Troubles cardiaques
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Fonction cardiaque (hémodynamique et rythme)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 1000
Cochons d'Inde : 1000
Lapins : 180
Chiens : 300
Cochons : 200
3 180 animaux non-humains, souris, rats, cobayes, lapins, chiens et cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. On leur pose des cathéters et des électrodes ou un implant de télémétrie, sous anesthésie, pour enregistrer l'effet de nouvelles molécules sur le cœur avant leur passage chez l'humain. Le porteur indique que 1 750 de ces animaux, soumis à des procédures modérées, peuvent être réutilisés après accord du vétérinaire, tandis que 1 430 sont tués sans réveil. Il conclut que les tests in vitro et in silico ne remplacent pas l'évaluation dans un organisme intact.
Objectifs
Dans le cadre des études précliniques, les nouvelles molécules en voie de développement doivent être étudiées pour leur efficacité par rapport aux cibles thérapeutiques visées. Quel que soit le contexte d’étude de ces nouvelles substances, une difficulté majeure liée aux études de pharmacologie préclinique est de disposer de modèles suffisamment sensibles et/ou prédictifs afin de garantir la pertinence des résultats expérimentaux par rapport à l’utilisation thérapeutique des futurs médicaments. Les études précliniques menées dans le cadre réglementaire de la Pharmacologie de Sécurité ont pour objectifs de déterminer les effets secondaires possibles de nouvelles molécules en développement, avant ou au moment de leur passage en phase clinique et en vue de l’obtention de leur autorisation de mise sur le marché. Les études précliniques doivent au minimum étudier les possibles effets indésirables des nouveaux médicaments sur les trois systèmes vitaux que sont le système nerveux central, le système cardiovasculaire et le système respiratoire. Au niveau du système cardiovasculaire notamment, il est capital de pouvoir dépister toute molécule pouvant présenter un risque arythmogène, détectable par l’allongement de l’intervalle QT. En effet, de nombreux médicaments, anciens ou nouveaux, ont dû être retirés du marché suite à un taux de mortalité inquiétant constaté après administration chez des patients ayant développé des arythmies cardiaques. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets cardiovasculaires de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes des effets secondaires.
Bénéfices attendus
Les modèles mis en place ont pour objectif d’évaluer les effets pharmacologiques principaux de substances en développement par rapport aux cibles thérapeutiques visées ou de s’assurer que ces substances n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus avant leur passage chez l’homme. Ils entrent comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnés avec attention dans des tests in vitro.
Procédures
Dans les modèles anesthésiés, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Des cathéters et/ou électrode (électrocardiogramme ou ECG) sont positionnés dans/autour d’artères/veines et/ou en sous cutané, pour la mesure de paramètre cardiovasculaire (pressions, fréquence cardiaque, débit sanguins/cardiaque, ECG). Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (juste avant l'euthanasie). La procédure sous anesthésie n'excède généralement pas 2 heures (rat, cobaye, lapin) ou 6 heures (chien, porc) et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Dans les modèles éveillés, les animaux sont dans une première phase équipés (sous anesthésie) d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continu de paramètres cardiovasculaires (pressions, fréquence cardiaque, ECG) par cathétérisme des lits artériels d’intérêt (ou d’une cavité cardiaque) et positionnement d’électrodes pour l’ECG. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum chez les petits animaux et deux semaines au minimum chez les gros animaux), les paramètres sont enregistrés en continu avant (baseline d'au moins 1 heure) et après administration de la substance à évaluer (classiquement 24 heures par session). Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires.La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (classiquement 2 maximum par 24 heures, volume et fréquence adaptés à l'espèce) peuvent être réalisés (animal vigile ou anesthésié) pendant le test et/ou en fin de test, selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée à l’administration des substances. Dans les modèles éveillés, certaines périodes d'hébergement en cage individuelle (avec enrichissement) sont cependant nécessaires: 1) pendant la phase de récupération post-chirurgicale, afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères (généralement pour un période d'une semaine); 2) pendant les mesures (généralement un peu plus de 24h), car soit le système de télémétrie ne fonctionne qu'avec une fréquence d'émission des signaux (petits animaux, un hébergement groupé ne permet donc pas d'identifier la source d'émission d'un signal ; interférence entre les implants), soit les animaux ne reçoivent pas le même traitement ce qui nécessite l’isolement pour éviter les contaminations croisées et donc un biais dans l’interprétation des résultats de l’étude. Lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit…).
Devenir
Pour les procédures modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisables.
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés (ou même requis d'un point de vue réglementaire). Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les effets dans un environnement biologique et physiologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement par rapport à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison). Dans les procédures mises en place chez l'animal anesthésié et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Dans les procédures mises en place chez l'animal éveillé et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nos analyses statistiques (basées sur des analyses de variances et test de Dunnett) indiquent qu’un effectif de 4-8 animaux par groupe (nombre de groupes variables, 2 en standard) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux issus des procédures chez l’animal éveillé (étude par télémétrie) sont également réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subis de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur la fonction cardiaque de rongeurs (rats, souris), de lapins, de cobayes, de chiens ou de porcs est prédictif de leur efficacité et/ou inocuité en clinique. Principalement rongeurs, cobayes et lapins sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques. Chiens adultes et porcs sevrés, conformément aux données historiques.
Evaluation de l’utilisabilité d’un dispositif médical d’analyse des caillots dans le traitement des AVC par thrombectomie
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
23 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil, chaque intervention durant de quatre à huit heures. On leur implante des caillots dans les vaisseaux et on y navigue un guide instrumenté, pour tester un dispositif d'analyse des caillots destiné à la thrombectomie de l'AVC. Le porteur indique viser le marquage CE et l'autorisation FDA, soit une finalité commerciale et réglementaire. Il décrit avoir écarté les essais in vitro, ex vivo et in silico et juge le test sur l'animal "essentiel".
Objectifs
Le projet vise à développer et valider pour l’utilisation clinique un dispositif médical, un guide intelligent, qui aidera les médecins dans le traitement des Accidents Vasculaires Cérébraux (AVC) par trombectomie.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est d’améliorer la prise en charge des patients avec AVC ischémique éligibles à la thrombectomie. Les résultats obtenus sur animaux, en complement d’une étude de recherche clinique, seront directement utilisés pour améliorer la performance de détection du guide vasculaire instrumenté et seront inclus dans le dossier technique réglementaire en vue de l’obtention du marquage CE pour une autorisation de mise sur le marché en Europe, de même pour les USA (FDA).
Procédures
Chaque animal est anesthésié et soumis à une chirurgie sans réveil de 4 à 8 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles pour les animaux sont en lien avec l’intervention chirurgicale : -Anesthésie : nausées et désorientation pendant l’induction, apnée pendant l’intubation, hyperthermie maligne (hypersensibilité aux gaz halogénés d’origine génétique). -Pose de cathéter artériel : saignement, hématome. -Navigation endovasculaire et injection de caillots : vasospasme, occlusion vasculaire, saignements.
Devenir
les animaux sont mis à mort à la fin de l'opération, sans réveil de l'anesthésie. Des prélèvements post mortem sont réalisés à des fins d'analyses histologiques.
Remplacement
Avant de débuter ce projet, toutes les possibilités de méthodes alternatives ont été étudiées et prises en comptes. Des études in vitro ont permis de confirmer la possibilité de discriminer des thrombi de différentes compositions. Cependant, il est impossible de reproduire au laboratoire des conditions vasculaires physiologiques, notamment vis-à-vis de l’interaction entre le thrombus et la paroi artérielle (friction entre le thrombus et la paroi, interactions cellulaires et moléculaires, contraintes spatiales, flux perturbé autour du caillot). Ces paramètres sont tous susceptibles de modifier la mesure électrique effectuée par le capteur. De plus, des données préliminaires laissent penser que le guide se positionne entre la paroi artérielle et le thrombus, augmentant la complexité de la mesure réalisée par le capteur puisqu’il doit être capable de distinguer les deux signaux provenant des deux tissus, et ce à quelques microns près. Des expériences d’artères cultivées ex vivo ont été réalisées mais ne sont pas satisfaisantes, en particulier vis-à-vis de la physiologie endothéliale. Des analyses in silico ont été réalisées pour simuler la portée des mesures électriques mais sont d’une efficacité limitée pour la prise en compte systémique des interactions biologiques, biochimiques et mécaniques entre la paroi et le caillot. Il est donc essentiel de tester les performances du capteur in situ en vue d’une utilisation efficace chez le patient.
Réduction
Le nombre total d’animaux nécessaires pour cette étude est de 23. Les données in vitro ont permi d'établir le nombre minimal de mesures nécessaires pour une efficacité satisfaisante de classification des caillots avec une approche statistique basée sur des méthodes d’apprentissage machine. L’effectif animal a été réduit au mieux en exploitant plusieurs artères, en augmentant le nombre de caillots implantés par sujet et en testant plusieurs fois les dispositifs avec des médecins différents sur un même animal, sans réveil à l’issue de l’intervention.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe social dans de larges box enrichis de jeux à macher et de balles, ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les conditions d’ambiances sont contrôlées et la température est maintenue entre 18 et 24°C. Une période d’acclimatation de quelques jours permet aux animaux de s’habituer à leur environnement et au personnel soignant qui met en place un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses. Le jour de l’intervention, les porcs sont tranquillisés avant d’être transportés dans la salle d’opération, ils sont maintenus sous anesthésie générale avec gestion de la douleur pendant toute la procédure. Des points limite sont établis pour arrêter l'intervention en cas de souffrance de l'animal.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales, le porc est celle dont les paramètres physiologiques cardiovasculaires sont les plus proches de l’Homme : fréquence cardiaque de 90-110 batt/min contre 60-100 chez l’Homme, pression aortique systolique de 90-120 mmHg contre 100-140 chez l’Homme, dimensionnement du système vasculaire comparable. De ce fait, le porc est largement reconnu comme modèle de choix pour toutes les études cardiovasculaires. De plus, la composition du sang de porc est très similaire à celle de l’Homme, permettant des mesures électriques similaires. Les porcs seront utilisés à un poids compris entre 20 et 25 kg. En effet, la taille de leurs carotides sera ainsi proche de celle des artères cérébrales humaines que l'on veut mimer pour l'AVC, soit 2 mm environ.
Développement d’un vecteur AAV de thérapie génique plus efficace dans le cadre du traitement de l’hémophilie B.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie, génétiquement modifiée pour être hémophile, saigne spontanément, et toutes reçoivent une injection de vecteur viral puis jusqu'à douze prélèvements de sang par sectionnement du bout de la queue. Le projet cherche à mettre au point des vecteurs AAV plus efficaces contre l'hémophilie B et d'autres maladies du foie. Le porteur affirme qu'après un tri sur cultures de cellules il faut mesurer l'efficacité sur un "organisme entier" capable de réagir au traitement.
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie génétique due à un déficit du facteur de coagulation IX (FIX). L’incidence est de 1 à 2 cas pour 25 000 naissances. Elle est causée par des mutations du gène F9, qui se trouve sur le chromosome X. La fabrication de la protéine appelée facteur IX de la coagulation va être endommagée. Chez une personne saine, cette protéine est produite dans le foie et va être relachée dans la circulation sanguine. Elle joue un rôle essentiel dans le système de la coagulation: elle permet de former des caillots sanguins en réponse à une blessure. Quand le gène F9 est muté, la quantité de facteur de coagulation IX est réduite dans la circulation sanguine, ce qui empêche la coagulation normale du sang et provoque des épisodes de saignements excessifs. Actuellement, le traitement principal est un traitement de substitution qui consiste à administrer par voie intraveineuse des concentrés de FIX purifiés ou du FIX recombinant. Cependant ces traitements ont plusieurs inconvénients tels que les infusions répétées par intraveineuse. Le but de ce projet est de développer des outils plus performants lors de traitement par thérapie génique AAV de maladies hépatiques, telles que l'hémophilie B. Pour cela, on veut développer des capsides AAV (« boite de transport du médicament ») et des promoteurs (permet l’expression du médicament dans un tissus particulier) spécifiques du foie ce qui nous permettra d'augmenter la stabilité du gène médicament au cours du temps et ainsi éviter les problèmes de réaction immunitaire. Pour se faire, nous avons réalisé des modifications de capsides AAV, pour augmenter la spécificité du vecteur pour les cellules du foie. Parallèlement, nous allons tester différents promoteurs pour définir ceux qui permettent une efficacité supérieure à notre contrôle. Grâce à cela, nous réaliserons des combinaisons pour essayer de rendre synergiques les effets. Le but final étant de trouver un candidat thérapeutique qui permet une expression à long terme de notre gène médicament dans un contexte de maladie hépatique, comme l'Hémophilie B, mais adaptable à d'autres maladies hépatiques.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet et de développer de nouveaux outils de traitement des maladies hépatiques. Ces outils permettront au traitement d’être plus efficace, plus stable, moins et moins couteux. Ces outils développés seront directement applicables pour améliorer le traitement de l’hémophilie, déjà existant.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection de vecteurs AAV en début de protocole, puis à différents prélèvements de sang hebdomadaires (J1, J7, J14, J21, J28) ou mensuels (M1 à M12).
Impact sur les animaux
Nuisances souris WT : 1 injection IV (J0), 5 prélèvements sanguins hebdomadaires (J1, J7, J14, J21, J28) pendant 1 mois, clip tail. Nuisances souris KO : Souris au phénotype dommageable (saignement), 1 injection IV (J0), 5 prélèvements sanguins (J1, J7, J14, J21, J28) pendant 1 mois pour l'étude à court terme ou 12 prélèvements sanguins (de M1 à M12) pour l'étude à long terme, clip tail. Pour les deux phénotypes : Stress au moment de l'injection ou des prélèvements.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer le foie pour les analyses.
Remplacement
Afin de limiter au maximum l'utilisation du modèle animal, nous avons réalisé un premier tri parmi notre liste de candidats (vecteurs viraux AAV) grâce à l'utilisation de culture cellulaire de foie humain. Néanmoins, nous devons approfondir ces résultats en mesurant l’efficacité de ces traitements sur un organisme entier, pouvant réagir contre ce traitement (par exemple, à cause de la réponse immunitaire) et également mesurer son efficacité de traitement sur une maladie hépatique.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 612 souris). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la première étape n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes. De même, si le nombre de candidats efficace est inférieur à ce dont nous avons prévu, moins de souris seront utilisées. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (486 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Les souris seront maintenues en élevage en nombre réduit par cage afin de limiter les bagarres entre souris, pouvant entrainer des blessures et saignement (4 souris par cages). Les souris seront observées régulièrement : les souris dominantes seront isolées, les souris blessées seront soignées (plaies désinfectées et cautérisées) pour éviter les hémorragies. Si une hémorragie ne peut pas être stoppée, la souris sera euthanasiée afin d'éviter des souffrances inutiles. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisée.
