Troubles cardiaques

20 chiennes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit trois IRM de deux heures sous anesthésie générale, un prélèvement de globules blancs de trois heures sous anesthésie générale, 27 prises de sang à l'état vigile, six échographies cardiaques et six enregistrements de l'électrocardiogramme portés de douze à soixante-douze heures. Le porteur annonce une perte d'appétit, une journée de fièvre avec abattement, un risque de saignement de la vessie et un risque rare de relargage cytokinique, et prévoit d'interrompre les sorties en extérieur pendant une quinzaine de jours. Ces chiennes portent l'anomalie génétique de la myopathie de Duchenne et développent toutes une fibrose du cœur entre trois et neuf ans, ce que le porteur présente comme le seul modèle animal caractérisé pour les femmes porteuses de cette maladie.

Objectifs

En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisée est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T tueurs =sous-population de globule blanc) modifiées artificiellement pour cibler des marqueurs tumoraux spécifiques. Les globules blancs du patient sont isolés par une procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple, puis modifiés ex vivo pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques, dont la fibrose myocardique qui accompagne de multiples maladies cardiaques. En particulier, les femmes qui peuvent transmettre la myopathie de Duchenne peuvent développer une fibrose myocardique. Il en est de même chez des chiennes qui portent une anomalie génétique dans le gène en cause dans la myopathie de Duchenne (dites "porteuses saines" car ne présentant pas d'anomalie clinique évidente) et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans le coeur de ces animaux. L'objectif de ce projet est de déterminer si le ciblage de ce marqueur par des cellules CAR-T permet de réduire la fibrose du coeur chez des chiennes porteuses de myopathie de Duchenne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept pré-clinique sur l'efficacité du ciblage d'un marqueur spécifique de la fibrose, pour réduire celle-ci dans un contexte de patiente porteuse de myopathie de Duchenne. Si cette stratégie s'avère efficace, cette étude ouvrira la voie à la possibilité d'utiliser ce marqueur comme une cible thérapeutique chez les patientes porteuses de myopathie de Duchenne, mais aussi chez des patients atteints de cardiomyopathies d'origines diverses dans lesquelles une fibrose cardiaque évolue et contribue à la dégradation de la fonction cardiaque.

Procédures

- Trois examens d'imagerie IRM sous anesthésie générale, durée approximative 2 heures/examen - Un prélèvement de globules blancs par une procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple, sous anesthésie générale, durée approximative 3 heures - 27 prélèvements sanguins vigile, temps estimé 5 minutes y compris préparation et compression pour éviter la formation d'un hématome. - Vigiles, les chiennes subiront également des examens cliniques, six échographies cardiaques (20 minutes) et six enregistrements de l'électrocardiogramme en "ambulatoire" (12 à 72 heures, équipement sans fil porté par le chien).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les chiennes au cours de ce projet sont de trois ordres : - Celles liées aux arythmies ventriculaires qui touchent ces animaux et qui pourraient conduire à une fibrillation ventriculaire et un arrêt cardiaque (événement rarissime) - Celles liées au protocole médicamenteux préparatoire qui a pour but de diminuer la quantité de globules blancs circulants pour permettre une meilleure efficacité des cellules CAR-T. Les principales nuisances induites sont une perte d'appétit transitoire en cours de traitement, qui répond à un traitement anti-vomitif et une journée de fièvre avec abattement associée à la baisse des globules blancs dans le sang, environ une semaine après le début du traitement. La formule sanguine et l’état général se normalisent ensuite en quelques jours. Par ailleurs, malgré les mesures préventives recommandées mises en œuvre, il ne peut être exclu qu’un épisode de cystite hémorragique (saignement de la vessie) puisse survenir, s’agissant d’une toxicité connue d’un des agents pharmacologiques utilisés - Celles liées à la survenue éventuelle mais rare d'un syndrome de relargage cytokinique (état inflammatoire aigu), complication connue chez l'Homme des traitements par cellules CAR-T. - Celles liées au stress des anesthésies générales, prélèvements sanguins et examens effectués.

