Troubles cardiaques

868 rats vont être utilisés, chacun recevant jusqu'à neuf injections sous-cutanées espacées de trois jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypertension pulmonaire ou une atteinte hépatique leur est induite, certains subissent une chirurgie abdominale de vingt minutes, tous passent deux échographies sous anesthésie légère puis une procédure terminale de trente minutes avec mesures de pression et prélèvement des poumons, du cœur, du foie et de la rate. Le porteur annonce une fatigue progressive, une réduction de la prise de poids et, dans le modèle hépatique, une jaunisse, et prévoit d'utiliser les rats témoins non malades dans plusieurs analyses pour éviter d'en commander d'autres. Les plus jeunes arrivent à quatre semaines et pèsent une centaine de grammes, tandis que le bénéfice espéré, de nouveaux traitements pour deux maladies vasculaires graves, reste suspendu à des résultats positifs.

Objectifs

L’hypertension pulmonaire est une maladie vasculaire rare et progressive caractérisée par une augmentation de la pression dans la circulation pulmonaire, résultant du rétrécissement des petites artères pulmonaires. Cette augmentation de pression impose une surcharge au ventricule droit, menant progressivement à une insuffisance cardiaque. Malgré les traitements actuels, cette pathologie reste associée à une mortalité élevée. Des avancées récentes ont mis en évidence le rôle central de certaines voies de signalisation impliquées dans l’équilibre vasculaire pulmonaire. En particulier, des anomalies dans les mécanismes régulant la prolifération et la survie des cellules vasculaires contribuent au remodelage pathologique des vaisseaux pulmonaires. Ainsi, le ciblage de ces voies moléculaires constitue une stratégie prometteuse pour améliorer les options thérapeutiques actuelles. Ce projet vise à évaluer l’impact de nouvelles approches pharmacologiques agissant sur ces mécanismes. L’objectif est d’analyser leur capacité à atténuer le remodelage vasculaire et à améliorer la fonction pulmonaire et cardiaque dans des modèles expérimentaux. Par ailleurs, ces stratégies seront également explorées dans le cadre d’une autre pathologie pulmonaire secondaire à une atteinte hépatique, partageant des altérations similaires des voies de signalisation vasculaire. L’ensemble de ces travaux contribuera à préciser les mécanismes physiopathologiques sous-jacents et à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant directement les causes du dysfonctionnement vasculaire pulmonaire.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer le traitement de maladies vasculaires graves, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et le syndrome hépato-pulmonaire (SHP), qui sont encore aujourd’hui mal prises en charge. Il s'appuie sur des résultats encourageants issus de recherches récentes pour tester de nouvelles approches thérapeutiques combinées. L’objectif est d’agir plus efficacement sur les vaisseaux pulmonaires et le cœur afin de ralentir la progression de ces maladies. Si les résultats sont positifs, ils pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour les complications pulmonaires liées à certaines maladies du foie ou à des atteintes chroniques du système vasculaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions expérimentales selon les objectifs des modèles étudiés. Injections sous-cutanées : Chaque animal recevra jusqu’à 6 injections pour 2 procédures et 9 injections pour une autre, dans le cadre de traitements expérimentaux ou de l’induction des pathologies. Une injection est prévue en début de procédure puis les autres sont réalisées tous les 3 jours. Chaque injection dure moins de 1 minute et est réalisée sous anesthésie locale. Échographies cardiaques ou hépatiques : Deux échographies par animal sont prévues, à des temps définis selon le modèle. Chaque séance dure environ 5 minutes sous anesthésie légère. Intervention chirurgicale (dans une procédure uniquement) : Une chirurgie abdominale est réalisée une fois par animal sous anesthésie générale. L’intervention dure environ 20 minutes, suivie d’une période de surveillance post-opératoire. Procédure terminale : Réalisée une fois par animal, sous anesthésie générale profonde. Elle dure environ 30 minutes et inclut des mesures hémodynamiques et des prélèvements d’organes. Chaque intervention est répartie selon les phases expérimentales, avec un suivi rigoureux du bien-être des animaux tout au long du protocole.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans ce projet concernent les interventions expérimentales ainsi que les manifestations liées aux pathologies induites : • Les injections sous-cutanées peuvent provoquer une douleur modérée et transitoire au point d'injection • La chirurgie abdominale peut entraîner une douleur postopératoire modérée, localisée dans la zone opérée. • Les échographies peuvent générer un stress léger et temporaire dû à la contention et à l’anesthésie. • Les procédures terminales sont réalisées sous anesthésie générale et ne génèrent pas d’effet indésirable postérieur. • Les modèles de pathologies peuvent provoquer : une fatigue progressive et une réduction de la prise de poids dans les modèles d’hypertension pulmonaire ; une jaunisse et une réduction de la prise de poids dans le modèle de pathologie hépatique.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car des prélèvements d'organes (poumons, cœur, foie et rate) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques.

Remplacement

Ce projet repose sur des résultats prometteurs obtenus à partir d’échantillons humains et d’études in vitro sur des cultures cellulaires. Ces données ont mis en évidence des altérations dans des voies de signalisation clés impliquées dans le remodelage vasculaire pulmonaire, avec un potentiel de restauration significatif grâce à l’utilisation de molécules expérimentales. Ces approches ont montré des effets importants sur des phénomènes cellulaires tels que la prolifération, la résistance à l’apoptose et la migration cellulaire. Toutefois, pour valider l’impact de cette restauration sur le remodelage vasculaire pulmonaire, la fonction cardiaque et les anomalies hépato-pulmonaires, des modèles animaux restent indispensables. Les modèles choisis pour ce projet sont des outils largement validés dans la recherche préclinique, permettant d’étudier de manière approfondie des mécanismes physiopathologiques complexes dont la voie signalisation, cible de notre projet, est impactée. Ces modèles permettent d’examiner l'interaction entre plusieurs organes (cœur, poumons et foie) et de tester l’efficacité de la molécule dans un contexte systémique. L’utilisation combinée des modèles in vivo pour l’hypertension pulmonaire et le syndrome hépatopulmonaire constitue une approche complémentaire essentielle pour établir une preuve de concept robuste, en intégrant les différentes dynamiques systémiques et pathologiques associées à ces maladies. C’est pourquoi, dans ce projet, les approches in vitro et in silico, bien que précieuses dans l’étude de mécanismes cellulaires spécifiques, sont limitées car elles ne prennent pas en compte les interactions multi-organiques qui sont des processus physiopathologiques dynamiques et majeurs. De plus, les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire l’environnement tissulaire complexe ni les effets systémiques d’une thérapie sur un organisme entier. De même, les modèles informatiques, bien qu’outils complémentaires pour des analyses prédictives, ne sont pas encore en mesure de capturer avec précision les réponses biologiques complexes à l’échelle d’un organisme vivant. Le recours aux modèles animaux est donc indispensable pour évaluer l’efficacité et la tolérance des molécules dans un cadre physiologique réaliste, prenant en compte les interactions entre les systèmes cardiovasculaire, pulmonaire et hépatique. À ce jour, aucune alternative ne permet d’obtenir ces données de manière aussi fiable et transposable.

Réduction

Les effectifs ont été soigneusement calculés en utilisant des outils statistiques avancés, en tenant compte des données issues de nos études préliminaires et des résultats disponibles dans la littérature sur les thérapies vasculaires et l’étude des voies BMP. Les critères hémodynamiques, tels que la pression artérielle pulmonaire moyenne et l'évaluation du remodelage vasculaire, sont les principaux paramètres utilisés pour évaluer l’efficacité des traitements, ce qui permet de concentrer les analyses sur des mesures précises et pertinentes, réduisant ainsi la nécessité d’effectuer des évaluations multiples ou prolongées. De plus, les animaux non malades, ou les témoins utilisés dans le cadre de ces études, seront réutilisés pour des analyses complémentaires, lorsque cela est possible, afin d'éviter l’utilisation de nouveaux animaux pour des expériences supplémentaires. Cette stratégie permet de tirer parti des données obtenues tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires à l’ensemble du projet. Par ailleurs, les résultats de ces expérimentations pourront être exploités dans le cadre d'autres projets de recherche, contribuant à une utilisation optimale des ressources animales disponibles.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un système de surveillance basé sur des points limites sera appliqué afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Une attention particulière est portée à la gestion de la douleur : une analgésie est administrée avant les interventions douloureuses, notamment avant la chirurgie, et toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie adaptée (anesthésie générale pour la chirurgie, anesthésie locale pour les injections). Cela permet de réduire efficacement toute douleur ou stress potentiel. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de référence dans l’étude des pathologies cardiovasculaires et pulmonaires, notamment en raison de sa taille permettant les mesures hémodynamiques, de sa physiologie bien caractérisée, et de la robustesse des modèles expérimentaux développés. Il présente également une bonne transposabilité des mécanismes physiopathologiques à l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour l’évaluation thérapeutique et la compréhension des maladies ciblées dans ce projet. Des rats âgés de 4 semaines (environ 100 grammes) seront utilisés pour les modèles ciblant les phases précoces du développement de l’hypertension pulmonaire. Ce choix permet de reproduire les conditions expérimentales couramment utilisées dans la littérature scientifique, facilitant ainsi la comparaison et l’interprétation des résultats. Des rats âgés de 8 semaines (environ 200 grammes) seront utilisés pour les modèles nécessitant une exposition prolongée ou une intervention chirurgicale, afin de garantir une meilleure tolérance aux procédures et une récupération post-opératoire optimale. Ce stade est également en cohérence avec les pratiques décrites dans les études de référence.

Cinquante-cinq minutes d'opération pour implanter une sonde de mesure sur la carotide gauche, avec un risque d'hémorragie et de détresse respiratoire, 130 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite pendant 28 jours un régime qui leur provoque une maladie rénale, des injections répétées dans la veine de la queue, deux mesures de filtration rénale de deux heures et des tests d'exploration, d'apprentissage et de mémoire dont aucun n'est nommé. Le porteur annonce des nuisances réduites au maximum, et compose dans le même texte des lots de dix animaux parce qu'il en attend jusqu'à 20 % de morts en cours de route. Toutes finissent exsanguinées sous anesthésie, organes et sang prélevés.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique touche près de 700 millions d'adultes dans le monde, avec des taux plus élevés dans les pays les plus développés. Les complications liées aux maladies rénales chroniques incluent notamment l’hypertension artérielle, qui est la cause principale des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Les patients atteints de maladie rénale chronique souffrent également de nombreuses complications neurologiques, notamment d'anxiété, de dépression, d'anomalies motrices, de troubles du sommeil et de troubles cognitifs. Le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique est un mécanisme clé dans le développement des troubles cognitifs au cours de la maladie rénale chronique. Notre projet vise à évaluer l’influence de l’hypertension sur les troubles cognitifs dans un modèle animal de maladie rénale chronique. Nous utiliserons notamment une approche pharmacologique afin d’évaluer l’impact de la modulation de la pression sanguine sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et la fonction cognitive.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le lien les atteintes cérébrales et l’hypertension au cours des maladies rénales chroniques, et de développer des stratégies de prévention de ces atteintes cérébrales via des approches pharmacologiques. La possibilité d’améliorer la prise en charge et le pronostic neurologique des patients atteints de maladie rénale chronique présente un bénéfice en santé humaine. Les troubles cognitifs pouvant être associés aux maladies rénales chroniques entraînent des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie pour placer un implant afin de pouvoir mesurer leurs constantes cardio-vasculaires (55 min). Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique induisant le modèle de maladie rénale (28j). Les animaux seront soumis à l’administration de substances pharmacologiques (schéma d'administration dépendant des molécules). Les animaux seront soumis à deux reprises à une injection sous courte anesthésie de molécules fluorescentes, puis mesure pendant 2 heures de la décroissance de la fluorescence avec une caméra miniature afin de mesurer la filtration glomérulaire. Les animaux seront soumis à des imageries qui seront espacées d’au moins 24h pour une durée maximale de 30min. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux de l’exploration, de l'apprentissage et de la mémoire afin d'évaluer les troubles cognitifs (moins d'une heure pour l'ensemble des tests). Enfin un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer un stress de la manipulation, un risque de déshydratation et de détresse respiratoire lié à l’anesthésie, de la douleur et un risque d’hémorragie . L’induction d’une maladie rénale par un régime spécifique provoque une altération de l’état général et un stress de l’animal qui peut se manifester par une perte de poids. L’imagerie et l’injection de molécules fluorescentes nécessiteront une anesthésie halogénée et pourront engendrer un stress, ainsi qu’une hypothermie. Les tests comportementaux pourront induire un stress par des manipulations quotidiennes. L’administration de substances pharmacologiques pourra engendrer un stress. Plusieurs injections intraveineuses dans les veines caudales seront réalisées pouvant entrainer une douleur et un stress chez l'animal. L'exsanguination, pratiquée sous anesthésie et analgésie, provoquera la mort des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure. Les organes et le sang seront prélevés pour réaliser des analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

La pose d’implants au niveau de la carotide gauche chez la souris ne peut se faire que sur animaux vivants. C’est une méthode validée et utilisée chez la souris. Il n’y a pas d’alternative non animale. En partant de nos résultats observés chez la souris montrant une altération de la barrière hématoencéphalique en contexte de modélisation de maladie rénale chronique, nous étudions une communication entre des organes : le rein et le cerveau, qu'il est impossible de modéliser in vitro et il n’existe actuellement pas de modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d'une substance sur la survenue de troubles cognitifs à la suite d’une insuffisance rénale. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles après une maladie rénale chronique, nous réalisons des évaluations neurocomportementales des animaux, qui n'est pas modélisable in vitro.

Réduction

Comme évalué dans des expériences précédentes notamment concernant l’implantation des sondes télémétriques, des lots de 8 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats. Nous utiliserons des tests statistiques spécifiques pour comparer deux lots entre eux ou pour comparer plusieurs (>2) lots. La mortalité est estimée

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement dans toutes les cages. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge peri-opératoire de la douleur avant, pendant et après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne, par du personnel qualifié et formé, de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole. Toute atteinte de points limites amènera à la mise en place d'actions décrites dans cette annexe. Les critères d’arrêt sont la prostration, la présence de plaies ne cicatrisant pas, ou une perte de poids trop importante.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle souris car ce modèle est largement décrit dans la littérature concernant l’implantation de sondes télémétriques et la modélisation d’insuffisance rénale. Ces espèces permettent également le recours à des techniques validées d’évaluation neurocomportementales, d’imagerie cérébrale et d’immunohistochimie cérébrale, permettant de répondre à nos hypothèses. Un stade de développement adulte est souhaité car cohérent avec le développement de cette pathologie chez l'être humain.

5 450 nouveau-nés, 3 250 ratons et 2 200 souriceaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun passant ses quatorze premiers jours de vie enfermé dans une enceinte en hyperoxie pour lui provoquer une hypertension pulmonaire. Leurs mères sont échangées toutes les vingt-quatre heures pour leur éviter l'effet toxique de l'oxygène. Suivent des échographies cardiaques, des mesures de pression cardiaque et une pléthysmographie invasive, sur des animaux gardés jusqu'à un an afin de suivre les séquelles à l'âge adulte. Tous sont tués pour l'extraction du bloc cœur-poumon, le porteur affirmant qu'il est "indispensable" de comprendre les mécanismes de cette maladie et que "seul l'animal entier" permet les interactions entre organes.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons des modèles animaux (rats et souris) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (jour (J)15, J60, J180 et J365 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’HTP-DBP et leur évolution dans le temps. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (normoxique – groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie chronique dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. La méthode et la fréquence d’injection pendant la mise en place des modèles pathologiques seront ajustées en fonction de la substance considérée. Le protocole préventif sera appliqué dès le début du protocole (au jour 2 de vie des ratons ou souriceaux) et le protocole curatif sera appliqué à la fin des 14 jours d’hyperoxie jusqu’à la fin du protocole J60 (adolescence, 12-18 ans), J180 (jeune adulte, 25-30 ans) et J365 (adulte, 40-50 ans) chez le rat et la souris. Après 14 jours, une partie des ratons/souriceaux sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du bloc-cœur-poumon. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du bloc cœur-poumon. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le bloc cœur-poumon. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours pour le rat et la souris. Durant cette période de « vieillissement », les animaux seront pesés 2 fois/semaine et tous les animaux auront une échocardiographie sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole de « vieillissement » à J60, 180 ou 365. Ainsi, les animaux explorés à J60, J180 et J365 auront au total, respectivement 2, 3 et 4 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue de chaque période de « vieillissement », les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang et extraction du bloc cœur-poumons.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Le risque de douleur est le principal effet indésirable des expérimentations in vivo. De ce fait, nous réaliserons systématiquement une analgésie-sédation. Avant de débuter les expérimentations in vivo, la surveillance de la profondeur de l’analgésie-sédation sera réalisée en s’assurant de l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte en réponse au pincement des orteils des membres postérieurs. Le rythme cardiaque et la fréquence respiratoire seront surveillés pour s’assurer également de la profondeur de l’anesthésie. Le changement de mère toutes les 24h peut être source de stress pour les petits.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche, (2) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (3) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (randomisation, travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. Le nombre d’animaux sera également réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12-13 ratons ou 10 souriceaux et 1 mère allaitante seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement et conserver sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. L’échange quotidien des mères sera réalisé par le même opérateur en utilisant le tunnel mis à disposition dans la cage ou l’enceinte. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et pesés. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà d’une période de 2 h post-administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduirait à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. L’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont quasiment absents chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. De plus, le rat et la souris sont particulièrement adaptés pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats/souriceaux nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux. La première partie de l’étude vise à reproduire une pathologie concernant uniquement les nouveau-nés grands prématurés, les expérimentations concerneront des rats/souris nouveau-nés pendant leurs 14 premiers jours de vie. La deuxième partie du projet portant sur l’évolution longitudinale des anciens nouveau-nés grands prématurés ayant eu une dysplasie broncho-pulmonaire, les expérimentations porteront sur des ratons/souriceaux ayant été exposés pendant 14 jours à l’hyperoxie ou à la normoxie en période néonatale puis laissés en normoxie seule jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours (adolescent, jeune adulte et adulte chez l’homme respectivement).

Gavés chaque jour pendant trente jours d'un antiagrégant, opérés sous anesthésie générale pour qu'une déchirure soit créée dans la paroi de leur aorte puis maintenue par un stent, 48 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une seconde anesthésie précède les imageries de contrôle, puis la mise à mort pour analyse histopathologique. L'objet est de comparer des stents résorbables et des stents permanents dans le traitement des dissections artérielles, dont les dispositifs actuels restent en place à vie chez les patients. Le porteur annonce évaluer l'efficacité de ces dispositifs tout en présentant le projet comme exploratoire et sans calcul statistique, avec six lapins par condition et un échec de la création de la dissection estimé à 20 %.

Objectifs

Les dissections artérielles correspondent à une brèche de l’artère au niveau de la média, entrainant un vrai et un faux chenal de circulation du sang. La membrane qui sépare les deux chenaux, est appelée « flap ». Cela peut entrainer des complications à type de malperfusions d’organes (par mécanisme statique ou dynamique), de thrombose, de douleurs. Ces dissections peuvent être spontanées, post-traumatiques ou iatrogènes suite à un traitement endovasculaire. Ces dissections sont souvent traitées par voie endovasculaire (par l’intérieur des vaisseaux sanguins) via implantation d’un dispositif médical (stent, endoprothèse) qui resteront en place tout au long de la vie du patient, avec les nombreuses complications potentielles, déjà bien connues, que cela induit. L’objectif du traitement est de rétablir une bonne perfusion sanguine d’organe, reconstruire un seul chenal de circulation sanguine et permettre une cicatrisation artérielle. Cette cicatrisation artérielle intervient dans les 3 mois suivant la pose du stent qui n’est donc plus nécessaire au-delà de cette période. - L’objectif est d’évaluer l’efficacité de différents stents (résorbables ou permanents) dans le cadre d’une dissection artérielle. - Les critères de jugement seront la mortalité, la cicatrisation artérielle, la capacité à reformer un seul chenal artériel, la persistance d’un faux chenal, le degré d’une potentielle sténose résiduelle, qui pourront être confirmés par imagerie et par analyses histologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’effectuer des analyses non réalisables chez l’être humain afin évaluer l’efficacité du traitement par différents stents des dissections artérielles. Il permettra également d’évaluer la cicatrisation de l’aorte et de comparer les différents stents.

Procédures

Les animaux recevront tout au long du projet un traitement oral antiagrégant (sonde de gavage, 5 minutes/jour sur 30 jours au total). Ils seront soumis jusqu’à deux anesthésies générales : une pour la procédure chirurgicale et une pour les imageries de contrôle avant mise à mort. La durée de l’intervention chirurgicale avec création de la dissection, implantation du dispositif médical (stent) et imagerie de contrôle est prévue entre 30 et 60min par animal.

Impact sur les animaux

Une gêne et une douleur post-chirurgicales sont possibles au niveau des abords artériels. L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque procédure/prélèvement. Un stress supplémentaire peut être observable sur les animaux qui seront amenés à recevoir un traitement oral quotidien. Les animaux recevront tout au long du projet un traitement oral antiagrégant 1 fois par jour (sonde de gavage, 5 minutes/jour). Ils auront jusqu’à deux anesthésies générales : une pour la procédure chirurgicale et une pour les imageries de contrôle avant mise à mort. La durée de l’intervention chirurgicale avec création de la dissection, implantation du dispositif médical (stent) et imagerie de contrôle est prévue entre 30 et 60min par animal. Lors de l’identification d’un problème mettant en jeu le pronostic vital de l’animal et/ou des douleurs non contrôlées, une mise à mort sous anesthésie sera réalisée.

Devenir

Mise à mort afin de pouvoir réaliser des analyses histopathologiques

Remplacement

Ce projet vise à étudier le traitement par stent et la cicatrisation d’une dissection artérielle dans des conditions in vivo. Aucune méthode alternative in vitro ou ex vivo ne permet de reconstruire un modèle proche de ces conditions en ce qui concerne la coagulation, la pression sanguine et les autres contraintes mécaniques appliqué sur la paroi artérielle ou le suivi après ces laps de temps. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est ainsi indispensable.

Réduction

Ce projet est à visée exploratoire et a pour objectif l’obtention de résultats préliminaires au cours d’études de faisabilité et de reproductibilité. Ces données pourront au besoin servir de base pour d’autres projet intégrant des analyses d’efficacité avec calcul statistique, dans un dossier APAFiS dédié (distinct de ce dossier). Dans le cadre de ce présent projet, un nombre de 6 lapins par condition a été déterminé pour répondre au mieux aux besoins des analyses effectuées (prend en compte le risque d'échec de la création de la dissection et/ou de la procédure, estimé à 20 % - utilisation des tests t de Student et Chi2 en fonction des variables étudiées). Le nombre de conditions pourra éventuellement évoluer en fonction des différents dispositifs médicaux implantables étudiés, jusqu’à 8 groupes de 6 lapins pourront être créés soit 48 lapins. De plus, plusieurs types d’analyses seront effectués (imagerie par angiographie, scanner, OCT, histologie), sur chaque animal dans le but de limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale, et leur première entrée en procédure. Leur environnement comportera un enrichissement (bûchettes à ronger, foin...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé et de bien-être sera évalué tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure. Un suivi renforcé sera effectué durant les premiers jours après chaque procédure opératoire. Si un animal présente un signe de douleur ou de souffrance, des analgésiques pourront lui être administrés. Au besoin, un traitement antibiotique pourra être mis en place. Dans le cas où l'animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique sans qu'il soit possible de le soulager efficacement (atteinte d'un point limite), l'animal sera sorti d'expérimentation et mis à mort.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle animal reconnu pour l’étude des pathologies artérielles. La biologie vasculaire a été bien étudiée chez le lapin et est similaire aux mécanismes humains. Le diamètre de l’aorte du lapin varie de 3 à 7mm, ce qui correspond au calibre de nombreuses artères humaines.

1 300 cochons, moutons, bovins et chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation d'un dispositif vasculaire, parfois précédée d'une seconde intervention destinée à lui créer la lésion à traiter, par section d'un nerf, découpe de tissu ou ligature d'un vaisseau. Ces opérations peuvent durer plusieurs heures et s'accompagnent d'une mise à jeun de douze à seize heures, de prélèvements de sang hebdomadaires et d'une douleur postopératoire que le porteur annonce sur plusieurs jours. La mise à mort finale sert à ouvrir les corps pour évaluer la tolérance et la durabilité des implants, dans un cadre que le porteur présente comme une "obligation règlementaire" pour la mise sur le marché de dispositifs médicaux.

Objectifs

Le système vasculaire comprend les réseaux artériels et veineux qui, reliés à la pompe cardiaque, permettent de faire circuler le sang dans l'ensemble de l'organisme et d'assurer la perfusion de tous les organes. La circulation veineuse est connectée avec le réseau des vaisseaux lymphatiques qui vient s'y déverser avant le coeur. Les pathologies vasculaires telles que les thromboses, les sténoses, les anévrismes, les traumatismes, etc... avec leurs conséquences telles que les accidents vasculaires cérébraux ou l'infarctus du myocarde représentent un enjeu majeur pour la santé publique et constituent une préoccupation croissante avec l’augmentation des populations à risque liée au vieillissement de la population, à la sédentarité et aux nouveaux modes de vie. L’implantation ou la mise en oeuvre de techniques et dispositifs médicaux vasculaires (endoprothèses, filtres, stents, delivery systems, cathéters, ballons et guides ou encore dispositifs pour embolisation ou pour thrombectomie par exemple) sont des approches thérapeutiques indispensables pour soigner ces maladies mais aussi pour permettre un accès régulier au compartiment vasculaire (exemple des chambres implantables pour dialyses ou chimiothérapies). Avec le développement de nouvelles technologies, les limites des actes chirurgicaux sont sans cesse repoussées avec le souci permanent de réduire le traumatisme chirurgical et les complications, de raccourcir les temps opératoires et les phases de récupération. La chirurgie mini-invasive, la chirurgie assistée par la robotique, la chirurgie transluminale, la chirurgie endovasculaire, la chirurgie vasculaire sous coelioscopie sont autant d’exemples qui illustrent ces avancées et la transformation de la pratique de la chirurgie vasculaire. Ce projet de recherche a pour objectif le développement et l'évaluation de nouveaux dispositifs et techniques pour le traitement des affections vasculaires au niveau des coronaires, des vaisseaux périphériques et des vaisseaux cérébraux."

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif vasculaire avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif vasculaire associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins, 12 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion nerveuse, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux : recours systématique à l’anesthésie générale avec prise en charge de la douleur durant les interventions d’imagerie, pendant et après les procédures chirurgicales, utilisation de tapis chauffants et suivi du réveil. La réalisation des examens d’imagerie sur le site même des animaleries permet de réduire au maximum le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - Le système vasculaire du mouton, du porc et du chien reproduisent fidèlement les réactions vasculaires humaines et le processus de cicatrisation des vaisseaux est similaire à celui observé chez l'homme. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements angiographiques et échographiques standards. - Chez l'ovin, la taille des veines iliaques externes est comparable à celle des humains. - Le modèle porcin est pertinent pour l'évaluation de la thrombogénicité des dispositifs. - Les débits et les volumes dans la veine cave inférieure ou les veines jugulaires du canidé peuvent être similaires à ceux des veines fémorales humaines, la structure hémodynamique des veines est similaire à celle des veines fémorales humaines. - Le modèle veau est pertinent pour les endoprothèses aortiques complexes. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.