Choix des espèces
Les souris hémophiles présentent une activité de coagulation réduite conduisant à des hémorragies spontanées dans les tissus du coussinet plantaire et des hémorragies sous-cutanées. Ce modèle de souris hémophile est très proche de la maladie humaine. Les souris malades sont viables, fertiles et de taille normale. Nous utiliserons des souris mâles adultes, car c'est une maladie qui touche uniquement les males (souris ou humains). Les souris adultes seront injectées entre 6 et 8 semaines de vie, ce qui correspond à un âge adulte pour la souris, et nous permettra de comparer avec l’âge des adultes que nous souhaitons traiter.
Evaluation du potentiel anti-thrombotique d’anticorps antiplaquettaire dans le cas de formation de thrombi occlusifs
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
336 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Chacune subit une chirurgie au cou, l'induction d'un caillot dans l'artère carotide par électrolyse de la paroi du vaisseau, puis 40 minutes d'imagerie de fluorescence. Le porteur teste si un anticorps ciblant les plaquettes empêche la formation d'un thrombus occlusif, dans la perspective d'un futur essai clinique. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité du processus et que les plaquettes, cellules sans noyau, ne peuvent être cultivées.
Objectifs
Lors d'un saignement les plaquettes s'accumulent au niveau de la lésion formant un clou hémostatique qui stoppe l’hémorragie. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à la formation d'un thrombus entrainant l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Un nouvel agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité chez l’homme dans le cadre d’un essai clinique. Nous avons récemment observé que cet agent entraine une désagrégation d’un thrombus plaquettaire non occlusif. Ce projet vise à déterminer si cet agent est également capable de prévenir la formation d’un thrombus occlusif dans l’artère carotide chez la souris. Cette étude pourrait suggérer qu'un tel agent soit particulièrement efficace pour traiter la thrombose artérielle occlusive et ainsi justifier l’utilisation de cet agent pour un futur essai clinique chez l’homme et pour de nouvelles indications thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur deux aspects différents : •Premièrement l'agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité anti-thrombotique lors d’un essai clinique en prévention d’AVC (Accident Vasculaire Cérébral). Nous souhaitons poursuivre l’étude de l’effet de cet agent dans le cas cette fois ci de thrombus occlusif plus sévère pour proposer de nouvelles indications. •Dans un deuxième temps si les résultats sont encourageant, une étude clinique pourra être envisagée sur des patients souffrant d’un thrombus occlusif.
Procédures
L’ensemble de la procédure expérimentale est réalisée sous anesthésie générale plus anestésie locale de la peau au moment de l’incision et elle est sans réveil. Tous les animaux subiront : • Une anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale de la peau. • Une injection d’un mélange d’un anticorps anti-fibrine couplé à un fluorochrome d'un marqueur fluorecent des plaquettes • Tonte de la face ventrale du cou et nettoyage de la peau • Induction du thrombus par electrolyse à la paroi externe du vaisseau • Imagerie par macroscopie de fluorescence pendant 40 min
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long de la procédure. La procédure expérimentale comprenant une chirurgie au niveau du cou de la souris sera réalisée sous anesthésie générale et anesthésie locale au moment de l’incision de la peau. A l’issu de l’expérience, les animaux anesthésiés seront mis à mort.
Devenir
Le projet porte sur l’étude de l'effet d'un anti-thrombotique dans le cas d'un thrombus occlusif au niveau de l'artère carotide, en conséquence les animaux ne peuvent pas être garder en vie à l'issu de l'expérimentation.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’inhibiteurs dans un processus complexe et intégré qu’est la désagrégation plaquettaire. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum. Les groupes expérimentaux seront comparés en utilisant des tests statistiques pertinents permettant d’évaluer le potentiel anti-thrombotique d’anticorps antiplaquettaire dans le cas de formation de thrombi occlusifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un antalgique sera administré au niveau de la zone de chirurgie. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique : •Exprimant la Glicoprotéine VI humaine permettant de tester des anticorps humain chez la souris. •N’exprimant pas la protéine Glicoprotéine VI permettant d’évaluer l’importance de la glicoprotéine dans la formation de thrombus occlusif. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. L’expression de la Gliprotéine VI humaine n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles sauvages. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.
Fonction cardiaque (hypertension)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
1 800 rats vont être utilisés dans des procédures menées en partie sous anesthésie sans réveil, en partie avec un niveau de souffrance modéré, 100 étant réutilisés et les autres tués. Ils servent à tester des candidats médicaments contre l'hypertension pour le développement préclinique de produits pharmaceutiques, certains subissant une néphrectomie, la pose d'un clip sur une artère rénale ou une ligature du canal biliaire sous anesthésie. Le porteur indique que le modèle de ligature biliaire provoque une jaunisse puis une ascite, et que le modèle d'hypertension pulmonaire entraîne une dégradation de l'état général et une perte de poids rapide, les rats étant tués avant les stades les plus avancés. Il affirme que les tests in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent "entièrement suppléer" les modèles animaux.
Objectifs
L’hypertension artérielle (HTA) est l’un des principaux facteurs de risque cardiovasculaire, c’est-à-dire qu’elle augmente fortement les risques de développer des complications cardiovasculaires (AVC, infarctus du myocarde, insuffisance rénale, artériopathie des membres inférieurs…). Dans 90% des cas, l’origine de l’hypertension est inconnue, elle n’a pas une seule cause directe mais est souvent multifactorielle. Si l’HTA systémique est la plus connue, une hypertension peut également apparaitre plus spécifiquement au niveau pulmonaire ou portal. L’HTA pulmonaire constitue une complication courante des maladies cardiopulmonaires. Les patients atteints d’HTA pulmonaire développent une hypertrophie ventriculaire droite et à long terme une insuffisance cardiaque. L’hypertension portale (HTP) résultant d’une augmentation des résistances intra-hépatiques est une complication courante des maladies chroniques du foie et constitue une des causes entrainant la mort de patients atteints de pathologie du foie. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments par la réduction de différentes formes d'hypertension et de leurs conséquences.
Bénéfices attendus
Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter l’hypertension systémique, pulmonaire ou portale, et leurs conséquences. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnés avec attention dans des tests in silico, in vitro ou ex vivo.
Procédures
Dans les modèles anesthésiés, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Des cathéters et/ou électrodes (électrocardiogramme) sont positionnés dans des artères/veines et/ou en sous cutané respectivement, pour la mesure en continue de paramètre cardiovasculaire (pressions, fréquence cardiaque, ECG). Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (immédiatement avant l'euthanasie). La procédure (sous anesthésie) n'excède généralement pas 2 heures et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Dans les modèles éveillés, les animaux sont dans une première phase opérés sous anesthésie (néphrectomie, pose de clip vasculaire autour d’une artère rénale, ligature du canal biliaire) et/ou équipés d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continu de paramètres cardiovasculaires (pressions, fréquence cardiaque, électrocardiogramme ou ECG) par cathétérisme des lits artériels d’intérêt (ou d’une cavité cardiaque) et positionnement d’électrodes pour l’ECG. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum), les paramètres sont enregistrés en continu, généralement avant (au moins 1 heure) et après administration de la substance à évaluer (classiquement 24 heures par période d’enregistrement). Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, souscutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (classiquement 2 maximum par 24 heures, volume et fréquence adaptés à l'espèce) peuvent être réalisés (animal vigile ou anesthésié) pendant le test et/ou en fin de test, selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs des substances testées ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Dans les modèles nécessitant une intervention chirurgicale (sous anesthésie) suivie d’un réveil, les animaux sont hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (généralement pour une période d'une semaine) afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères. Lors de la phase de récupération, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit…). Pendant les mesures par télémétrie, l’hébergement en cage individuelle est également nécessaire (généralement environ 24h) pour éviter les interférences entre les implants ainsi que les contaminations croisées (les animaux ne recevant généralement pas tous le même traitement le même jour. De même, pendant les phases de mesure de la pression artérielle par la méthode du tail cuff, les animaux doivent être placés dans des boites de contention (généralement pour des périodes de 45 minutes maximum et une fois par semaine, avec un nombre de semaines variant d’une étude à l’autre). Si des périodes de récolte de l'urine (24 heures maximum) sont inclues dans l’étude, l'isolement des animaux est nécessaire et peut aller jusqu'à 24 heures (pour la détermination de la filtration glomérulaire, les urines doivent impérativement être collectées individuellement pendant 24 heures). Pendant les phases d'hébergement individuel, les animaux gardent cependant un contact visuel, olfactif et auditif avec leurs congénères. Plus spécifiquement, dans le modèle BDL/cholestase (ligature du canal biliaire), une jaunisse apparait progressivement. Elle peut être accompagnée d'ascite (à un stade plus tardif, environ 4 semaines) et une diminution de l'appétit. Le stade d'encéphalopathie hépatique (et de coma), observé chez l'homme à un stade terminal, n'est pas atteint dans ce modèle (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). Egalement, dans le modèle d’hypertension pulmonaire MCT, l’état général des animaux peut se dégrader, généralement à partir de la 5ième semaine (le premier signe étant une perte de poids rapide). Cependant ce stade n'est pas atteint dans ce modèle (les animaux étant euthanasiés avant ce stade).