Devenir

Les animaux seront mis à mort du fait de la nécessité de réaliser des prélèvements larges de tissus incluant l'organe cible du traitement qui est le coeur

Remplacement

Ce projet vise à évaluer une stratégie de thérapie anti-fibrose, ayant recours à une injection systémique de cellules du système immunitaire modifiées pour se diriger contre un marqueur de la fibrose et aller détruire les cellules responsables de cette fibrose dans le coeur. Il apparaît donc incontournable de réaliser cette étude dans un organisme entier. Des tests réalisés in vitro ont confirmé que les globules blancs modifiés pour devenir des "CAR-T" se dirigent bien contre d'autres cellules si elles expriment le marqueur de fibrose. Ces tests de fonctionalité in vitro sont renouvelés à chaque production de cellules pour valider la qualité du produit de thérapie cellulaire administré aux animaux traités. Reste à déterminer si dans le contexte d'un organisme entier, les cellules parviennent bien à migrer dans le tissu cible, à atteindre les zones de fibrose et les détruire.

Réduction

Un effectif de 10 chiennes traitées par des cellules CAR-T et 10 chiennes recevant un placebo a été sélectionné car une modélisation statistique, effectuée dans le logiciel Statistica, sur la base de données déjà disponibles dans le modèle utilisé dans ce projet, a montré qu'il s'agit de l'effectif nécessaire et suffisant pour démontrer la normalisation, dans le groupe traité, d'un paramètre clé d'imagerie cardiaque reflétant la fibrose.

Raffinement

Les chiennes seront évaluées à l'aide de mesures non invasives développées, pour la plupart d'entre elles, à partir de méthodes utilisées chez les patients et adaptées aux chiens. Elles seront hébergées par groupes de deux, de tempéraments compatibles, avec accès à un lieu de couchage, des plateformes et des jeux variés. Elles seront sorties quotidiennement en groupes plus larges dans des espaces extérieurs. Cependant, durant une quinzaine de jours entourant le protocole de préparation et l'injection de cellules, les sorties devront être interrompues pour les protéger d'éventuelles infections opportunistes. Du temps supplémentaire sera passé avec les chiennes afin de remplacer cette activité habituelle par du jeu ou des caresses. Des moments d'intéractions avec l'homme seront ménagés quotidiennement (temps de jeux, caresses). Elles bénéficieront d'un suivi vétérinaire quotidien afin de suivre au plus près les éventuelles complications liées à leur pathologie cardiaque ou au projet. Des points limites précis, adaptés à ce contexte pathologique, et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis. Dans le cadre du projet, les gestes potentiellement stressants seront réalisés sous anesthésie générale, et une analgésie sera mise en place pour tout geste potentiellement douloureux. Par ailleurs, des points limites adaptés aux effets secondaires possibles et connus chez le chien du protocole médicamenteux préparatoire ont été déterminés, et permettront, suivant le cas considéré, de soulager la souffrance des animaux le plus précocement possible par des traitements adaptés, ou de les mettre à mort sans délai.

Choix des espèces

Cette étape préclinique de validation d'une approche thérapeutique anti-fibrose en développement est prévue chez le chien. En effet, il s'agit actuellement du seul modèle animal caractérisé pour les femmes porteuses de myopathies de Duchenne ou Becker, et qui reproduit fidèlement la maladie humaine notamment sur le plan de la fibrose, et de l'expression du marqueur de fibrose ciblé. Par ailleurs, l'espèce chien permet la mise en oeuvre des mêmes procédures que celles mise en oeuvre chez l'Homme pour le traitement par des cellules CAR-T (prélèvement des lymphocytes T par cytaphérèse et autogreffe en particulier). Les chiennes seront des adultes de 3 à 9 ans, tranche d'âge au cours de laquelle une fibrose myocardique est présente de manière systématique chez ces animaux.

Soumis à une ligature d'artère coronaire de vingt-cinq minutes qui leur provoque une insuffisance cardiaque, 404 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois mois plus tard, une fois la défaillance installée, ils passent quelques jours exposés à une chaleur de type canicule, avec cinq échocardiographies et quatre épreuves d'effort, et 40 % d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour l'implantation d'un capteur de télémétrie. Le calcul des effectifs intègre la mortalité attendue dans ce modèle. Le porteur décrit pourtant des "examens non douloureux" et un "environnement sécurisé et surveillé", et présente le projet comme un moyen de mieux protéger les personnes fragiles pendant les fortes chaleurs.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment les fortes chaleurs, comme celles rencontrées lors des canicules, peuvent aggraver certaines maladies cardiaques. Les animaux seront exposés à une température élevée pendant quelques jours, dans un environnement sécurisé et surveillé. Leur état de santé sera suivi à l’aide d’examens non douloureux, comme l’échographie, ou de petits capteurs mesurant la température ou la pression artérielle. Les résultats aideront à mieux protéger les personnes fragiles lors d’épisodes de chaleur extrême.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment la chaleur intense, comme lors d'une canicule, peut aggraver une maladie cardiaque déjà présente. Grâce à ce modèle animal, il sera possible d’observer les effets de la chaleur sur le cœur et la circulation, et d’identifier des signes d’alerte utiles pour prévenir les complications. L’étude évaluera aussi des outils permettant de surveiller les animaux de manière plus précise et moins stressante. Ces travaux pourraient, à terme, aider à mieux protéger les patients cardiaques pendant les périodes de fortes chaleurs, en améliorant les recommandations médicales.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront différentes interventions, principalement dans un but d’observation ou de mesure. Certaines procédures sont non invasives, comme les échocardiographies (5 fois, 15min max, espacées d'au moins 48h) ou l’évaluation à l’effort (4 fois, 30min max, espacées d'au moins 72h). D’autres sont plus invasives, comme la pose de puces sous-cutanées pour suivre la température ou la pression artérielle (1 seule injection, 2 min max), ou une chirurgie d’implantation de capteur de télémétrie pour effectuer les mêmes mesures (1 seule intervention de 35min concernant 40% des animaux maximum). La mise en place du modèle d’insuffisance cardiaque est obtenue par chirurgie de ligature coronaire sous anesthésie générale avec gestion de la douleur péri et post-opératoire (1 seule intervention de 25min concernant tous les animaux). Tous les gestes sont réalisés sous anesthésie et selon les normes éthiques en vigueur, avec un suivi rigoureux du bien-être animal.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront exposés à certaines contraintes liées à leur état de santé, à la chaleur ambiante ou aux examens nécessaires. Les principales nuisances prévues sont : une tolérance réduite au stress, un risque modéré lié à la chaleur (perte d’appétit, fatigue, aggravation cardiaque), une à deux chirurgies espacées d'au moins 3 mois (avec antidouleurs adaptés), et des examens répétés mais non douloureux (échographies, suivi de la température).

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront mis à mort conformément aux normes éthiques en vigueur afin de permettre les prélèvements nécessaires aux analyses post-mortem (histologie, biologie moléculaire, etc.). Ces analyses sont indispensables pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour comprendre les mécanismes tissulaires associés à la décompensation cardiaque.

Remplacement

Le projet porte sur les effets d’un stress thermique sur l’évolution de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection réduite. Les mécanismes étudiés impliquent une réponse cardiovasculaire intégrée, thermorégulatrice et inflammatoire, impossible à reproduire in vitro ou in silico avec pertinence. Les méthodes alternatives ont été considérées pour l’optimisation des phases exploratoires (modélisation informatique, revue bibliographique, données historiques), mais les objectifs scientifiques nécessitent ici l’utilisation d’un organisme entier. Aucun modèle alternatif ex vivo ou cellulaire ne permet à ce jour de simuler la complexité des interactions physiopathologiques impliquées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été optimisé grâce à plusieurs stratégies complémentaires : tout d'abord, l'utilisation d'outils statistiques pour déterminer les effectifs minimum permettant l'obtention de données robustes, la mutualisation de certains groupes entre procédures pour éviter les redondances ; la constitution de sous-groupes expérimentaux permettant de répartir les manipulations et de limiter le stress tout en assurant la robustesse statistique des résultats ; l’exploitation de données historiques internes, notamment pour les groupes témoins lorsque cela est justifié ; l’utilisation de dispositifs de suivi longitudinal (thermopuces ou télémétrie) autorisant des mesures répétées sur un même individu ; et enfin, une estimation rigoureuse du nombre nécessaire d’animaux par calcul de puissance, prenant en compte la mortalité attendue dans ce modèle.

