, très courte (environ 3 minutes), suivie d’une injection de cellules souches humaines directement dans le foie, qui ne dure que quelques secondes. Méthode 2, utilisée uniquement dans de très rares cas (2% d'humanisations), concerne des jeunes femelles âgées de 4 à 5 semaines. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales de busulfan à 24 heures d’intervalle, chacune ne durant que quelques secondes. Ensuite, une seule injection de cellules est réalisée par voie rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse. Bien que l’injection elle-même prenne seulement quelques minutes, l’animal reste anesthésié pour une durée totale maximale de 7 à 10 minutes. Chaque animal ne suit qu’une seule méthode complète, soit au stade nouveau-né, soit à l’âge adulte.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux immunodéficients et doivent donc être maintenues dans des conditions très protégées pour éviter les infections. Lorsqu’elles ne sont pas exposées à des agents infectieux, elles restent en bonne santé. Un léger stress peut survenir lors de leur transport entre les sites, ainsi que lors de la manipulation des nouveau-nés et de leur séparation avec la mère. Chez les nouveau-nés, l’injection dans le foie peut provoquer une légère gêne de courte durée. Les injections intrapéritonéales de busulfan peuvent entraîner un inconfort transitoire au point d’injection ainsi qu’une période limitée de malaise, se manifestant par une baisse d’activité, un appétit diminué et une légère perte de poids. L’injection rétro-orbitale peut causer une irritation oculaire passagère liée à la manipulation, mais le produit injecté n’est pas irritant. Pour garantir une qualité optimale des soins et des conditions sanitaires, les animaux humanisés sont hébergés chez un éleveur professionnel jusqu’à leur expédition vers l’utilisateur final. En conséquence, ils doivent être transportés depuis notre site vers celui de l’éleveur. Ce trajet, d’une durée d’environ 45 minutes en camion agréé, est direct et réalisé dans des conditions contrôlées. Bien que court, ce déplacement peut entraîner un stress transitoire chez les souris.

Devenir

Tous les animaux sont gardés à vie à l’issue de chaque procédure de ce projet. Ils sont destinés à être utilisés dans des études scientifiques menées par les utilisateurs finaux, ce qui constitue l’objectif principal de leur production.

Remplacement

Les souris immunodéficientes portant un système immunitaire humain reconstitué sont aujourd’hui des modèles essentiels pour étudier le fonctionnement de cellules humaines dans un organisme vivant, avant les phases cliniques. Des méthodes alternatives sans animaux se développent, comme les systèmes organ-on-chip, les co-cultures avancées ou les organoïdes, qui permettent de reproduire certaines fonctions de tissus humains. Ces approches offrent des avantages, notamment la possibilité d’utiliser des cellules provenant de patients, et elles sont progressivement intégrées aux stratégies de développement pour réduire l’usage d’animaux. Toutefois, elles ne permettent pas encore de reproduire les interactions complexes entre organes, les régulations hormonales ou métaboliques, ni la dynamique complète du système immunitaire. Pour ces raisons, les modèles de souris humanisées restent indispensables pour comprendre les réponses immunitaires dans un organisme entier et obtenir des données fiables avant les essais chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris humanisées produites est défini en fonction des besoins prévus pour les six prochains mois. La production est répartie en petits lots hebdomadaires, ce qui permet d’ajuster les objectifs de production chaque semaine. Les fluctuations naturelles peuvent être compensées grâce à des lots produits jusqu’à deux semaines avant ou après. Ainsi, seules les souris réellement nécessaires sont produites et toute surproduction est évitée. Enfin, seules les femelles sont actuellement humanisées, car il n’existe pas de demande du marché pour les mâles. Des méthodes innovantes sont à l’étude pour, à terme, permettre l’utilisation des mâles ou réduire leur proportion à la naissance.