Devenir
Dans les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisables. Dans les procédures modérées ne nécessitant pas de prélèvements d'organes, les animaux peuvent être gardés en vie et réutilisés, sauf si, pour les besoins de l’étude, un volume de sang non-compatible avec la survie est nécessaire. Dans les procédures modérées pour lesquelles des prélèvements d’organes sont prévus, le maintien en vie n'est pas possible. De plus le niveau de l’hypertension atteint en fin de test n’est à terme pas compatible avec le maintien en vie.
Remplacement
En amont des tests in vivo sur des modèles d'hypertension, des tests in silico, in vitro ou ex vivo peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires , ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer ces pathologie évolutives et leurs conséquences dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test a été optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition du test. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègre dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de stopper précocement la douleur, la souffrance ou l'angoisse. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (et positif si approprié). Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant stopper précocement la douleur, la souffrance ou l'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur les différentes formes d'hypertension chez le rat dans les modèles décrits, est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rats sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques.
Etude des potentiels effets indésirables d’une vésiculothérapie CD146 dans l’athérosclérose
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse des vésicules extracellulaires portant la molécule CD146 sous anesthésie gazeuse, subissent une mesure du temps de saignement à la queue, avant mise à mort pour prélever la moelle osseuse. Le porteur indique attendre un stress physique ou thermique et une douleur légère, et présente l'étude comme la vérification des effets indésirables d'une thérapie déjà jugée efficace contre l'athérosclérose. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'évaluer les effets hors cible d'une thérapie sur l'organisme.
Objectifs
Ce projet permettra d'étudier les effets indésirables d'une thérapie constituée de vésicules portant une molécule d'adhésion ; le CD146. En effet, un protocole précédemment accepté a testé le bénéfice d'une nouvelle thérapie dans l'atherosclérose. : l'apport de CD146 sur les macrophages de la plaque d'athérosclérose par des vésicules extracellulaires. Nos études en cours montrent un effet significatif des ces vésicules dans la régréssion de la maladie athéromateuse. Les vésicules extracellulaires étant décrites comme pouvant être pro-coagulantes ou pro-inflammatoires, il est essentiel de vérifier que la vésiculothérapie proposée n'entraîne pas de phénomènes de coagulation ou d'inflammation qui pourraient être délétères dans l'athérosclérose. Ainsi, nous allons étudier l'effet de ces vésicules sur le phénotype inflammatoire des macrophages qui sont leurs cellules cibles privilégiées. Nous étudierons également le temps de saignement des modèles expérimentaux soumis à cette thérapie.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique dans la lutte contre l'athérosclérose.
Procédures
1/ injection dans la veine de vésicules extracellulaires après anesthésie gazeuse 2/Temps de saignement : Prélèvement de quelques gouttes de sang à la queue après anesthésie gazeuse 3/Extraction des cellules de la moelle osseuse sur animal euthanasié.
Impact sur les animaux
L'animal subit une injection, une anesthésie ainsi qu'une biopsie de la queue. Cela pourra entrainer par exemple : un stress physique léger, un stress thermique ou une douleur légère chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, en effet il est necessaire d'avoir un animal euthanasié pour récolter la moelle osseuse des tibias et des péronés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle murin pour tester le bénéfice global d'une thérapie dans l'athéroslérose, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.
Réduction
Les souris seront observées avant d’initier le protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, deux protocoles différents seront testés sur le même animal sans que cela ne perturbe les données scientifiques. Ainsi, les souris qui seront soumises à un test de saignement pour évaluer l'effet de la thérapie sur l'hémostase, seront ré-utilisées pour leur extraction de moelle osseuse afin d'isoler et de mettre en cuture les macrophages in vitro.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages contenant de l'enrichissement. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection, ils seront écartés des protocoles. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration d'un médicament anti-inflammatoire tant que les signes de douleur persistent.
Choix des espèces
La meilleure façon d'appréhender les effets indésirables et 'hors cibles' d'une nouvelle stratégie thérapeutique est de l'étudier dans un modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, seul le modèle murin adulte développe des plaques d'athérosclérose semblables à celle de l'homme.
Etude de l’efficacité d’un composé anti-obésité en développement chez la souris rendue obèse par une alimentation riche en graisse en thermoneutralité
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues obèses par un régime à 60 % de graisses puis hébergées seules à thermoneutralité, elles reçoivent chaque jour un composé par voie orale et subissent pesées, mises à jeun, prélèvements sanguins et test de tolérance au glucose, avant ponction cardiaque sous anesthésie et dislocation cervicale. Le porteur mène cette étude pour un laboratoire pharmaceutique client afin de confirmer qu'un composé réduit le poids et la prise alimentaire. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et le métabolisme.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré qu'un de ces composés induit une perte de poids corporel associée à une diminution de la prise alimentaire chez des souris obèses. L'objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l'impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique (60% de l'énergie issue des graisses) pendant 10 semaines avant démarrage du traitement. Par ailleurs, afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°C).
Bénéfices attendus
Cette étude devrait permettre de proposer une solution thérapeutique pour les personnes atteintes d'obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - obésité des animaux de part leur phénotype - un hébergement individuel sur toute l'étude - une administration orale quotidienne à partir de D-11 - une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - une mise à jeûn de 4h + un prélèvement sanguin à la queue à D-6 et D57 - une prise alimentaire et une pesée trois fois par semaine à partir de D1 - une analyse de leur composition corporelle à D29 - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) à D57 [Mise à jeun pendant 16h, Prélèvements sanguins (2 goutte) 0, 15, 30, 60 et 120min aprés administration du glucose]. De plus, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance.
Impact sur les animaux
La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°). Les animaux seront pesés régulièrement afin d'administrer le bon volume de véhicule ou de traitement. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins à D-3 et D29, une administration quotidienne per os à partir de D-11, un test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 16h), une analyse de la composition corporelle et une mise à jeun de 4h avant euthanasie sont prévus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète de ce composé.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisément l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Par ailleurs, nous avons remarqué que la litière en cellulose permet non seulement une bonne absorbance mais également un enrichissement (nidification). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux, lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés avant la dislocation cervicale. Les animaux de la procédure 1 seront euthanasiés par surdose d’anesthésique puis par dislocation cervicale. L'autre partie des animaux seront anesthésiés, puis, une fois la ponction cardiaque réalisée, une dislocation cervicale sera réalisée avant tout prélèvement post mortem. Dans cette deuxième procédure, la ponction cardiaque n'est pas une méthode de mise à mort règlementaire. Toutefois, l'étude nécessite un volume important de sang pour des analyses ultérieures. Après la ponction cardiaque réalisée sous anesthésie, une deuxième méthode de mise à mort de l'animal (celle-ci règlementaire) par dislocation cervicale sera réalisée avant les prélèvements d'organes post mortem pour des analyses ultérieures. Enfin, en cas de signe de souffrance de l'animal, un analgésique sera administré. Si aucune amélioration n'est constatée passé un certain délai, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Etude de l’implication de la perte des cellules murales vasculaires dans les maladies des petits vaisseaux cérébraux chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par exsanguination et perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la naissance elles reçoivent des injections intragastriques, puis subissent une restriction alimentaire ramenant leur poids à 85 % pendant deux mois et des tests d'équilibre, d'attention et de flexibilité comportementale, pour clarifier le rôle des cellules murales dans les maladies des petits vaisseaux cérébraux. Le porteur reconnaît que la manipulation des nouveau-nés peut provoquer leur cannibalisme par la mère et que la perte de cellules murales peut entraîner lésions cérébrales, troubles moteurs et mort prématurée, tout en qualifiant ces lésions de très bien tolérées. Il affirme ne pas pouvoir substituer au modèle animal une approche in vitro ou informatique.
Objectifs
Les vaisseaux sanguins sont des conduits qui transportent le sang dans l'organisme. Ils sont schématiquement constitués de l'intérieur vers l'extérieur d'une monocouche interne de cellules endothéliales en contact avec le sang et d'une ou plusieurs couches de cellules murales permettant la contraction ou la dilatation du vaisseau. Dans le cerveau, il existe au moins 3 grands types de vaisseaux: les artères/artérioles, les capillaires et les veines. Les cellules endothéliales et les cellules murales présentent des caractéristiques moléculaires, histologiques et fonctionnelles qui différent en fonction du type de vaisseau. Les maladies des petits vaisseaux cérébraux sont définies par la présence de lésions structurales ou fonctionnelles des cellules endothéliales ou des cellules murales. Elles sont responsables chez l'homme d'environ un tiers des accidents vasculaires cérébraux, de lésions de la substance blanche diffuse, de microsaignements, d'une atrophie cérébrale et sont une cause majeure de déclin cognif. IL n'existe à ce jour aucun traitement spécifique pour ces maladies, une des raisons étant que les mécanismes physiopathogéniques de ces maladies sont encore très mal connus. Des données de la littérature suggèrent que la perte des cellules murales joue un rôle important dans le déterminisme de ces maladies mais il existe des données contradictoires quant à l'implication des cellules murales des artères versus celles des capillaires. L'objectif de ce projet est de clarifier l'implication des cellules murales de ces différents types de vaisseaux cérébraux dans les différentes manifestations cliniques des maladies des petits vaisseaux cérébraux chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet de recherche fondamentale permettront de clarifier de façon définitive le rôle respectif de la perte des cellules murales des artères, des capillaires et des veines dans la symptomatologie des maladies des petits vaisseaux cérébraux. S'il s'avère comme nous le pensons que la perte des cellules murales des artères joue un rôle déterminant dans ces maladies, nos résultats conduiront à une ré-orientation des travaux de recherche dans ce domaine et à l'exploration de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
3 injections intragastriques quotidiennes après la naissance (durée 10 min/injection). Restriction alimentaire visant à réduire le poids à 85% du poids initial d’une durée maximale de 2 mois, de l’âge de 4 à 6 mois et de l’âge de 10 à 12 mois. Tests de comportement d'une durée de 5 min à 1 heure / jour pendant 2 mois, de l’âge de 4 à 6 mois et de l’âge de 10 à 12 mois. 1 injection intraveineuse 6 heures avant la mise à mort (durée de l'injection 10 min). Mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque (durée 30 min).
Impact sur les animaux
La manipulation des nouveaux nés en vue de la réalisation des injections intragastriques de tamoxifène pourrait conduire au cannibalisme par la mère mais ceci peut être très largement évité en soupoudrant les souriceaux de sciure de la cage après leur manipulation. La perte des cellules murales des vaisseaux peut conduire à des lésions histologiques du cerveau, des troubles moteurs et la mort prématurée de la souris mais dans notre expérience ces lésions sont extraordinairement bien tolérées chez la souris car d'apparition très progressive. La restriction alimentaire pourrait conduire à une perte de poids supérieure à celle souhaitée (environ 85% du poids original) mais pour prévenir celà les souris seront pesées tous les jours.
Devenir
mise à mort par exsanguination et perfusion transcardiaque de fixateurs. La perfusion intracardiaque de fixateurs permet de fixer le cerveau in situ avant son prélèvement et donc de préserver la morphologie des tissus et des vaisseaux du cerveau , ce qui est indispensable dans notre projet.
Remplacement
La complexité des interactions vaisseaux –cerveau- débit sanguin fait qu’il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal vivant, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. De plus, la complexité de ces interactions fait qu’on ne sait pas modéliser correctement ce système in vitro. Pour ces raisons, nous ne pouvons pas substituer au modèle animal un modèle in vitro ou computationnel.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Les mêmes animaux seront utilisés pour étudier différents aspects de la symptomatologie des maladies des petits vaisseaux cérébraux. Plus spécifiquement, les mêmes animaux seront utilisés pour examiner l’équilibre et la cognition de l’âge de 2 à 12 mois et la présence de lésions des vaisseaux et du cerveau à 12 mois. Comme il n’est pas recommandé de réaliser chez la même souris 2 tests cognitifs distincts qui requièrent plusieurs semaines d’apprentissage et que les modalités de conservation du cerveau prélevé après la mise à mort pour l’analyse des lésions en histologie et en immunohistochimie sont très différentes de celles requises pour l’étude en IRM qui requière le prélèvement de la tête entière, nous utiliserons une première série d’animaux chez lesquels seront analysés les processus attentionnels et les lésions du cerveau en IRM et une deuxième série d’animaux chez lesquels seront analysés la flexibilité comportementale et les lésions du cerveau en immunohistochimie. De plus, les analyses en histologie et en IRM seront réalisées de façon séquentielle. Nous commencerons pour chaque modèle par l’analyse des souris de 12 mois. L’analyse des souris âgées de 6 mois ne sera effectuée que si nous détectons des lésions à 12 mois ; idem pour les souris âgées de 2 mois qui ne seront analysées que si nous détectons des lésions à 6 mois. Nous ne pouvons pas fournir de calcul de puissance puisque les souris avec les génotypes décrits dans cette saisine n’ont encore jamais été explorées avec les tests proposés dans cette saisine. En revanche, nous avons calculé la taille des échantillons en nous basant sur des jeux de données collectées au cours d’expériences précédentes similaires mais avec des souris de génotype différent. 10 Males et 10 femelles par groupe sont suffisants pour détecter la présence de lésions en histologie ou en IRM. 20 males et 20 femelles par groupe sont suffisants pour détecter la présence de troubles de l’équilibre ou de la cognition.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies afin d’éviter le stress lié à l’isolement. Les injections intragastriques sont réalisées, entre jour 1 à 3 après la naissance quand l’estomac des souriceaux est facilement identifiable du fait de sa couleur blanchâtre et avant l’apparition de la pigmentation de la peau. La restriction alimentaire, nécessaire pour la réalisation de certains tests du comportement, aura pour objectif d’obtenir une réduction du poids de la souris de 15% par rapport à son poids initial. Elle sera étroitement surveillée par la pesée quotidienne de la souris et l’apport de nourriture sera adapté individuellement afin de maintenir le poids à 85% du poids initial. La durée de la restriction alimentaire n’excédera pas 2 mois et ne sera renouvelée au maximum qu’une fois. Les injections intraveineuses seront réalisées sous analgésie. La mise à mort sera effectuée sous analgésie et anesthésie générale profonde. Nous veillerons au bienêtre des animaux en mettant en place une grille de score et en utilisant des points limites adaptés, un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé au préalable avec des analgésiques.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Elles permettront de déléter des populations spécifiques de cellules murales vasculaires. La majorité des animaux utilisés seront des souris jeunes âgées de 2 mois à souris âgées de 12 mois car il est nécessaire de pouvoir analyser la progression des lésions au cours de la maladie. Un nombre limité d'animaux seront analysées à l’âge de 18 jours afin de valider le modèle expérimental.
Etude des effets de l’ExtraCorporeal Life Support (ECLS) sur la biomécanique et le remodelage tissulaire du muscle cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
80 brebis vont être utilisées dans une chirurgie unique d'environ sept heures menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Un infarctus puis un choc cardiogénique leur sont provoqués pour étudier l'assistance circulatoire par ECLS, le cœur étant prélevé en fin d'intervention. Le porteur indique que la procédure peut entraîner hémorragies, troubles du rythme et arrêt cardiaque, et rapporte une mortalité péri-opératoire de l'ordre de 25 % dans ce type de modèle. Il conclut que le recours aux animaux est "incontournable" et "ne peut être remplacé".
Objectifs
Lors d’un infarctus du myocarde, le cœur perd en partie sa fonction contractile et peut devenir incapable de faire circuler le sang dans l’organisme. On parle de choc cardiogénique. En cas de choc sévère, des machines de circulation extracorporelle (ExtraCorporeal Life Support=ECLS) sont utilisées. Elles permettent d’assurer la circulation sanguine en attendant une récupération cardiaque. Cependant l’ECLS augmente le travail que doit fournir le cœur pour éjecter. Il existe un conflit entre l’ECLS et l’éjection résiduelle du cœur défaillant. Ainsi, l’ECLS permet de faire circuler le sang et d’assurer la survie immédiate du patient mais au prix d’une majoration du travail myocardique. On observe sous ECLS, une dilatation du cœur avec un étirement des parois et des cellules. Cette dilatation et l’augmentation du travail cardiaque vont augmenter la taille de la zone nécrosée et de l’infarctus. Le patient survit mais avec un infarctus plus grand. Or plus la zone nécrosée est importante et plus le patient deviendra insuffisant cardiaque chronique. Cette évolution, d’un infarctus aigu vers une maladie chronique, semble liée à des phénomènes de remodelage ventriculaire. Il intègre des modifications des fonctions cellulaires et des tissus, de l’inflammation et de la mort cellulaire. L’enjeu est donc de réduire au maximum la nécrose lors d’un infarctus. Pour limiter le travail du coeur sous ECLS, des techniques ont été développées. Il s’agit, entre autres, du ballon de contre- pulsion intra-aortique ou de la pompe micro-axiale. Des machines d’assistances pulsatiles sont également en cours d’étude. Les effets hémodynamiques, tissulaires et cellulaires et les conséquences de l’ECLS restent cependant mal connus. Les objectifs sont donc de décrire l’impact et les stratégies complémentaires de l’ECLS sur : l’hémodynamique et les performances énergétiques du myocarde défaillant, la taille de l’infarctus et les voies de signalisation cellulaires impliquées dans le remodelage ventriculaire.
Bénéfices attendus
A court terme les bénéfices attendus sont : une diminution des syndromes de bas débit (faible circulation sanguine, une récupération plus rapide de l’état clinique des patients avec une réduction des durées d’hospitalisation. A long terme les bénéfices suivants sont attendus : une réduction des modifications structurelles du cœur (remodelage) et une réduction du taux d’insuffisance cardiaque chronique.
Procédures
L’ensemble des animaux du projet (80) sont inclus dans une unique procédure sans réveil. Cette procédure correspond à une seule intervention chirurgicale. Celle-ci permet des réaliser les tests ayant pour objectif de pallier aux effets indésirables de l’utilisation d’ECLS. Ces tests durent environ 7 heures pendant lesquelles l’animal reste anesthésié, cette procédure permet de répondre aux objectifs du projet. Pour ce projet, les animaux sont donc sous anesthésie générale lors de la procédure sans réveil, et ceci concerne l’ensemble des animaux inclus.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels peuvent être : un hématome au point de ponction, une dissection des vaisseaux (lors de la pose des cathéters), un hématome de paroi, une dissection des vaisseaux, des troubles du rythme cardiaque et un arrêt cardiaque (lors de la coronarographie et de la réalisation de l’infarctus), une hémorragie (lors de la sternotomie). Ces événements sont surveillés et des actions sont mises en place lors de l'intervention qui est réalisée sous anesthésie générale et sans réveil pour l'animal.
Devenir
L’ensemble des animaux sera sacrifié pour permettre la réalisation d'analyses de tissus et de l’activation des voies de remodelage ventriculaire. Il s’agit d’une expérimentation sans réveil pour l’animal.
Remplacement
Notre étude nécessite de créer un infarctus conduisant à un choc cardiogénique pour évaluer l’impact d’une assistance de type ECLS, pulsée ou non, et d’une décharge ventriculaire mécanique. Ces machines sont indispensables pour assurer la survie d’un patient en choc cardiogénique mais ont un effet potentiellement délétère sur le coeur et peuvent précipiter le patient vers l’insuffisance cardiaque chronique. Pour étudier les effets de l’ECLS, des décharges et les phénomènes de remodelage ventriculaire, le cœur est prélevé en fin d’expérimentation. C’est l’unique moyen pour réaliser des analyses tissulaires et cellulaires et évaluer les activations des voies de remodelage des tissus. L’utilisation de modèles mathématiques ou l’expérimentation sur un cœur isolé n’est pas réalisable pour plusieurs raisons : les connaissances actuelles en la matière ne sont pas encore étendues et cohérentes, ce qui ne permet pas une modélisation mathématiques ; nos approches se caractérisent par une exploration fonctionnelle et moléculaire dans un modèle de choc cardiogénique ; la réalisation de ce type d’étude avec un tel niveau de complexité n’a été jusqu’à présent pas été réalisée de manière aussi approfondie. Afin d'atteindre les objectifs scientifiques du projet, l'utilisation d'animaux est incontournable et ne peut être remplacée.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette étude et dans le but d’obtenir le plus grand bénéfice, nous avons calculé que 80 brebis sur une durée de 5 ans seraient nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques. Il s’agit du nombre minimal d’animaux nécessaire à l’obtention de données de qualité exploitable et permettant une analyse statistique fiable. Si les objectifs expérimentaux peuvent être atteints par l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux, ou si l’obtention de résultats via l’utilisation d’animaux reste irréalisable, alors plus aucun animal supplémentaire ne sera utilisé. Il a été observé par d’autres laboratoires, ainsi que par notre équipe une mortalité péri-opératoire de l’ordre de 25% dans ce type de modèle animal de choc cardiogénique. Des points réguliers avec l'équipe porjet seront réalisés régulièrement au cours des cinq ans en vue d’optimiser la qualité de l’expérimentation. Les prélèvements de tissus seront conservés pour permettre des analyses immédiates mais également futures par la création d'une banque de tissus et de plasma permettant de travailler sur plusieurs années sans utiliser d'autres animaux.
Raffinement
Pour réduire les nuisances sur le bien-être, toutes les mesures sont mises en place, tout au long du projet. Les animaux sont transportés dans les conditions adaptées à l'espèce, dans un véhicule autorisé par les instances de contrôle et par du personnel formé plusieurs jours avant l’expérimentation. Cela permet une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire le stress du déplacement. Les animaux sont hébergés dans des locaux agréés. Des méthodes de raffinement sont mises en place afin d’améliorer leur condition d’hébergement : les brebis sont hébergées en groupe social (les brebis étant des animaux grégaires), sur paille avec à leur disposition de la pierre à sel. Un personnel formé leur apporte les soins nécessaires quotidiennement. Le jour de l’intervention, les animaux reçoivent une prémédication à base de sédatif permettant d’être complètement détendu pour le transfert au bloc opératoire. Le protocole expérimental est réalisé sous anesthésie générale incluant une tranquillisation (prémédication), une inconscience (sédation) et une analgésie adaptée. Durant l’ensemble de la procédure, l’animal est surveillé (fréquence cardiaque, tension artérielle, fréquence respiratoire). En cas d’augmentation de ces paramètres (sans raison cardiaque), l’anesthésie pourra être approfondie afin de maintenir une anesthésie profonde et une absence de souffrance. L’électrocardiogramme, la pression artérielle, et la saturation en oxygène seront suivis tout au long de l’anesthésie. Des molécules de réanimation et des anti-arythmiques seront utilisées si nécessaire notamment en cas de survenue de troubles du rythme. Un défibrillateur sera installé afin de réduire au maximum le temps de délivrance du choc électrique externe en cas de fibrillation ventriculaire si elle survient. Des critères d’arrêt sont définis : en cas d’arrêt cardiaque persistant après 20min malgré la mise en place de l’assistance circulatoire, l’animal ne sera plus réanimé et l’assistance sera éteinte. L'animal ne sera jamais réveillé lors de l’expérimentation et la mise à mort sera réalisée sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Bien que des modèles d’infarctus chez le petit mammifère existent, les cœurs de plus grands mammifères ont des caractéristiques électrophysiologiques et géométriques plus proche de celles du cœur humain. Les méthodes cliniques d’imagerie cardiaque conventionnelle (IRM) peuvent être directement appliquées de par leurs similitudes avec le cœur humain. L’application de ces techniques représente donc une étape importante vers une application en clinique. L’espèce Ovins a été choisi car : - le modèle d’infarctus dans cette espèce est bien décrit et caractérisé - le personnel menant la procédure possède une grande expertise avec cette espèce - le réseau coronarien de la brebis est proche de celui de l’homme (circulation coronarienne de type terminale sans ou avec peu d’anastomose permettant de créer un infarctus sans que de petits vaisseaux assurent la perfusion du tissu) Age adulte (entre 1 et 3 ans) afin d’expérimenter avec des cavités cardiaques et un réseau vasculaire dont les dimensions sont comparables à l’homme. Cet aspect est essentiel notamment pour la mise en place des canules artérielles et veineuses pour l’ECLS et les décharges mécaniques.
Le rôle des plaquettes dans la rupture des anévrysmes intracrâniens
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 151 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un anévrysme intracrânien est provoqué par injection d'une molécule dans le cerveau et pose d'un dispositif augmentant la pression artérielle, jusqu'à la rupture et l'hémorragie cérébrale. Le porteur indique une mortalité attendue lors de la chirurgie et des symptômes neurologiques déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucun dispositif ne reproduit tous les paramètres de la maladie et qu'il est "nécessaire" de provoquer chez l'animal une pathologie proche de celle des humains.
Objectifs
Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. Dix anévrysmes sur 100 000 évolueront jusqu'à leur rupture, entrainant des saignements dans le cerveau, ce qui conduit le plus souvent à la mort du patient. De plus en plus d’études suggèrent que l’évolution de l’anévrysme jusqu’à sa rupture n’est pas systématique et qu’elle ferait appel à des mécanismes particuliers. Pourtant, le seul traitement aujourd'hui consiste à retirer l'anévrysme, rompu ou non, lors d'une chirurgie très risquée. Un traitement moins dangereux pourrait être mis au point si les mécanismes impliqués dans la rupture de l'anévrysme étaient identifiés. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'anévrysme intracrânien évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, qui ont un rôle connu dans la coagulation sanguine, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques menant ou non à une rupture. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leurs mécanismes de réponses lors des stades tardifs de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 15 jours chez la souris des anévrysmes rompus. Nous allons l'appliquer à des souris n'ayant pas certaines protéines nécessaires au fonctionnement des plaquettes et étudier si leur absence à un effet positif sur la maladie. Une fois les protéines plaquettaires impliquées dans la maladie identifiées, nous utiliserons des médicaments déjà utilisés chez l'Homme ainsi que des molécules antiplaquettaires en développement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre dans un premier temps d’identifier des molécules plaquettaires impliquées dans l’évolution de l’anévrysme vers sa rupture. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant l'évolution de l'anévrysme jusqu'à sa rupture chez la souris, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgicale compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.
Procédures
Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrismes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgical : un prélèvement sanguins est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (10 minutes au total). Une procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance). L'évolution du comportement plaquettaire durant l'évolution de la pathologie sera suivie par analyse sanguine. Pour analyser ce sang, 2 prélèvements sanguins supplémentaire seront réalisés sur souris anesthésiées. (un prélèvement sanguin = 1 minute)
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie d'injection de molécule dans le cerveau (J0). Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée, 24h); perte de poids postopératoire (modérée, 24h); Stress de contention pendant la mesure de pression artérielle (9 sessions de 15 min). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme :Perte de poids (2g en 24h); Apparition de symptômes neurologiques, hémorragie.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée ou à la fin de la procédure s'ils n'atteignent pas les points limites défini dans ce projet avant. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.
Remplacement
La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie due au passage de la micropipette dans un vaisseau survienne. Ceci s’exprime par une l’apparition de symptôme neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours et des points limites précoces ont été mis en place pour éviter toute souffrance inutile à l'animal. Du coton est mis à leur dispositon dans leur cage afin qu'ils puissent nidifier.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Homme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absente, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine.
Etude des mécanismes de la fibrillation atriale chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
346 rats vont être utilisés, tués sous anesthésie avant tout réveil, pour prélever le bloc cœur-poumon. Ce prélèvement terminal permet d'étudier les canaux potassiques des veines pulmonaires impliqués dans le déclenchement de la fibrillation auriculaire. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle cellulaire ou in silico de la veine pulmonaire utilisable en remplacement. Il retient le rat parce que ses cellules cardiaques sont bien caractérisées et que ses résultats antérieurs y ont été obtenus.
Objectifs
La fibrillation auriculaire est le trouble du rythme cardiaque le plus fréquemment rencontré en pratique clinique. Son incidence augmente avec l’âge et elle est associée à une diminution de la qualité de vie ainsi qu’à une augmentation de la morbidité (survenue d’accidents vasculaires cérébraux, etc.) et de la mortalité des patients. Les mécanismes cellulaires et moléculaires à l’origine de ce trouble du rythme sont encore mal compris et aucun traitement pharmacologique efficace n’existe à ce jour. Les veines pulmonaires (VP) s’abouchent à l’oreillette gauche (OG) et possèdent une couche de cellules cardiaques (cardiomyocytes) spécifique de ces veines. Ce manchon de cardiomyocytes constitue la principale source de foyer d’activités électriques anormales à l’origine du déclenchement de la fibrillation auriculaire. Chez le rat, nous avons montré que l’activation sélective des récepteurs α1-adrénergiques présents dans les cardiomyocytes de VP entraine une perte de la conduction électrique entre les VP et l’OG. Cette perte de conduction est due à une dépolarisation de la membrane des cardiomyocytes de VP, qui conduit à la perte de leur excitabilité. Ce phénomène n’est pas retrouvé dans les cardiomyocytes d’OG. Ainsi, la dépolarisation sélective des cardiomyocytes de VP par une approche pharmacologique pourrait constituer une statégie thérapeutique innovante pour le traitement de la fibrillation auriculaire à un stade précoce de la pathologie. L’utilisation des agonistes des récepteurs α1-adrénergiques en thérapeutique n’est cependant pas envisageable du fait de la répartition ubiquitaire de ces récepteurs dans l’organisme. Au sein du laboratoire, nous avons récemment montré que l’activation des récepteurs α1-adrénergiques bloquait, dans les cardiomyocytes de VP, des courants qui pourraient correspondre aux courants portés par les canaux potassiques TREK qui sont connus pour jouer un rôle important dans le maintien du potentiel de membrane de repos des cardiomyocytes. L’objectif de notre projet est donc de caractériser les canaux TREK au sein des cardiomyocytes de VP, ce qui n’a jamais été réalisé auparavant, ainsi que leur implication dans la perte de la conduction éléctrique induite par l’activation des récepteurs α1-adrénergiques au sein des VP en utilisant l’OG comme contrôle.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus au cours et à l’issu de ce projet devraient nous permettre : 1) D’améliorer à court terme les connaissances fondamentales concernant les mécanismes physiologiques contrôlant l’excitabilité des veines pulmonaires 2) D’améliorer à court terme les connaissances des mécanismes physiopathologiques à l’origine du déclenchement de la fibrillation auriculaire 3) D’identifier à court terme une cible pharmacologique exploitable en thérapeutique pour le développement à plus long terme d’une nouvelle stratégie thérapeutique innovante de la fibrillation auriculaire basée sur le développement d’une nouvelle classe pharmacologique de médicaments.
Procédures
Prélèvement du bloc cœur-poumon sous anesthésie générale ; sur 346 rats maximum ; 1 fois/animal pendant moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
Mort de l’animal concomitante aux prélèvements de tissus/d’organes.
Devenir
Le prélèvement du bloc cœur-poumon entraine la fin de vie de l’animal.
Remplacement
Du fait de sa structure comportant plusieurs types cellulaires et de son fonctionnement peu connu, il n’y a pas de modèle cellulaire ou in silico de la veine pulmonaire que nous pouvons utiliser en remplacement des animaux.
Réduction
L’utilisation d’outils statistiques permet de réduire au minimum le nombre d’animaux indispensable à l’obtention de résultats interprétables. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, plusieurs expérimentateurs vont intervenir pour mettre en œuvre différentes techniques expérimentales afin d’utiliser les veines pulmonaires et l’oreillette gauche de chaque animal.
Raffinement
La planification des expériences, la manière de prélever et les appareillages ont été optimisés pour obtenir et utiliser l’ensemble des tissus d’intérêt par rat. Les animaux réceptionnés sont hébérgés à l’animalerie de la faculté de pharmacie dans un milieu enrichi. Nous prévoyons toujours une semaine d’acclimatation pour les stabiliser au point de vue physiologique et comportemental dans leur nouvel environnement et réduire leur stress avant leur utilisation. De plus, nous planifions nos expérimentations de telle sorte qu’un rat ne se retrouve pas seul dans sa cage plus de 24 heures. Le jour de l'expérimentation, les animaux reçoivent anesthésie et analgésie, ils sont étroitement surveillés jusqu'au moment du prélèvement.
Choix des espèces
Les cellules cardiaques sont assez bien caractérisées chez le rat. Il a également été choisi en raison des dimensions des préparations tissulaires adaptées à nos dispositifs expérimentaux. Par ailleurs les résultats des expérimentations précédentes sur lesquelles se base ce projet ont été obtenus chez le rat. Adulte car c’est le stade de maturité et de stabilisation physiologique.
Etude de pharmacocinétique chez le mini porc
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Six mini-porcs vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit douze à treize prélèvements sanguins sur neuf jours après administration intraveineuse ou sous-cutanée de deux formulations, avec suivi de la température et des sites d'injection. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal entier pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques. Les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre l'insuffisance cardiaque, sont renvoyées au long terme.
Objectifs
L'objectif de cette étude est d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques de deux formulations test . La classe thérapeutique de ces formulations est: Cardiologie.
Bénéfices attendus
Il est necessaire de conduire ce projet pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques de ces deux formulations test qui pourront être utiles pour de futurs projets. A long terme ce projet aura pour objectif de trouver de nouveaux médicaments candidats pour les personnes souffrant d'insuffisance cardiaque.
Procédures
Dans ce projet, des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront réalisés. Douze et treize prélèvements de sang prévus sur 9 jours aprés l'administration intraveineuse ou souscutannée ( 1 mL de sang par prélèvement Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute) Des prélèvements sanguins seront effectués aprés l'administartion intraveineuse aux temps suivants: pre-dose, 0.25h, 0.5h, 2h, 6h, 10h, 24h, 48h, 72h, 120h, 168h et 216h. Des prélèvements sanguins seront effectués aprés l'administartion sous cutannée aux temps suivants: pre-dose, 1h, 3h, 8h, 12h, 24h, 30h, 48h, 72h, 96h, 120h, 168h et 216h. Un suivi de la température corporelle sera effectuée sur 24h ( pre dose, 2h, 8h et 24h post administration). Durée d'une mesure de température: de l'ordre de la minute. Suite aux administrations souscutannées, un suivi des sites d'injections sera également fait sur 48h post administration (pre dose, 1h, 3h, 8h, 24h, 30h et 48h). L'observation macroscopique des sites d'injections est de l'ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Des prélèvements sanguins sont prévus dans ce projet. Les prélèvements seront réalisés sur animal vigile par un personnel expérimenté, conformément aux bonnes pratiques vétérinaire. Les prélèvements seront fait au niveau des veines jugulaires. Le sites de prélèvement seront alternés, droite et gauche, autant que possible. De même, les sites d'administration pour la voie sous cutannée seront observés pendant 48 h pour le suivi de la tolérance post administration. Toutes manipulations sur les animaux seront faites avec un personnel expérimenté, cela minimisera le stress des animaux lors des diverses manipulations.
Devenir
A la fin de ce projet, comprenant qu'une seule procédure, tous les animaux seront gardés en vie.
Remplacement
Il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques de ces deux formulations test.
Réduction
Deux groupes de 3 animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal par groupe pour avoir des résultats interprétables.
Raffinement
Dans ce projet, les points limites sont: - Douleurs importantes au niveau des sites de prélèvements (zones des veines jugulaires) - Réactions locales sévères ( exemple: induration, chaleur, douleur, érythème) au niveau du site d'administration ( administration sous cutanée au niveau de la zone lombaire) - Modification du comportement général des animaux suite aux administrations. Il est possible d'observer une hypotonicité des animaux pendant les premières 24h. Cette hypotonicité peut devenir un point limite si elle se prolonge. - L'élément test administré est un peptide biologique (classe thérapeutique: cardiologie). Il est possible d'observer une réponse immunitaire. L'intensité de la réponse sera reflétée par le suivi de la température corporelle. Si cette température est supérieure à 42°C cela pourra être considéré comme étant une point limite. Si un des points limites est atteint, l'animal sera exclu du projet.
Choix des espèces
Espèce de choix pour ce type d'étude Jeune adulte . A ce stade les animaux sont plus faciles à manipuler.