Raffinement

Dans ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place pour garantir le bien-être des animaux et limiter toute souffrance. Des critères cliniques stricts sont utilisés pour évaluer l'état de santé des animaux, permettant d'interrompre toute procédure en cas de signes de souffrance et d'opter pour une euthanasie anticipée si nécessaire. Les interventions stressantes sont réparties de manière à éviter les cumuls sur un même animal, et l'hébergement des animaux en condition de "canicule" est limité dans le temps, avec un suivi clinique renforcé et des aménagements pour améliorer leur confort. De plus, l'utilisation de thermopuces pour la surveillance thermique réduit le besoin d'interventions chirurgicales, et les éventuelles chirurgies, telles que l'implantation de dispositifs de télémétrie, sont réalisées sous anesthésie appropriée, avec des soins analgésiques avant et après l'intervention. Enfin, un suivi clinique rigoureux est effectué pour assurer la santé des animaux tout au long de l'expérimentation.

Choix des espèces

Le choix des rongeurs, et spécifiquement des rats Wistar, est motivé par plusieurs facteurs. Les rats Wistar sont largement utilisés dans des études similaires au sein du laboratoire, ce qui permet de comparer et d’enrichir les résultats avec les données historiques accumulées. Leur taille, qui facilite les manipulations pratiques, ainsi que leur place intéressante dans la phylogénie, sont également des éléments importants. Au début du projet, les animaux seront âgés de 8 semaines. Ce modèle récupère bien d’une chirurgie réalisée au cours de leur 10ème semaine de vie, présentent une insuffisance cardiaque 3 mois après cette chirurgie, stade idéal pour étudier l’évolution de cette pathologie.

384 souris porteuses d'une mutation qui détruit la cohésion des cellules du cœur vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La thérapie génique leur est injectée entre le deuxième et le cinquième jour de vie, sur souriceau vigile, puis chaque animal passe quatre à six examens cardiaques, électrocardiogramme sans anesthésie ou échographie sous anesthésie légère. Le porteur indique qu'une mort subite peut survenir à partir de huit mois, comme chez les personnes atteintes, et que les souris reproductrices seront tuées à cet âge. Il décrit par ailleurs les tissus cardiaques humains qu'il fabrique en trois dimensions à partir de cellules souches comme très prometteurs, avant de conclure qu'un modèle animal "reste nécessaire".

Objectifs

La cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit est une maladie génétique du cœur qui touche environ 1 personne sur 5000, soit plusieurs milliers de cas en France. Elle provoque une perte de cohésion entre les cellules du cœur, ce qui entraîne des troubles du rythme cardiaque et peut provoquer une mort subite chez de jeunes adultes. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour cette maladie. Les recherches se concentrent sur le muscle du cœur, pour mieux comprendre sa structure et son fonctionnement. Pour étudier la maladie de façon réaliste, il est nécessaire d’utiliser une lignée de souris qui reproduit fidèlement la maladie humaine. L’objectif est de tester chez ces souris une thérapie génique capable de prévenir l’apparition de la maladie ou, au minimum, d’en ralentir le développement.

Bénéfices attendus

Ce projet utilise un modèle de souris déjà existant, qui reproduit très fidèlement la maladie humaine appelée cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit. Cette maladie génétique empêche les cellules du cœur de bien rester attachées entre elles, ce qui provoque des troubles du rythme cardiaque et peut conduire à une mort subite chez de jeunes adultes. Les résultats de ces recherches permettront de valider une stratégie de thérapie génique et pourront aussi aider à mieux comprendre d’autres formes de la maladie causées par d’autres gènes. À long terme, l’objectif est de mettre au point une thérapie génique capable de traiter tous les patients atteints de cette maladie, quelle que soit l’anomalie génétique en cause.

