Troubles cardiaques
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Test des fonctions cardiaques et musculaires chez des souris déficientes en Tafazzin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
30 souris déficientes en Tafazzine vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des échocardiographies sous anesthésie, des tests d'effort sur tapis roulant puis un prélèvement terminal du cœur, pour caractériser un modèle du syndrome de Barth. Le porteur reconnaît que ce projet ne teste aucun traitement et prépare seulement une future demande. Il justifie le recours à la souris par l'incapacité des modèles cellulaires à reproduire un "organisme tout entier".
Objectifs
Dans cette Demande d'Autorisation de Projet, nous voulons caractériser finement le modèle souris du Syndrome de Barth en terme de suivi de poids, d'endurance, et de fonctionnement mitochondrial et cardiaque. Cette caractérisation permettra de mettre en avant des défauts du modèle souris qui serviront dans une future demande d'Autorisation de Projet où nous testerons la capacicté de candidats médicaments à supprmier ces défauts (dans l'optique de proposer un médicaments à des patients atteints du syndrome de Barth). Ce projet est conçu pour permettre le déroulement des procédures expérimentales de tests de composés médicaments, à suivre, dans les conditions les plus respectueuses de l’animal et de l’environnement.
Bénéfices attendus
Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome de Barth, dans nos animaleries afin de vérifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. La caractérisation du modèle souris au niveau du poids, du comportement, de la force musculaire ainsi que les analyses sur échantillons d'urine, de sang et d'organes seront réalisées dans une Demande d'Autorisation de Projet en cours. La présente demande d'Autorisation de Projet permet d'aller plus loin dans la caracterisation du modèle souris en réalisant échocardiogrammes et tests d'effort et d'endurance sur des appareillages uniquement présents dans une autre animalerie que celle où sont produits les animaux.
Procédures
pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants. - échocardiographies - tests d'endurance sur tapis roulant - prélèvements terminaux du coeur sur animaux sacrifiés
Impact sur les animaux
Les caractéristiques du phénotype dommageable décrites par nos collaborateurs sont les suivantes : poids inférieur de 20 à 25% dès la naissance, défaut au niveau des ventricules cardiaques (plus fins : fonctions diastolique et systolique réduites), défaut au niveau de la morphologie des mitochondries (augmentation de la taille, baisse dans la densité des crêtes). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse échographique nécesite une analyse sous anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données échographiques. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux du coeur. Afin d'utiliser au maximum tous les animaux, des prélèvements de coeurs seront effectués pour des analyses qui permettent d'évaluer l'état et le fonctionnement des mitochondries de coeurs. Si des défauts sont mis en avant chez la souris modèle du syndrome de Barth par rapport à la souris sauvage, nous pourrons par la suite, dans une prochaine demande d'Autorisation de Projet, tester la capacité des candidats médicaments à supprimer ces défauts.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés dans toutes les expérimentations de la procédure . Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés. Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 12 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 25% d’animaux en plus, soit 15 souris par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent grâce à la grille de score des points limites. Le poids sera suivi 2 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48h aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des mutants est inférieur de 20 à 30% dès la naissance : si on dépasse les 25% d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront élevés jusqu'au sevrage dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP juste après le sevrage et utilisés durant 6 semaines. En effet le déficit de poids se voit normalement dès la naissance, il est donc intéréssant de corréler ce déficit avec d'autres phénotypes délétères (fonctions cardiaques et test à l'effort/endurance). Avant d'utiliser les animaux nous attendons qu'ils soeint sevrés.
Caractérisation et sélection de composés ciblant un nouveau mécanisme d’action biologique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sans réveil, c'est-à-dire une mise à mort sous anesthésie sans reprise de conscience. Auparavant vigiles, elles subissent des contentions, des injections et une administration orale de composés, puis sont endormies et tuées pour prélever sang et organes, afin de caractériser la pharmacocinétique et la biodistribution d'inhibiteurs enzymatiques. Le porteur affirme avoir mené de nombreux tests in vitro et sur embryon de poisson zèbre en amont pour limiter le recours aux souris. Il conclut que l'expérimentation animale est "obligatoirement requise" par les agences réglementaires avant tout essai clinique, sans autre alternative.
Objectifs
Le projet consiste à caractériser les propriétés de pharmacocinétique, de pharmacodynamique et de biodistribution de composés inhibiteurs d'une famille d'enzyme par voie systémique et orale. Au final, le but sera d'identifier et d'isoler les meilleurs composés. Les résultats constitueront un ensemble de données qui alimenteront le dossier préclinique réglementaire en vue d'obtenir les autorisations pour réaliser les essais cliniques chez l’Humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont multiples et d’une très grande valeur pour le développement pharmaceutique envisagé. Cibler le mode d’action de l’enzyme d’intérêt n’a jamais été réalisé dans le panorama scientifique et pharmaceutique. A terme ces composés pourront servir à réaliser des essais cliniques humains dans des indications médicales comme certaines neuropathies, pour espérer apporter de nouveaux traitements dans des maladies présentant de forts besoins médicaux insatisfaits. Ainsi, les résultats du projet alimenteront la base de connaissances scientifiques et renseigneront sur les effets pharmacologiques et potentiellement toxiques de la voie de signalisation ciblée. L’ensemble des travaux proposés alimenteront le dossier à soumettre aux agences réglementaires en vue d’obtenir les autorisations d’essais cliniques. Ce projet permettra également de développer les compétences des équipes sur la recherche pharmaceutique qui pourront largement être mises à profit pour de futurs projets et pour la diffusion des connaissances.
