Troubles cardiaques

Récupérées parmi les femelles dont d'autres projets n'avaient pas besoin, au lieu d'être tuées au sevrage, 50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasage de la face ventrale sous anesthésie, incision au cou pour atteindre la veine jugulaire et l'artère carotide, injection de nanoparticules, dix minutes d'ultrasons appliqués sur le thorax, sutures, imagerie : une trentaine de minutes par animal. Toutes sont ensuite tuées pour que le cœur soit prélevé et analysé. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à un "organisme entier" pour suivre la distribution des molécules injectées, et qualifie d'"indispensable" la preuve de concept chez le petit animal avant tout passage au gros animal puis à la clinique.

Objectifs

Les arythmies cardiaques ventriculaires sont la principale cause de mort subite cardiaque. Chaque année, environ 250 000 personnes sont victimes de mort subite en Europe. De manière générale, les résultats de l’ablation de tachycardie ventriculaire par cathéters (stratégie actuellement utilisée en clinique) sont mauvais avec environ 50% de récidives. Nous souhaitons développer une méthode permettant de réaliser une ablation combinant différentes stratégies. Pour cela, il est envisagé une délivrance de molécules thérapeutiques encapsulées dans des nanoparticules, facilitée par l’ouverture préalable de pores dans la barrière vasculaire grâce à l’utilisation de microbulles et d’ultrasons, pour permettre aux nanoparticules d’atteindre la cible cardiaque avec une forte concentration et d’ainsi augmenter leur efficacité.

Bénéfices attendus

L’intérêt de la démarche est d’améliorer le pronostic des patients souffrant de tachycardie ventriculaire en traitant sélectivement la région cardiaque responsable de l’arythmie, de façon plus efficace et sécuritaire que les techniques actuelles. De manière plus large, ce projet pourra ouvrir des perspectives d'application au-delà du traitement des arythmies cardiaques ventriculaires (traitement de maladies génétiques, protection du cœur après un infarctus).

Procédures

Tous les gestes potentiellement douloureux seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie (2 maximum par animal). Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale sous anesthésie générale pour des raisons d'imagerie (1 par animal, environ 2min). Des incisions sous-cutanées seront réalisées pour l'analgésie (3 maximum par animal) Des incisions seront réalisées au niveau du cou pour accéder aux vaisseaux (veine jugulaire, artère carotide) afin d’injecter les traitements (2 injections maximum par animal). Un appareil générateur d’ultrason sera appliqué sur le thorax de l’animal afin d’envoyer les ultrasons au cœur (1 par animal, environ 10 min). 3 points de sutures par animal seront réalisés pour suturer l'incision réalisée. Les animaux seront imagés sous anesthésie générale (1 par animal,

Impact sur les animaux

Il s’agit d’une approche impliquant une chirurgie légère (pour accéder à la veine jugulaire et à l’artère carotide), une administration intraveineuse de nanosystèmes non toxiques et l’application ciblée (thorax) d’ultrasons non délétères. Le rasage de la face ventrale de l'animal peut occasionner du stress chez l'animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre le prélèvement du cœur et l’analyse (histologie) des tissus afin de confirmer l’efficacité de la thérapeutique étudiée.

Remplacement

Il est nécessaire de recourir à un organisme entier pour étudier le profil de distribution des molécules injectées et évaluer l'efficacité de l'ouverture de la barrière vasculaire cardiaque par les ultrasons. La preuve de concept sur l’efficacité de cette nouvelle approche sur petit animal vivant est indispensable avant d’envisager des études plus approfondies sur plus gros animal, puis un transfert à la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé au minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables. Le sexe des animaux n’ayant pas d’importance d’un point de vue scientifique dans ce projet, les femelles non-utilisées d’autres projets (dont le sexe d'intérêt sont les mâles) seront utilisés dans ce projet au lieu d’être mises à mort au sevrage.

Raffinement

Durant toute la durée des protocoles, les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Une analgésie sera mise en place avant et après l'étape de chirurgie.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour les études de diffusion des nanoparticules dans le cœur. De plus, ce modèle est parfaitement compatible avec une approche par ultrasons cardiaque.

Une perte de 25 % du poids, ou un score de douleur de huit à neuf sur la grille du laboratoire, déclenche la mise à mort. 313 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome mitochondrial rare, elles sont suivies de la naissance jusqu'à deux ans, avec prélèvements sanguins et urinaires à un, deux, quatre et six mois, tests de force et d'endurance et séances d'IRM et d'échocardiographie sous anesthésie aux mêmes âges. Le porteur attend un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire, et présente ce travail comme l'étape préalable au test de candidats médicaments déjà repérés sur des cellules de patients.

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - les symptômes de la maladie retrouvés dans le modèle murin sont équivalents à ceux retrouvés chez l'homme suggérant qu'un candidat médicament efficace dans le modèle murin le sera également chez l'homme Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

Les souris utilisées sont génétiquement hypercholestérolémiques et développent rapidement des plaques d'athérosclérose dès qu'elles reçoivent un régime gras. Elles sont 2 148, toutes tuées pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pneumonie leur est provoquée par instillation dans la trachée sous anesthésie générale, et le sang est prélevé plusieurs fois par incision de l'extrémité de la queue sur animal éveillé, entre dix semaines et huit mois d'âge. Le porteur annonce une première étape vers la prévention de l'athérosclérose après une pneumonie, et justifie l'effectif en une phrase, un nombre "réduit au minimum" pour permettre une analyse statistique fiable.

Objectifs

Les pneumonies font partie des maladies infectieuses principales, qu’elles soient acquises dans la communauté (comme la grippe ou la COVID-19) ou au cours d’une hospitalisation. Les maladies cardiovasculaires sont quant à elles l’une des causes les plus fréquentes de mortalité dans le monde. Il a été observé que l’incidence des maladies cardiovasculaires augmente après une infection, mais les mécanismes reliant l’un et l’autre n’ont pas encore été mis en évidence. L’idée principale du projet est d’étudier la relation causale entre la progression des maladies cardiovasculaires et les altérations observées suite à une pneumonie au niveau de la réponse immunitaire et de l’ensemble des microorganismes vivant en communauté complexe au sein du poumon. Ceci permettrait d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués et nous permettrait de contribuer, sur une plus grande échelle, à de nouvelles pistes pour mieux identifier les patients à risque, à trouver de nouvelles cibles thérapeutiques, et globalement à améliorer le rétablissement des patients et diminuer l’impact des infections. Notre objectif pour cette partie est de mettre en place et caractériser un modèle murin de pneumopathie dans un contexte de prédisposition aux maladies cardiovasculaires, ici l’athérosclérose, une maladie fréquente et caractérisée par le dépôt d’une plaque essentiellement composée de lipides (aussi appelée athérome) sur la paroi des artères. À terme, ces plaques peuvent entrainer une lésion de la paroi artérielle (sclérose) et conduire à l’obstruction des vaisseaux ou à leur rupture avec des conséquences souvent graves. Pour cela, nous allons : 1) Étudier la réponse de l’hôte à une pneumonie après le développement de plaques d’athérosclérose et d’une hypercholestérolémie, et caractériser le paysage immunitaire pendant et après la guérison de la pneumonie. 2) Étudier la progression des maladies cardiovasculaires après résolution d’une pneumonie et étudier la composition des cellules immunitaires dans les lésions d'athérome Pour ces deux parties, nous chercherons également à identifier les médiateurs immunitaires affectant la susceptibilité à la progression des maladies cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de comprendre comment l'athérosclérose influence la réponse immunitaire des poumons pendant la pneumonie, ce qui contribuera à améliorer les soins aux patients souffrant de maladies cardiovasculaires et d'infections respiratoires. En caractérisant les réponses immunitaires, le projet mettra en lumière les interactions complexes entre l'athérosclérose et les infections pulmonaires, ce qui pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet constitue la première étape pour prévenir la progression de l'athérosclérose et améliorer les résultats du traitement après la pneumonie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Pour toutes les souris, plusieurs prélèvements de sang par une coupure minime à l’extrémité de la queue sera réalisé à différents temps, sur animaux vigiles. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Tous les gestes d’IT, SC et prélèvements sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe sont des modèles entraînant quelques nuisances attendues et contrôlées (type perte de poids et poils hérissés) avec une récupération de l’état général des souris à partir de 2 jours après l’infection. Une petite douleur consécutive à l’instillation intratrachéale peut survenir, due à l’insertion de la sonde de gavage. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) et modérée (environ 10%) est observée, sans perte de motricité. Les souris présentent une hypercholestérolémie et développent une athérosclérose lorsqu’elles sont nourries avec un régime hyperlipidique, sans impact négatif sur la vie de l’animal. Plusieurs prélèvements de sang seront réalisés par incision minime à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles après application d’une crème anesthésiante.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre la réponse immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie et l'athérosclérose nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Celui-ci permet notamment d’évaluer l’aspect physique global (perte poids et état de la peau, présence de plaie), le comportement des animaux (prise d’eau et de nourriture ; absence d’activité et perte de mobilité) et la modification des selles et des urines. Un système de score a été établi en fonction des signes cliniques observés, et selon les résultats obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage est préalablement enduite d’analgésique pour anesthésier localement la trachée. Une crème anesthésiante est utilisée comme anesthésiant local lors des prélèvements sanguins. Les volumes de sang et les temps de récupération ont été définis selon les recommandations (prélèvement inférieur à 7.5% du volume sanguin total et temps de récupération minimal d’une semaine). Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les données déjà générées dans ce projet de recherche. De plus, le modèle murin est le modèle de choix et utilisé de longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme du cholestérol et des maladies cardiovasculaires. Nous disposons d’un modèle de souris hypercholestérolémiques et prédisposées au développement rapide de la plaque d’athérosclérose lorsqu'elles sont nourries avec un régime hyperlipidique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte : ils auront 10 semaines au début des procédures et environ 8 mois à la fin. À ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables et le système immunitaire est mâture. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.

Anesthésiées pour une chirurgie de quarante minutes qui interrompt la circulation dans l'artère fémorale d'une patte, 1 380 souris passent ensuite par cinq à six imageries laser doppler et cinq imageries isotopiques pouvant durer deux heures, étalées sur 21 jours. Une partie reçoit en plus des injections abdominales ou des gavages, jusqu'à deux fois par jour pendant trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur énumère les atteintes possibles : douleur, œdème douloureux du membre, infections, incapacité à se servir de la patte, irritations de l'œsophage liées au gavage. Celles qui vont au bout sont tuées pour prélever leurs tissus, et 88 souris qui n'auront pas perdu la vascularisation de leur patte pourront être réutilisées dans un autre projet.

Objectifs

La maladie artérielle périphérique (MAP) se définit comme un blocage partiel ou total d’une artère causé par une accumulation de lipides dans la paroi des vaisseaux artériels se situant en périphérie de l’aorte. Elle est généralement provoquée par un durcissement des artères (athérosclérose). La MAP représente un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Malgré les progrès réalisés dans la prévention des facteurs de risque (tabac, diabète, obésité…) et dans les techniques interventionnelles et chirurgicales (pontage, stents…) pour améliorer la perfusion des membres inférieurs, une partie importante des patients atteints sont considérés comme « non répondeurs » pour la revascularisation et ont un pronostic particulièrement défavorable avec des taux élevés de mortalité et d’amputation des membres. En conséquence, l’identification de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter cette complication invalidante est d’un intérêt critique. Le but de ce projet est d’évaluer soit de nouveaux radiotraceurs qui permettraient un meilleur suivi ou détection des processus de réperfusion (recrutement des petits vaisceaux autour ou créations de nouveaux vaisseaux permettant la revascularisation du membre inférieur), soit d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats-médicaments sur un modèle murin d’ischémie de la patte par arrêt de la circulation dans l'artère fémorale de la patte.

Bénéfices attendus

Le diagnostic et le traitement précoces, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à améliorer la qualité de vie des patients en réduisant les symptômes associés et en augmentant l’efficacité des traitements. L’utilisation de nouveaux traceurs permet de détecter le site d’ischémie et facilite la prise en charge rapide des traitements, en augmentant les chances de bon pronostic des patients. Les traceurs développés grâce à la recherche en imagerie médicale offrent une précision supérieure dans la détection du site ischémique. Cela permet aux médecins de cibler plus précisément les zones affectées, réduisant ainsi les dommages aux tissus sains environnants.

Procédures

Les animaux auront : une chirurgie (1 fois, durée 40 minutes max, sous anesthésie générale), des imageries laser doppler (5 à 6 fois sur 21 jours, durée :5 min ; sous anesthésie général), des imageries isotopiques (5 fois sur 21 jours, durée maximum 2h ; sous anesthésie). Une partie des animaux auront également des injections de médicaments soit par injections abdominal soit par gavage (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours , durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2min).

Impact sur les animaux

Pendant les procédures décrites dans cette saisine, les animaux sont passibles d’expérimenter ce qui suit : • Douleur et inconfort : la chirurgie pourra provoquer une douleur due au manque d'oxygène et de nutriments dans les tissus affectés. Cela peut aussi entraîner une diminution de l'appétit chez l'animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entrainer un stress dû aux contentions répétées de l’animal ainsi que des irritations de l’œsophage et des problèmes de déglutition dans les cas des gavages. Les traitements répétés par injections peuvent entrainer des petites plaies cutanées. • Problèmes circulatoires et œdème : le manque de circulation peut entraîner une accumulation de liquide dans les tissus, provoquant un gonflement douloureux et une altération de la fonction des membres affectés. • Infections : en raison de la chirurgie, les tissus ischémiques sont plus sujets aux infections en raison de la réduction de l'apport sanguin et de la réponse immunitaire locale ; ça peut entrainer aussi une dégradation de la peau et du pelage dans le cas des infections cutanées. • Difficulté de locomotion : les animaux dont la patte n'est plus correctement vascularisé peuvent présenter une difficulté ou une incapacité à utiliser leur patte. Cela peut réduire leur capacité à se déplacer librement ou à chercher de la nourriture. • Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps.

Devenir

Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort de afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations ex vivo et in vitro. Les animaux qui n'auront pas développé de perte de la vascularisation de la patte et qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisé dans un autre projet.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent l’utilisation de modèle complexe. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative in vitro ou in sillico qui permet d'avoir une vision complète des grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’Homme. L’ensemble des candidats radiotraceur et des candidats médicament, qui seront testés dans ce projet, auront été préalablement évalués pas des études in vitro pour leur ciblage spécifique et leur efficacité.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé aux maximums tout en assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé les effectifs à l’aide d'un logiciel de statistique G*Power. Pour l’évaluation de nouveaux traceur radioactif, le marquage spécifique dans la patte avec le blocage artériel sera comparé avec la patte en controlatérale (saine), chaque animal sera donc son propre contrôle. Pour la partie sur le développement de nouveaux candidat médicament, nous réaliseront sur 5 groupes distincts une série de 5 mesures répétées sur les mêmes animaux grâce aux imageries in vivo permettant de visualiser les traceur radioactif et permettant de faire des études longitudinales. Nous analyserons les données à l'aide de tests statistiques multiparamétriques.

Raffinement

Les chirurgies, les injections par voie veineuse et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale et générale par injection sous cutanée de morphinique . Pendant une heure après la chirurgie, une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post- opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Les périodes de traitements sur animaux vigiles seront précédées d’une semaine d’habituation à la contention pour diminuer le stress lors des expérimentations. Les gavages se feront avec sonde de nutrition vétérinaire adaptée aux souris. L’embout est arrondi pour ne pas endommager les parois de l’œsophage et de l’estomac et l’on attend que la souris avale le bout de la sonde (sans forcer) pour éviter les fausses routes. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement classiques ; animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et à l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12 h ; seront enrichies en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de bâtons ou boules en bois pour faire les dents, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le modèle d'ischémie des membres inférieurs chez la souris est bien documenté et a fait l'objet de plusieurs publications dans notre équipe. Notre modèle d’ischémie des membres inférieurs se fait chez le jeune adulte. Les animaux arriveront dans l’animalerie à 6 semaines (poids compris entre 25 et 35 g en fonction du sexe) et la chirurgie sera faite dans leur 8e semaine (poids compris entre 27 et 40 g). À la fin du protocole, les souris devraient peser entre 28 et 45 g.

Huit disques de péricarde bovin sont implantés dans les muscles de chaque jeune lapin de huit semaines, et y séjournent deux à trois mois. 144 lapins vont être utilisés sur trois ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués par injection intracardiaque pour récupérer les disques. Le porteur signale des douleurs postopératoires dans la zone lombaire et un hébergement individuel qu'il reconnaît comme source de stress. Multiplier les implants par animal est présenté comme une mesure de réduction des effectifs, ce qui revient à concentrer sur chaque lapin ce qui aurait été réparti sur plusieurs.

Objectifs

Un cœur sain bat environ 100 000 fois par jour pour alimenter l’organisme avec un sang riche en oxygène. Le cœur se compose de quatre cavités : 2 oreillettes (droite et gauche) ; deux ventricules (droit et gauche) et de quatre valves. Lorsque les valves cardiaques fonctionnent normalement, elles assurent un écoulement efficace du sang entre les cavités du cœur. En revanche, les valves malades ne peuvent pas s’ouvrir ou se fermer correctement, et finissent par se rigidifier et se calcifier progressivement. Le traitement de choix pour les patients est le remplacement de la valve cardiaque par une valve artificielle mécanique ou par une bioprothèse valvulaire d’origine animale. Les bioprothèses valvulaires d’origine animale sont composées de péricarde bovin ou porcin. La mise au point des techniques pour leur préservation a révolutionné les indications de remplacement valvulaire en clinique humaine. De nombreuses études ont démontré les avantages significatifs des bioprothèses valvulaires par rapport aux prothèses mécaniques, en particulier la diminution du risque de maladie thromboembolique et donc l’absence d’utilisation d’anticoagulants avec une morbidité et une mortalité per-opératoire et post-opératoire moindres. Néanmoins, l’une des limitations principales à l’utilisation des bioprothèses valvulaires, est la survenue plus ou moins tardive de calcifications, c’est l’inconvénient majeur nécessitant un nouveau remplacement valvulaire. L’objectif de ce projet est de modifier les traitements de la bioprothèse valvulaire, afin de diminuer les calcifications qui apparaissent après implantation chez l’homme et de prolonger la durée de leur fonctionnement. Ces nouveaux traitements seront testés et analysés après implantation intramusculaire de péricarde bovin chez les jeunes lapins âgés de 8 semaines. Pour ce projet, 144 jeunes lapins seront nécessaires pour une durée de 3 ans. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail vont nous permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes de calcification et une meilleure sélection parmi les différents traitements chimiques proposés. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie. Il s'agit d'une implantation intramusculaire de disques de péricarde bovin pendant 2 à 3 mois. La durée de l'intervention est de 10 minutes par lapin. 2) Deux injections intramusculaires pour l'anesthésie et l'analgésie avant la chirurgie d’implantation. 3) Une injection intramusculaire pour l'anesthésie et une injection intracardiaque pour la mise à mort avant la chirurgie d’explantation.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont le stress et les douleurs associés aux injections des anesthésies et potentielles douleurs post-opératoire dans la zone lombaire après la chirurgie. L'hébergement individuel est une source de stress.

Devenir

La mise à mort des lapins avant l’explantation de péricarde est nécessaire pour récupérer les disques afin d'effectuer des tests, dosages et immunohistochimie.

Remplacement

L’étude de la prévention de la calcification des bioprothèses valvulaire nécessite le recours aux animaux. Il n’existe pas de modèle in vitro capable de réunir tous les facteurs biologiques, immunologiques ou mécaniques responsables de la calcification des bioprothèses.

Réduction

La diversité des traitements et des tests nécessite un grand nombre de groupes tests et chaque groupe doit contenir un grand nombre d’échantillons nécessaires pour nos études statistiques. Dans l’intention de réduire le nombre d'animaux au maximum, chaque jeune lapin recevra 8 disques de tissu péricardique. Le nombre des jeunes lapins par groupe a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique adaptée. Cela permet de comparer les moyennes de calcification de chaque groupe, tout en prenant en compte le fait qu'un même animal puisse avoir plusieurs groupes.

Raffinement

Pour réduire la douleur, souffrance ou angoisse ressenties par les jeunes lapins : notre étude sera effectuée sous anesthésie générale profonde et l’injection intra musculaire d'un analgésique. Les lapins sont hébergés dans des cages (portoirs de 3 cages), avec un accès à l’eau et à la nourriture en granulé sans restriction et dans un milieu d'enrichissement adapté. Durant toute la procédure nous surveillerons les animaux. La surveillance sera quotidienne durant toute la période d’implantation plus la visite hebdomadaire d’un vétérinaire. Des points limites ont été définis et leur atteinte entrainera la mise mort du lapin.

Choix des espèces

Les calcifications observées chez le lapin correspondent à celle observées chez l’homme, ainsi le lapin est le modèle préférentiel pour cette étude. Pour l’implantation en intramusculaires chez le jeune lapin, nous utiliserons de jeunes lapins de 8 semaines ± 1 semaine, à cet âge les processus de calcification sont plus rapides que chez l’animal adulte, ce qui permet d’écourter l’expérimentation

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant des mois une eau contaminée au césium, reçoivent pour certaines un régime riche en lipides, subissent jusqu'à sept échocardiographies de trente minutes sous anesthésie, des jeûnes de douze heures en cage individuelle, et jusqu'à vingt minutes en tube de contention pour la mesure de leur radioactivité. L'objet est de chercher un seuil de dose à partir duquel apparaissent des atteintes des petits vaisseaux du cœur et du cerveau, en simulant l'exposition de personnes vivant sur un territoire contaminé après un accident nucléaire. Le porteur écrit que ni le césium ni le régime gras n'entraînent "de douleur ni d'effet secondaire pour les animaux", alors que les 104 souris sont toutes déclarées en souffrance modérée.

Objectifs

L’objectif de notre étude est d’identifier la réponse de la microvascularisation cardiaque et cérébrale à une contamination interne chronique à des doses faibles à modérées de RI, associée ou non à un facteur de risque tel qu’un régime riche en graisse. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sur les troubles moléculaires, physiopathologiques, phénotypiques et fonctionnels cardiaque et cérébral sera réalisée. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition interne unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur les vaisseaux du cœur et du cerveau seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur la microvascularisation (cardiaque et cérébrale), et permettra l’apport de nouvelles connaissances sur l’effet de faibles doses sur la microvascularisation cérébrale très peu étudié auparavant sur un modèle pré-clinique.

Procédures

Les animaux seront exposés en chronique à des faibles doses internes de rayonnements ionisants (Césium à une concentration de 500 KBq/L déjà utilisés dans des projets passés). Certains lots recevront un régime alimentaire riche en lipides pendant toute la durée de l’étude. Pour les échocardiographies (10 animaux par lot soit 40 animaux), elles sont non invasives et effectuées sous anesthésie (au maximum 7 échographies par animal, durée maximale par échographie de 30 minutes). Pour les tests métaboliques (10 animaux par lot soit 40 animaux) : - 1 administration orale ou 1 administration intrapéritonéale selon le test, - 7 ou 8 prélèvements d’une goutte de sang à la queue (suffisant pour la mesure avec l’aide d’un glucomètre) sur animal vigile. Ce type de prélèvement dure 3 à 4 secondes. - ou 1 prélèvement de 75 microlitres de sang sous anesthésie Ces tests nécessitent une mise à jeun au préalable (avec eau à disposition) en hébergement individuel pendant maximum 12 heures. Pour les mesures de zooradiamétrie (10 animaux par lot soit 26 animaux), la mesure se fait sur animal vigile maintenu en tube à contention (temps maximum en tube à contention 20 min). L’ensemble des prélèvements sera réalisé en terminal.

Impact sur les animaux

L’exposition à de faibles concentrations de Césium dans l’eau de boissons (débit de dose 6µGy/h), de même que le régime gras (modérément riche en lipides) n’entrainent pas de douleur ni d’effet secondaire pour les animaux. Seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observées à long terme. L’ajout d’un régime riche en graisse n’impacte pas le bien-être des animaux. Cela peut pour les temps longs les faire prendre du poids. Il peut exister un inconfort au point d’injection lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline et un stress lié à la contention des animaux lors de prélèvements de sang en vigile ou lors des mesures de zooradiamétrie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique, il est de plus très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.

Réduction

Au total, 104 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 26 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 20 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs (4 à 5 souris par cage) et l’isolement est évité. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. En cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies quotidiennement. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite.

Choix des espèces

Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies microvasculaire (raréfaction au niveau cardiaque ou cérébrale) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature.