Troubles cardiaques
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Analyse d’images multimodales précliniques (SPECT et IRM) pour la détection de la dysfonction coronaire microvasculaire (1/2)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
20 rats Zucker obèses vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des séances d'imagerie répétées sous anesthésie à 17, 25 et 32 semaines, avec injections intrapéritonéales et intraveineuses, avant d'être mis à mort pour prélever le cœur. Le porteur veut entraîner des outils d'intelligence artificielle à détecter une atteinte des petits vaisseaux du cœur, et présente les 20 rats comme le minimum permettant des résultats exploitables. Les retombées annoncées pour l'évaluation clinique de cette atteinte sont renvoyées au terme.
Objectifs
Les pathologies cardiovasculaires représentent la première cause mondiale de mortalité. La dysfonction coronaire microvasculaire (DCM) est de plus en plus reconnue comme un responsable majeur de la mortalité cardiovasculaire indépendamment de la présence ou de l'absence de maladie macrovasculaire. Bien que la DCM soit dorénavant considérée comme un marqueur clinique dont l'évaluation fournirait des informations primordiales pour la stratification du risque des patients avec ou sans maladie macrovasculaire, il n’existe pas à l’heure actuelle de technique non invasive et largement disponible pour l’évaluation de la DCM. L'imagerie nucléaire a un rôle majeur dans la prise en charge diagnostique et pronostique des patients coronariens avérés ou suspectés. L’objectif du projet est de réaliser le suivi longitudinal de l’évolution de la DCM chez le rongeur par imagerie nucléaire ainsi que par IRM, avec un double objectif. Il s’agit tout d’abord de développer des outils d’intelligence artificielle (IA) permettant d’améliorer la détection précoce de la DCM sur les images nucléaires à l’aide de l’IRM. L’objectif à terme est d’améliorer l’évaluation clinique de la DCM en imagerie nucléaire. Deuxièmement, nous souhaitons améliorer l’analyse du signal IRM pour la mesure de la DCM. Nous limitons le projet, qui se déroule en collaboration entre deux établissements, aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 20 rats seront utilisés. Compte-tenu de l’utilisation de l’intelligence artificielle, il s’agit du minimum d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables. Le nombre d’animaux par cage (avec enrichissement du milieu de vie) sera adapté en fonction de leur poids. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. La mise en place de points limites adaptés permettra de limiter la souffrance de ces animaux. Les injections seront réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’améliorer l’évaluation de la DCM en imagerie nucléaire grâce à la comparaison des données avec les valeurs de référence procurées par l’IRM et des analyses histologiques réalisées ex vivo. Il devrait permettre à terme d’améliorer l’évaluation clinique de la DCM en SPECT.
Procédures
A l’âge de 17 semaines les animaux seront placés sous anesthésie générale. Une injection intrapéritonéale sera réalisée pour mimer un effort avant l’acquisition IRM. La durée de l’acquisition sera de 60 min environ. A l’issue de l’anesthésie, les animaux seront replacés dans leurs cages. L’acquisition IRM sera répétée selon les mêmes modalités à 25 semaines et 32 semaines d’âge. A l’issue de l’acquisition à 32 semaines, une acquisition d’image nucléaire sera réalisée après anesthésie générale et pose d’un cathéter intraveineux pour l’injection de l’agent de contraste. La durée d’acquisition des images sera de 25 min, à l’issue de laquelle les animaux seront mis à mort avant prélèvement du coeur pour analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
L’acquisition des images IRM est réalisée sans agent de contraste et ne nécessite qu’une anesthésie gazeuse et une injection intrapéritonéale dont les nuisances ou effets indésirables attendus sont très faibles. L’acquisition d’images SPECT nécessite une injection intraveineuse caudale et une injection intrapéritonéale, aux effets indésirables également très limités, d’autant plus que les animaux seront mis à mort sans réveil à l’issue de l’acquisition.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de l’unique procédure expérimentale pour analyses post mortem.
Remplacement
Cette étude vise à caractériser les conditions d’analyse des images précliniques SPECT de la perfusion myocardique pour permettre l’évaluation de la DCM sur les images cliniques. Le remplacement de l’expérimentation animale par un modèle alternatif n’apparaît pas envisageable.
Réduction
Au total 20 rats seront utilisés ici. Il y aura 10 animaux par groupe. Il s’agit du strict minimum d’animaux nécessaires afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables en termes de classification des images SPECT comme correspondant à des animaux présentant ou non une DCM par machine learning ou deep learning en fonction des valeurs de référence procurées par les images IRM (vérité-terrain).
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. Le poids des animaux ainsi que la prise de nourriture seront surveillés une fois par semaine. Le nombre d’animaux par cage sera adapté en fonction de leur poids. Ils disposeront d’enrichissement de leur milieu de vie (bâton en bois, tunnels, etc…). Une surveillance particulière de la consommation d’eau de boisson sera effectuée considérant le statut pré-diabétique des animaux. Les expérimentations prévues lors de cette étude sont des procédures non invasives (IRM et SPECT). Lors de ces procédures, les animaux sont sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane. Une surveillance quotidienne des animaux reste cependant nécessaire et des points limites sont proposés. L’effet de l’agent pharmacologique permettant de mimer la situation d’effort pour l’acquisition des images SPECT est transitoire et sans effet secondaire attendu, mais une grille de surveillance sera toutefois ajoutée pour la surveillance respiratoire des rats. Si les points limites sont atteints, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le rat Zucker obèse est très largement utilisé pour l’étude de pathologies métaboliques. Une étude préliminaire a permis de démontrer par imagerie échographique une atteinte microvasculaire (diminution de la réserve coronaire) chez les animaux obèses aux stades où nous prévoyons d’utiliser les animaux dans le présent projet. De plus, nous disposons de données préliminaires qui pourront être comparées à celles obtenues dans le cadre du présent projet. Enfin, le rat est particulièrement adapté au matériel d’acquisition (gamma-caméras) en termes de sensibilité et de résolution, par comparaison avec la souris. Les animaux seront accueillis à un âge compris entre 13 et 16 semaines. Ils seront hébergés dans des conditions standards pendant 1 semaine minimum avant inclusion dans le protocole. Cet âge correspond, d’après la littérature, au stade initial du syndrome métabolique (obésité, insulinorésistance, hyperlipidémie) développé par ces animaux. Ils seront suivis jusqu’à 32 semaines, âge auquel nous avons précédemment observé une DCM par imagerie échocardiographique.
Epac1 : une nouvelle cible thérapeutique testée dans un modèle murin d’AVC ischémique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 48 sous anesthésie sans reprise de conscience et 78 dans des procédures de niveau modéré. Elles subissent une chirurgie du cou pour occlure une artère cérébrale et provoquer un accident vasculaire, suivie d'une imagerie IRM, puis sont gardées vivantes 24 heures avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur indique que l'AVC provoque perte de poids et déficits sensorimoteurs, et que moins de 10 % des souris opérées meurent d'œdème ou d'hémorragie. Il décrit le recours au rongeur comme conditionnant la validité de l'évaluation et le transfert en clinique.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la formation des lésions cérébrales suite à un AVCi est devenu une priorité pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection. L’objectif global du projet est d’évaluer l’impact de la protéine Epac-1 sur les dommages cérébraux dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) transitoire appelée aussi ischémie-reperfusion cérébrale. L’implication d’Epac1 a été démontrée dans le cœur, le rein et la rétine suite à une ischémie-reperfusion. A notre connaissance, le rôle d’Epac1 dans la pathogenèse de l’AVC n’a pas été étudié à ce jour. Cependant, des études préliminaires in vitro et ex vivo sur cette nouvelle cible thérapeutique suggèrent un effet délétère d’Epac-1 sur l’unité neurovasculaire en condition d’ischémie-reperfusion cérébrale. Afin de confirmer ces résultats et d’aller plus loin dans l’exploration des effets in vivo de Epac-1 dans l’AVCi, nous proposons d’évaluer les conséquences d’une modulation d’Epac-1 soit à l’aide d’un agoniste (qui favorise l’expression de la cible thérapeutique), soit à l’aide d’un inhibiteur (qui supprime l’expression de la cible thérapeutique), par imagerie par résonance magnétique (IRM) multiparamétrique. Notre hypothèse est que l’inhibition d’Epac-1 devrait diminuer la taille des lésions, et protéger la barrière hématoencéphalique.
Bénéfices attendus
Si l’effet neuroprotecteur de la modulation d’Epac-1 est prouvé, cela validera Epac-1 comme une nouvelle cible thérapeutique. Il sera possible de proposer un nouveau traitement de l’AVCi, avec l’espoir à terme de limiter les séquelles neurologiques pour les patients victimes d’un AVC.
Procédures
L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) est effectuée via un abord chirurgical au niveau du cou, pour accéder à la carotide commune, dans laquelle est inséré le filament occlusif qui est remonté dans l’artère carotide interne jusqu’à atteindre la bifurcation avec l’ACM. Cette seconde chirurgie, ainsi que l’imagerie réalisée pendant l’occlusion, puis la reperfusion par rétraction du filament, nécessite une anesthésie générale de 2h30 au maximum.
Impact sur les animaux
Suite à l'accident vasculaire cérébral, les animaux perdent du poids et présentent des déficits neurofonctionnels sensorimoteurs (par exemple hémiparésie et diminution de la sensibilité des vibrisses). La douleur concerne principalement la cicatrice due à l’abord chirurgicale (le cou) car les dommages au niveau du parenchyme cérébral n’engendrent pas de douleur (raison pour laquelle les patients présentant un AVC tardent à se rendre aux urgences). Les animaux sont gardés en vie 24 heures puis ils sont mis à mort à l’issue de l’examen IRM terminal. La principale complication du modèle est le décès par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne (
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses complémentaires postmortem (étude des mitochondries).