Procédures
Les souris vigiles recevront des manipulations de "classe légère", comme des contentions (30 à 45 secondes, 3 à 4 fois maximum, sur une période de 24 heures) et des procédures équivalentes à une piqûre (15-30 secondes, un maximum de 3, sur une période de 24 heures). Pour les administrations en voie orale (une seule fois par animal), la contention et l'administration dureront au maximum 1minute par animal. Pour les manipulations classées sans réveil, les animaux recevront un analgésique, puis seront endormis par anesthésie générale (20 à 25 minutes, une seule et unique fois pour un animal). Nous veillerons à l’application des gestes corrects par le personnel qualifié pour limiter le stress des animaux et assister pendant toute la procédure à l'observation des animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Un de nos composés administré par voie systémique à des souris à des doses 4 fois supérieures à la dose efficace n’a présenté aucune toxicité apparente, ni à l’échelle macroscopique ni sur des paramètres anatomopathologiques. Ce résultat préliminaire important présage de l’absence ou du peu d'effets indésirables. De plus, nous savons que les données de la littérature entrevoient un profil de toxicité favorable pour nos inhibiteurs. Les animaux seront manipulés avec ou sans contention et seront soumis à des prélèvements de petits volumes sanguins, suffisants pour réaliser les analyses, mais n’entraînant pas de perturbations physiologiques. Ces manipulations représentent des douleurs de l’ordre d’une piqûre. Pour l'ensemble du projet, nous avons établi un score de suivi des animaux basé sur l'apparence physique, des signes cliniques et comportementaux pour contrôler nos procédures et limiter toute souffrance animale. Notamment, nous répertorierons toute anomalie liée au comportement (la tonicité et la réactivité), la posture (s’il y a isolement), l’alimentation, la température corporelle, les excrétions ; Et rapporterons le cas échéant, tout effet délétère au responsable du bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des mesures à prendre. En cas d'effet indésirable avéré, aucun animal ne sera laissé sans traitement palliatif, et si non applicable, sera immédiatement sorti du protocole.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’échantillons et d’organes afin de les analyser. Ces échantillons uniques et précieux permettront de réaliser les analyses microscopiques pour déterminer les effets de l’action des composés inhibiteurs et déterminer quels organes reçoivent ou non la molécule, ce qui permettra de réaliser la caractérisation à visée pharmacologique et réglementaire. L’euthanasie sera réalisée conformément aux méthodes recommandées par la réglementation et les comités d'éthique et de bien-être animal. Nous veillerons au contrôle des méthodes utilisées par le personnel formé et qualifié pour éviter toute souffrance animale.
Remplacement
Pour caractériser le devenir de nos composés inhibiteurs dans un organisme, le recours à l’expérimentation animale est obligatoirement requis par les agences réglementaires avant le passage à l’expérimentation clinique humaine. Notre projet nécessite donc l’utilisation de souris vivantes, sans aucune autre alternative. Toutefois, avant de proposer de tester nos composés inhibiteurs chez la souris, nous avons réalisé une multitude de tests in vitro, in cellulo et ex vivo pour traquer de potentiels effets toxiques et/ou indésirables. Jusqu’alors, nous avons analysé et confirmé que nos inhibiteurs n’engendrent aucun effet sur la prolifération et la survie cellulaire, le métabolisme énergétique, le métabolisme du calcium intracellulaire cardiaque. Nous avons également évalué la toxicité sur le développement de l’embryon de poisson zèbre par balnéation sans relever d’effet toxique notable. Avant de rédiger ce projet, nous avons veillé à mettre au point des méthodes robustes de détection et d’analyse sur des modèles non animaux. En somme, toutes ces préparations en amont permettent de drastiquement limiter les mises au point sur des échantillons issus de l’expérimentation animale.
Réduction
Nous avons déjà vérifié qu’un de nos composés ne provoque aucun dommage sur des neurones primaires de rétine jusqu’à dix fois la dose efficace. De plus, nous avons réalisé des expérimentations sur des lots très restreints d'animaux pour évaluer les potentiels effets délétères de nos composés sur le système nerveux ou plus généralement dans la circulation générale et n’avons relevé aucun effet dommageable. Le déroulé de ce projet, construit sur une séquentialité, permettra de bien choisir les doses minimales et maximales à utiliser et de révéler les organes cibles où les molécules s’accumulent : ces données sont prédictives des effets indésirables à anticiper et permettront de réduire de façon significative le nombre d’animaux. Nous avons défini des filtres décisionnels de sélection permettant d'étudier les composés inhibiteurs sur un faible nombre d’animaux de manière incrémentale et ainsi de rapidement réduire le nombre de composés à analyser et le nombre d'animaux. Ensuite, nous avons prévu d’arrêter chacune des procédures dès lors que les objectifs seraient atteints (par exemple, retenir 5 composés formulés ou non). Ceci permettra de facto de réduire le nombre d’animaux. Des tests statistiques sont prévus pour établir des corrélations clés, évaluer systématiquement la robustesse des résultats obtenus et interroger leur significativité. Ces tests permettront de contrôler la variabilité expérimentale, ce qui limitera drastiquement le nombre de répétition. En somme, ces analyses permettront de cerner des tendances ou valider des résultats sans recourir à un grand nombre d’animaux.
Raffinement
A réception, les souris seront stabulées une semaine dans leur habitat d’hébergement avant toute manipulation. Aucun animal ne sera jamais délaissé en isolement. De manière générale, pour pallier au manque de recul de l’effet de nos composés, les animaux traités seront suivis rigoureusement et quotidiennement pour traquer l’émergence d’effets indésirables potentiels. La méthodologie choisie permettra de détecter l’atteinte des « points limites » les plus précoces. Nous prévoyons de rapporter tout effet délétère au responsable de bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des orientations à suivre. Plus spécifiquement, notre stratégie de raffinement prévoit de rechercher l’émergence d’effets toxiques selon le suivi du comportement (agitation ou prostration), de l’apparence physique des animaux (clôture des yeux, aspect du pelage et du poil), et du suivi des signes cliniques (température corporelle, rythme respiratoire, poids corporel, état des fèces). De plus, nos travaux cadreront les fonctions rattachées aux organes à monitorer. Nous porterons alors une attention stricte aux fonctions biologiques liées à ces organes. Nous prévoyons qu’aucun animal présentant un signe de souffrance ne sera laissé sans traitement palliatif. Nous prévoyons une prise en charge des nuisances en apportant un complément à l’alimentation et à l’eau si nécessaire. Un animal recevant une injection sera désinfecté localement avec un antiseptique. Les manipulations plus invasives prévoient d’abord une analgésie, puis une anesthésie générale pour pallier à toute douleur potentielle.
Choix des espèces
La souris est un des modèles de petit animal de laboratoire utilisé pour étudier les caractéristiques pharmaceutiques in vivo pour des inhibiteurs de nature chimique. De plus, ce modèle est reconnu par les agences réglementaires de médicaments pour constituer les preuves pharmaceutiques et scientifiques en vue d'obtenir les autorisations d'essais cliniques. Puisque l’application de nos composés inhibiteurs est prévue pour des adultes, ce projet prévoit donc d’utiliser des souris mâles et femelles adultes, ce qui permet de réaliser l’étude alors que le contexte hormonal adulte est déclenché. Nous n'avons pas trouvé d'alternative de remplacement.
Evaluation de la sénescence cellulaire en modèles précliniques de pathologies cardiométaboliques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent quatre interventions provoquant une stéatose du foie ou des altérations du cœur, une injection intrapéritonéale et deux à quatre séances d'imagerie échographique sous anesthésie, avant une mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur affirme que ces interventions n'entraînent qu'un faible niveau d'effets indésirables et pas de perte de poids, et qu'aucune approche de remplacement pertinente n'a été identifiée. Cette étude pilote cherche des marqueurs de la sénescence cellulaire, bénéfice présenté au conditionnel comme une amorce pour de futurs agents d'imagerie.
Objectifs
La sénescence cellulaire est impliquée dans de nombreuses pathologies chroniques liées au vieillissement, y compris un certain nombre de pathologies cardiométaboliques La sénescence cellulaire est impliquée dans de nombreuses maladies chroniques liées au vieillissement. Il n’existe pas de modalité d’imagerie permettant l’identification de la sénescence cellulaire in vivo, qui présente pourtant potentiellement un grand intérêt. L’objectif de ce projet est d’évaluer la présence de sénescence cellulaire dans plusieurs modèles précliniques de pathologies cardiométaboliques et d’identifier un ou plusieurs marqueurs de sénescence cellulaire communs à ces modèles.
Bénéfices attendus
Il est attendu qu’un ou plusieurs des modèles animaux testés révèlent la présence de cellules sénescentes et qu’au moins un marqueur de sénescence cellulaire, commun à ces modèles et pouvant être ciblé par imagerie moléculaire, soit identifié. Cette étude pilote devrait donc permettre d’amorcer le développement d’agents d'imagerie de la sénescence cellulaire, ciblant le marqueur identifié, et dans un même temps de valider la pertinence de modèles animaux pour tester ces agents d'imagerie après leur développement.