Procédures

Dans ce projet, la thérapie génique sera testée avec une seule injection, effectuée sur le souriceau vigile. L’injection ne dure que quelques secondes. Pour suivre l’évolution, chaque souris sera examinée minimum 4 fois au cours de sa vie (et 6 foix au maximum) grâce à des méthodes simples et indolores : un électrocardiogramme sur animal vigil pour contrôler le rythme du cœur, ou une échographie cardiaque sous légère anesthésie pour observer son fonctionnement. Ces examens sont rapides (environ 15 minutes au total) et réalisés de façon regroupée pour limiter le stress et les manipulations des animaux.

Impact sur les animaux

L’injection prévue peut provoquer une douleur légère et passagère chez le nouveau-né. Comme pour toute injection, il existe aussi un faible risque d’infection à l’endroit où elle est réalisée. La manipulation des animaux peut être une source de stress. Avant l’âge de 8 mois, certains animaux peuvent présenter une augmentation des troubles du rythme cardiaque, ce qui peut leur causer un inconfort. À partir de 8 mois, une mort subite peut survenir, comme cela est décrit dans cette maladie. Les examens cardiaques (électrocardiogramme et échographie)sont non invasifs et largement utilisés, sans effets secondaires connus. Pour l’échographie, une anesthésie légère est nécessaire : elle peut entraîner un refroidissement de l’animal, un ralentissement de la respiration et du rythme cardiaque, mais ces effets sont contrôlés et réversibles.

Devenir

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront euthanasiés en fin de procédure. Les animaux surnuméraires dans un groupe serviront pour compléter d'autres groupes. En fin d'inclusion, des euthanasies seront effectuées par une méthode règlementaire.

Remplacement

Depuis plusieurs années, nous essayons de développer des modèles de cœur humain en laboratoire, grâce à des cellules souches et à des techniques de bioingénierie en 3 dimensions. Ces approches permettent de créer des tissus cardiaques et de réduire l’utilisation d’animaux pour les recherches. Cependant, il n’est pas encore possible de reproduire en laboratoire toute la complexité d’un organisme vivant, avec l’ensemble des mécanismes qui régulent le cœur et expliquent l’apparition de maladies comme la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit. De plus, l’effet réel d’une thérapie génique ne peut pas encore être évalué uniquement avec ces méthodes de substitution, même si elles sont très prometteuses. C’est pourquoi un modèle animal reste nécessaire pour répondre à certaines questions essentielles, notamment pour vérifier et valider de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Pour ce projet, nous avons utilisé des simulations statistiques afin de déterminer le nombre minimal de souris nécessaires. L’objectif est d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Les calculs tiennent compte des différents groupes de comparaison (selon les gènes et les traitements) et de la mortalité attendue dans certains cas. De cette façon, nous nous assurons d’avoir 5 à 10 animaux par groupe en fin d’étude, ce qui est le strict minimum pour pouvoir tirer des conclusions solides. Les deux sexes sont utilisés et répartis de façon équilibrée. Les naissances sont ajustées au fur et à mesure pour éviter un excès d’animaux, et les souris surnuméraires sont intégrées uniquement si elles permettent de compléter un groupe manquant. Au total, le plan de recherche prévoit environ 384 souris sur 5 ans, auxquelles s’ajoutent une petite marge liée à la reproduction nécessaire pour maintenir la lignée. Ce chiffre correspond au nombre le plus réduit possible, tout en permettant de répondre aux questions scientifiques posées.