Remplacement
Notre étude in vivo vient compléter des études déjà réalisées in vitro et ex vivo qui ont montré la pertinence de nos hypothèses. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique (modèle de thrombectomie). L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des animaux de plus grande taille (chats, primate) grâce à l’utilisation d’un appareil d’imagerie à haut champ (7 Tesla) dedié aux petits animaux.
Réduction
Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude statistique en prenant en compte la variabilité attendue du modèle et les critères d'exclusion (absence d'infarct cérébral, hémorragie sous-arachnoïdienne). L’utilisation de l’IRM longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion à 24h par la taille de l’atteinte initiale en perfusion ou en diffusion en perocclusion chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
L’imagerie réalisée pendant l'accident vasculaire cérébral permet de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. L’IRM per-occlusion est également efficace pour détecter les animaux présentant un hémorragie sous-arachnoïdienne précoce (
Choix des espèces
Les souris utilisées pour cette étude seront des souris SWISS car il existe une littérature importante rapportant l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVCi. En particulier, cette souche de souris a peu d'artères collatérales dans le cerveau ce qui permet d'avoir une lésion ischémique plus reproductible d'un animal à un autre. D'autre part, leur pigmentation de peau blanche rend plus facile la pose du cathéter caudal pour les examens IRM nécessitant l’administration d’un agent de contraste (imagerie de perfusion et de perméabilité). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : la maturité cérébrale est atteinte et le poids suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.
Evaluation du mélange Glubran®2/visipaque 320 sur modèle porcin lors d’embolisations artérielles rénales
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles cardiaques
6 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils subissent une obstruction des artères des reins sous imagerie, puis leurs reins sont prélevés pour analyse. Le porteur teste le remplacement d'un agent de contraste par un autre, en présentant le coût croissant du produit actuel comme le problème "majeur" à résoudre. Il justifie le choix du cochon par la ressemblance de ses reins avec ceux de l'humain, et écarte le recours à un simulateur au nom des conditions réelles de flux sanguin.
Objectifs
L'embolisation est une intervention thérapeutique mini-invasive consistant à obstruer une artère ou une veine. Elle permet d'empêcher le dysfonctionnement d'un vaisseau sanguin ou la prolifération d'une pathologie. Les indications de l’embolisation sont nombreuses et variées selon les pathologies et les vaisseaux à emboliser ( stopper une hémorragie ; traiter des lésions de vaisseaux sanguins ; traiter des tumeurs, et notamment des reins ou du foie) . Un des agents couramment utilisé pour l’embolisation est la Colle Chirurgicale Glubran®2 en mélange avec une huile iodée (Lipiodol) pour la visualisation sous rayons X. L'objectif du projet est d'évaluer le remplacement du Lipiodol par un autre agent de contraste lors d’embolisation artérielles rénales sur modèle porcin, et d’étudier son comportement rhéologique endovasculaire, en termes de pénétration et d’occlusion. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades le traitement le plus adapté.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet sera de proposer une alternative à l'utilisation du Lipiodol lors des embolisations chimiques au Glubran®2. En effet, le problème majeur du lipiodol est son cout croissant, qui freine aujourd'hui son utilisation. Des alternatives permettraient également d'apporter des solutions pour les patients pour lequel le lipiodol est contre-indiqué. Cela permetta d’offrir aux praticiens et aux malades le traitement le plus adapté .
Procédures
La veille du traitement, les animaux seront mis à jeun pour la nuit. Le jour du traitement, les animaux seront placés sous anesthésie générale et subiront une procédure chirurgicale mini-invasive d'une durée d'environ 30 minutes. (L'embolisation sera réalisée sous contrôle angiographique et l'accès aux artères rénales sera réalisé par navigation endovasculaire, après mise en place de guide et cathéter dans l'artère fémorale droite.) Les animaux ne seront pas réveillés à la fin de la procédure et les reins seront prélevés pour être analysés.
Impact sur les animaux
La procédure se fait sous anesthésie générale et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendu au cours de ce projet. Les nuisances ou effets indésirables pourraient être : douleurs et stress lors de l'induction de l'anesthésie par administration IM, saignements lors de l'introduction des guides et cathéters dans l'artère fémorale, qui pourront être stoppées par application d'un point de compression ou d'une suture si besoin.
Devenir
Les 6 porcs du projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs reins pour les analyser (micro CT et analyse histologique).
Remplacement
Pour cette étude, il est nécessaire de travailler en conditions réelles de flux artériel ce qui est actuellement impossible à reproduire sur simulateur ou in vitro.
Réduction
Le nombre minimum de répétitions pour s’assurer de la reproductibilité est de 3 par mixture, et il y a 4 mixtures à évaluer. 12 reins sont donc nécessaires. Afin de réduire le nombre d'animaux, les deux reins seront traités, et 6 porcs seront donc nécessaires.
Raffinement
Les porcs arriveront sur place au minimum 7 jours avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés par groupes sociaux afin de respecter leur comportement grégaire, dans un box sur litière de paille ou de copeaux de bois agrémenté de jouets. En cas de température inférieure à 10 degrés dans l’animalerie, un système de chauffage individuel sera activé. Lors de la semaine d'acclimatation, le personnel animalier observera deux fois par jour le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. La procédure se déroulera sous anesthésie générale (AG).
Choix des espèces
Le modèle choisi est le porc, car la taille, l'anatomie et la physiologie de ses organes ( reins) sont comparables à celles de l'homme. De plus, le calibre du réseau vasculaire ainsi que la cascade de la coagulation porcine sont comparables à l’homme. Les animaux auront entre 3 et 5 mois (environ 60 kg) pour avoir une taille d’organes (reins) comparable à ceux des humains.
Modèles précliniques in vivo pour l’exploration de la fonction rénale
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles urogénitaux
Rats : 150
600 rongeurs, 450 souris et 150 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. 150 souris subissent une obstruction chirurgicale de l'uretère pour provoquer une fibrose du rein, avec traitements quotidiens et séjours en cage métabolique, sur des animaux rendus diabétiques ou hypertendus. Le porteur signale que l'anesthésie profonde peut entraîner la mort chez ces animaux fragilisés. Les reins sont prélevés après la mise à mort, et il affirme que ses modèles in vitro ne peuvent "substituer" les observations chez l'animal.
Objectifs
10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale induit une perte de fonction de l’organe et le décès prématuré des patients due à des problèmes cardiovasculaires. Ces problèmes rénaux sont particulièrement exacerbés chez les personnes présentant des désordres métaboliques. Il a été démontré que le vieillissement, le diabètes ou la prise chronique de médicaments accélère le développement de maladies rénales chroniques à la suite de lésions aigües de l’organe. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles couramment utilisés ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique notament par l'absence de pathologies associées comme l'obésité, le diabètes ou le vieillssement. L'objectif de ce projet est de mettre en place de nouveaux modèles expérimentaux de rongeurs (souris, rats) afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant le rein. Les modèles de rongeurs développés dans ce projet permettront d'améliorer la prédiction d'efficacité et de toxicité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer de nouveaux modèles expérimentaux in vivo qui expriment une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur des modèles pertinents d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques. Enfin, comme les désordres métaboliques accélèrent l’établissement de maladie rénal chronique, ces nouveaux modèles in vivo permettront de réduire considérablement les délais d’expérimentations et les contraintes associés subit par les animaux.
Procédures
Les animaux utilisés dans ces procédures pourront être soumis à des prélevements de sang (20-50 ul) par légère incision au niveau de la queue afin de réaliser des dosages de marqueurs sanguin. Ces prélevements pourront se faire de manière répété avec un temps minimal de 48h entre 2 prises sur une durée de 7 jours, ou de façon hebdomadaire sur une durée de 4 semaines. 150 souris seront soumises à une obstruction de l'uretère par micro-chirurgie afin d'induire le développement rapide d'une fibrose rénale et de tester l'efficacité de composés anti-fibrotiques. Cette procédure chirurgicale est effectuée sous anesthésie pour une durée de 15-30 min. Les animaux utilisés dans ce projet seront aussi soumis à des traitements par des candidats médicaments (par voie oral, ou intra-péritonéal, ou intra-veineux) allant de 15 jours à 4 semaines. Ces traitements seront réalisés quotidiennement. Enfin, afin d'évaluer l'efficacité des candidats médicaments, les animaux pourront être placés en cages métabolique afin de collecter les urines et feces ainsi que mesurer la consommationd e nourriture et d'eau. Cette procédure nécessite le placement des animaux en cage individuelle avec fond en grille pendant 24h.
Impact sur les animaux
Certains animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à des procédures de microchirurgie rénale. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure chirurgicale d’obturation de l'uretère. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à opérer - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux ayant des problèmes métaboliques (obéses, diabétiques, hypertension) - Perte de poids à l'acte chirurgical
Devenir
Tous les animaux inclus dans chaque procédure seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.
Remplacement
En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons sur le développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations physiologiques réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiopathologique et les réponses systémiques ne peuvent pas être reproduites sur nos modèles in vitro.
Réduction
Dans la première phase de mise au point de chacun des modèles, un nombre restreint de souris sera utilisé (environ 20) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Ces procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la deuxième phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés : - Pour des données uniques en fin d'expérimentation, il seront analysés par ANOVA 1-way ou par le test de Kruskal-Wallis (en fonction de l'analyse des variances). - Pour des données enregistrées en longitudinales, celles-ci seront analysées par ANOVA 2-way + Bonferonni’s post-test.
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (100mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture. Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime.
Choix des espèces
Les souris C57/Bl6 wild-type ou génétiquement modifée db/db (présentant un phénotype diabétique), ainsi que le modèle de rat spontanément hypertendu (SHR) sont largement utilisés par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale. L’avantage des lignées de souris sélectionnées est qu’elles répondent très bien à la procédure de micro-chirurgie permettant une ligature de l'uretère afin d'induire une fibrose rénale et ils constituent un excellent mime des conditions de pathologies rénales retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, ces animaux ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. Les rats SHR présentent spontanément une hypertension artérielle, et les effets des médicaments pour la prévention des désordres rénaux peuvent être étudiés sans procédure additionnelle. Les procédures seront réalisées sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées. Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines pour les souris et 7 semaines chez le rat. Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines pour les souris et 7 semaines chez le rat. Les souris diabétiques db/db seront plus agées (environ 12 semaines) afin qu'elles puissent présenter des déréglements rénaux suffisant pour pouvoir les traiter et observer la restauration des fonctions rénales normales.
Les techniques d’embryologie réalisées sur des modèles génétiquement modifiés
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 12000
87 000 rongeurs, 75 000 souris et 12 000 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie tuée en fin de procédure et les femelles réimplantées avec succès transférées en élevage. Ils subissent vasectomies, réimplantations d'embryons et chirurgies sous anesthésie, avec prélèvements sanguins et injections, pour créer, congeler et régénérer des lignées génétiquement modifiées destinées à la communauté scientifique. Le porteur présente la cryoconservation et la fécondation in vitro comme des avancées réduisant le nombre d'individus utilisés. Il affirme que seul le recours à des "organismes entiers" vivants permet d'étudier les conséquences d'une modification génétique.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la création, la cryoconservation et la redérivation de lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche ou pour le développement de médicaments. À la vue du nombre croissant de modèles génétiquement modifiés, la cryoconservation de ceux-ci est devenue indispensable pour réduire le nombre d’animaux vivants utilisés pour une conservation du modèle génétique et sécuriser les lignées des éventuelles dérives génétiques, contaminations, catastrophe naturelle …
Bénéfices attendus
La création de lignées par réimplantation d’embryons permet l’obtention de modèles génétiquement modifiés ciblant un ou des gênes d’intérêt, modèle capital dans la compréhension des mécanismes physiologiques et physiopathologies des maladies, des médicaments et autres domaines de recherche. La cryoconservation des modèles génétiquement modifiés est devenue indispensable pour réduire le nombre d’animaux utilisés pour une conservation du modèle génétique et sécuriser les lignées des éventuelles dérives génétiques, contaminations, catastrophe naturelle… La redérivation de lignées génétiquement modifiées par réimplantation d’embryons permettra aux chercheurs d’avoir des animaux dont le statut sanitaire sera maitrisé et évitera ainsi tout éventuel impact du statut sanitaire sur l’expression du phénotype. Les résultats des essais réalisés sur cette lignée redérivée seront alors plus précis et limiteront donc le nombre d’animaux utilisés. La stimulation des femelles par traitement hormonal permet de synchroniser les individus et augmenter le nombre d’ovocytes collectés par femelle. Cette approche présente une avancée éthique considérable.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans le cadre de vasectomie ou de réimplantation d’embryons seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée de 20 minutes à 1 heure sous anesthésie générale. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Selon le besoin des projets, les animaux pourront être soumis à des injections intrapéritonales. Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions,aux injections de stimulations (72h max) et aux transferts entre les différentes zones. Douleur, stress et perte de poids dûs aux procédures chirurgicales et à la récupération post-opératoire (12h max).
Devenir
Les animaux sont transférés en zone d’élevage interne pour les femelles réimplantées avec succès. Tous les autres animaux sont mis à morts en fin de procédure expérimentale ou dans le cas d’atteinte d’un point limite.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne peut remplacer ce projet qui vise à fournir aux scientifiques les animaux qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. L’intérêt de disposer d’organismes vivants et entiers est de pouvoir observer ceci dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques.
Réduction
Basé sur nos données historiques, nous évaluons le nombre d’animaux requis pour répondre aux besoins des scientifiques. La technique de production d’embryons par Fécondation In Vitro pour les souris présente une avancée éthique considérable pour la réduction du nombre d’individus utilisés comparée à une technique d’accouplement naturel. La cryoconservation du potentiel génétique permet de réduire le nombre d’animaux requis pour la conservation ou la redérivation d’une lignée. La réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet repose sur : l'expertise de l’équipe embryologie et sa maitrise des procédures, les conditions expérimentales, le suivi des données techniques, l’observation de l’état clinique de l’animal afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle.
Raffinement
Le contrôle de la douleur est réalisé lors des procédures chirurgicales par une administration d’analgésique avant et après la chirurgie ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée après la chirurgie pour tous les animaux. La technique chirurgicale est régulièrement raffinée (dilacération plan musculaire vs incision …) afin de minimiser les nuisances liées à l’acte. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes Pour la stimulation hormonale, sont concernés que les animaux de 3 semaines minimum, dont la taille et le poids sont compatibles avec l’injection d’hormones, selon les recommandations éthiques en vigueur. Pour la vasectomie, sont concernés des animaux de 3 à 10 semaines. Pour la réimplantation d’embryons, sont concernés des animaux de 7 à 14 semaines
Modification spécifique du microbiote intestinal pour lutter contre l’inflammation du myocarde
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
4 307 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles reçoivent par gavage des bactéries intestinales et des injections de cellules immunitaires, avec des prélèvements répétés de sang et de fèces, pour tester une technique visant à bloquer un mimétisme moléculaire lié à une myocardite. Le porteur indique que le modèle de myocardite devient progressivement mortel et que, sur vingt semaines, jusqu'à la moitié des souris succomberaient ou seraient mises à mort, période qu'il prévoit de ramener à douze semaines. Il affirme que la complexité du microbiote et du système immunitaire ne peut être reproduite in vitro et qu'un modèle murin est "nécessaire".
Objectifs
Les maladies auto-immunes sont des maladies chroniques déclenchées par la perte de tolérance immunologique de l’organisme face à ses propres constituants. Dans leur grande majorité, ces dysfonctionnements du système immunitaire sont multifactoriels, compliquant de fait la détermination de l’origine exacte. Différents facteurs, tels que les facteurs génétiques, endogènes, exogènes et/ou environnementaux peuvent ainsi conduire ce dernier à s’attaquer aux constituants du soi. Notre susceptibilité à développer des maladies auto-immunes découlerait de l’exposition de notre système immunitaire aux micro-organismes viraux ou bactériens. L’une des théories est celle du mimétisme moléculaire. Celle-ci repose sur l’idée que les antigènes exposés par des micro-organismes puissent présenter des similitudes structurelles avec les antigènes du soi, ce qui induirait une réaction immunitaire chronique. Dans ce projet, nous nous intéressons au mimétisme moléculaire impliqué chez certains patients souffrant d’une myocardite inflammatoire. Une étude récente a démontré l’existence d’un mimétisme moléculaire entre un peptide de la myosine et celui d’une bactérie commensale du tractus gastro intestinal. Ce mimétisme peut causer ou aggraver la situation chez les patients souffrant de myocardite. Cette bactérie est une bactérie commensale retrouvée chez environ 80% de la population mondiale. Cette bactérie occupe de nombreuses fonctions indispensables pour notre santé, telle que l’absorption des fibres non digestibles de l’alimentation. Dans ce projet, nous avons pour ambition de développer une technologie nous permettant d’inhiber le mimétisme moléculaire de notre bactérie d’intérêt sans pour autant altérer sa présence dans l’intestin. En effet, au contraire des antibiotiques, notre technologie nous permettra de soulager les patients souffrant de myocardite sans pour autant impacter l’intégrité du microbiote intestinal. La réussite de ce projet ouvrira de nombreuses portes dans le développement thérapeutique de demain avec notamment le développement de traitements spécifiques contre toutes les pathologies auto-immunes déclenchées ou aggravées par ce phénomène de mimétisme bactérien.
Bénéfices attendus
Le mimétisme bactérien fait l’état d’une attention toute particulière ces dernières années. En effet, de nombreux laboratoires se sont lancés dans la compréhension des intéractions entre les maladies auto-immunes et le mimétisme bactérien de résidents du microbiote intestinal, afin de cibler spécifiquement cette communication dynamique pour le développement de nouvelle stratégie thérapeutique. Dans notre étude, nous nous intéressons au mimétisme moléculaire d’une espèce commensale du microbiote intestinal, présente chez environ 80% de la population humaine mondiale et qui pourrait avoir un impact important sur le développement et l’aggravation de la myocardite inflammatoire. À notre connaissance, aucun traitement efficace n’a été développé pour soigner ces patients. Ce projet servira non seulement à démontrer la puissance et la spécificité des stratégies développées dans un environnement aussi complexe que l’intestin de mammifère, mais permettra également de mieux appréhender les intéractions entre les bactéries de l’espèce B. theta et le système immunitaire de l'hôte. Par ailleurs, nous développerons un modèle de transfert de matériel fécal humain chez la souris. Notre étude permettra également d’en apprendre plus sur ce nouveau modèle au vu d’un développement futur. En effet, ce modèle murin à flore humanisée correspond aux conditions les plus proches de celles retrouvées chez l’Homme. Pour finir, le bénéfice ultime de ce projet concerne les patients souffrant de myocardite inflammatoire. A l'issue des 5 ans d’expérimentation, nous espérons acquérir des connaissances solides sur le développement d’une stratégie de traitement efficace pour lutter contre la survenue et l’évolution de cette maladie en forme grave. Cette preuve de principe ouvrira le chemin à de nombreuses applications de traitement contre d‘autres maladies auto-immunes liées au mimétisme bactérien.
Procédures
Dans ce protocole, les animaux recevront un gavage oral de quelques secondes avec des souches bactériennes. Celui-ci sera effectué à l’aide d’une canule souple adaptée à une utilisation chez la souris par un manipulateur expérimenté à cette technique. Des prélèvements de sang de quelques secondes seront effectués sur certains animaux de ce protocole à la fréquence d’une fois par mois pendant 3 mois. Des prélèvements de fèces seront également réalisés de façon non invasive sur nos animaux durant toute la durée des procédures de ce protocole (maximum 5 fois par semaine pendant 1 mois, puis 1 fois par semaine pendant 2 mois). L’injection intraveineuse de cellules immunitaires sera effectuée une fois dans la vie de certains animaux, pendant quelques secondes. L’ensemble de ces gestes seront effectués par des manipulateurs expérimentés à ces techniques.
Impact sur les animaux
Nos souches bactériennes d’intérêt ne sont pas des pathogènes murins et ne devraient déclencher aucun symptôme à elles seules dans le modèle d’intérêt. Un léger stress est attendu lors du gavage des animaux, mais la présence de praticiens expérimentés réduira ce stress au minimum. Les souris génétiquement modifiées d’intérêt vont-elles développer des symptômes d'inflammation après injection des cellules immunitaires reconnaissant la bactérie d’intérêt. Aucun symptôme n’est attendu en l’absence de cette bactérie. D’après la littérature, l’inflammation attendue se limitera à une augmentation des cytokines inflammatoires dans le sang, et une infiltration de cellules immunitaires sans avoir d’atteintes physiques sur les animaux. Enfin, le modèle de myocardite inflammatoire devrait entrainer une activation de ces cellules immunitaires et une inflammation chronique, en particulier au niveau du cœur. Après 6-8 semaines de colonisation, ce phénotype devient progressivement létal; après 20 semaines de colonisation, jusqu’à 50% des animaux succomberont ou seront mis à morts (données issues de la littérature). Nous prévoyons de réduire la période d’observation à 12 semaines, ce qui est le minimum requis pour obtenir des données exploitables. Dans tous les cas, ces souris seront surveillées de très près, et les points limites décrits dans les procédures correspondantes seront appliqués.
Devenir
Tous les animaux étant soit génétiquement modifiés soit colonisés par une bactérie (ou les deux), ils seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Dans un but de remplacement, une partie de notre étude se base sur des expériences préliminaires avec des cellules immunitaires en culture que l’on a stimulées en présence de différents peptides candidats pour être ‘non immunogènes'. Cependant, les résultats obtenus avec des cellules isolées ne sont pas représentatifs de la complexité du système immunitaire et des interactions qui peuvent avoir lieu dans un milieu structuré tel qu'un organisme vivant. De plus, les interactions entre membres du microbiote intestinal ne peuvent pas être totalement reproduites in vitro; or ces interactions sont primordiales pour évaluer l’efficacité de nos approches thérapeutiques, qui doivent pouvoir atteindre les bactéries cibles dans un contexte anatomique précis (survie des traitements dans le tractus gastro-intestinal, bactéries dans le lumen vs mucus du côlon, etc).
Réduction
Afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés, une même expérience pourra être mise en place de manière à pouvoir répondre à plus d'une question scientifique en utilisant un même lot d’animaux. En amont de la phase d'expérimentation animale, nous avons comparé une collection de peptides candidats pour leur capacité à ne pas déclencher une activité dans des lymphocytes T répondants . Basés sur cette expérience, nous avons pré-sélectionné les meilleurs candidats pour ne pas avoir à comparer un trop grand nombre de peptides chez l’animal. De plus, nous allons vérifier la colonisation bactérienne dans l’intestin des animaux au cours de l’expérience à partir du matériel fécal; ce type de stratégie non invasive, que nous avons déjà mis en place dans le passé, nous permettra de réduire le nombre d’animaux à sacrifier sans perte de connaissance essentielle pour le développement et l'interprétation de nos expérimentations. En outre, pour investiguer la réduction de symptômes après traitement, nous avons choisi un modèle qui présente une très haute pénétrance dans le développement de la pathologie, afin d’optimiserle condtions expérimentales en réduisant le nombre d’animaux utilisés. L’utilisation de tests statistiques (t-test, Mann Whitney et ANOVA), et la consultation au besoin de biostatisticiens tout au long des séries d’expérimentation nous permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux à utiliser tout en garantissant la qualité et la reproductibilité des résultats.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, les animaux ne seront jamais laissés seuls dans une cage pour faciliter les intéractions sociales. Les souris seront manipulées avant le début des expériences afin de les habituer et leur enlever un maximum de stress en début d’expérimentation. Les modèles animaux sont choisis avec soin en fonction de l’état actuel des connaissances ainsi que la finalité recherchée. Les procédures sélectionnées ont été préalablement étudiées pour réduire au maximum la souffrance animale. Ainsi, nous donnons une préférence aux procédures non invasives. Certaines mises seront effectuées autant que possible sur des animaux/modèles ne présentant pas de symptômes de pathologie, afin de minimiser le nombre d’animaux concernés par une procédure sévère. Les points limites établis préalablement seront bien évidemment respectés, et raffinés en fonction des résultats des premières expériences. Des tests statistiques seront utilisés tout au long du projet pour réajuster le nombre d’animaux en fonction des résultats obtenus. Dans le but de vérifier le niveau d’anxiété des animaux axéniques inoculés avec un microbiote, nous réaliserons un contrôle des expressions faciales. Aussi, dans le cadre de la seule procédure sévère de ce protocole, les animaux souffrant de déshydratation recevront une injection sous-cutanée d’une solution saline à 37°C.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous effectuerons au préalable des tests d’activités in vitro en conditions reflétant au maximum la réponse immunitaire des cellules T aux peptides candidats afin de sélectionner uniquement les meilleurs pour nos expériences chez l’animal. Cependant, un modèle qui mime les symptômes et qui nous permettra de quantifier l'efficacité de notre traitement est nécessaire; un tel modèle n’existe à notre connaissance que chez la souris, où il a déjà été développé par un chercheur expert de ce champ de recherche. De plus, il existe une version de ce modèle avec des symptômes beaucoup moins sévères, également en souris, ce qui nous permettra de répondre à de nombreuses questions scientifiques avant l’utilisation du modèle le plus symptomatique en fin de projet. Nous utiliserons dans ce projet des animaux jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines, afin de laisser la flore intestinale se stabiliser post-sevrage avant notre intervention.
Evaluation des CAR-T Cells pour traiter la fibrose dans la Dystrophie Musculaire de Duchenne dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections répétées de lymphocytes T génétiquement modifiés, des prélèvements sanguins, des échocardiographies sous anesthésie et une mesure de force par stimulation du nerf sciatique, avant la mise à mort pour prélever le cœur et les muscles. Le porteur décrit un affaiblissement musculaire et une baisse modérée de la fonction cardiaque liés au modèle lui-même. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés à une utilisation future, et le porteur revendique la souris comme une source "unique et indispensable" faute de système in vitro reproduisant la maladie.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations du gène de la dystrophine qui assure la stabilité structurelle des muscles squelettiques et cardiaque. Chez les patients DMD, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. La présence d’une quantité importante de tissus fibreux (fibrose) dans le muscle des patients est l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement. Pour cette raison, il est cliniquement pertinent de réduire la quantité de tissus fibreux comme une nouvelle piste dans la prise en charge de la DMD. L’une de ces pistes consiste à cibler et dégrader une protéine présente en grande quantité au niveau des tissus fibreux et ceci à l’aide de lymphocytes T génétiquement modifiés ou de nanoparticules lipidiques permettant de cibler spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin de cardiopathie a été préalablement réalisée. Cette pathologie diffère toutefois de la DMD, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables à la DMD. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de lymphocytes T génétiquement modifiés dans des modèles murins de DMD. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la DMD.
Bénéfices attendus
La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes-T spécifiques dans des modèles murins de la dystrophie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. L’objectif de ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la dystrophie de Duchenne à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permet également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront 1- Injection intra-péritonéale en solution saline (150 microlitres, réalisée en quelques secondes) -2 Injections intra-veineuse caudale espacées d'une semaine (solution isotonique saline contenant ou pas des lymphocytes) réalisés sous anesthésie avec un volume de 150 microlitres, avec une durée d'environ 5 minutes - 3 Prélèvements sanguins (une goutte, environ 50microlitre) espacés d'une semaine pour les deux premiers et 3 mois plus tard pour le dernier avec une durée d'une minute -Echocardiographie réalisé sous anethésie (fréquence 3, durée 20 minutes). -Test de préhension (Fréquence 5; Durée 2 minutes) qui consiste à mesurer la capacité de la souris à s'agripper sur une grille et de ce fait nécessite que l'animal soit éveillé. Cet examen n'est pas invasif et ne provoque donc aucune douleur chez l’animal. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal. -Mesure de la force musculaire suite à une stimulation du nerf sciatique réalisée sous anesthésie générale et analgésie (Fréquence 1; durée 15 minutes). A l'issue de ce test la procédure sera achevée pour procéder à l’analyse histologique des tissus afin de récolter les données. Ainsi, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et si nécessaire analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci à l’exception du test de préhension et du prélèvement sanguin. Une grille d’évaluation des points limites sera établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité. Tous les animaux qui ont atteint les points limites seront sortis de protocole précocement.
Impact sur les animaux
Ici, les souches de souris étudiées ont été choisies pour mimer la pathologie humaine. Les effets indésirables consistent en l'affaiblissement musculaire et une réduction modérée de la fonction cardiaque. La contention pour l'injection intra-péritonéale et le prélèvement sanguin pourrait générer du stress à l'animal, cependant le même expérimentateur sera chargé de l'acte et les souris seront préalablement habituées à la personne. Le prélèvement de sang (une goutte) peut occasionner un léger stress chez l'animal, ce niveau de stress est équivalent à l'effet d'une piqure. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal.
Devenir
A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (coeur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et receuillir ainsi les donnés indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.
Remplacement
En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité des CAR-T cells est mise en place in vitro via des tests cytotoxiques sur des modèles cellulaires musculaire et cardiaque. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité in vitro. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration histologique et fonctionnelle induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur le profil de sécurité de ce traitement grâce à la détection d’un potentiel syndrome de relargage des cytokines, effet indésirable communément observé en clinique humaine.
Réduction
Nous allons dans un premier temps vérifier grâce à des coupes histologiques issues de travaux précédents la présence des protéine d’intérêt chez des animaux d’âge et sexe différents. Le but est de sélectionner le moment optimal de l’administration de CAR-T cells pour observer un effet thérapeutique. Lors du passage à la phase in vivo, les mêmes animaux sont utilisés pour les évaluations fonctionnelles, les tests de contraction musculaire ainsi que les études d’histologie et de transcriptomique à la suite de la mise à mort. Les procédures expérimentales sont donc conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés au maximum, sans compromettre la puissance statistique de l’étude. Les calculs d’effectifs, assurés par une statisticienne, se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe. Ce nombre devrait permettre de valider le concept et tient compte de l’exclusion du protocole de certains animaux (due à l’atteinte de points limites ou de décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisé sera de 300 souris. L’effectif de 25 souris par groupe a été établi grâce à un calcul de puissance. Suite à l'analyse des données, des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Nous réduirons au maximum la souffrance des animaux. En effet, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception des mesures de la force musculaire (test de préhension) l'injection intra-péritonéale et le prélèvement d'une goutte de sang, seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse de CAR-T cells étant donné qu’elle est simple et non invasive. L'injection sera réalisée sous anésthésie et avec l'utilisation d'une source de chaleur pour dialter la veine ce qui facilitera l'injection. Pour réduire les effets indésirable liés à des anesthésies fréquentes, les prélèvements sanguins correspondant en terme de douleur et stress à une piqure seront réalisés sans anethésie. Des antalgiques sont prévus pour la mesure de la force musculaire qui intervient en étape finale. Une grille d’évaluation des points limites est établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité . Tous les animaux qui ont atteint ces points limites seront euthanasiés précocement. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté, c’est-à-dire avec des congénères (répartis en cages de 5) et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (cubes de bois à ronger, abris, substrats pour la construction de nids, nourriture et eau de boisson ad libitum) afin de créer un environnement propice au confort des animaux.
Choix des espèces
Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser des modèles murins car aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la DMD. Nous utiliserons ici un modèle préclinique pertinent de la Dystrophie de Duchenne. Ces modèles développent une fibrose du myocarde et des muscles squelettiques, ainsi qu'une altération fonctionnelle et récapitule ainsi la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. Les contrôles seront des souris contrôle saines avec le même fond génétique. Ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application potentielle chez l’homme de ces approches thérapeutiques. La souris constituant le modèle sera étudiée entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant accompli leurs croissances musculaires et cardiaques. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ces modèles à partir de 5 mois. Cette fourchette sera affinée en fonction de l’analyse histologique en cours de coupes issues d’études antérieures.
Effets d’un antihypertenseur pulmonaire sur les molécules plasmatiques au repos et après un test d’activité
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
30 souris mâles vont être utilisées, réutilisées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un antihypertenseur pulmonaire par gavage avec prélèvements veineux six fois en six semaines, et passent un test d'activité quatre fois. Le porteur veut vérifier chez la souris des effets déjà observés chez l'humain et valider le modèle murin pour cette famille de médicaments. Il écarte les femelles pour éviter la variabilité liée au cycle hormonal, et affirme que le modèle cellulaire est "peu adapté".
Objectifs
Ce projet vise à 1) Décrire les effets d’un antihypertenseur pulmonaire en prise unique et par voie orale sur les molécules plasmatique des souris au repos et après un test d’activité 2) Comparer les effets observés avec ceux obtenus chez l’humain
Bénéfices attendus
Les effets du médicament sur les molécules du plasma de la souris pourront confirmer ceux observés chez l’homme. Ceci pourra : 1) Confirmer l’action du médicament sur certaines voies physiopathologiques remaniées chez l’homme, 2) Montrer la pertinence du modèle murin dans l’étude de la pharmacodynamique du médicament et pour l’exploration d’autres médicaments de la même famille
Procédures
Gavage/prélèvement veineux au niveau de la veine mandibulaire sur animaux vigiles c’est-à-dire non anesthésiés : 6 fois en 6 semaines (1 fois par semaine) Test d’activité sur animaux vigiles c’est-à-dire non anesthésiés: 4 fois en 4 semaines (1 fois par semaine)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont l’inconfort lié à l'administration orale , au prélèvement sanguin veineux et au test d’activité. Il n’y a pas d’effet indésirable (somatique ou comportamental), dû au médicament à la dose utilisée. Le médicament va être administré dans une solution sucrée à pH neutre.
Devenir
A la fin du protocole et en tenant compte des procédures menées tous les animaux peuvent être réutilisés
Remplacement
Les effets du médicament ont déjà été étudiés chez l’homme. Il nous semble donc indispensable d’utiliser le modèle murin (la souris) pour confirmer et amplifier nos connaissances sur les effets du médicament sur les molécules du sang. La réponse globale au médicament intégrant tous les organes ainsi que les effets combinés du médicament et de l’activité physique sur les molécules du sang rendent le modèle cellulaire (cellules en culture) peu adapté à notre problématique
Réduction
L’étude envisagée est une étude appariée dans laquelle chaque souris est son propre témoin. Cette méthodologie permet de réduire le nombre de souris dans le protocole
Raffinement
Les souris seront logées dans des cages avec de l’enrichissement. Il ne s’agit pas d’un protocole comportant une souffrance animale nécessitant des soins. Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (au minimum 2, au maximum 4), enrichies par des jouets (rouleau de sopalin, copeaux, maison). Les animaux sont surveillés au quotidien par le personnel de l'animalerie. Le poids des animaux sont suivis en fonction de leur croissance et des procédures opératoires.
Choix des espèces
Le devenir du médicament ainsi que quelques aspects de son mécanisme d'action sont aussi bien connus chez la souris que chez l’homme. Ces mécanismes évalués chez la souris montrent une grande similitude avec ce qui se passe chez l'Homme. Sur un versant plus pratique la souris a un taux de fécondité très élevé avec une maturité sexuelle aquise rapidement. Aussi nous allons utiliser des souris mâles car les souris femelles sont soumises aux changements hormonaux liés au cycle menstruel ce qui impacte fortement le taux de molécules dans le sang. Nous voulons éviter cette source de variabilité dans une première étude. Sur un versant plus pratique la souris a un taux de fécondité très élevé avec une maturité sexuelle acquise rapidement et un coût d’élevage par animal très avantageux. Cet âge correspond approximativement à un âge humain de 30 ans, ce qui est en accord avec les objectifs de l’étude qui s’intéresse dans un premier temps aux effets du médicament dans une population de jeunes adultes. Nous allons utiliser des souris de 5 mois.
Exposition maternelle à un mélange de contaminants alimentaires et effets sur la descendance chez les lapines Site N°2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
476 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles reçoivent par voie orale un mélange de contaminants alimentaires chaque jour pendant 90 à 120 jours, avec prélèvements sanguins et suivi échographique de la gestation, puis elles et leur descendance sont mises à mort à différents stades, du fœtus à neuf mois, pour prélever organes et tissus. Le projet vise à évaluer les effets de ces contaminants sur la santé de la mère et des enfants. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable" et qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut le remplacer.
Objectifs
La population générale est exposée à de nombreux contaminants alimentaires qui entrent dans la composition d’un grand nombre de produits de consommation courante. La population, dont les femmes enceintes, est exposée quotidiennement à ce mélange de substances par ingestion, inhalation et/ou voie cutanée. Or, cette exposition représente un risque élevé pour la santé de la mère et de sa descendance. Ce risque est mal caractérisé car les études prennent rarement en compte les effets d’une exposition multiple à plusieurs contaminants (effet cocktail). De plus, le pas de temps entre les générations humaines est trop long pour permettre d’identifier les risques de pathologies développés à l’âge adulte. Il apparait donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour explorer ces effets qui peuvent être spécifiques au sexe de la descendance. Les objectifs du projet sont d'évaluer les effets de l’ingestion maternelle d’un mélange de contaminants alimentaires, fréquemment retrouvé dans les prélèvements humains et suspecté d'affecter le poids placentaire et le poids du nouveau-né chez l’humain. Ces effets seront étudiés, chez des lapines, sur le développement et la croissance du fœtus au cours de la gestation, la fonction du placenta, la santé de la descendance en termes de maladies cardiovasculaires, d’obésité, de diabète et de troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des effets d'un mélange de contaminants alimentaires sur la santé des mères et de leurs enfants en termes de maladies cardiovasculaires, d’obésité, de diabète et de troubles de la reproduction/fertilité. Les résultats obtenus aideront au suivi clinique des enfants dont les mères ont été exposées à ce cocktail de contaminants au cours de la conception, la grossesse et l’allaitement maternel. De plus, ce projet va générer des informations sur la toxicité de l'exposition des mères aux contaminants alimentaires et sur leurs effets sur la descendance, ce qui représente un défi pour les autorités publiques en termes de recommandations et d'évaluation des risques, pour les femmes enceintes, les nourrissons, les enfants et les adultes.
Procédures
1ère étape sur le lot N°1 de 24 animaux : Sur 10 animaux, collecte de sang pour évaluer le niveau de base des contaminants chez les animaux. 15 jours après, injection du mélange de contaminants alimentaires sous anesthésie locale (12 animaux) ou exposition orale aux contaminants alimentaires (12 animaux), prises de sang sous anesthésie locale de 3 min sur animaux vigiles (3 prélèvements maximum par animal). 2nde étape sur le lot N°2 de 40 animaux : exposition orale aux contaminants alimentaires (une fois par jour) pendant 90 jours, prises de sang de 3 min sur animaux vigiles (une fois sur 10 animaux contrôles et 10 exposées), suivi échographique de la gestation à 4 stades de gestation sur des animaux vigiles, 40 min maximum d’échographie par session, 4 sessions par animal à une semaine d’intervalle. 3ème étape sur le lot N°3: exposition orale aux contaminants alimentaires de 40 animaux, une exposition par jour pendant 120 jours. Sur les descendants, 20 mâles et 20 femelles par groupe : - prises de sang avec anesthésie locale sur animaux vigiles à 5 et 8 mois (durée 3 min par prélèvement) - mesure de la pression artèrielle à 5 et 8 mois sur animaux vigiles (durée totale par stade 30 min) - test de tolérance au glucose pour rechercher le développement d’un éventuel diabète sur animaux vigiles (prise de sang à 6 temps différents, durée quelques secondes car pose d’un cathéter pour une durée de 120 min pour ne pas avoir à réintroduire une aiguille) - mesure de la répartition de la masse maigre, masse grasse et densité osseuse à 7 mois (acquisition d’images sur animaux anesthésiés pendant 15 min) - collecte de sperme à 6, 7 et 8 mois Sur les descendants, 10 mâles et 10 femelles par groupe : Mise à la reproduction des descendants âgés de 9 mois, suivi échographique de la gestation à 4 stades de gestation sur des animaux vigiles, 40 min maximum d’échographie par session, 4 sessions par animal à une semaine d’intervalle.et évaluation des effets sur les ovaires et testicules de la seconde génération.
Impact sur les animaux
- Risques de stress liés à la manipulation pour l’exposition par voie orale ou à la contention pour les prélèvements de sang et les approches physiologiques - Le sevrage peut être une étape délicate chez le lapin car il peut parfois causer un risque de diarrhée - Une douleur peut apparaître au point de prélèvement de sang
Devenir
-Mise à mort des animaux adultes afin de collecter un important volume de sang, ce qui est nécessaire pour mettre les dosages des contaminants et de leurs dérivés -Mise à mort des femelles non gestantes et des femelles après sevrage des descendants. Etape nécessaire pour évaluer les effets des contaminants sur les différents tissus par des approches d’histologie et de biologie moléculaire. -Mise à mort des animaux en fin de gestation : cette étape est nécessaire pour déterminer le poids des organes et conditionner les tissus pour de l’histologie et des approches de biologie moléculaire permettant de caractériser les effets des contaminants et de rechercher déjà à cette étape des signatures prédictives de certaines maladies développées à l’âge adulte. -Mise à mort des descendants à différents stades (4 jours, sevrage, 3 mois, 9 mois) : nécessaire pour suivre le développement des ovaires et des testicules et/ou l’apparition de troubles métaboliques mais aussi corréler des effets physiologiques observés chez l’animal aux données histologiques, aux profils en lipides et aux approches de biologie moléculaire.
Remplacement
Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit d’étudier les effets de l’exposition maternelle aux contaminants sur la vie fœtale et au stade adulte. Il n'est donc pas possible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou une simulation informatique.
Réduction
- Pour étudier la distribution des contaminants dans le sang et les urines, le nombre d’animaux a été défini selon un modèle de distribution des contaminants décrit dans la littérature scientifique et qui permet de limiter le nombre d’animaux à chaque temps de collecte de sang. -,Les animaux adultes seront exposés pendant une période de 90 jours qui inclut la période gestationnelle. Comme les contaminants sont connus pour affecter la fertilité, 40 lapines seront mises en protocole afin d’obtenir 12 lapines gestantes par groupe et 96 animaux dans le groupe témoin et 96 animaux dans le groupe exposé au stade fœtal. Ces effectifs ont été déterminés en nous basant sur nos précédents protocoles et publications scientifiques. - Pour le suivi de la descendance après la naissance, sur les 96 descendants attendus par groupe et de manière à prendre en compte les effets sexe et à avoir des résultats scientifiques robustes : 5 mâles et 5 femelles/groupe seront mise à mort à 4 jours afin d’évaluer les effets sur le développement des ovaires et des testicules ; 10 mâles et 10 femelles/groupe seront euthanasiés au sevrage et à 3 mois afin d’évaluer les effets sur le développement des ovaires et des testicules. Ces effectifs ont été calculés afin d’obtenir des résultats robustes en histologie et en biologie moléculaire. - Pour l’étude de la fréquence cardiaque, la pression sanguine, la composition corporelle (masse maigre, masse grasse et densité osseuse), la qualité du sperme et la recherche d’un diabète, 20 mâles et 20 femelles/groupe seront suivis afin d’obtenir des résultats robustes prenant en compte le sexe. Parmi ces animaux, 10 mâles et 10 femelles/groupe seront euthanasiés à 9 mois pour une exploration de la fonction hépatique et gonadique. -, Pour calculer le taux de reproduction, 10 mâles et 10 femelles/groupe issus de lapines exposées ou non aux contaminants pendant la gestation et la lactation seront mis à la reproduction, il s’agit d’un nombre nécessaire et suffisant pour évaluer ce paramètre. - Tous les tissus maternels et de la descendance seront collectés et stockés afin de pouvoir être utilisés dans le projet lui-même mais aussi ultérieurement dans d’autres projets collaboratifs.
Raffinement
- Les cages d’hébergement des animaux seront enrichies avec une chaînette, des mobiles suspendus, une plateforme et des blocs à ronger composés de foin compressé. De plus, pour le confort de l’animal, les cages disposent de repose-pattes. Les animaux seront en cage individuelle mais les cages sont positionnées les unes à côté des autres ce qui permet aux animaux d’être en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Au moment de la reproduction et de l’élevage, les salles d’hébergement disposent de blocs de phéromones maternelles qui diminuent les sources de stress et apaisent les animaux. - L'état de santé des animaux sera surveillé tous les jours et tout au long de l'expérience, incluant le niveau d’activité, le comportement, la posture au repos, l’apparence (pelage), l’alimentation, les mouvements à la sollicitation. Si un animal présentait une altération de ces critères alors une évaluation de la douleur serait réalisée avec la grille dédiée à l’établissement d’un score. Selon le score, une analgésie serait mise en place. Si la douleur persistait, après concertation avec le vétérinaire, l’euthanasie pourrait être envisagée. - Une phase d’habituation à la manipulation, à l’exposition par voie orale et à la contention sera mise en place 4 semaines avant l’entrée en protocole des animaux. - Avant la mise à mort, les lapines gestantes seront pré-médiquées avec un analgésique de type morphinique qui traverse la barrière placentaire et qui assurera l’analgésie de la mère et des fœtus.
Choix des espèces
Pour ce projet, l’espèce lapin a été choisie pour plusieurs raisons : i/ son type de placentation est plus proche de celle de l’humain que celle des rongeurs ii/ sa taille permet de réaliser un suivi de la gestation en utilisant des appareils d’échographie utilisés en clinique humaine iii/ il n’est pas nécessaire d’anesthésier les lapines pour réaliser les échographies iv/ cette espèce est pertinente pour étudier la toxicité sur le développement du fœtus et offre la possibilité d'évaluer les effets à long terme v/ le lapin est une espèce plus appropriée pour suivre la distribution des contaminants car, chez le lapin comme chez l’humain, l'élimination urinaire prédomine vi/ cette espèce est pertinente car la production d’hormones par les ovaires et testicules pendant la vie fœtale est similaire à celle de l'homme. Stades de développement choisi : - Animaux adultes : nécessaire à l’étude de la distribution des contaminants dans le sang et les urines mais également à l’exposition des femelles pour évaluer les effets sur la santé des descendants aux stades de développement décrits ci-dessous - Stade fœtal (28 jours de gestation) : nécessaire pour étudier les effets des contaminants sur la croissance et le développement fœto-placentaire, les paramètres biochimiques, la biologie moléculaire de différents tissus, dont le placenta, ceci afin de relier la santé des fœtus à la santé à l’âge adulte. - Stade de la naissance au sevrage et à l’âge de 3 mois : nécessaire à l’étude des effets de l’exposition sur le développement de l’ovaire et du testicule. - De l’âge de 5 à 9 mois : nécessaire pour évaluer si l’exposition des mères aux contaminants alimentaires au cours de la gestation et de la lactation altère la santé de la descendance et augmente le risque de troubles cardio-métaboliques (augmentation du risque d’obésité, de diabète, de maladies cardiovasculaires, composition corporelle) et de la fertilité.
Exposition maternelle à un mélange de contaminants alimentaires et effets sur la descendance-chez les lapines- Site N°1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
476 lapins, femelles reproductrices et leur descendance, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les lapines sont exposées par voie orale pendant la gestation à un mélange de contaminants alimentaires, avec suivi par prises de sang et échographies, tandis que la descendance subit des tests de tolérance au glucose, des mesures de composition corporelle et des collectes de sperme. Adultes et petits sont tués à différents âges, dès quatre jours pour certains, afin d'analyser organes et tissus. Le porteur affirme le recours à l'animal "indispensable" pour étudier les effets d'une exposition maternelle sur toute une vie.
Objectifs
La population générale est exposée à de nombreux contaminants alimentaires qui entrent dans la composition d’un grand nombre de produits de consommation courante. La population, dont les femmes enceintes, est exposée quotidiennement à ce mélange de substances par ingestion, inhalation et/ou voie cutanée. Or, cette exposition représente un risque élevé pour la santé de la mère et de sa descendance. Ce risque est mal caractérisé car les études prennent rarement en compte les effets d’une exposition multiple à plusieurs contaminants (effet cocktail). De plus, le pas de temps entre les générations humaines est trop long pour permettre d’identifier les risques de pathologies développés à l’âge adulte. Il apparait donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour explorer ces effets qui peuvent être spécifiques au sexe de la descendance. Les objectifs du projet sont d'évaluer les effets de l’ingestion maternelle d’un mélange de contaminants alimentaires, fréquemment retrouvé dans les prélèvements humains et suspecté d'affecter le poids placentaire et le poids du nouveau-né chez l’humain. Ces effets seront étudiés, chez des lapines, sur le développement et la croissance du fœtus au cours de la gestation, la fonction du placenta, la santé de la descendance en termes de maladies cardiovasculaires, d’obésité, de diabète et de troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des effets d'un mélange de contaminants alimentaires sur la santé des mères et de leurs enfants en termes de maladies cardiovasculaires, d’obésité, de diabète et de troubles de la reproduction/fertilité. Les résultats obtenus aideront au suivi clinique des enfants dont les mères ont été exposées à ce cocktail de contaminants au cours de la conception, la grossesse et l’allaitement maternel. De plus, ce projet va générer des informations sur la toxicité de l'exposition des mères aux contaminants alimentaires et sur leurs effets sur la descendance, ce qui représente un défi pour les autorités publiques en termes de recommandations et d'évaluation des risques, pour les femmes enceintes, les nourrissons, les enfants et les adultes.
Procédures
1ère étape sur le lot N°1 de 24 animaux : Sur 10 animaux, collecte de sang pour évaluer le niveau de base des contaminants chez les animaux. 15 jours après, injection du mélange de contaminants alimentaires sous anesthésie locale (12 animaux) ou exposition orale aux contaminants alimentaires (12 animaux), prises de sang sous anesthésie locale de 3 min sur animaux vigiles (3 prélèvements maximum par animal). 2nde étape sur le lot N°2 de 40 animaux : exposition orale aux contaminants alimentaires (une fois par jour) pendant 90 jours, prises de sang de 3 min sur animaux vigiles (une fois sur 10 animaux contrôles et 10 exposées), suivi échographique de la gestation à 4 stades de gestation sur des animaux vigiles, 40 min maximum d’échographie par session, 4 sessions par animal à une semaine d’intervalle. 3ème étape sur le lot N°3: exposition orale aux contaminants alimentaires de 40 animaux, une exposition par jour pendant 120 jours. Sur les descendants, 20 mâles et 20 femelles par groupe : - prises de sang avec anesthésie locale sur animaux vigiles à 5 et 8 mois (durée 3 min par prélèvement) - mesure de la pression artèrielle à 5 et 8 mois sur animaux vigiles (durée totale par stade 30 min) - test de tolérance au glucose pour rechercher le développement d’un éventuel diabète sur animaux vigiles (prise de sang à 6 temps différents, durée quelques secondes car pose d’un cathéter pour une durée de 120 min pour ne pas avoir à réintroduire une aiguille) - mesure de la répartition de la masse maigre, masse grasse et densité osseuse à 7 mois (acquisition d’images sur animaux anesthésiés pendant 15 min) - collecte de sperme à 6, 7 et 8 mois Sur les descendants, 10 mâles et 10 femelles par groupe : Mise à la reproduction des descendants âgés de 9 mois, suivi échographique de la gestation à 4 stades de gestation sur des animaux vigiles, 40 min maximum d’échographie par session, 4 sessions par animal à une semaine d’intervalle.et évaluation des effets sur les ovaires et testicules de la seconde génération.
Impact sur les animaux
- Risques de stress liés à la manipulation pour l’exposition par voie orale ou à la contention pour les prélèvements de sang et les approches physiologiques - Le sevrage peut être une étape délicate chez le lapin car il peut parfois causer un risque de diarrhée - Une douleur peut apparaître au point de prélèvement de sang
Devenir
-Mise à mort des animaux adultes afin de collecter un important volume de sang, ce qui est nécessaire pour mettre les dosages des contaminants et de leurs dérivés -Mise à mort des femelles non gestantes et des femelles après sevrage des descendants. Etape nécessaire pour évaluer les effets des contaminants sur les différents tissus par des approches d’histologie et de biologie moléculaire. -Mise à mort des animaux en fin de gestation : cette étape est nécessaire pour déterminer le poids des organes et conditionner les tissus pour de l’histologie et des approches de biologie moléculaire permettant de caractériser les effets des contaminants et de rechercher déjà à cette étape des signatures prédictives de certaines maladies développées à l’âge adulte. -Mise à mort des descendants à différents stades (4 jours, sevrage, 3 mois, 9 mois) : nécessaire pour suivre le développement des ovaires et des testicules et/ou l’apparition de troubles métaboliques mais aussi corréler des effets physiologiques observés chez l’animal aux données histologiques, aux profils en lipides et aux approches de biologie moléculaire.
Remplacement
Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit d’étudier les effets de l’exposition maternelle aux contaminants sur la vie fœtale et au stade adulte. Il n'est donc pas possible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou une simulation informatique.
Réduction
- Pour étudier la distribution des contaminants dans le sang et les urines, le nombre d’animaux a été défini selon un modèle de distribution des contaminants décrit dans la littérature scientifique et qui permet de limiter le nombre d’animaux à chaque temps de collecte de sang. -,Les animaux adultes seront exposés pendant une période de 90 jours qui inclut la période gestationnelle. Comme les contaminants sont connus pour affecter la fertilité, 40 lapines seront mises en protocole afin d’obtenir 12 lapines gestantes par groupe et 96 animaux dans le groupe témoin et 96 animaux dans le groupe exposé au stade fœtal. Ces effectifs ont été déterminés en nous basant sur nos précédents protocoles et publications scientifiques. - Pour le suivi de la descendance après la naissance, sur les 96 descendants attendus par groupe et de manière à prendre en compte les effets sexe et à avoir des résultats scientifiques robustes : 5 mâles et 5 femelles/groupe seront mise à mort à 4 jours afin d’évaluer les effets sur le développement des ovaires et des testicules ; 10 mâles et 10 femelles/groupe seront euthanasiés au sevrage et à 3 mois afin d’évaluer les effets sur le développement des ovaires et des testicules. Ces effectifs ont été calculés afin d’obtenir des résultats robustes en histologie et en biologie moléculaire. - Pour l’étude de la fréquence cardiaque, la pression sanguine, la composition corporelle (masse maigre, masse grasse et densité osseuse), la qualité du sperme et la recherche d’un diabète, 20 mâles et 20 femelles/groupe seront suivis afin d’obtenir des résultats robustes prenant en compte le sexe. Parmi ces animaux, 10 mâles et 10 femelles/groupe seront euthanasiés à 9 mois pour une exploration de la fonction hépatique et gonadique. -, Pour calculer le taux de reproduction, 10 mâles et 10 femelles/groupe issus de lapines exposées ou non aux contaminants pendant la gestation et la lactation seront mis à la reproduction, il s’agit d’un nombre nécessaire et suffisant pour évaluer ce paramètre. - Tous les tissus maternels et de la descendance seront collectés et stockés afin de pouvoir être utilisés dans le projet lui-même mais aussi ultérieurement dans d’autres projets collaboratifs.
Raffinement
- Les cages d’hébergement des animaux seront enrichies avec une chaînette, des mobiles suspendus, une plateforme et des blocs à ronger composés de foin compressé. De plus, pour le confort de l’animal, les cages disposent de repose-pattes. Les animaux seront en cage individuelle mais les cages sont positionnées les unes à côté des autres ce qui permet aux animaux d’être en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Au moment de la reproduction et de l’élevage, les salles d’hébergement disposent de blocs de phéromones maternelles qui diminuent les sources de stress et apaisent les animaux. - L'état de santé des animaux sera surveillé tous les jours et tout au long de l'expérience, incluant le niveau d’activité, le comportement, la posture au repos, l’apparence (pelage), l’alimentation, les mouvements à la sollicitation. Si un animal présentait une altération de ces critères alors une évaluation de la douleur serait réalisée avec la grille dédiée à l’établissement d’un score. Selon le score, une analgésie serait mise en place. Si la douleur persistait, après concertation avec le vétérinaire, l’euthanasie pourrait être envisagée. - Une phase d’habituation à la manipulation, à l’exposition par voie orale et à la contention sera mise en place 4 semaines avant l’entrée en protocole des animaux. - Avant la mise à mort, les lapines gestantes seront pré-médiquées avec un analgésique de type morphinique qui traverse la barrière placentaire et qui assurera l’analgésie de la mère et des fœtus.
Choix des espèces
Pour ce projet, l’espèce lapin a été choisie pour plusieurs raisons : i/ son type de placentation est plus proche de celle de l’humain que celle des rongeurs ii/ sa taille permet de réaliser un suivi de la gestation en utilisant des appareils d’échographie utilisés en clinique humaine iii/ il n’est pas nécessaire d’anesthésier les lapines pour réaliser les échographies iv/ cette espèce est pertinente pour étudier la toxicité sur le développement du fœtus et offre la possibilité d'évaluer les effets à long terme v/ le lapin est une espèce plus appropriée pour suivre la distribution des contaminants car, chez le lapin comme chez l’humain, l'élimination urinaire prédomine vi/ cette espèce est pertinente car la production d’hormones par les ovaires et testicules pendant la vie fœtale est similaire à celle de l'homme. Stades de développement choisi : - Animaux adultes : nécessaire à l’étude de la distribution des contaminants dans le sang et les urines mais également à l’exposition des femelles pour évaluer les effets sur la santé des descendants aux stades de développement décrits ci-dessous - Stade fœtal (28 jours de gestation) : nécessaire pour étudier les effets des contaminants sur la croissance et le développement fœto-placentaire, les paramètres biochimiques, la biologie moléculaire de différents tissus, dont le placenta, ceci afin de relier la santé des fœtus à la santé à l’âge adulte. - Stade de la naissance au sevrage et à l’âge de 3 mois : nécessaire à l’étude des effets de l’exposition sur le développement de l’ovaire et du testicule. - De l’âge de 5 à 9 mois : nécessaire pour évaluer si l’exposition des mères aux contaminants alimentaires au cours de la gestation et de la lactation altère la santé de la descendance et augmente le risque de troubles cardio-métaboliques (augmentation du risque d’obésité, de diabète, de maladies cardiovasculaires, composition corporelle) et de la fertilité.
Création de modèles de cathétérisation vasculaire et non vasculaire chez le rongeur destiné à des études toxicologiques, pharmacodynamiques ou pharmacocinétiques
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 12000
15 500 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale pour poser à demeure un cathéter dans un vaisseau, un organe ou le cerveau, puis peut recevoir jusqu'à quatre prélèvements sanguins ou gavages par jour, avec un hébergement isolé jusqu'à sept jours. L'établissement décrit une activité de fourniture de rongeurs cathétérisés "prêts à l'emploi", les animaux étant ensuite expédiés vivants aux laboratoires ou tués en cas d'atteinte d'un point limite ou pour contrôle qualité. Il justifie l'élevage d'animaux "surnuméraires" par les taux d'échec chirurgical et conclut que la complexité des mécanismes exclut un modèle in vitro.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles de rongeurs équipés de manière permanente (par technique chirurgicale) de cathéters dans des vaisseaux, des organes ou le cerveau permettant soit la libération de substances (comme des médicaments ou des hormones) de manière répétée ou continue, soit le prélèvement de fluides biologiques (sang, bile, liquide cérébro spinal)
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles cathétérisés permet l’administration répétée ou continue de substances d’intérêts (comme des médicaments ou des hormones) ou la mesure et le suivi de paramètres biologiques grâce au prélèvement de fluides biologiques comme le sang, la bile ou le liquide cérébro spinal chez l’animal tout en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie. Cela permet donc la réduction très importante du stress provoqué chez l’animal par des injections ou des prélèvements de manière répétée à différents sites d’injection ou de prélèvement. Ces administrations et mesures pourront permettre à la communauté scientifique d’augmenter leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines de recherche (devenir d’un médicament dans le corps, toxicité d’un médicament, maladies cardiaques, maladies du cerveau, hypertension, cancer, infertilité, ...) tout en réduisant les nuisances possibles sur l’animal.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure sous anesthésie générale et à la mise en place d’un matériel cathétérisé. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins ou à des gavages (maximum 4 prélèvements sanguins/gavages par jour). Les actes de prélèvements, de gavages et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 7 jours. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux font suite à la mise en place du cathéter suite à la chirurgie : douleur, stress et perte de poids possible chez tous les animaux dus aux contentions, aux procédures chirurgicales, à la présence du matériel cathétérisé. Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Les animaux sont à la demande, expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
La production de modèles cathétérisés a pour objectif de mettre à disposition des modèles prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Ces programmes visent à étudier les réactions des organes ou leurs interactions face à une substance, de comprendre la vie d’une substance à l’intérieur d’un organisme ou sa toxicité, ce qui entraine l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels programmes sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Les cathétérisations permettent le suivi de paramètres biologiques ou encore l’administration de substances répétées ou en continu en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie ce qui permet une réduction très importante pour l’animal du stress provoqué par des prélèvements ou des injections répétés à différents sites. Le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectuée dès la phase d’acclimatation (en fonction du stress observé de l’animal à réception, par exemple). Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique mais l’équipe de chirurgie se réserve le droit de proposer des changements de modèles sur la base de son expérience. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec la pose du matériel cathétérisé, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Conception d’un revêtement capable de pacifier la réponse inflammatoire secondaire à l’implantation de valve cardiaque artificielle 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
78 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Comme dans le volet complémentaire du même projet, des composants de bioprothèse cardiaque sont implantés sous la peau de leur dos sous anesthésie, avec deux séances d'imagerie TEP, avant euthanasie à J29 pour prélever le sang et les tissus. Le porteur teste un revêtement censé réduire l'inflammation déclenchée par les valves biologiques, un bénéfice pour les patients qu'il formule au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe aucune méthode fiable sans animaux et que la souris reproduit fidèlement la réaction humaine aux biomatériaux.
Objectifs
Les valves cardiaques artificielles sont utilisées pour remplacer des valves malades chez l'Homme. Certaines valves dites biologiques sont composées de tissus biologiques d’origine animale (porc ou bovin). Elles présentent de nombreux avantages par rapport à des prothèses complétement synthétiques (valves dites mécaniques), notamment en termes de fonction et risque de formation de caillots (thrombose). En revanche, la composition des valves biologiques reste « étrangère » au système immunitaire du receveur les rendent susceptibles d’être rejetées par le tissu receveur. En effet, malgré toutes les mesures mises en place pour rendre le tissu biologiquement inactif, les cellules qui assurent la défense de notre organisme reconnaissent inéluctablement la différence d’origine du tissu implanté et déclenchent une réaction inflammatoire qui réduit sensiblement la durée de vie des bioprothèses par rapports aux solutions mécaniques. Ainsi, bien que plus performantes, les bioprothèses sont rarement implantées chez les sujets jeunes en raison de ce risque de vieillissement prématuré. L’objectif de cette étude est de tester le potentiel d'un traitement de surface sur les valves biologiques capable de diminuer cette réaction inflammatoire.
Bénéfices attendus
Les effets attendus sont une diminution de l'inflammation des tissus environnants lorsque les bioprothèses sont recouvertes avec le traitement de surface à l'étude avant implantation par rapport aux bioprothèses standard non traitées. L'évaluation pré-clinique du bénéfice apporté par le revetement proposé peut considérablèment accélérer le transfert de l'innovation chez l'homme (application aux bioprothèses cardiovasculaires qui sont utilisées en pratique clinique).
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule procédure d'implantation des composants des bioprothèses (traitées avec le traitement de surface ou non) sous la peau du dos sous anesthésie générale et à deux séances d'imagerie dans les suites (TEPscanner, 7 jours et 28 jours après implantation, toujours sous anesthésie générale) pour visualiser et mesurer la réaction inflammatoire au niveau de la zone d'implantation. Ces procédures d'imagerie comportent une injection d'un traceur par voie intraveineuse. Les procédures de chirurgie dureront 20 minutes et les séances d'imagerie 40 minutes.
Impact sur les animaux
Concernant l'intervention chirurgicale, les effets indésirables potentiels après l'intervention comportent des douleurs au site d'implantation sur la peau du haut du dos, des démangeaisons et des troubles de la cicatrisation. Concernant les scanners, ces examens sont peu invasifs et ne comportent pas d'effets indésirables attendus.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés le lendemain de la dernière imagerie (soit J29) afin de prélever du sang et d'étudier les biomarqueurs de l'inflammation. Les composants des bioprothèses implantés 29 jours plus tot seront également prélevés pour etre analysés en microscopie.
Remplacement
Dans ce projet, il n'existe pas de moyens alternatifs à l'expérimentation animale. En effet, à ce jour il n'existe pas de méthode fiable permettant d'estimer de facon fiable l'efficacité du traitement de surface à l'étude. Toutefois, des manipulations préliminaires sur des cellules endothéliales aortiques humaines (expériences "in vitro") ont permis d'affiner le protocole du traitement de surface et d'utiliser le nombre minimal d'animaux.
Réduction
Afin de diminuer au maximum le nombre d'animaux, un calcul statistique a été réalisé en amont. De la meme facon, une mutualisation des résultats expérimentaux au sein de l’unité de recherche pourrait permettre l'exploitation des résultats par d'autres chercheurs et de limiter l'utilisation ultérieure d'animaux.
Raffinement
Le confort, la douleur et le stress des animaux seront scrupuleusement recherchés à l'aide de grille de surveillance journalière. Un recours à l’anesthésie générale sera systématique pour toutes les procédures et des soins spécifiques pourront etre conduits en fonction de l'examen (désinfectant, anti-douleurs). L'administration d'anti-douleurs sera réalisée en cas d'inconfort ou de douleurs et une euthanasie sera pratiquée dans les plus brefs délais en cas de non-amélioration. La surveillance de points limites (devant faire stopper l'expérimentation) sera systématique et faite quotidiennement. Les conditions d’hébergement seront également optimisées au maximum avec respect du rythme veille/sommeil. Afin de minimiser le stress post-chirurgie, des éléments d’enrichissement des cages comme des bâtons à ronger et du coton, ainsi que de la nourriture en gélée, seront placés. Enfin, nous priviliégerons des procédures d’imagerie non invasive (TEPscanner) pour visualiser l'inflammation des tissus.
Choix des espèces
Le modèle animal (souris) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet. Des souris adultes C57Bl6/J de 6 à 9 semaines d'âge seront utilisées. Bien qu'il n'existe pas d'impact de genre attendu, des sujets femelles seront utilisés pour une meilleure cohabitation. La reaction aux biomatériaux chez cette espèce reproduit de façon très fidèle les réponses observées chez l'homme (mammifère). Les tests précliniques sont communemment effectués dans cette espèce et sont abondamment documentés dans la littérature scientifique.