Procédures
Une partie des animaux sera soumis à des injections intrapéritonéales en début de protocole (une injection par animal). Les animaux seront soumis à des procédures d’imagerie par échographique, avant le début des interventions, à la fin de la durée d’intervention prévue et à des temps intermédiaires pour une partie des animaux, (entre 2 et 4 procédures d’imagerie par animal, sous anesthésie gazeuse et d’une durée approximative de 30 min par animal).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à quatre interventions menant au développement de pathologies cardiométaboliques. Deux de ces interventions mènent au développement de stéatose du foie. Deux autres interventions mènent à des altérations du cœur. Pour deux de ces interventions (une visant le foie et l’autre le cœur), la présence de cellules sénescentes a été décrite, alors que pour les deux autres interventions, l’implication de la sénescence cellulaire reste à confirmer, ce qui fait partie des objectifs de cette étude. L’efficacité de ces interventions sera validée par imagerie échographique. Ces interventions ont été décrites dans la littérature scientifique et n’entrainent qu’un faible niveau d’effets indésirables et notamment pas de perte de poids. Le protocole d’imagerie, quant à lui, n’entraine pas de douleur, souffrance ou angoisse chez les animaux.
Devenir
A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser les altérations tissulaires des modèles pathologiques étudiés, y compris la présence de cellulaire sénescentes, et évaluer les marqueurs communs à ces cellules sénescentes.
Remplacement
L’objectif de l’étude étant l’évaluation d’un phénomène apparaissant chez l’animal suite à des interventions métaboliques au long cours, y compris dans l’optique de valider ces interventions comme modèle pour une évaluation ultérieure in vivo par imagerie, aucune approche pertinente de remplacement n’a été identifiée.
Réduction
L’étude a été conçue pour limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant un effectif suffisant pour une analyse statistique permettant de se prononcer sur l’efficacité des interventions évaluées. Ceci implique, notamment la limitation des doses de molécules actives utilisés et des points temporels ou l’étude sera réalisé sur les bases de résultats précédemment rapportées dans la littérature, et l’utilisation d’un groupe contrôle commun.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce. Une surveillance et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie échographique sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
Cette étude porte sur l’identification de cellules sénescentes dans des modèles animaux déjà établis (et d’un marqueur, commun à ces modèles, pertinent pour le développement d’agents d'imagerie). Les modèles identifiés comme potentiellement pertinents ont été établis chez la souris. Pour cette raison, des souris au même stade de développement (adultes) que décrit dans la littérature scientifique, présentant ces modèles déjà établis, vont être utilisés pour ces travaux sur un aspect peu ou pas étudié dans ces modèles animaux.
Génération de modèles de souris transgéniques la technologie par CRISPR / Cas9 combinée ou pas à un transgène
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
1366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1128 femelles reçoivent un traitement hormonal par deux injections pour produire des embryons, 178 autres subissent une chirurgie de réimplantation au niveau de l'oviducte et 60 mâles une vasectomie, l'ensemble servant à fabriquer de nouvelles lignées génétiquement modifiées à la demande d'équipes de recherche. Les mâles vasectomisés sont tués six à douze mois après l'opération, les femelles au moment du sevrage des portées. Le porteur affirme que seul un "organisme intégré" permet d'étudier les interactions entre cellules et tissus et présente ces souris transgéniques comme des "modèles indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste à développer de nouvelles lignées de souris transgéniques pour permettre aux chercheurs d’avoir les outils les plus adaptés à leurs études. La première étape de ce projet est de vérifier que cette lignée de souris transgéniques n’est pas disponible dans une banque internationale ou dans un laboratoire académique. En cas d’indisponibilité, le modèle de souris transgénique est alors créé dans notre service par transgénèse aléatoire ou par la technologie CRISPR/Cas9.
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes (Bradley et al., 2012, Meehan et al., 2017).
Procédures
Pour obtenir un grand nombre d’embryons, les 1128 femelles donneuses reçoivent un traitement hormonal qui consiste en 2 injections intra-péritonéales à 48h d’intervalle. Ces injections sont réalisées sur animal vigile. Les embryons sont ensuite manipulés génétiquement puis réimplantés dans 178 femelles receveuses (=mères porteuses) au niveau de l’oviducte qui est un conduit reliant l'ovaire à l’utérus, Ces femelles receveuses sont produites en accouplant des femelles avec des males vasectomisés c’est-à-dire rendus stériles. Pour obtenir ces mâles vasectomisés, 60 males subissent une chirurgie qui consiste à couper les canaux qui permettent aux spermatozoïdes de sortir du testicule. La réimplantation et la vasectomie requièrent une chirurgie qui est réalisée sous une anesthésie générale induite par une injection intra-péritonéale d’un complexe anesthésique. L’anesthésie de ces 238 animaux (178 femelles receveuses + 60 mâles vasectomisés) dure en moyenne 20 minutes. Une prise en charge de la douleur est systématiquement effectuée par une injection intra-péritonéale d’un anti-inflammatoire non stéroïdien Pour une récupération de meilleure qualité après l’anesthésie et la chirurgie, une injection sous cutanée d’une solution de réhydratation est réalisée sur les animaux opérés. Pour éviter l’hypothermie, le réveil se fait sur un tapis chauffant. Un apport de graines de tournesol et d’une nourriture enrichie en matières grasses permet d’augmenter les bien-être des femelles opérées. Il favorise ainsi un meilleur développement des gestations et une lactation de meilleure qualité pour la prise en charge des nouveaux nés L’ensemble de ces approches technologiques permettent de générer des modèles de souris transgéniques pour l’étude de mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire, le cancer ou dans des maladies immunitaires, par les équipes de recherche.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : 1- ceux liés à l’injection intrapéritonéale d’hormone. La durée des effets indésirables est limitée au moment de l’injection. 2- ceux liés à des petites chirurgies abdominales. La durée des effets n’excédera pas 24 heures.
Devenir
Vasectomie : Les mâles sont conservés pendant la période de leur plus forte activité sexuelle et seront euthanasiés 6-12 mois après leur vasectomie (selon leur aptitude d’accouplement scorée). Après 8 accouplements sans bouchon vaginal, le mâle est euthanasié. Superovulation des femelles donneuses Les femelles superovulées qui présentent un bouchon vaginal sont euthanasiées pour la récupération des embryons Toutes les femelles sans bouchon vaginal sont réutilisées pour une deuxième injection d’hormones, 2-3 semaines plus tard. Réimplantation d’embryons L’ensemble des femelles réimplantées sont euthanasiées au moment du sevrage des naissances.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de des bases de données (études in silico ) et des modèles in-vitro ( culture de cellules , organoïdes…) . En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Les nouveaux outils technologiques tel que l’électroporation combinée à des nucléases toujours plus performantes et des ARN guides commerciaux plus stables (IDT ; Synthego) ont permis de diminuer par un facteur 2 le nombre de séances nécessaires à l’obtention de modèles Knock-Out et de petits Knock-In. Le nombre de naissance a été augmenté en changeant notre approche pour la réimplantation. Une réimplantation bilatérale sur une femelle unique est désormais effectuée en routine (Mahabir E et al 2018) Pour les grands Knock-In, un test d’efficacité de coupure des ARN guides est effectué sur un test in-vitro. Une analyse sur blastocyste unique est réalisée et permet d’éviter d’avoir recours à des femelles réimplantées et des naissances. À la suite de ces tests, une séquence d’ARN guide est choisie. Le plasmide donneur sera alors élaboré en fonction des résultats de ce test. L’expérimentation in-vivo (Injection des embryons avec mélange contenant le plasmide donneur / ARN guides / Cas9) sera alors réalisée avec réimplantation des femelles pseudogestantes.
Raffinement
L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale. Injection IP d’un mélange Xylazine (7.5mg/kg), kétamine (40 mg/kg) et flunitrazépam (0.5 mg/kg) dans du NaCl 0.9%, à raison de 50 μL pour 10g. Ce mélange permet une anesthésie assez longue et profonde ce qui permet de réaliser l’opération dans de bonnes conditions pour l’animal. L’effet analgésique de la Xylazine est utilisé pour soulager la douleur. En complément à la Xylazine, une injection de Rimadyl est effectuée pour une meilleure prise en charge de la douleur. A la fin de l’intervention avant de refermer la paroi musculaire, du Carprofène (Rimadyl) est administré dans la cavité abdominale à raison de 1mg/ml dans NaCl 0.9% à raison de 100µl pour 20g de souris.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée (superovulation efficace et embryons faciles à injecter) Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. En fond mixte B6D2 (C57BL6 x DBA/2), les femelles donneuses ont 8 semaines ce qui permet une quantité et une qualité optimale des embryons. En revanche pour un fond pur C57BL6/J ou N, les femelles ont 4 semaines pour l’obtention d’un plus grand nombre d’embryons avec une qualité correcte. Nous utilisons femelles pseudogestantes NMRI entre 8 et 24 semaines. Les mâles stériles NMRI (vasectomisés) utilisés pour les accouplements ont entre 2 mois et 12 mois.
Test des fonctions cardiaques et musculaires chez des souris déficientes en Tafazzin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles subissent des échocardiographies sous anesthésie et des tests d'effort sur tapis roulant, avant prélèvement terminal du coeur. Le porteur indique un déficit de poids dès la naissance et des points limites déclenchant la mise à mort en cas d'anomalie cardiaque. Cette caractérisation prépare un futur projet de test de candidats médicaments.
Objectifs
Dans cette Demande d'Autorisation de Projet, nous voulons caractériser finement le modèle souris du Syndrome de Barth en terme de suivi de poids, d'endurance, et de fonctionnement mitochondrial et cardiaque. Cette caractérisation permettra de mettre en avant des défauts du modèle souris qui serviront dans une future demande d'Autorisation de Projet où nous testerons la capacicté de candidats médicaments à supprmier ces défauts (dans l'optique de proposer un médicaments à des patients atteints du syndrome de Barth). Ce projet est conçu pour permettre le déroulement des procédures expérimentales de tests de composés médicaments, à suivre, dans les conditions les plus respectueuses de l’animal et de l’environnement.
Bénéfices attendus
Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome de Barth, dans nos animaleries afin de vérifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. La caractérisation du modèle souris au niveau du poids, du comportement, de la force musculaire ainsi que les analyses sur échantillons d'urine, de sang et d'organes seront réalisées dans une Demande d'Autorisation de Projet en cours. La présente demande d'Autorisation de Projet permet d'aller plus loin dans la caracterisation du modèle souris en réalisant échocardiogrammes et tests d'effort et d'endurance sur des appareillages uniquement présents dans une autre animalerie que celle où sont produits les animaux.
Procédures
pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants. - échocardiographies - tests d'endurance sur tapis roulant - prélèvements terminaux du coeur sur animaux sacrifiés
Impact sur les animaux
Les caractéristiques du phénotype dommageable décrites par nos collaborateurs sont les suivantes : poids inférieur de 20 à 25% dès la naissance, défaut au niveau des ventricules cardiaques (plus fins : fonctions diastolique et systolique réduites), défaut au niveau de la morphologie des mitochondries (augmentation de la taille, baisse dans la densité des crêtes). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse échographique nécesite une analyse sous anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données échographiques. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux du coeur. Afin d'utiliser au maximum tous les animaux, des prélèvements de coeurs seront effectués pour des analyses qui permettent d'évaluer l'état et le fonctionnement des mitochondries de coeurs. Si des défauts sont mis en avant chez la souris modèle du syndrome de Barth par rapport à la souris sauvage, nous pourrons par la suite, dans une prochaine demande d'Autorisation de Projet, tester la capacité des candidats médicaments à supprimer ces défauts.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés dans toutes les expérimentations de la procédure . Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés. Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 12 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 25% d’animaux en plus, soit 15 souris par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent grâce à la grille de score des points limites. Le poids sera suivi 2 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48h aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des mutants est inférieur de 20 à 30% dès la naissance : si on dépasse les 25% d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront élevés jusqu'au sevrage dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP juste après le sevrage et utilisés durant 6 semaines. En effet le déficit de poids se voit normalement dès la naissance, il est donc intéréssant de corréler ce déficit avec d'autres phénotypes délétères (fonctions cardiaques et test à l'effort/endurance). Avant d'utiliser les animaux nous attendons qu'ils soeint sevrés.
Etude comparative de six méthodes de traitement des varices sur modèle ovin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
6 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs veines saphènes sont traitées sous anesthésie par six techniques utilisées contre les varices humaines, avec un suivi échographique jusqu'à 28 ou 56 jours, avant mise à mort pour analyse des veines. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu car la sécurité est déjà validée chez l'humain, et surveille malgré tout hématomes, brûlures et nécroses. Il décrit le mouton comme le "modèle de référence" pour évaluer les traitements vasculaires.
Objectifs
Les varices sont des manifestations de la maladie veineuse chronique et leur prévalence est estimée à 25%. Elles sont liées à une perte d'élasticité des parois veineuses et à leur élargissement, ou à des lésions des valvules veineuses qui ne fonctionnent plus correctement. Plusieurs techniques sures et efficaces sont disponibles mais les mécanismes d’actions locales sur la paroi veineuse n’ont été que très peu analysés. L’objectif du projet est d’étudier six techniques existantes afin d’identifier les mécanismes d'action et les réactions inflammatoires locales.
Bénéfices attendus
Les varices sont des manifestations de la maladie veineuse chronique et leur prévalence est estimée à 25%. Les complications si les varices ne sont pas traitées sont des ulcères veineux. Le coût du traitement des ulcères veineux de jambe est très élevé ; le traitement des varices peut réduire l’incidence des ulcères de jambe de 50%, est il est donc très interessant d'un point de vue médiccal, économique et sociétal. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives les varices. Cette étude permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de ces différentes techniques existantes des traitements de varice et aidera à terme le praticien à choisir la technique la plus adaptée en fonction du type de patient à traiter et de limiter les risques de récidives.
Procédures
Les veines saphènes, des brebis, seront traitées par différentes techniques utilisées chez l’homme pour le traitement des varices (Radiofréquence, laser 980 nm ou 1940 nm, clarivein, veinaseal, mousse fibroveine) . Le jour du traitement, la zone à traiter sera marquée et des mesures seront effectuées par échographie. Le traitement se fera sous anesthésie et dure environ 20 minutes par veine saphène. Un suivi échographique aura ensuite lieu 7 jours, 14 jours puis 28 jours après le traitement. Si nécessaire, les animaux seront sédatés pour cet examen. Au bout de 28 jours, 3 brebis seront mises à mort après prélèvement de leurs veines saphènes traitées sous anesthésie générale dans le but de faire une analyse anatomopathologique. Les 3 dernières brebis auront une nouvelle échographie 56 jours après le traitement avant d’être aussi mises à mort après prélèvement de leurs veines saphènes traitées sous anesthésie générale dans le but de faire une analyse anatomopathologique. Pendant la première semaine post-traitement la zone traitée sera inspectée quotidiennement afin de détecter d’éventuelles lésions dues au traitement.
Impact sur les animaux
Le traitement se fera sous anesthésie et analgésie et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendue. A l'issu du traitement, aucun effet indésirable n’est attendu car la sécurité de la procédure est déjà largement validée chez l’homme. Les points à surveiller seront la réaction de la peau dans la zone de traitement : hématome au point de ponction, matting de la peau (cordon marron le long du trajet de la veine), brûlure, nécrose.
Devenir
Les six brebis du projet seront mises à mort à la fin de l'étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter les points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant. Le modèle ovin est le modèle de référence pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires.
Réduction
Le traitement sera appliqué sur les deux veines saphènes des animaux, ce qui permet d'utiliser deux fois moins d'animaux pour obtenir le même nombre d'échantillons de veines saphènes. Un minimum de 6 brebis est nécessaire (soit 12 veines saphènes) pour évaluer les 6 traitements avec des prélèvements des veines saphènes à deux temps (J28 et J56).
Raffinement
Les brebis arriveront sur place au minimum une semaine avant la procédure pour leur permettre de s’habituer au lieu et ainsi de diminuer leur stress. Les ovins étant des animaux grégaires, les brebis seront logées en groupe, sur une litière de paille afin de les occuper et auront accès à de l'eau et du foin ad libitum pour respecter leur fonctionnement de ruminants. De plus, le personnel animalier observera régulièrement le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. Durant le traitement, les brebis seront placées sous anesthésie générale avec une association médicamenteuse permettant d’obtenir un effet anesthésique et analgésique. Afin d’éviter le dessèchement de leur cornée, une pommade ophtalmique est appliquée dans leurs yeux. Enfin, durant les examens angiologique, si les animaux présentent des signes de stress ou d’agitation, ils sont sédatés ou anesthésiés selon l'avis du vétérinaire.
Choix des espèces
Le mouton est recommandé comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme (diamètre et profondeur des veines saphènes) et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié pour évaluer l'occlusion veineuse. Les animaux sont adultes afin d'avoir une structure comparable à l'homme. De plus, certains animaux étant gardés plus de deux mois, il n'est pas possible d'utiliser des animaux en croissance..
Système nerveux autonome
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
300 rats vont être utilisés, dont 250 opérés sous anesthésie et tués sans réveil et 50 réutilisés après avis vétérinaire, dans des procédures impliquant selon les cas un niveau de souffrance modéré. On leur pose un cathéter dans la carotide ou un implant de télémétrie dans l'aorte, puis on provoque à plusieurs reprises une chute de tension par basculement brutal de leur position, pour tester des médicaments contre l'hypotension orthostatique. Le porteur affirme ces modèles "nécessaires" à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et juge qu'ils "ne peuvent pas être remplacés" par des méthodes alternatives. L'impact du produit lui-même est déclaré faible, l'atteinte venant surtout de la chirurgie et des manipulations.
Objectifs
L’hypotension orthostatique est définie comme une chute brutale de la pression artérielle qui survient lors du passage de la position couchée à la position debout. Par gravité, le passage en position debout résulte en une accumulation sanguine dans le pool veineux (jambes) qui en retour induit une diminution transitoire du retour veineux, du débit cardiaque et de la pression artérielle. Chez le patient sain, la pression artérielle revient rapidement à des valeurs normales grâce au mécanisme réflexe sympathique. Toutefois, certains médicaments, tels que les antagonistes des récepteurs adrénergiques ou les vasodilatateurs (les antagonistes des récepteurs à l’angiotensine II par exemple), diminuent ce réflexe sympathique, aggravant l’hypotension orthostatique et pouvant ainsi conduire à l’étourdissement et la perte de connaissance. Ces effets secondaires peuvent réduire considérablement le champ d’application thérapeutique de ces médicaments et limiter leur utilisation clinique. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments (par la réduction de cette hypotension) ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes une hypotension orthostatique pouvant conduire à une syncope.