Raffinement

Les souris sont élevées dans de bonnes conditions de confort, en groupe avec leurs congénères, dans des locaux où la température, l’humidité et l’alternance jour/nuit sont soigneusement contrôlées. Elles ont en permanence accès à de la nourriture et de l’eau grâce à un système automatique. Leur environnement est maintenu parfaitement sain grâce à la stérilisation du matériel et à l’utilisation d’eau purifiée. Des objets d’enrichissement (papier, coton, bois, rouleaux en carton ou abris) sont également ajoutés pour stimuler leur comportement naturel. La santé des animaux est vérifiée chaque jour. Pour limiter le stress, les manipulations sont réduites au minimum, faites rapidement et avec douceur. Lors des injections, tout est prévu pour réduire au maximum l’inconfort : les souriceaux sont sortis de la cage pour une durée très courte, maintenus au chaud, manipulés avec précaution, puis replacés immédiatement dans leur nid, avec vérification qu’ils soient bien repris par leur mère. Pendant les examens cardiaques non-invasifs, des mesures spécifiques assurent leur bien-être : l’échographie est réalisée sous une anesthésie très légère pour stabiliser cœur et respiration, et un gel protecteur est appliqué sur les yeux si l’examen dure plus de dix minutes ; l’électrocardiogramme (ECG) est effectué sans anesthésie, afin d’éviter des manipulations supplémentaires. Les animaux sont suivis attentivement tout au long de leur vie. Une surveillance renforcée est mise en place dès l’âge d’un mois pour les animaux les plus fragiles. Si un problème de mobilité survient, de la nourriture hydratée est placée au sol pour qu’ils puissent s’alimenter facilement.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé et le mieux documenté pour étudier les maladies du cœur. La lignée sur laquelle nous travaillerons reproduit fidèlement la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit chez l’homme, une maladie grave pour laquelle il n’existe pas encore de traitement curatif. C’est le seul modèle connu qui permette de tester une thérapie génique et d’étudier les modifications au niveau des cellules, des molécules et du fonctionnement du cœur. L’objectif est de stabiliser les structures des cellules cardiaques affectées par la maladie. Le suivi du cœur se fera grâce à des examens non invasifs qui permettent de mesurer le rythme et la contraction cardiaque, et de vérifier l’efficacité de la thérapie. Les résultats obtenus chez la souris pourront ensuite servir à envisager un développement de cette thérapie chez l’homme. Comme la maladie se déclare tôt chez l’homme, les injections de thérapie génique seront réalisées sur des souris très jeunes (2 à 5 jours), et les animaux seront suivis jusqu’à l’âge de 6 mois. Les souris utilisées pour la reproduction seront employées jusqu’à 8 mois avant d’être euthanasiées, conformément aux règles de l’expérimentation animale.

Sensibilisées puis soumises à un choc allergique, 60 souris reçoivent quatre injections et un prélèvement sanguin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées après prélèvement et imagerie. L'objectif déclaré porte sur les événements vasculaires de l'anaphylaxie, la perméabilité des vaisseaux et la perte de volume sanguin qui accompagnent les formes les plus graves. Le porteur mentionne que "la chirurgie peut causer des saignements", sans que le RNT décrive nulle part quelle intervention chirurgicale les souris subissent.

Objectifs

Selon l’Organisation mondiale de la santé, l’allergie est une réaction d’hypersensibilité systémique dont les formes les plus sévères peuvent mettre la vie en danger. Elle se manifeste par une apparition rapide de troubles respiratoires, circulatoires ou des voies respiratoires, potentiellement mortels, et s’accompagne généralement – mais pas systématiquement – de modifications cutanées ou des muqueuses. Il est donc essentiel d’en étudier les mécanismes afin d’améliorer la qualité des soins et la prise en charge des patients. Le système cardiovasculaire est l’un des principaux systèmes impliqués dans la physiopathologie de la réaction. Plus précisément, le système vasculaire joue un rôle clé car il est impacté par les médiateurs biologiques libérés par différents types de cellules impliquées dans la réaction allergique. L’altération des vaisseaux provoque une augmentation de la perméabilité des vaisseaux sanguins et une perte conséquente du volume sanguin circulant vers l'espace extracellulaire entraînanant une hémorragie. L'objectif principal est d'étudier les événements vasculaires se produisant dans un modèle d'allergie chez la souris.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de faire progresser la connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans les réactions allergiques et anaphylactiques les plus sévères. L'objectif est de rechercher de nouvelles stratégies immunothérapeutiques pouvant être utilisées en pratique clinique et de rechercher des marqueurs de gravité permettant de personnaliser les traitements des patients afin d'améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle murin d’allergie réalisé sous anesthésie générale et analgésie systématique. Le protocole comporte quatre injections (incluant les traitements et l’analgésique), chacune durant environ 5 secondes. Les souris feront également l’objet d’un prélèvement sanguin, dont la durée est estimée à 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins causent un stress et une douleur légère de courte durée. L’induction de l’allergie (sensibilisation) peut causer une réaction inflammatoire au site d’injection.. La chirurgie peut causer des saignements.

Devenir

Les souris seront mises à mort après prélèvements sanguins et analyse par imagerie.

Remplacement

À l'heure actuelle, il est impossible de réaliser des études sur les cellules pour atteindre les objectifs du projet, car il est obligatoire de disposer d'un système physiopathologique chez l'animal intact qui reproduit les conditions qui se produisent dans les cas d'allergie alimentaire, d'asthme et d'anaphylaxie pour transférer les conclusions à la situation clinique.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude statistique a été réalisée au préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Les groupes expérimentaux ont été conçus de manière optimisée sur la base d’études antérieures, afin de garantir l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. L’analyse des résultats reposera sur des méthodes statistiques appropriées, assurant une interprétation rigoureuse des données tout en respectant le principe de réduction de l’usage des animaux

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur potentiellement liée au modèle, un traitement antalgique sera administré en amont des manipulations expérimentales. L’état de santé des animaux sera suivi de manière rigoureuse à l’aide d’une grille d’évaluation spécifique, incluant des points limites stricts et adaptés au projet. Ce dispositif permettra une détection rapide de toute souffrance, assurant une prise en charge appropriée. En cas de douleur, un traitement adapté sera mis en place, et si nécessaire, une mise à mort sera effectuée conformément à la réglementation en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge 10 semaines. C'est l’âge où le système immunitaire est mature.

20 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Entre leur quarantième et leur quarante-huitième semaine de vie, elles reçoivent une injection cinq jours sur sept et passent deux fois un électrocardiogramme et une échocardiographie sous anesthésie générale. Cette étude pilote cherche à savoir si le tofacitinib, déjà utilisé en médecine humaine contre des maladies inflammatoires, freine la fibrose cardiaque. Le porteur écrit que ce modèle "mime parfaitement" la maladie génétique visée, tout en précisant que ces souris ne développent ni bloc de conduction complet ni tachycardie ventriculaire sévère, contrairement aux patientes et patients les plus atteints.

Objectifs

L'objectif du projet est de déterminer si un traitement chronique au tofacitinib, une molécule déjà utilisée en pharmacopée humaine pour le traitement de diverses maladies inflammatoires, permet de bloquer la survenue de fibrose cardiaque dans un modèle de souris transgénique. Ce modèle mime parfaitement une maladie génétique caractérisée par des troubles progressifs de la conduction cardiaque et la survenue de fibrose cardiaque au cours du vieillissement. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement préventif médicamenteux pour les patient.e.s affecté.e.s par cette maladie, dont les plus séverement touché.e.s doivent être implanté.e.s avec un stimulateur et/ou un défibrillateur cardiaque. Pour ce projet, 20 souris transgéniques, mâles et femelles, seront traitées chroniquement avec le tofacitinib, ou le véhicule, pendant 8 semaines à partir de l'âge de 40 semaines, qui correspond au début du remodelage fibrotique. L'effet du traitement sur la survenue de fibrose cardiaque (analyse histologique), ainsi que sur la fonction électrique (électrocardiogramme) et contractile (échocardiographie), sera évalué en fin de traitement.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une prévention, au moins partielle, du remodelage fibrotique cardiaque normalement observé dans le modèle transgénique à partir de 40 semaines.

Procédures

A l'âge de 39 semaines et de 48 semaines, les souris seront soumises à un enregistrement de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) et un examen échocardiographique (15-20 min) réalisés sous anesthésie générale. Entre 40 et et 48 semaines, les souris seront soumises à une injection 5 jours sur 7.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme pour les patient.e.s, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme chez les patient.e.s les plus sévèrement touché.e.s. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. Les examens électrocardiographiques et échocardiographiques ne sont pas des techniques générant de la douleur mais seront cependant réalisés sous anesthésie générale (anesthésie gazeuse) pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable, en contrôlant leur température corporelle. Sur la base de la bibliographie, aucun effet indésirable du tofacitinib n'est attendu à la dose utilisée. Les injections seront l'acte produisant le plus d'effets indésirables, en particulier de stess, lors de la manipulation.

Devenir

Les souris seront mises à mort à l'issue de l'étude, après la dernière échographie, afin de prélever leur coeur pour des études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la structure et la fonction cardiaque. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal.

Réduction

Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. La taille des lots de souris a été déterminée à l'aide d'un logiciel de statistiques sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale à l’isoflurane. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 39 semaines, le traitement commencant à l'âge de 40 semaines, jusqu'à l'âge de 48 semaines.

Pour tester des candidats médicaments contre l'accident vasculaire cérébral hémorragique, 1 200 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus cérébraux. L'hémorragie est provoquée par une injection de collagénase dans le striatum, au cours d'une chirurgie d'une vingtaine de minutes, suivie d'un prélèvement sanguin à J1, J3 ou J7 et d'une évaluation neurologique. Le porteur indique que ce modèle peut provoquer des douleurs, de la prostration, des difficultés à se déplacer et une perte de poids. Il annonce des points limites stricts et une mise à mort si la souffrance se prolonge, sans indiquer les seuils retenus.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral hémorragique représente un problème de santé publique (20 à 30% de toutes les pathologies neurovascualaires) et ne disposent actuellement d’aucune thérapeutique efficace pour en réduire la gravité. Ils surviennent lorsque les vaisseaux sanguins dans le cerveau se rompent, entraînant une hémorragie. Le taux de mortalité est le plus élevé parmi les pathologies neurovasculaires. L’accident vasculaire cérébrale hémorragique déclenche une réponse immunitaire et inflammatoire qui aggrave les lésions cérébrales en favorisant l’expansion de l’hématome (épanchement de sang) et formant un oedeme autour de l’hématome. Ce dernier est associé à un mauvais pronostic neurologique. Actuellement, les mécanismes impliqués dans le développement de cet œdème sont complexes et mal compris. Les objectifs de ce projet seront d’une part de comprendre la physiopathologie de l’oedeme formé autour l’hématome et d’autre part d’évaluer la tolérance et l’efficacité de nouveaux traitements sur la résorption ou non de l’hématome et de l’œdème formé à la suite d’un accident vasculaire cérébral hémorragique

Bénéfices attendus

A terme, ce projet donnera des résultats concernant l'efficacité thérapeutique et la sûreté de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébrales hémorragiques. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral hémorragique et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.

Procédures

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) hémorragique, procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie. L’intervention chirurgicale dure environ 20 minutes. Chaque animal recevra deux injections (traitement et anesthésie profonde) ainsi qu’un seul prélèvement sanguin (réalisé à J1, J3 ou J7). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle d’AVC peut provoquer des douleurs anisi que prostration, difficultés à se déplacer et perte de poids. L’injection de collagènase dans le striatum cause un stress et une douleur légère de courte durée. L’injection de médicament et d’analgesie peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique dans l’accident vasculaire cérébral hémorragique. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet thérapeutique bénéfique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'accident vasculaire cérébral hémorragique chez l'homme

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une étude statistique préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse nous permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Nous avons conçu nos groupes de manière optimisée en nous basant sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral hémorragique que nous utilisons sest bien maîtrisés par notre équipe, ce qui nous permet de mener nos recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, nous appliquerons des méthodes statistiques adaptées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant notre engagement à réduire l’usage des animaux.

Raffinement

Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie Nous surveillerons attentivement leur état de santé grâce à une grille d’évaluation précise, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés.