Troubles cardiaques

Amenés depuis un autre établissement le matin et ramenés le soir même, 12 chiens, 12 porcs et 12 brebis sont anesthésiés le temps d'une séance de scanner, à laquelle s'ajoutent 12 lapins hébergés sur place. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et aucun des 48 animaux n'est tué dans le cadre de ce projet. Les lapins peuvent recevoir une anesthésie par jour pendant sept jours, pour un maximum de cinq scanners corps entier ou dix scanners ciblés, avec injection possible d'un produit de contraste. L'étude sert à préparer d'autres projets, ceux qui évalueront des candidats médicaments, et à l'issue les chiens, porcs et brebis repartent vers de nouvelles procédures expérimentales, quatre lapins seulement étant proposés à l'adoption.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la faisabilité, la plus-value et les bénéfices scientifiques et/ou éthiques (réduction du nombre d’animaux nécessaire) de l’imagerie scanner dans différents projets relatifs à des aires thérapeutiques différentes : cardio-vasculaire, maladie de l’os et du cartilage, implants, … Ainsi, ce projet servira d’étude pilote afin de tester la faisabilité de l’imagerie (répondre à la question est-il possible de visualiser et/ou quantifier l’organe/tissu cible ?) et tester différents protocoles d’imagerie (injection ou non de produit de contraste, temps d’acquisition, paramètres scanner…) permettant d’obtenir des acquisitions optimales nécessaire pour répondre à l’objectif scientifique des études principales. La réalisation de scanner pourra être réalisé sur 4 espèces en fonction des besoins scientifiques des études principales : chez le lapin, la brebis, le porc ou le chien. Les résultats obtenus permettront d’intégrer de l’imagerie scanner ultérieurement dans le cadre d’étude précliniques d’évaluation de candidats médicaments. Les études principales cités ci-dessus feront l’objet de demande d’autorisation de projet spécifique pour chacune d’entre elles. Les animaux seront fournis par un second EU. Il s'agit donc d'un projet multisite qui se déroule sur 2 EU différents.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à évaluer si l’utilisation de l’imagerie scanner dans des études d’efficacité de nouveaux médicaments / d’implants, de tolérance locale, … peut-être avantageuse afin de répondre à des objectifs précis sans avoir recours à l’euthanasie des animaux à chaque délai et donc en réduisant ainsi le nombre d’animaux inclus dans ces études. Ce projet permettra également de valider l’utilisation de l’imagerie scanner en tant que méthode d’analyse précise et robuste dans les études principales d’efficacité.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 session d’imagerie scanner pour les porcs, brebis et chiens et au maximum 1 session d’acquisition scanner sera réalisé par jour pendant 7 jours pour les lapins (1 session d’imagerie correspond à une anesthésie mais pouvant servir à la réalisation de plusieurs acquisitions scanner dans la foulée pour tester différents paramètres). Au maximum, durant toute l’étude, 5 scanners corps entier pourront être réalisés ou 10 scanners ciblés sur une région afin de minimiser la dose d’irradiation reçue. Une session d’imagerie (anesthésie comprise) durera en moyenne entre 20 et 45 minutes (maximum 1 heure).

Impact sur les animaux

Les brebis, porcs et chiens seront transportés vigiles entre leur EU d’origine et notre EU. L’aller-retour se fera dans la même journée. Ces transports peuvent être une source de stress. Les brebis, porcs et chiens seront mis à jeun avant l’examen scanner. Les animaux recevront une anesthésie en fixe (chien, porc et brebis) ou gazeuse (lapin) afin de réaliser l’imagerie scanner pouvant induire un stress. Lors de cette même anesthésie, un produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observé dans les quelques jours suivant l’anesthésie.

Devenir

Les animaux ayant simplement été utilisés pour des actes d’imagerie non invasives (n’étant pas infectés ou traités avec un traitement pouvant causer des effets secondaires à long terme), les animaux pourront être, après une période de réhabilitation, réintégrés dans une nouvelle procédures expérimentales. Pour les lapins, certains d'entre eux pourront être proposés à l'adoption.

Remplacement

Au cours de ce projet, l'objectif sera de tester la faisabilité de l’imagerie (répondre à la question est-il possible de visualiser et/ou quantifier l’organe/tissu cible ?) chez le lapin, la brebis, le porc ou le chien. Il n'existe donc pas actuellement de méthodes alternatives permettant de modéliser un corps entier ou certains organes/tissues en imagerie scanner afin de tester différents paramètres d'imagerie (paramètres scanner, injection ou non de produit de contraste, ...). L'utilisation d'animaux dans cette procédure expérimentale est donc nécessaire.

Réduction

Le recours à l’imagerie médicale par scanner (CT) permet de suivre, au cours du temps, les mêmes animaux sans avoir à les euthanasier pour réaliser des analyses histologiques par exemple. Ce projet permettra donc à terme, grâce au recours au scanner, de diminuer le nombre d’animaux inclus dans les études d’efficacité finales. L’objectif de ce projet, étant de mettre au point et de tester des protocoles expérimentaux permettant d’obtenir des images scanner exploitables pour répondre à des objectifs scientifiques d’autres projets, entre 1 et 3 animaux par étude seront utilisés (au maximum 12 lapins, 12 brebis, 12 porcs et 12 chiens). Sauf en cas d’atteintes des points limites, les animaux ne seront pas euthanasiés à l’issu de ces actes d’imagerie et seront retournés dans leur établissement d’origine pour les porcs, brebis et chiens. Pour les lapins, ils seront, autant que possible, inclus dans d’autres protocoles expérimentaux ou utilisés dans le cadre de la formation du personnel et/ou adoptés selon la procédure mise en place au sein de notre EU.

Raffinement

Pour les lapins, une période d’acclimatation de 7 jours à minima sera respectée. Ces animaux seront hébergés en groupes, en parc, pendant toute la durée de l’étude (sauf exception : bagarre ou blessure justifiant un isolement de l’animal sur recommandation du vétérinaire) avec des enrichissements appropriés tels que des bâtonnets de bois à ronger, du foin, des balles, une plateforme et cachette. Ils seront suivis quotidiennement afin de détecter précocement tout signe clinique anormal et ainsi mettre en place rapidement des mesures de soutien (désinfection de plaies, isolement, réhydratation …) ou mise à mort en cas d’état clinique irréversible. Les lapins seront pesés une fois par semaine afin de suivre l’évolution de leur poids. La fréquence des pesées pourra être augmentée suivant l’état clinique des animaux et le nombre d’actes d’imagerie réalisé par animal. Une évaluation clinique des animaux sera basée sur différents critères adaptés à l’espèce. Pour les espèces: brebis, porcs et chiens, un transport sera organisé dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur entre les deux EU. Des tapis anti-dérapants seront mis en place. Un contrôle clinique de chaque animal sera réalisé par du personnel qualifié (vétérinaire, technicien ou zootechnicien) au départ et à l’arrivée. Afin de limiter le stress des animaux, une période de repos de minimum 1h sera respectée entre la réception des animaux et l’anesthésie pour les acquisitions scanner, et entre le réveil des animaux et le transport retour. Du gel oculaire de type vaseline ou Ocrygel sera appliquée au niveau de la cornée lors des anesthésies des animaux afin d’éviter tout assèchement oculaire. Une attention particulière sera portée à la lutte contre l’hypothermie : température de la salle, l’animal est placé sur le sol équipé d’un isolant avec des couvertures si besoin. Des lampes chauffantes seront rajoutées si nécessaire. En cas de doute, une mesure de la température rectale sera réalisée.

Choix des espèces

Les espèces (lapins, brebis, porcs et chiens) seront utilisés au stade adulte (à partir de 10 semaines pour les lapins, 4 mois pour les porcs et 12 mis pour les brebis et chiens). Les espèce et les stades de développement ont été choisies en fonction des espèces et des stades de développement qui seront utilisées à la suite de ce projet pour évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. L’adéquation entre les espèces et leur stade de développement de l’étude de mise au point et les études principales d’efficacité ultérieures est indispensable pour éviter tous biais expérimentaux.

Placés en manque d'oxygène de un à vingt-et-un jours et injectés chaque jour sous la peau, 756 rats vont être utilisés dans ce projet, mères gestantes et nouveau-nés compris. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le porteur indique que l'hypoxie peut provoquer des troubles respiratoires, cardiovasculaires et métaboliques, et affirme dans le même temps que les effets "devraient être amoindris" chez ses animaux. Les mises à mort à la naissance, à sept jours et à vingt-et-un jours sont faites par dislocation et par décapitation, une couverture anesthésique n'étant prévue que pour les mères, afin de prélever cœur, aorte, poumons, reins, foie et sang.

Objectifs

L'oxygène est essentiel à la survie, les humains ayant besoin d'au moins 94 % d’oxygène dans leur sang pour un fonctionnement cellulaire approprié. Les malformations cardiaques peuvent perturber la circulation sanguine et l'oxygénation en raison de modifications anatomiques. La malformation la plus courante, touche 1 naissance sur 2 000. Cette condition entraîne des altérations morphologiques du coeur, provoquant une décoloration bleutée de la peau due à un manque d'oxygène dans le sang, communément appelée "bébés bleus", par opposition aux "bébés roses" ayant une concentration normale. Dans d'autres malformations cardiaques congénitales, la saturation peut même descendre en dessous de 30 %. De manière remarquable, ces nourrissons peuvent survivre pendant des semaines, voire des années, avant de nécessiter une intervention chirurgicale, malgré des niveaux d’oxygène dans le sang généralement considéré comme incompatibles avec la vie. Le taux de survie de ces patients est étonnamment élevé. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire expliquant ce phénomène n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. La stimulation d’une une modification protéique a démontré être bénéfique lors d’un manque d’oxygénation du cœur et dans le choc hémorragique. Son importance lors du développement cardiaque a été souligné dans de nombreuses études ainsi que son rôle dans la réponse à l’hypoxie. De plus notre équipe a mis en évidence un switch des niveaux de cette modification au niveau cardiaque entre le jour avant la naissance et le jour de la naissance. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux de cette modification pourrait être bénéfique dans le cadre d’un manque d’oxygénation à la naissance. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication de cette modification dans la transition vie intra utérine et vie extra utérine. (2) Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’adaptation à l’hypoxie.

Bénéfices attendus

Pour vivre l’humains a besoin d'une concentration en oxygène dans le sang d'au moins 94 %. Les nourrissons atteints de malformation cardiaque peuvent avoir une concentration artérielle en oxygène proche de la normale (au-dessus de 90 %) ou considérablement réduite, avec des niveaux tombant jusqu'à 30 % dans les cas graves. De manière remarquable, ces nourrissons peuvent survivre pendant des semaines, avant de nécessiter une intervention chirurgicale, malgré des niveaux d’oxygène dans le sang généralement considéré comme incompatibles avec la vie. Le taux de survie de ces patients est étonnamment élevé. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire expliquant leur capacité d’adaptation n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge de ces patients. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’adaptation au manque d’oxygène natale et 2) identifier des cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subissent 1 unique procédure qui correspond à une hypoxie de 1 à 21 jours. 1 jour avant l’accouplement et jusqu’au sacrifice ou la mise bas les animaux recevront une fois par jour, une injection sous cutanée de NButGT afin d’augmenter les niveaux de O-GlcNAcylation. L’injection est réalisée sur une période de 5 secondes afin de limiter tout stress chez l’animal. L’étude de l’impact structurel et fonctionnel de l’hypoxie +/- O-GlcNAcylation sera réalisée via une échocardiographie d’environs 5min sur les animaux à la naissance et 7 jours de vies. A la fin de cette période, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, aorte, rein, poumons, foie, sang).

Impact sur les animaux

L’injection sous cutanée peut être à l’origine d’une inflammation localisée. Afin de limiter ce risque les sites d’injections seront modifiées chaque jour. De plus tout animal ayant une apparition d’une réaction cutanée, des difficultés respiratoires ou d’une modification de son comportement (léchage, grattage intensif) fera l’objet d’un arrêt du protocole. L’impact de l’hypoxie sur les animaux est très bien décrit dans la littérature. L’hypoxie peut provoquer des problèmes respiratoires, cardiovasculaire, et métabolique. Les animaux étant soumis à une hypoxie pendant 24h à 21 jours les effets observés ici devraient être amoindrit. Chaque signe de détresse de l’animal mettra fin au protocole.

Devenir

A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses.

Remplacement

Le développement cardiaque est un processus complexe et intégré faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque par des approches cellulaire n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’adaptation à la vie extra utérine, le manque d’oxygène et notre modification post-traductionnelle.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 756 animaux.

Raffinement

Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements (tunnel et bâton en bois) sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement dans des grandes cages avec enrichissements (tunnel, frisotis et bâton en bois) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Lors de la mise a morts des animaux, et lorsque cela est possible (mise à mort des mères), une couverture anesthésique sera mise en place. La mise à mort des animaux à 7, 21 jours et à la naissance (J0) ne peut être réalisé respectivement que par dislocation et décapitation. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recourt et qui les maitrise.

Choix des espèces

Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien le lien entre l’adaptation à la vie extra utérine, le manque d’oxygène et notre modification post-traductionnelle. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque, différents stades de développement sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux à la naissance (J0), à 7 jours post naissance (J7) et à 21 jours post naissance, permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque post-natal

Des rates gestantes reçoivent chaque jour une injection sous-cutanée et un gavage de glucose par semaine, après une injection destinée à enflammer les îlots de leur pancréas pour aggraver leur hyperglycémie. 972 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le porteur affirme qu'aucune étude n'a montré d'effet délétère du régime gras et sucré imposé pendant neuf à dix-sept semaines, et indique par ailleurs que la mise à mort des petits à la naissance et à douze jours ne peut se faire que par décapitation et par dislocation, sans couverture anesthésique. Embryons à 15,5 et 20,5 jours de gestation, nouveau-nés, jeunes de douze et de soixante jours : tous sont tués pour prélever cœur, aorte, poumons, reins, foie, sang et placenta.

Objectifs

Les défauts cardiaques et l’hypertrophie cardiaque sont des pathologies cardiaques qui sont trois fois plus fréquents chez les enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale, retrouvée chez les enfants nés d'une maman ayant eu un diabète gestationnel, a longtemps été considérée comme une conséquence de l’élévation du taux d'insuline dans le sang (hyperinsulinémie) retrouvée chez le foetus. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à cette pathologie cardiaque dans ce type de contexte (diabète gestationnel) n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. Une modification des protéines est augmentée lors de l'élévation du taux de glucose sanguin (hyperglycémie) et a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiaque. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux de cette modification protéique associée à une hyperglycémie, pourrait être un facteur causal de l’hypertrophie cardiaque néonatale retrouvée lors d'un diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication de cette modification protéique dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse, (2) Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par cette modification protéique.

Bénéfices attendus

Les défauts cardiaques et l’hypertrophie cardiaque sont trois fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subissent une unique procédure qui correspond à une alimentation standard ou riche en sucre et lipides sur une période de 9 à 17 semaines. Un jour avant l’accouplement et jusqu’au jour dr l'euthanasie ou au jour de la mise bas, les mères recevront une fois par jour, une injection sous cutanée d'un composé pharmaceutique permettant d'augmenter les niveaux d'une modification protéique de manière indépendante de la diète. Une injection unique d'un analogue du glucose (sucre) induisant une réaction inflammatoire des cellules pancréatiques, complétera et exacerbera le phénotype d’hyperglycémie pendant la gestation. L'injection durera 5secondes et sera faite au début de la gestation. Entre la 14ème semaine d’âge et jusqu’à la mise bas, une fois par semaine, des tests de tolérance au glucose oral ainsi que des mesures de glycémie (taux du glucose dans le sang) seront réalisés afin de valider l’intolérance au glucose. Le test de tolérance au glucose orale consiste en un gavage de glucose et au suivi de la glycémie sur les deux heures suivantes. Les mesures de la glycémie sont réalisées par un appareil spécifique, un glucomètre, avec prélèvement d’une goutte de sang à la queue des animaux. L’étude de l’impact structurel et fonctionnel du diabète sera réalisée via une échocardiographie et un électrocardiogramme sur les animaux à 60 jours post naissance. A la fin de cette période, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, aorte, rein, poumons, foie, sang). L'injection répétée sur des femelles gestantes est une procédure validée et maitrisée par l'équipe. Lors des précédentes expérimentations, aucun risque de mise à bas précoce ou de surrisque de canibalisme n'ont été observé et rapporté.

Impact sur les animaux

L’alimentation riche en sucre et gras utilisée dans ce projet est une alimentation très bien décrite dans la littérature. A ce jour, aucune étude n’a démontré une modification délétère du phénotype des animaux nourris avec cette diète sur une telle période. L'injection de notre modulateur pharmacologique peut entrainer une inflammation localisée et celle de notre analogue du glucose induit une réaction inflammatoire des îlots du pancréas. Ces dernières seront surveillées quotidiennement. En outre, s’il y a une inflammation sur le site d’injection, un anti inflammatoire cutané sera utilisé. Le gavage oral de glucose pour faire les tests de tolérance sera effectué en sonde rigide et ce dernier n'a pas d'effets indésirables sur la mère et les petits. La durée d’une gestation entre la 12ème semaine de vie est de 21jours, soit 3 semaines. C’est pour cela que la dernière date de prélèvements des embryons est 20.5 de jours de vie embryonnaire..

Devenir

A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie, le placenta, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses.

Remplacement

Le développement cardiaque est un processus complexe et intégré faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et la modification protéique. Considérant la grande disparité physiologique entre les animaux dans le développement du diabète, une première phase de mise au point de modèle de diabète gestationnel chez l’animal a été nécessaire et effectuée par notre équipe sous une demande préalable . Les animaux de cette saisine ayant validé le modèle, seront réutilisés et viendront compléter nos animaux des groupes contrôles pour ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 972 animaux. Lors de la phase d’analyse, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture classique. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Lors de l'euthanasie des animaux, et lorsque cela est possible (euthanasie des mères, des animaux à 60 jours), une couverture anesthésique sera mise en place. Le sacrifice des animaux à 12 jours et à la naissance (J0) ne peut être réalisé respectivement que par dislocation et décapitation. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recourt et qui les maitrise.

Choix des espèces

Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque, différents stades de développement sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux à 15,5 jours de vie embryonnaire ; à 20,5 jours de vie embryonnaire, à la naissance (J0), à 12 et 60 jours post-naissance (J12 et J60), permet d’obtenir une information complète sur l’impact de notre modification protéique lors du développement cardiaque embryonnaire et post-natal.