Troubles cardiaques

Les souris de ce projet sont immunodéficientes et humanisées, la rate qu'on leur retire étant remplacée par des fragments de rate humaine, y compris de rate fœtale. 1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins répartis sur 112 jours et une échographie de quarante-cinq minutes tous les quatorze jours, leur immunodéficience les exposant par ailleurs aux infections. Le porteur justifie la mise à mort par le fait que ces animaux sont modifiés et greffés de tissu humain, et prévoit de proposer les rates murines retirées à des équipes d'immunologistes du campus comme source de cellules.

Objectifs

Le premier objectif du projet est d’explorer expérimentalement le rôle de filtration de la rate et les différents mécanismes physiques et biologiques à l’origine de la rétention des globules rouges dans la rate, en particulier dans le cadre de maladies héréditaires (drépanocytose, sphérocytose héréditaire, ...) ou acquises (Paludisme,...). Dans ces maladies, la déformabilité des globules rouges est altérée, entraînant une rétention dans la rate à l’origine d’anémie et de complications pouvant être graves. Les mécanismes d’anémie et de congestion de la rate sont complexes et requièrent un modèle expérimental. Les modèles murins conventionnels ne sont pas totalement pertinents pour analyser cette fonction physiologique et les mécanismes physiopathologiques. Des souris greffées par des fragments de rate humaine permettraient en revanche d’aborder ces questions. La filtration des globules rouges est un phénomène dynamique, tridimensionnel et multicellulaire, impossible à répliquer entièrement in vitro dans l’état actuel de la technique. L’étude aura également pour objectif d’étudier la prise de greffe et le développement de fragments de rate fœtale. Cela permettra d’analyser la fonction filtrante et immunologique de ces rates immatures en considérant que leur développement reflète – ou non – en partie la poursuite de leur développement physiologique. En deuxième objectif, nous souhaitons explorer la faisabilité de l’auto-greffe splénique humaine afin de restaurer une fonction déficiente, sur le modèle de la préservation de la fertilité par cryopréservation-réimplantation différée des ovaires en médecine humaine. Chez les patients atteints de drépanocytose, une splénectomie est parfois nécessaire du fait de complications graves. La cryopréservation d’une partie du tissu splénique permettrait sa réimplantation et la restauration d’une fonction splénique normale chez les patients guéris ultérieurement de leur drépanocytose. Démontrer dans le modèle murin la prise de greffe avec des fragments de rate humaine serait une indication forte du succès possible de notre démarche. La probabilité de succès est élevée du fait du phénomène de splénose (repousse de petits fragments spléniques), observé tant chez l’être humain que chez la souris.

Bénéfices attendus

La rate joue un rôle crucial dans le système immunitaire et aide à maintenir une circulation fluide des globules rouges en éliminant ceux qui pourraient obstruer les petits vaisseaux. En cas de certaines maladies des globules rouges, la rate peut devenir hyperactive, entraînant une anémie et d'autres complications. Les mécanismes exacts de ces processus ne sont pas encore bien compris. Un processus spécifique appelé "pitting" permet à la rate d'éjecter des corps rigides ou des parasites morts des globules rouges sans les endommager. Ce processus est difficile à étudier en laboratoire, car il nécessite l'utilisation de rates humaines, qui sont rares et limitées. Pour mieux comprendre ces mécanismes, l’étude propose de greffer des fragments de rate humaines sur des souris afin d'observer directement la filtration des globules rouges et d'évaluer les effets de médicaments sur la déformabilité des globules rouges. Ce modèle pourrait également être utilisé pour des interventions thérapeutiques ou prophylactiques. L’utilisation de rates fœtale permettrait également d’étudier la maturation de ces dernières dans notre modèle. La perte de fonction splénique peut entraîner des complications graves. Après une rupture de rate traumatique, la rate peut se régénérer spontanément, ce qui suggère qu'une réimplantation contrôlée de tissu de la rate pourrait améliorer le pronostic à long terme des patients. Cette étude préclinique est une étape nécessaire avant de solliciter l'agence de la biomédecine pour la mise en œuvre d'une démarche ambitieuse de préservation de la fonction de la rate chez l'être humain, ce qui pourrait avoir de grands bénéfices pour certains patients.

Procédures

Les animaux dans ce projet expérimental seront soumis : Procédure 1 : - 2 à 6 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toutes les 8-12h - 1 à 3 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toute les 8-12h - 1 chirurgie (45 min) sur animaux anesthésiés et analgésiés - 8 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (30 sec) répétés tous les 14 jours sur une période totale de 112 jours - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux endormis jusqu’à 112 jours (45min) Procédure 2 : - Pour l’ablation de la rate et la greffe, les interventions seront les mêmes que pour la procédure 1 - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux anesthésiés jusqu’à un temps déterminé en procédure 1 (45 min) sur animaux anesthésiés - 2 injections (30 sec) espacées de 3 jours si besoin - 1 injection sur animaux endormis (2min) - 5 prélèvements sanguins (30sec) de faible volume répété à 1 min, 30 min, 2h, 24h et 48h - Imagerie sur animaux anesthésiés durant un temps défini ne dépassant pas 4 heures

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont immunodéficiente ce qui augmente leurs sensibilités aux infections. Les injections et prélèvements de sang peuvent causer une douleur légère et temporaire à chaque site d'injection. La piqure d’aiguille pour l’injection elle-même provoque une douleur légère de courte durée. La chirurgie (exérèse de la rate, greffe) quant à elle, entraîne une douleur et un inconfort modérés.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis à mort car étant des organismes génétiquement modifiés et/ou greffés et/ou injectés avec du tissu humain ils ne peuvent pas être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La démarche n'est pas directement applicable chez l'être humain et nécessite une étape préclinique. Les seules données antérieures disponibles sur cette démarche de greffe de rate humaine ont été obtenues chez la souris. Les modèles in vitro et ex vivo préalablement développés présentent des limites dans leur puissance d’exploration (visualisation directe de la filtration des globules rouges, évaluation de l’impact des médicaments in vivo), ne pouvant être franchies que par l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de souris impliquées est réduit au maximum pour confirmer la faisabilité de la démarche et évaluer les médicaments avant leur utilisation chez l'être humain. Nous souhaitons nous assurer d'une probabilité de prise de greffe fonctionnelle supérieure à 70%. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la prise de greffe lors de nos procédures permet un suivi transversal permettant de réduire le nombre d’animaux. Les rates murines enlevées lors de la splénectomie préparatoire seront proposées à des équipes d’immunologistes du campus comme source de cellules. Le nombre d’animaux a été défini avec un biostatisticien et à l’aide d’un outil statistique où nous considérons deux groupes et 3 répétitions. Chaque répétition sera divisée en 4 jours d'expériences, avec 2 animaux par groupe et par jour. Par conséquent, nous considérons un effet aléatoire jour qui inclut à la fois les effets de la répétition et du jour. Un effet lot/jour pourrait représenter 10,00 % de la variabilité totale, ce qui nous amène à multiplier le nombre total d'individus par un facteur adapté par rapport à une situation où aucun effet de lot n'est attendu. Résolution statistique de l'expérience : Nous avons décidé d'utiliser 8 individus par groupe et par répétition, ce qui porte le nombre total d'individus à 48. En tenant compte d'un effet lot/jour de 10,00 %, ces nombres devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des effets importants à très importants.

Raffinement

Le choix du modèle animal participe au raffinement en sélectionnant une espèce et une souche adaptées aux objectifs scientifiques tout en minimisant l’inconfort. Leur immunodéficience impose un hébergement en conditions sanitaires strictes où tout ce qui sera en contact avec les animaux sera stérile pour limiter les risques infectieux. Les interventions chirurgicales et injections seront faites sous anesthésie gazeuse avec une analgésie adaptée afin de limiter la douleur, le stress et d’optimiser la récupération. Des plaques chauffantes préviendront l’hypothermie, une réhydratation post-opératoire sera assurée, et un gel appliqué pour éviter le dessèchement oculaire. Les greffons stériles seront traités afin de garantir une asepsie maximale et prévenir toute infection ou réponse inflammatoire. La greffe sera effectuée là où la rate se régénère naturellement. Cette technique est privilégiée car elle est robuste et évite une nouvelle incision. L’échographie permet un suivi transversal des animaux et déceler des signes précoces de nécrose des greffons. Les animaux seront observés quotidiennement, avec des critères d’évaluation précis basés sur les recommandations de la SBEA. Des points limites spécifiques et précoces, tels qu’une perte de poids, des signes de détresse, des signes inflammatoires ou d’infections sont identifiés et pourrons permettre de traiter l’animal avec l’avis du vétérinaire et le cas échéant, la mise à mort sera réalisée.

Choix des espèces

Notre objectif est de développer des mesures fiables et indépendantes de fonctionnement anormal de la rate. Nous utilisons plusieurs techniques. Les marqueurs actuels, peu adaptés aux contraintes hospitalières, nécessitent une validation plus robuste comme prédicteurs de gravité. Le produit final visé est un test biologique de routine quantifiant la fonction splénique. Pour atteindre cet objectif, un modèle expérimental animal est indispensable. Après avoir testé diverses hypothèses physiopathologiques et agents pharmacologiques in vitro, nous devons désormais confirmer nos résultats in vivo pour proposer de nouvelles solutions thérapeutiques. Un modèle murin est essentiel, car les systèmes moins évolués ne reflètent pas suffisamment le contexte humain. L’humanisation du modèle murin par greffe d’organes humains a déjà permis des avancées significatives dans la compréhension de plusieurs phénomènes physiopathologiques. De jeunes adultes de 8 semaines seront utilisés afin d’être suffisamment âgés pour permettre une chirurgie aisée et suffisamment jeunes pour permettre un suivi prolongé (3 mois). De plus, cet âge correspond à l’âge des souris dans l’article publié sur lequel nous nous basons pour ce projet.

1 500 rats et 1 000 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre eux passant trois semaines enfermés dans un caisson à atmosphère appauvrie en oxygène. Les autres reçoivent une injection destinée à déclencher une hypertension pulmonaire en quatre semaines. Viennent ensuite une échographie, une thermodilution, une mesure de pression artérielle pulmonaire et un prélèvement sanguin, tous sous anesthésie, avant le prélèvement du cœur et des poumons. Le porteur indique que les animaux deviennent essoufflés et inactifs mais estime la souffrance modérée puisqu'ils ne seront pas soumis à l'effort, et renvoie les éventuels essais cliniques à un horizon "plus long terme".

Objectifs

L’hypertension pulmonaire (HTP) est une maladie grave, caractérisée par une élévation de la pression artérielle pulmonaire qui conduit à une hypertrophie cardiaque droite, puis à une insuffisance cardiaque droite, à l’origine du décès des patients. Les traitements disponibles actuellement ne sont pas curatifs. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques à visée curative. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. L’objectif de ce projet est donc d’utiliser des modèles animaux (rats, souris) d’HTP expérimentale classiquement utilisés dans la littérature et au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Il existe différents type d’HTP chez l’Homme et nous allons donc utiliser deux modèles animaux pour étudier d’une part l’HTP associée à une hypoxie chronique (HC) similaire aux HTP associées aux maladies respiratoires hypoxémiantes (asthme, bronchite chronique, fibrose…) et d’autre part, l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) induite par une injection d'une substance pharmacologique pour étudier l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) idiopathique (de cause inconnue). A ce jour aucune lignée cellulaire ne rassemble toutes les caractéristiques pathophysiologiques de l’HTP donc nous avons besoin d’utiliser des animaux notamment pour mieux connaitre les mécanismes de cette pathologie ce qui permettra ensuite de tester de potentiels nouveaux traitements et d’évaluer leurs potentiels effets bénéfiques et/ou effets secondaires.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes associés à la pathologie de l’HTP/HTAP. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs seront mis en évidence ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées de façon à mettre en place un traitement plus efficace avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients et adapté au type d’hypertension pulmonaire HTP et/ou HTAP.

Procédures

Pour obtenir le modèle de rat ou souris hypoxiques chroniques, les animaux sont maintenus dans un environnement où l’air contient moins d’oxygène pour une durée de 3 semaines. Pour le modèle d’HTAP idiopathique chez le rat, une seule injection d’une substance pharmacologique appropriée sur animal vigile va induire au bout de 4 semaines de l’HTAP idiopathique. Le potentiel thérapeutique de substances pharmacologiques sera testé sur animal vigile. La fréquence d’injection et donc le nombre d’injections sera ajustée en fonction de la substance considérée. Lorsque l’HTP/HTAP est installée, des mesures in vivo sont effectuées sur chaque animal : -des mesures échographiques sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 10 minutes) -des mesures de thermodilution sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 15 minutes) -des mesures de pressions artérielles pulmonaires sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 20 minutes) -un prélèvement de sang sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes) -après euthanasie, prélèvement du cœur et des poumons (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes)

Impact sur les animaux

Chez l’homme, l’HTP/HTAP n’induisent pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Chez l’animal il a été noté une légère dyspnée et les rats/souris sont généralement assez inactifs. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP/HTAP chez les animaux. Les points d’injection des substances et solvants peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’hypertension pulmonaire. De plus, étant donné qu’il existe de nombreux types d’HTP associées à diverses maladies (respiratoires hypoxémiantes notamment), il est très difficile d’obtenir des résultats reproductibles sur ce type de tissu (provenant de patients ayant subis une greffe de poumon). Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. De plus, cette pathologie implique plusieurs organes et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) les rats contrôles utilisés seront les mêmes pour les deux type d’HTP, (2) une partie des utilisateurs utiliseront le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche (dans tous les cas les deux poumons seront utilisés), (3) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (4) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines exposées à l’hypoxie et étirées in vitro pour simuler l’HTP hypoxique. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée et en concertation avec tous les utilisateurs. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche.

Raffinement

Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Le caisson hypobare sera ouvert 3 fois par semaine afin de renouveler l’eau et la nourriture, et d’effectuer le change de la litière une fois par semaine. Un système automatisé permet de modifier la pression atmosphérique progressivement et automatiquement pendant 45 minutes pour le retour à la pression atmosphérique normale ou la mise en hypobarie. Le caisson et les cages sont transparents ce qui permet de surveiller les animaux. Les animaux contrôles seront juste placés dans leurs cages habituelles. A l’occasion de l’ouverture du caisson (3 fois par semaine), tous les animaux seront pesés. Si le décès survenait avant la fin du protocole, le protocole serait également modifié ou arrêté. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. Lors de l’anesthésie un tapis chauffant sera utilisé pour le bien-être de l’animal. Le degré d’anesthésie sera surveillé en permanence.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le choix du rat est également justifié par le fait que le modèle d’HTAP fonctionne difficilement chez la souris. Néanmoins, l’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont moins nombreux chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. L’HTP/HTAP sont des pathologies de l’adulte donc nous utilisons des animaux adultes en fin de protocole.

Une partie des souris porte un phénotype dommageable reproduisant la maladie de Marfan, avec scoliose, prolapsus rectal et hernie diaphragmatique. 16 200 souris vont être utilisées au total, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour analyse de l'aorte. Au sevrage, chacune subit une biopsie d'oreille et la pose d'une bague, puis selon les groupes des échographies sous anesthésie, jusqu'à vingt injections intrapéritonéales hebdomadaires, jusqu'à dix prélèvements sanguins submandibulaires en état vigile et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique sous la peau. Ce chiffre englobe l'élevage des lignées déficientes pour les gènes étudiés, dont les animaux qui ne seront retenus pour aucune expérience.

Objectifs

Ce projet a pour but de comprendre le rôle de l'inflammation dans l’anévrisme de l’aorte. Pour cela, des modèles de souris présentant des anévrismes dans différentes régions de l’aorte seront utilisés. La dilatation de l’aorte, la survenue d’anévrismes, le remodelage de la paroi aortique et l'inflammation seront étudiés chez ces souris. Ce projet a également pour objectif d'étudier l'effet de la déficience et de l'activation de certains acteurs moléculaires et cellulaires de l’inflammation sur la survenue et la gravité des anévrismes.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à une meilleure compréhension rôle de l’inflammation dans l’anévrisme de plusieurs régions de l’aorte. En particulier, l’identification des mécanismes moléculaires activés au sein des cellules immunitaires et des cellules de la paroi aortique est essentielle pour le développement à plus long terme de stratégies thérapeutiques innovantes.

Procédures

Ce projet comporte une partie d'élevage de souris déficientes pour certains gènes d'intérêt. Lors du sevrage, ces animaux subiront une biopsie d'oreille pour génotypage et la pose d’une bague d’identification. Des échographies non-invasives et indolores du thorax et de l’abdomen seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir des injections intrapéritonéales d'une durée maximale de 30 secondes (au maximum 1 injection par semaine pendant 20 semaines). Une partie des animaux subira un prélèvement sanguin toutes les deux semaines par voie submandibulaire en étant vigile, d'une durée maximale d'une minute (maximum 10 prélèvements). Une partie des animaux va subir une procédure chirurgicale de 5 minutes au cours de laquelle une pompe osmotique est implantée sous la peau. Cinq injections sous- cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire.

Impact sur les animaux

- Effets indésirables liés à la biopsie pour génotypage : inconfort lié à la préhension et la contention des animaux. Le niveau de douleur est estimé léger et de courte durée. - Effets indésirables liés aux injections et aux prélèvements : inconfort lié à la préhension et la contention des animaux. Stress/potentielle douleur au point d'injection et prélèvement. Le niveau de douleur est estimé léger et de courte durée. - Effets indésirables spécifiques à la chirurgie : les souris sur lesquelles seront implantées des pompes osmotiques risquent de subir l’inconfort de la pompe et de la plaie. Le niveau de douleur est estimé modéré. - Effets indésirables liés aux modèles : la survenue d’anévrismes est inhérente à ce projet. Le niveau de douleur est estimé modéré. - Effets indésirables liés au phénotype dommageable d’une partie des souris dont les symptômes récapitulent ceux des patients atteints de la Maladie de Marfan : scoliose, prolapsus rectal et hernie diaphragmatique. Le niveau de douleur est estimé modéré.

Devenir

A la fin des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques ou d’inflammation dans l’aorte.

Remplacement

L'étude expérimentale sur des animaux est une étape incontournable pour comprendre les mécanismes intervenant dans le développement des anévrismes. En effet, ces phénomènes complexes impliquent une multitude de types cellulaires, ce que les modèles de culture cellulaire ne peuvent reproduire complètement. Le modèle animal permet d'étudier les diverses interactions cellulaires et tissulaires qui se produisent lors de la dilatation de l’aorte et qui peuvent aboutir à sa rupture. Ces modèles précliniques de souris sont également un préalable indispensable pour valider les stratégies thérapeutiques avant leur application chez les patients atteints d'un anévrisme de l'aorte. En parallèle des études sur modèle animal, des études sur modèles cellulaires sur des lignées cellulaires de cellules inflammatoires ou tissulaires permettront d’obtenir des résultats complémentaires qui ne nécessitent pas l’utilisation de plus d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. En tenant compte des aléas inhérents à la survenue de ruptures des anévrismes étudiés, la taille de groupe est estimée à 20 animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, plusieurs paramètres seront étudiés sur le même animal. En ce qui concerne l'élevage, la stratégie de croisement des animaux permet d'optimiser la génération des animaux en fonction des groupes nécessaires pour les expériences et pour la gestion des lignées, à l'aide des tableaux de croisement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées, et par, l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en œuvre du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes nécessaires. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles de souris, d'importants résultats pourront être obtenus rapidement, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Ce projet comprend différents modèles d’anévrisme, touchant différentes régions de l’aorte. Pour les modèles d’anévrisme qui le permettent, les souris seront incluses à l’âge adulte une fois le système cardio- vasculaire arrivé à maturité. Cela permet de réduire la variabilité entre les individus. Pour les modèles d’anévrisme évoluant plus rapidement, les animaux seront inclus plus tôt, au stade de jeune adulte.

Privées du gène de l'apolipoprotéine E, 75 souris développent spontanément des plaques dans leurs artères, effet accéléré par un régime dont 40 % de l'énergie vient des graisses. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour prélever le tronc aortique et le cœur. Sur douze semaines, chaque animal reçoit 26 injections dans l'abdomen, passe quatorze pesées, trois prélèvements à la veine de la queue et une anesthésie pour l'injection d'une sonde fluorescente, l'obésité s'installant au fil de l'étude. Les quatre molécules testées appartiennent à un client du laboratoire, dont le développement pourrait, "à terme", aboutir à la mise sur le marché d'un médicament.

Objectifs

L'athérosclérose est un phénomène caractérisé par la formation de plaques d'athérome, constituées de lipides, sur la paroi des artères, induisant un durcissement et une perte d'élasticité de ces dernières. L'athérosclérose constitue un facteur de risque cardiovasculaire majeur. En effet, la rupture des plaques d'athérome peut conduire à une mauvaise oxygénation des organes, notamment le cerveau et le coeur et favoriser la survenue de complications graves telles que l'infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Ainsi, du fait de ces complications, et malgré l'existence de traitements ralentissant son évolution, l'athérosclérose demeure l'une des principales causes de mortalité dans le monde. Le développement de médicaments permettant un meilleur contrôle du développement de l'athérosclérose fait ainsi l'objet d'intenses recherches par les laboratoires pharmaceutiques. Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de 4 candidats médicaments sur le développement des plaques d'athérome chez un modèle murin développant spontanément de l'athérosclérose, notamment lorsque ce dernier est soumis à une alimentation enrichie en graisses (40% de l'énergie apportée par les graisses). Les candidats médicaments seront administrés 2 fois par semaine par voie intrapéritonéale pendant 12 semaines. L'effet de ces traitements sera observé principalement par histologie du tronc aortique à l'issue de l'étude.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à prévenir et traiter l'athérosclérose. Cette pathologie reste l'une des causes prinicipales de mortalité dans le monde, il existe un besoin important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développemlent dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché d'un nouveau médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (14 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Injections de placébo ou du candidat médicament 2 fois par semaine (26 injections; durée de l'administration : 1 minute); 3) à trois prélèvements sanguins pratiqués à la veine de la queue (durée: 5 minute/prélèvement); 4) à une anesthésie pour administration IV d'une sonde fluorescente (durée : 10 minute).

Impact sur les animaux

En termes de nuisances, les animaux seront soumis à du stress du fait des manipulation lors des pesées régulières de poids corporel ou des injections répétées du candidat médicament. Par ailleurs les animaux seront soumis à des douleurs légères et de courte durée lors des injections du candidat médicament, et des prélèvements sanguins. Enfin, le régime enrichi en graisse distribué aux animaux est de nature à induire un état d'obésité progressif au cours de l'étude.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes (tronc aortique, coeur) sont prévus après euthanasie afin d'observer la progression des plaques d'athérome chez les différents groupes traités, et de réaliser des dosages biochimiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur la formation et le développement des plaques d'athérome.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris soumis à une alimentation enrichie en graisses. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par un test statistique adapté.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter le stress et l'inconfort pour les animaux. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs formés et expérimentés pour ce type de pratique. Les animaux seront hébergés dans des conditions standard d'hébergement. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. Les injections seront réalisée sur animal anesthésié. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent notamment une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris employé est un modèle génétique présentant une déletion du gène codant pour une protéine constitutive des lipoprotéines, structures chargées du transport des triglycérides et du cholestérol dans le sang. Cette mutation induit chez ces souris une propension à développer spontanément des plaques d'athérome, en faisant un modèle de choix pour les études précliniques. Les animaux, mâles et femelles, seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

Génétiquement modifiées pour développer un diabète de type 2, les souris de ce projet grossissent jusqu'à une obésité que le texte qualifie lui-même de sévère et de "source de souffrance et d'inconfort". 1 080 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements jusqu'à deux fois par jour pendant dix semaines, subissent des ponctions dans une veine de la mâchoire en état vigile, une incision à la pointe de la queue, quatre séances d'imagerie cardiaque sous anesthésie, et passent jusqu'à vingt heures seules sur une grille, sans nourriture ni litière, pour le recueil d'urine. Les mâles restent isolés pendant tout le protocole. La mise à mort intervient après ouverture du thorax et mesure de la pression directement dans le cœur, et l'effectif prévoit 20 % d'animaux supplémentaires pour compenser la mortalité attendue en cours de route.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie progressive qui se caractérise par une incapacité du cœur à assurer un débit de sang suffisant pour couvrir les besoins du corps en oxygène, d’abord en cas d’effort puis même au repos. L'insuffisance cardiaque peut se caractériser par une diminution de la capacité du coeur à se remplir de sang, et ses causes sont multiples : âge, hypertension, obésité, diabète… Malgré les nombreuses recherches et études cliniques menées ainsi que l’arsenal thérapeutique déployé et testé, aucune thérapie semble être efficace en termes d’allongement de la durée de vie des patients atteint de cette maladie. Afin de pouvoir tester de nouveaux composés médicaments, le développement et l’utilisation de modèles animaux aux plus proches des atteintes cardiovasculaires de l'insuffisance cardiaque est nécessaire. Le modèle de souris génétiquement modifié pour exprimer des troubles du mébolisme et de la fonction rénale permet d'entrainer une insuffisance cardiaque similaire à ce que l'on retrouve chez l'Homme. Ainsi, l’objectif du projet est d’utiliser ce modèle d'insuffisance cardiaque pour évaluer l’efficacité de nouveaux composés à visée thérapeutique sur la progression de l’insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements sur un modèle de souris génétiquement modifiée d’insuffisance cardiaque . Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant de cette maladie.

Procédures

Au cours du protocole, plusieurs prélèvement de sang seront réalisés sur animaux vigiles au niveau de l'une des veines de la machoire et au niveau de la queue après une légère incision (1min par prélèvement). Les animaux seront soumis à plusieurs analyses d'imagerie cardiaque (4 fois maximum, 30min par analyse) réalisées sous anesthésie générale. Durant plusieurs heures (

Impact sur les animaux

Ce modèle de souris génétiquement modifié présente un phénotype dommageable et se traduit par le développement naturel de troubles métaboliques (exemple: augmentation du glucose dans le sang) et aboutit à un diabète de type 2. Ces effets entrainent une suralimentation et provoque une obésité sévère, source de souffrance et d’inconfort. Les souris mâles seront hébergées individuellement dans des cages et génére du stress. Le prélèvement de sang sur animal vigile nécessite une contention de l’animal pouvant être source de stress, ainsi qu’une ponction avec une aiguille dans l'une des veines de la mâchoire pouvant générer une douleur. L’étude du glucose sanguin nécessite une légère incision à la pointe de la queue entrainant un court saignement pouvant générer une douleur et du stress, et peut nécessiter une privation de nourriture lorsqu'elle est faite à jeun. L’utilisation des cages permettant de récolter l'urine requière l’hébergement individuel des souris sans alimentation et dans laquelle les souris sont uniquement placées sur une grille sans sciure et enrichissement et ce, sur plusieurs heures (20h au maximum). Des anesthésies gazeuses, provoquant une légère irritation des voies respiratoires, pourront être réalisées au cours du protocole afin de réaliser des examens du coeur sur plusieurs semaines. De même, en fin de protocole, des mesures de la pression sanguine seront effectuées dans la carotide et le coeur sur animal anesthésié à la suite de l’intubation des animaux et après l'ouverture du thorax pouvant être suivi par un prélèvement de sang dans le coeur. Un des effets indésirables potentiels est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. Le traitement par injection intra-péritonéale peut entrainer une inflammation de l'abdomen et le traitement par voie orale peut entrainer des fausses routes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car les mesures effectuées en fin de procédure sont des mesures terminales nécessitant l’ouverture de la cage thoracique pour les mesures de pression.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composés in vivo. Afin d’évaluer l’effet du composé sur l’insuffisance cardiaque, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’étudier les répercussions de la pathologie dans un système complexe entier ni d’évaluer l’efficacité d’un composé dans les organes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe (n=18) pour ce projet est basé sur des données obtenues dans la littérature (n=12) qui prennent en compte que des critères d’inclusion stricts peuvent être appliqués (+ 20%) et que du fait des différentes procédures prévues il peut y avoir une mortalité des animaux (+ 20%). Les animaux sont répartis de manière homogène à la suite des pesées et mesures de glucose sanguin à jeun initiales. L’examen cardiaque par imagerie permet de faire un suivi tout au long du protocole sur le même animal limitant ainsi le nombre d’animaux. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus des animaux contrôles sont conservés en interne pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). Cela permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Avec le recul de plusieurs études, le nombre d’animaux par groupe pourra être revu à la baisse.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 7 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux sous anesthésie lors de l’imagerie cardiaque seront placés sur un tapis chauffant et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux. Après chaque prélèvement, une réhydratation sera réalisée afin de compenser la perte de vu volume sanguin. Les doses et volumes d’injection des anesthésiques chimiques, analgésiques et de sérum physiologique seront réalisés selon les recommandations éthiques (doses, volume). Les mesures de pression sanguine réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'un analgésique.

Choix des espèces

La souris, classiquement utilisée en laboratoire, présente des similitudes importantes avec l’humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie vasculaire et cardiaque. La réponse pathophysiologique de la souris dans l'insuffisance cardiaque est comparable à celle des humains notamment en termes de modification du tissu cardiaque et de modification des pressions sanguines. De plus, ce modèle génétiquement modifié de souris développe des facteurs de comorbidités tels qu'un diabète de type 2 pouvant être à l’origine de l’insuffisance cardiaque chez l’Homme. Les souris utilisées auront au minimum 8 semaines. En effet, ce modèle est sensible à l’âge et la survenue de la pathologie apparait progressivement au cours du développement de l’animal. Un âge de 8 semaines correspond à l’âge minimum pour lequel les premiers symptômes apparaissent chez ces souris.

Tester des valves mitrales et des médicaments avant leur mise sur le marché suppose ici de provoquer d'abord un infarctus. 100 cochons et 100 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une à trois chirurgies de trois à quatre heures pour installer l'insuffisance cardiaque, puis une quatrième d'environ quatre heures pour l'implantation du dispositif, avec un risque d'arythmie, de fibrillation et d'arrêt cardiaque sur la table d'opération. Le porteur écrit que le client commanditaire s'engage à ne pas refaire un essai déjà mené, et prévoit que les animaux ne remplissant pas le critère d'inclusion après l'infarctus soient utilisés pour de la formation ou réutilisés dans un autre projet, les autres étant tués pour analyser les tissus au contact du dispositif.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé cardiovasculaire (exemple : médicaments, dispositifs médicaux implantables de remplacement ou réparation de valve mitrale) dans un modèle d’insuffisance cardiaque gauche. Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir la sécurité des patients et l’efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. La création d’un modèle animal d’insuffisance cardiaque gauche permet de reproduire des conditions très similaires à la future utilisation clinique de ces produits et permettre de tester leur efficacité dans cet environnement. Ce projet pourra se conduire dans plusieurs EU partenaires, afin d'obtenir des résultats d'imagerie spécifique non disponible dans notre EU.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir des données de performance et de tolérance de produits de santé cardiovasculaire dans un modèle d’insuffisance cardiaque induit. En mimant au plus près la situation pathologique des patients (cardiopathie comme par exemple l’insuffisance cardiaque gauche), ces études permettront de mieux appréhender la réaction de l’organisme au produit à tester, et ainsi améliorer la sécurité et/ou les performances du produit, avant sa mise sur le marché.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 à 3 interventions chirurgicales pour la création du modèle d’insuffisance cardiaque (induction d’un infarctus du myocarde), puis à une intervention chirurgicale pour l’implantation du produit à tester (exemple : remplacement/réparation de la valve mitrale), ou bien une injection du produit à tester (exemple : médicament). Les interventions chirurgicales sont d’une durée d’environ 3 à 4h (pour la création du modèle d'insuffisance cardiaque), et d’environ 4h pour l'implantation du produit à tester. Si le produit à tester est un médicament à injecter, cette durée sera raccourcie au temps d'injection du produit. Les interventions chirurgicales ont toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), analgésie et antibiothérapie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses (exemple imagerie : échocardiographie, angiographie, scanner, IRM) peuvent être réalisées sous anesthésie légère (à minima une session de contrôle est réalisée par procédure, qui peut être répétée en fonction de la durée de l'étude). Le scanner ou l'IRM sont externalisés dans des EU partenaires (EU1 et EU2), la durée de l'intervention est d'environ 1h dans l'EU1, et 1h30 dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont un risque d’arythmies, d’extrasystoles ventriculaires, tachycardie ventriculaire, fibrillation ventriculaire, pouvant aller jusqu’à l’arrêt cardio-respiratoire et au décès sur la table de chirurgie, en cas d’échec de la réanimation. Les autres nuisances sont une douleur et stress liés à la chirurgie, perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie pendant quelques jours, les hématomes, œdèmes ou infections au niveau des sites d’accès pour les cathéters ou du site opératoire (si chirurgie d’implantation), une hémorragie et une ischémie.

Devenir

A l'issue de la procédure de création d'un modèle d'infarctus du myocarde, les animaux sont maintenus en vie. S'ils valident le critère d'inclusion, ils entrent alors dans la procédure d'injection ou implantation d'un produit de santé cardiovasculaire . S'ils ne le valident pas, ils seront utilisés à des fins de formation ou ré-utilisés dans le cadre d'un autre projet, après accord du vétérinaire. A l'issue de la procédure d'injection ou implantation d'un produit de santé cardiovasculaire, des observations post-mortem sont nécessaires pour répondre aux objectifs du projet. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes au contact du produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques pour évaluer l’élasticité). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant de mimer une condition pathologique telle que l’insuffisance cardiaque gauche, afin d’évaluer la performance et la tolérance de produits de santé cardiovasculaire, en raison des interactions complexes s’établissant entre le tissu cible (cœur) et le produit injecté ou implanté.

Réduction

Le client demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires). Les transports des animaux vers les EU partenaires (séance d'imagerie) seront organisés dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur (durée transport jusqu'à 1h30). Mesure de raffinement pendant le transport : ajout de litière, animaux en groupe. Un contrôle clinique de chaque animal est réalisé par du personnel qualifié (vétérinaire, technicien ou zootechnicien) au départ et à l'arrivée. Lors des séances d'imagerie externalisées, afin de limiter le stress des animaux, une période de repos de minimum 1h sera respectée entre la réception des animaux et l'anesthésie et entre le réveil des animaux et le transport retour vers notre EU. La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (désinfection des sites chirurgicaux à une fréquence adaptée). Les signes cliniques servant de points limites ont été définis, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances. Les prises de sang peuvent être réalisées sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple) ou sous sédation légère avec au besoin une analgésie, afin de maitriser le stress et la douleur potentielle. Les conséquences de l’anesthésie/chirurgie : du gel oculaire est appliqué au niveau de la cornée lors des anesthésies des animaux pour prévenir l'assèchement oculaire. Une attention particulière est portée à la lutte contre l'hypothermie : température de la salle, isolation du sol, couvertures, lampes chauffantes si besoin. En cas de doute, une mesure de la température rectale est réalisée.

Choix des espèces

Les ovins et les porcins sont généralement de bons modèles en raison des similarités cardiovasculaires et hématologiques avec l'Homme. Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. Le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l'utilisation clinique du produit ou de sa taille par exemple. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. Cas particulier des porcs domestiques : étant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines) est la plus appropriée dans ce projet.

Des rats de quatre semaines, pesant une centaine de grammes, reçoivent un traitement qui leur provoque une hypertension des artères pulmonaires. 176 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélèvement des poumons, du cœur, du foie et de la rate. Chacun subit deux échographies cardiaques sous anesthésie et une injection intrapéritonéale par jour pendant deux à trois semaines, certains recevant en plus une minipompe posée chirurgicalement. Le porteur invoque un "besoin médical critique" et des options thérapeutiques limitées, quand le projet consiste à tester chez le rat des inhibiteurs d'une protéine repérée en culture cellulaire.

Objectifs

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire rare et progressive caractérisée par un rétrécissement des petites artères pulmonaires, entraînant une augmentation de la pression artérielle dans la circulation pulmonaire. Dans ce projet, nous allons tester de nouveaux médicaments susceptibles de ralentir ou corriger les anomalies à l’origine de cette maladie. Pour cela, nous utiliserons des modèles expérimentaux chez le rat qui reproduisent les principales caractéristiques de l’HTAP humaine. L’objectif est de mieux comprendre comment la maladie se développe et d’identifier les mécanismes biologiques sur lesquels les traitements agissent. Cela permettra d’envisager, à terme, de nouvelles approches pour soigner les patients atteints d’HTAP.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à répondre à un besoin médical critique en explorant de nouvelles approches thérapeutiques pour l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), une pathologie grave et complexe pour laquelle les options actuelles sont limitées. Avancées thérapeutiques : L’étude permettra d’évaluer si l’intégrine αvβ3 constitue une cible thérapeutique pertinente pour l’HTAP. L’efficacité des inhibiteurs de αvβ3 sera testée afin de déterminer leur impact sur la réduction du remodelage vasculaire pulmonaire et l’amélioration des paramètres hémodynamiques. Compréhension des mécanismes : Les résultats attendus contribueront à une meilleure compréhension des voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs de αvβ3. En particulier, ils permettront d’analyser leur effet sur la prolifération cellulaire, l’inflammation et la dysfonction endothéliale associées à l’HTAP. Impacts translationnels : Ce projet fournira une base scientifique solide pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’intégrine αvβ3 dans le traitement de l’HTAP. Les résultats obtenus pourraient également ouvrir des perspectives pour élargir l’utilisation de ces inhibiteurs à d’autres pathologies impliquant des mécanismes similaires. En se focalisant sur les mécanismes fondamentaux de l’HTAP, ce projet pourrait non seulement améliorer les résultats cliniques des patients, mais aussi contribuer à l’élargissement des connaissances sur cette maladie. Ces bénéfices attendus représentent une avancée importante vers des traitements plus ciblés et efficaces.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales. Deux échographies cardiaques non invasives seront réalisées sous anesthésie générale légère, chacune durant environ cinq minutes. Ces examens permettront de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer l’effet des traitements. Un sous-groupe d’animaux subira une courte chirurgie (environ 15 minutes) sous anesthésie générale pour l’implantation d’une minipompe osmotique permettant l’administration continue d’un traitement. Les animaux seront surveillés durant la phase de réveil post-opératoire. Chaque animal recevra une injection sous-cutanée unique en début de protocole, puis une injection intrapéritonéale par jour pendant 2 ou 3 semaines selon la procédure suivie (à l’exception des animaux porteurs de minipompe). Chaque injection est réalisée sous anesthésie locale et dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Les traitements administrés ont déjà été testés et présentent un bon profil de sécurité, avec une toxicité minimale. Les effets indésirables attendus dans ce projet concernent les interventions expérimentales ainsi que les manifestations liées aux pathologies induites : • Les injections sous-cutanées peuvent provoquer une douleur modérée et transitoire au point d'injection • La chirurgie abdominale peut entraîner une douleur postopératoire modérée, localisée dans la zone opérée. • Les échographies peuvent générer un stress léger et temporaire dû à la contention et à l’anesthésie. • Les procédures terminales sont réalisées sous anesthésie générale et ne génèrent pas d’effet indésirable postérieur. • Les modèles d’hypertension pulmonaire peuvent provoquer une fatigue progressive et une réduction de la prise de poids.

Devenir

À la fin de l’étude, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie, garantissant l'absence de souffrance. Des prélèvements d'organes (poumons, cœur, foie et rate) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.

Remplacement

Ce projet repose sur des résultats prometteurs obtenus à partir d’études in vitro sur des cultures cellulaires. Ces travaux ont permis de mettre en évidence des altérations dans des voies de signalisation clés impliquées dans le remodelage vasculaire pulmonaire. Le traitement par des inhibiteurs ciblant cette intégrine a montré une réduction significative de la prolifération des cellules musculaires lisses d’artère pulmonaire (CML-AP) induite par le Facteur de von Willebrand (vWF). Ces résultats suggèrent un rôle crucial de l’axe vWF/LRP4/αvβ3 dans la prolifération cellulaire associée à l’HTAP. Toutefois, pour valider l’impact de cette inhibition sur le remodelage vasculaire pulmonaire dans un contexte physiologique intégré, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire. Les modèles SuHx et MCT d’hypertension pulmonaire ont été choisis pour leur aptitude à reproduire les altérations pathologiques observées chez l’Homme, notamment le remodelage vasculaire, la prolifération des CML-AP et l’élévation de la pression artérielle pulmonaire. Ces modèles permettent d’induire ces modifications et constitue une approche préclinique pertinente pour tester l’efficacité de traitements. Ces modèles expérimentaux offrent une plateforme robuste pour évaluer les effets des traitements sur la progression de la maladie, mesurer la réduction du remodelage vasculaire et déterminer les implications thérapeutiques potentielles. L’étude des interactions entre les voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs d'intégrine fournira également des informations essentielles sur les mécanismes sous-jacents de cette approche thérapeutique.

Réduction

Les effectifs ont été soigneusement calculés en utilisant des outils statistiques avancés, en tenant compte des données issues de nos études préliminaires et des résultats disponibles dans la littérature sur l’hypertension pulmonaire. Les critères hémodynamiques, tels que la pression artérielle pulmonaire moyenne et l’évaluation du remodelage vasculaire, sont les principaux paramètres retenus pour évaluer l’efficacité des traitements. Cette approche permet de cibler les analyses sur des mesures précises et pertinentes, limitant ainsi la nécessité d’effectuer des évaluations multiples ou prolongées. De plus, les animaux témoins utilisés dans cette étude seront, lorsque cela est possible, réutilisés pour des analyses complémentaires afin d’optimiser leur usage et éviter l’expérimentation supplémentaire sur de nouveaux individus. Egalement, nous avons inclut dans la procédure 1 une étude pilote afin de déterminer le meilleur candidat médicament pour poursuivre le reste de l'étude avec une seule molécule. Cette stratégie vise à maximiser l’exploitation des données obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. Par ailleurs, les résultats issus de ces expérimentations pourront être valorisés dans le cadre d’autres recherches sur l’HTAP et les mécanismes moléculaires associés, garantissant ainsi une utilisation optimale des ressources animales disponibles

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un système de surveillance basé sur des points limites sera appliqué afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Une attention particulière est portée à la gestion de la douleur : une analgésie est administrée avant les interventions douloureuses, notamment avant la chirurgie, et toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie adaptée (anesthésie générale pour la chirurgie, anesthésie locale pour les injections). Cela permet de réduire efficacement toute douleur ou stress potentiel. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards et bien établis pour l’étude des maladies cardiovasculaires, notamment l’hypertension pulmonaire. Des rats âgés de 4 semaines et pesant environ 100 grammes seront utilisés, conformément aux standards expérimentaux des modèles validés d’hypertension pulmonaire. Cet âge est requis pour assurer l’induction efficace et reproductible de la maladie dans les protocoles utilisés, tout en permettant une comparaison directe avec les données existantes dans la littérature préclinique. Ce choix permet également d’optimiser la transposabilité des résultats vers des approches translationnelles ultérieures.

Des souris âgées subissent une insuffisance circulatoire aiguë provoquée par chirurgie, sous anesthésie, pendant trois heures au maximum et sans réveil, après un test de force des pattes. 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, leurs muscles, reins, foie et cerveau étant prélevés. L'objectif déclaré est d'établir une signature métabolique du muscle âgé, pour repérer plus tard les patients de réanimation exposés à des complications. Les nuisances attendues se résument, selon le porteur, au stress du test de force et aux quelques secondes précédant l'endormissement, sans que le geste chirurgical lui-même soit décrit ni les niveaux d'hypotension retenus, encore non arrêtés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’explorer la signature métabolique du muscle squelettique âgé préalablement exposé à une insuffisance circulatoire aigue (ICA) et d’en comprendre l’éventuel impact à distance sur les autres organes. In fine, il s’agit de positionner le muscle squelettique comme une possible cible thérapeutique afin d’améliorer le devenir des patients en réanimation et en péri-opératoire.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet présente un intérêt important pour le laboratoire de recherche puisqu’il permettra la mise en place d’un modèle d’insuffisance circulatoire aigue chez la souris dont l’objet principal sera l’étude du métabolisme musculaire. Ce modèle est conçu pour être au plus proche de la présentation et la prise en charge de l’ICA chez l’humain. Par ailleurs, ce modèle s’intègre dans une démarche translationnelle puisqu’il viendra compléter un essai clinique sur l’ICA en chirurgie cardiaque. Ce projet scientifique pourrait constituer une avancée importante dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques en anesthésie et réanimation, centrées sur le muscle squelettique. Grâce à la meilleure compréhension physiopathologique du rôle du muscle dans la récupération après une agression, nous souhaitons mettre en évidence des cibles métaboliques pour identifier les patients à risque de présenter des complications post-opératoires ou une hospitalisation prolongée en réanimation. Cela permettra d’améliorer la qualité des soins et la sélection des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à un grip test (3 répétitions du test d'une durée de quelques secondes chacune, entrecoupées de 2 à 3 minutes de repos) ainsi qu'à une procédure chirurgicale (ICA) de 3 h maximum, sans réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues se résument au stress lors du grip test (maximum 10 minutes au total) et de l'anesthésie générale (quelques secondes avant endormissement).

Devenir

A la fin de chacune des procédure, l'ensemble des animaux est mis à mort, par des personnes formées et compétentes, dans le but de collecter et d'analyser les tissus d'intérêt (sang, muscle squelettique, rein, foie, cerveau). Ces analyses (biochimie, expression genique, histologie) permettront d'explorer la signature métabolique du muscle squelettique âgé préalablement exposé à une insuffisance circulatoire aigue (ICA) et d’en comprendre l’éventuel impact à distance sur les autres organes.

Remplacement

L’étude de l’insuffisance circulatoire aigue et de la communication inter-organes qui lui succède nécessite un modèle intégratif permettant la prise en compte de l’action à distance de tous les organes après une ICA. De ce fait l’analyse ne peut être réalisé qu’in vivo pour garde un niveau d’information suffisant. L’intérêt de cette recherche réside aussi dans son potentiel applicatif et l’utilisation de critères de jugement fonctionnels. Il n’existe à ce jour pas d’autre méthode fiable d’analyse systémique de la communication inter-organe.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur les données bibliographiques actuelles. Compte tenu de la variabilité des réponses individuelles et du risque de décès durant l'ICA tant que les conditions expérimentales ne sont pas arrêtées, des groupes de 15 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. De plus, une veille bibliographique a été effectuée afin d'éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes de recherche et pour utiliser les travaux susceptibles de nous aider dans notre démarche (définir les niveaux d'hypotension à tester, les durées d'ICA notamment). Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les cages sont passées en revue quotidiennement pour repérer les blessures éventuelles, comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur sont réalisées sous anesthésie chirurgicale et un analgésique est utilisé en parallèle de ces procédures. Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé. Lors de l'ICA, si la pression artérielle moyenne chute en deçà de la valeur définie dans le protocole, une perfusion du sang de l'animal (prélevé pour l'ICA et hépariné) sera réalisée pour maintenir la pression à la valeur choisie.

Choix des espèces

Les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et la souche choisie pour ce projet a déjà été utilisée pour la réalisation d’un modèle d’ICA permettant l'étude de la fonction renale dans la littérature. Notre modèle s'intéresse à l'altération musculaire. Nous prenons donc exemple sur ce premier modèle publié et l'adaptons pour l'étude du muscle squelettique. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte, à partir de 8 semaines, pour ne pas interférer avec les mécanismes mis en jeu au cours du développement.