Raffinement

Les souris sont maintenues en conditions sanitaires strictes afin de les protéger des infections, auxquelles elles sont très sensibles en raison de leur immunodéficience. Pour l’humanisation selon la méthode 1, les petits sont manipulés avec précaution afin de limiter leur stress et permettre leur retour sans difficulté auprès de la mère. Avant toute manipulation, le technicien frotte ses gants avec de la litière afin de conserver l’odeur du nid. Cela est appliqué lors de l’irradiation et de l’injection des cellules humaines. Pour la méthode 2, l’injection rétro-orbitale est réalisée sous anesthésie afin de garantir le confort de l’animal. Après chaque procédure, les animaux font l’objet d’une surveillance attentive pendant 1 à 2 jours afin de détecter rapidement toute complication. En cas de perte d’appétit ou de poids, de la nourriture molle ou en gel est ajoutée pour faciliter l’alimentation.

Choix des espèces

Les progrès en génétique permettent aujourd’hui de créer des rongeurs présentant un système immunitaire humain ou l’humanisation de certains organes. Ces modèles sont essentiels pour mieux comprendre les maladies humaines et développer des traitements adaptés. Le rongeur est choisi pour sa taille et sa manipulation aisée, ce qui en fait un modèle idéal pour l’humanisation du système immunitaire par injection de cellules souches humaines. Ces modèles sont utilisés pour des études précliniques avant les essais chez l’Homme, notamment pour évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments. Ils permettent d’analyser le rôle des cellules immunitaires humaines dans des contextes complexes, comme les tumeurs ou les réactions inflammatoires. Le stade de développement des animaux utilisés est déterminé par la méthode d’humanisation : pour l’humanisation par irradiation et injection intra-hépatique de cellules souches de sang, des nouveau-nés âgés de 4 à 5 jours sont utilisés, car cette approche fonctionne mieux chez les très jeunes animaux. Pour la méthode utilisant le busulfan et l’injection en rétro-orbitale, des rongeurs âgés de 4 à 5 semaines sont choisis, car ils tolèrent ce traitement, qui serait toxique chez les nouveau-nés.

Une partie des souris utilisées développe spontanément une maladie auto-immune dès vingt-cinq semaines d'âge, et le projet cherche à accélérer ce développement par une infection. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Les expérimentateurs leur injectent des bactéries dans l'abdomen pour provoquer un sepsis, les traitent aux antibiotiques deux heures après, puis prélèvent leur sang derrière l'œil sous anesthésie jusqu'à cinq fois, avec cinq à dix semaines entre deux prélèvements. Une partie d'entre elles sera gardée jusqu'à quarante semaines après l'infection, le porteur indiquant ne pas pouvoir prédire les symptômes qui apparaîtront.

Objectifs

Les maladies auto-immunes à autoanticorps sont des maladies où le système immunitaire, qui est censé protéger le corps, se met à produire des anticorps contre l’organisme lui-même (autoanticorps), et à attaquer certains organes voire tout le corps (on dit alors que c’est systémique). Ces maladies sont rares (moins d’une personne sur 2000) et peuvent être causées par l’environnement (comme la pollution ou l’alimentation), des hormones (elles touchent plus souvent les femmes), et/ou des prédispositions génétiques, c’est-à-dire que certaines personnes sont plus à risque à cause de leurs gènes. On a remarqué que les personnes qui font une infection grave (comme un sepsis, qui est une infection très sévère) et qui vont en réanimation ont un risque cent fois plus élevé que les autres de développer une maladie auto-immune dans les six mois qui suivent leur sortie de l’hôpital. On ne comprend pas pourquoi, après une infection très grave, certains patients développent une maladie auto-immune et d’autres non. Si on arrive à prédire quels patients risquent de développer ce genre de maladies dans ces conditions, on pourra mieux les soigner et essayer d’empêcher que la maladie auto-immune ne se développe, car ces maladies diminuent la qualité de vie des patients et coûtent très cher à la société. Notre projet a pour but de comprendre comment une infection grave peut déclencher une maladie auto-immune, en utilisant des souris pour faire des expériences et observer ce qu’il se passe. On veut répondre à deux questions principales : 1) Est-ce qu’une infection sévère peut déclencher une maladie auto-immune chez des souris déjà à risque ? 2) Est-ce qu’une infection sévère peut aussi déclencher une maladie auto-immune chez des souris normales qui ne sont pas à risque ? En comprenant mieux ces mécanismes, on espère trouver de nouvelles façons d’identifier les individus à risque et ainsi améliorer leur prise en charge et mettre en place des stratégies de prévention.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension des mécanismes du lien entre infection sévère et développement de l’auto-immunité. Les cellules et molécules impliquées dans cette induction auto-immune seront ainsi identifiées. Le deuxième niveau concerne la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et l’identification des biomarqueurs (marqueurs de maladie faciles à détecter dans le sang ou les urines) associés à cette évolution de l’inflammation aiguë vers l’auto-immunité permettront de pouvoir identifier les patients à risques et de prévenir le développement de telles affections chroniques.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») et sous la peau (« sous-cutanées), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et les animaux seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang sous anesthésie générale. Les gestes réalisés durent moins de 30 secondes chacun. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec des bactéries une seule fois pour imiter une infection sévère. 2 heures plus tard, elles seront traitées avec des antibiotiques par injection sous-cutanée quatre fois sur une période de 24h dans le but de les guérir de l’infection, comme les patients en réanimation. Ces souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale avant l’infection, puis certaines seront à nouveau prélevées 4 fois avec 5 à 10 semaines entre deux prélèvements. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins des souris avant et après infection pour voir si elles ont développé une maladie auto-immune.

Impact sur les animaux

Certaines souris utilisées ici développent une maladie auto-immune légère mais quantifiable dès 25 semaines d’âge. Ces animaux entreront en procédure à l’âge de 10 semaines (+/- 2 semaines), c’est-à-dire à l’âge adulte, et ne seront conservés que deux semaines supplémentaires après l’infection sévère traitée par antibiotique. Nous nous attendons à cette procédure entraîne une accélération du développement de la maladie avec des signes d’auto-immunité à 12 semaines d’âge équivalents à ceux d’animaux non-infectés de 25 semaines. Une autre procédure utilisera des animaux normaux qui seront conservés sur un maximum de 40 semaines après l’infection sévère afin de déterminer s’ils développent une maladie auto-immune ou non, sans que nous puissions prédire concrètement les symptômes éventuels induits. Une grille d’évaluation clinique sera utilisée sur toute la durée de l’expérience afin d’éviter les éventuelles nuisances sur le bien-être des animaux. Lors des procédures, les souris seront soumises à quatre types de nuisance. 1) les contentions nécessaires à la réalisation des actes (injections et prélèvements d’urine) entraîneront un stress léger et bref pour les animaux (moins de 30 secondes chacun). 2) les injections intrapéritonéales (ip) et sous-cutanées (sc) (1 ip et 4 sc/animal réparties sur 24 heures) entraineront des douleurs brèves de piqure à chaque occurrence (moins de 30 secondes). 3) les prélèvements sanguins de faible volume par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale gazeuse (1 à 2 minutes) pourront entraîner ensuite un inconfort à l'orbite le temps que la cicatrisation soit complète (24 heures). 4) l’infection entraînera une gêne pour les souris (fièvre et inconfort) durant les deux premières heures. Le traitement antibiotique sera alors réalisé ce qui soulagera les souris rapidement.

Devenir

Les animaux seront systématiquement euthanasiés en fin de procédure pour analyse ou avant dans le cas d’atteinte de points limites.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivants avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes, ni des maladies étudiées, ni de la séquence infection/auto-immunité à l’échelle d’un organisme. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour ces études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

Dans notre laboratoire, on a déjà fait le modèle de péritonite avant, ce qui nous permet d’utiliser seulement le nombre de souris nécessaire. Il y aura 10 souris par groupe pour bien prendre en compte les différences entre chaque animal et voir comment ils réagissent à l’infection et au risque de maladies auto-immunes. Cela nous aide à être sûrs que nos résultats sont fiables et qu’on peut vraiment voir s’il y a une différence entre les groupes, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Les souris qui servent de contrôles seront juste traitées avec des antibiotiques et on n’ajoutera pas d’autres groupes pour ne pas en utiliser trop. Après les expériences, on gardera des échantillons pour pouvoir répondre à d’autres questions plus tard, toujours dans l’idée d’utiliser le moins d’animaux possible. Enfin, pour prouver que nos résultats sont solides et que l’expérience peut être refaite par n’importe quel autre laboratoire avec le même résultat, on fera chaque test trois fois, ce qui est le minimum demandé pour que ce soit accepté scientifiquement.

Raffinement

Avant et pendant les expériences, les souris vivent dans de bonnes conditions pour éviter qu’elles soient stressées. Elles ne sont jamais seules, ont toujours des objets pour s’occuper (comme du coton pour faire leur nid ou des petites maisons pour se cacher) et sont observées tous les jours. Pendant les expériences, on fait tout pour que les souris souffrent le moins possible. Après l’infection, on les surveille toutes les 6 heures pendant 24 heures et il n’y a que quelques souris à la fois pour pouvoir bien toutes les observer. Le traitement avec des antibiotiques commence 2 heures après que les souris ont reçu les bactéries, et donc aucune ne mourra à cause de cela. Si une souris est trop malade, elle sera euthanasiée tout de suite, sans attendre la fin de l’expérience. L’état de santé des souris est suivi grâce à une grille d’évaluation. On regarde à chaque fois trois choses : sa posture, sa façon de bouger et l’état de ses poils. À chaque critère, on donne un score de 0 à 3. Si la souris a 6 points ou plus au total, ou si elle a 3 points dans la posture ou la mobilité, elle sera euthanasiée. Après le traitement, en plus de surveiller les souris chaque jour, on continue de calculer les scores des souris chaque jour pendant 3 jours, puis une fois par semaine pendant 40 semaines, pour vérifier si elles restent en bonne santé. On regarde aussi leur poids et si elles n’ont pas de problèmes de peau, de poumons ou d’articulations. Si une souris atteint certains scores qui montrent qu’elle va trop mal, elle est euthanasiée et analysée immédiatement.

Choix des espèces

Notre projet s’inscrit dans l’objectif de définir des mécanismes de développement de maladies d’intérêt pour la santé humaine afin de pouvoir améliorer la prise en charge des patients. Les procédures et les souris utilisées dans le présent projet nous permettront d’atteindre cet objectif. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet et dont la biologie se rapproche suffisamment de la biologie humaine pour que son étude puisse y être transférée. De plus les outils d’analyse disponibles et l’expertise acquise des modèles utilisés ici justifient l’utilisation de ce modèle. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 10 semaines (stade adulte). Ce stade adulte correspond au stade de la population de patients concernés par la présente investigation.

Chaque macaque subit une trentaine d'anesthésies, autant de prélèvements sanguins et jusqu'à quatre ponctions de moelle osseuse. Ils sont 16 au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et reçoivent jusqu'à cinq injections de vaccins candidats contre l'hépatite C. Le dossier déclare les 16 animaux réutilisés, le porteur indiquant qu'ils pourraient être gardés en vie sur avis vétérinaire et versés à d'autres projets, alors que les anesthésies et prélèvements répétés peuvent entraîner anémie, hématomes, infections cutanées et pertes de poids. Le choix du macaque tient, selon le porteur, à sa proximité avec l'humain, qui permettrait une transposition "rapide et fiable" des résultats au design des essais cliniques.

Objectifs

L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) est une menace importante pour la santé publique mondiale, avec environ 300 000 décès chaque année. Le VHC entraîne 1,5 million de nouvelles infections par an, et en l’absence de vaccin, ce chiffre continue d’augmenter malgré l’existence de traitements antiviraux très efficaces. C’est pourquoi le développement d’un vaccin est essentiel. Le VHC est très variable. Cela rend difficile la création d’un vaccin capable de protéger contre tous les sous-types du virus. Les anticorps neutralisants à large spectre (bNAbs) ont la capacité de bloquer l’infection par un grand nombre de souches différentes du VHC. Dans le cadre d’un projet international, nous cherchons donc à développer un vaccin contre le VHC capable d’induire de tels anticorps. Pour cela, plusieurs stratégies sont utilisées. Les antigènes vaccinaux sont conçus en combinant une approche basée sur l’analyse de la structure des protéines du virus et une modélisation informatique. Le but du présent projet est d’étudier l’innocuité et l’immunogénicité des meilleurs candidats vaccins, identifiés in-vitro dans un modèle pré-clinique proche de l’humain.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats permettront de justifier la poursuite du développement du ou des meilleurs candidats vaccins en essais cliniques chez l’humain. A long terme, un vaccin contre le VHC permettrait d’épargner de nombreuses vies. Il permettrait aussi de diminuer l’impact économique lié à la prise en charge thérapeutique actuelle de l’infection par le VHC qui est très coûteuse.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet sont : - Administration de vaccins candidats (jusqu’à 5 administrations, tous les animaux, 10 minutes) - Anesthésie des animaux (30 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) - Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés (30 fois environ, 5 minutes, tous les animaux) - Prélèvements de moelle osseuse sur animaux anesthésiés (4 fois maximum, 10 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Nuisances suite à l’administration des vaccins (peu attendu) : Réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur, légère fièvre transitoire dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances suite aux prélèvements de sang, de moelle osseuse et aux anesthésies répétées : Dysorexies avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement.

Devenir

Dans ce projet, les modèles animaux n’étant pas infectés, ils pourraient être gardés en vie sur avis vétérinaire et être inclus dans d’autres projets compatibles avec la procédure suivie dans notre projet, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Remplacement

L’étude et la caractérisation de la réponse immunitaire induite lors de l’immunisation avec les vaccins candidats contre l’infection par le VHC nécessitent l’exploration de fonctions physiologiques et d’interactions à l’échelle de l’organisme entier. A ce jour, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux. Les systèmes expérimentaux in silico et in vitro basés sur l’étude de cellules ou de tissus isolés ne permettent pas de construire des modèles pertinents de la mise en place et de la persistance de la réponse immunitaire induite par une vaccination.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire avec 4 animaux par groupes. Comme il s’agit d’une étude de preuve de concept, il est prévu de détecter uniquement des différences importantes entre les groupes. L’effectif de 4 animaux permettra 1) de s’assurer qu’un vaccin est immunogène tout en prenant en compte une certaine variabilité interindividuelle et 2) de comparer la réponse immunitaire induite par les différents vaccins candidats au moyen de tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits échantillons

Raffinement

Anesthésies: Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie. En cas de problème de prises alimentaires suite aux anesthésies répétées, une diversification /complémentation alimentaire sera instaurée (fruits secs, fruits frais additionnels etc.). Prélèvements: Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Immunisation: . Mise en place de point limite pour limiter au maximum la douleur suite aux immunisations.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal retenu car il est le plus efficace pour prédire la sécurité des vaccins et la réponse immunitaire induite par les vaccins chez l’humain. Sa proximité avec l’humain permet en effet une transposition rapide et fiable des résultats au design des études cliniques. La réponse immunitaire induite chez l’humain adulte par la vaccination est un des paramètres majeurs étudié dans ce projet, nous utiliserons donc des animaux disposant d’un système immunitaire mature âgés d’au moins 3 ans.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées par deux injections de cyclophosphamide, elles reçoivent dans la cuisse une injection de Klebsiella pneumoniae multirésistante, puis développent rougeur, gonflement et boiterie, sous une surveillance des signes locaux toutes les six à huit heures. Le muscle infecté est prélevé après la mise à mort pour compter les bactéries. Aucun traitement n'est évalué ici, le porteur mettant au point un modèle d'infection qu'il décrit comme une étape "obligatoire et règlementaire", et affirmant qu'aucune alternative ne reproduit la diffusion des antibiotiques dans les tissus.

Objectifs

La résistance des bactéries aux antimicrobiens (AMR) représente actuellement un problème majeur de santé publique, et menace notre capacité à traiter des infections potentiellement mortelles telles que les infections à Klebsiella pneumoniae, dont le taux de mortalité peut atteindre 50 %. Il s’agit d’une espèce bactérienne fréquemment retrouvée en milieu hospitalier et le traitement de ces infections requiert souvent l’usage d’antibiotiques de dernière ligne. Toutefois, l’activité de ces antibiotiques est largement compromise par le fait que les bactéries produisent des facteurs (appelés MBL pour certains) et capables de détruire ces antibiotiques, les rendant ainsi inefficaces. Dans ce cadre, des stratégies thérapeutiques innovantes sont attendues. Certains laboratoires s’intéressent au développement de médicaments capables de s’attaquer aux mécanismes de résistance des bactéries et ainsi de restaurer l’activité des antibiotiques disponibles. Aussi, de façon à évaluer ultérieurement l’activité in vivo de ces médicaments, il convient, dans un premier temps, de développer le modèle d’infection optimal et surtout requis par les autorités de santé, permettant de répondre à la question. Pour cela, l’objectif de la présente étude consiste à développer un modèle prédictif d’infection musculaire (cuisse) à Klebsiella pneumoniae multi-résistante chez la souris. Ce modèle servira, par la suite, à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux composés anti-infectieux en développement.

Bénéfices attendus

Les infections bactériennes dues à des espèces multi-résistantes comme Klebsiella pneumoniae constituent un challenge pour les professionnels de santé, en raison de leur capacité à produire des facteurs capables de détruire les antibiotiques. L’étude de ces infections est donc primordiale. Le projet permettra de mettre à disposition un modèle d’infection à K. pneumoniae précieux, utile à l’évaluation de l’efficacité de composés anti-infectieux en développement, particulièrement attendus en thérapeutique.

Procédures

- Deux injections d’immunosuppresseur (5 secondes maxi) - Une instillation intramusculaire sous anesthésie

Impact sur les animaux

Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées selon un protocole bien défini (150 mg/kg de cyclophosphamide à J-4 et 100 mg/kg à J-1). Ce protocole a déjà été utilisé dans plusieurs études et n’a montré aucun effet indésirable sur les animaux (injection de 5 secondes maximum en intrapéritonéal). A J0, l’administration intramusculaire de la suspension bactérienne sera réalisée par du personnel compétent et expérimenté (temps d’infection 15 secondes maximum, sous anesthésie volatile). Suite à l’infection, la principale nuisance sera associée à des signes locaux au niveau du site infectieux et à un tableau inflammatoire local (rougeur, gonflement, boiterie). Des expériences antérieures menées sur un modèle similaire n’ont pas montré de signes d’infection grave à 24h de suivi post-infection.

Devenir

A l’issue de la procédure, le tissu musculaire sera prélevé, de façon à quantifier la charge bactérienne

Remplacement

Actuellement, le recours au modèle murin est justifié par l’absence d’alternatives expérimentales capables de reproduire de manière pertinente la complexité des infections multi-résistantes, intégrant l’infection et la diffusion intratissulaire des antibiotiques. Même si d’autres essais in vitro dynamiques sont en cours, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes, tout en respectant la variabilité biologique inhérente à ce genre d’étude. Aussi, des expériences précédentes sur des modèles similaires nous permettent de dire que 6 animaux par groupe (au lieu de 10) et par temps sont suffisants pour cette phase de mise au point de modèle.

Raffinement

Les injections intramusculaires seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 6 par cage. La principale nuisance sera liée à l’installation et à la progression de l’infection localement. Une surveillance accrue des signes locaux (toutes les 6-8h) sera réalisée tout au long des études. En fonction de ce score, l’administration d’un antalgique sera appliquée.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix pour la mise au point de ces modèles d’infection bactérienne (largement décrit dans la littérature) ainsi que pour l’évaluation de thérapies antibiotiques ultérieures. Des souris de 8 semaines seront utilisées de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédents modèles).