Bénéfices attendus
Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter les problèmes d'hypotension orthostatiques, ou à la recherche de tels effets secondaires de certains traitements (pour les caractériser voire pour aider à affier leur champ d'application).
Procédures
Dans le modèle anesthésié, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Un cathéter est positionné dans une artère carotide pour la mesure en continue de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque. L'hypotension orthostatique est provoquée (en plusieurs occasions) par un changement abrupte de position de l'animal qui passe d'une position horizontale à une position inclinée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvement de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (immédiatement avant la mise à mort). La procedure (sous anesthésie) n'excède pas 2 heures et les animaux sont immédiatement mis à mort (sans reveil préalable). Dans le modèle éveillé, les animaux sont dans une première phase équipé (sous anesthésie) d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continue de la pression artérielle (par cathétérisme de l'aorte abdominale) et de la fréquence cardiaque. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum), l'hypotension orthostatique est provoquée (sous anesthésie gazeuse légère et transitoire) par un changement abrupte de position de l'animal (appelé procédure de Tilt) qui passe d'une position horizontale à une position inclinée. Cette procédure de Tilt peut-être répétée en plusieurs occasions et à des jours différents. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sur animal vigile ou anesthésié au gaz isoflurane) pendant le test et/ou en fin de test.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Dans le modèle chez le rat éveillé, certaines périodes d'hébergement en cage individuelle (avec enrichissement) sont cependant nécessaires: 1) pendant la phase de récupération post-chirurgicale, afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères (généralement pour un période d'une semaine maximum); 2) pendant les mesures (généralement un peu plus de 24h), car le système de télémétrie ne fonctionne qu'avec une fréquence d'émission des signaux. Un hébergement groupé ne permet donc pas d'identifier la source d'émission d'un signal (interférence entre les implants).
Devenir
Pour les procédures modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisable.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la capacité de régulation du système nerveux autonome. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la capacité de régulation du système nerveux autonome, l'intégrité du système nerveux autonome ne pouvant être respecté que chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Dans la procédure mise en place chez l'animal anesthésié et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal, réduisant aisni le nombre d'animaux utilisés. Dans la procédure mise en place chez l'animal éveillé et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal à des jours différents, réduisant aisni le nombre d'animaux utilisés. Nos analyses statistiques (basées sur des analyses de variances et test de Dunnett) indiquent qu’un effectif de 8 animaux par groupe (nombre de groupes variables, 2 en standard) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux issus du modèle chez le rat éveillé (étude par télémétrie) peuvent également être réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subi de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le système nerveux autonome du rongeur est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rats sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique.
Imagerie non invasive de l’inflammation myocardique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ouverture du thorax provoquant une ischémie du cœur, une prise de sang à la queue puis des injections d'un agent d'imagerie sous anesthésie à deux et sept jours, pour vérifier si cet agent visualise l'inflammation cardiaque après infarctus. Le porteur indique une mortalité chirurgicale d'environ 20 %, qu'il place dans la fourchette basse de la littérature. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, le porteur affirmant que la réponse inflammatoire ne peut être évaluée qu'in vivo.
Objectifs
L’infarctus du myocarde induit une réponse inflammatoire qui est nécessaire à la cicatrisation. Cette inflammation peut cependant parfois avoir un effet délétère. C’est le cas lors de la reperfusion du territoire ischémique qui s’accompagne d’une forte production de radicaux libres, de l’activation du complément, de neutrophiles et de macrophages. Ce phénomène est dénommé en anglais « ischaemia-reperfusion-injury » et il peut avoir pour conséquence une augmentation de la taille du territoire infarcie. Des thérapies visant à moduler la réponse inflammatoire, soit en la stimulant soit en l’inhibant selon le contexte et la fenêtre temporelle, sont donc à l’étude. Un agent d’imagerie permettant de visualiser de manière non invasive la réponse inflammatoire dans le post infarctus permettrait de mieux appréhender sa cinétique, et d’évaluer des thérapies ciblant celle-ci. L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué dans ce contexte a déjà fait ses preuves chez la souris pour l’imagerie des plaques d’athéromes qui se développent dans la paroi des artères, ainsi que pour l’évaluation de l’inflammation hépatique. Il est en cours d’évaluation clinique pour l’imagerie de l’athérosclérose. L’objectif ici est donc de déterminer s’il est suffisamment spécifique et sensible pour permettre la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque dans le contexte du post-infarctus. Si oui, il pourra être utilisé dans le cadre de la recherche ou de la pratique clinique pour évaluer cette inflammation et pour tester de nouvelles thérapies. Cela ouvrira également la voie à l’exploration d’autres pathologies caractérisées par de l’inflammation du muscle cardiaque telles que l’endocardite, la myocardite, ou le rejet de greffe.
Bénéfices attendus
L’agent d’imagerie étudié fait a déjà fait ses preuves pour l’imagerie de l’athérosclérose et il fait actuellement l’objet d’un essai clinique pour cette application. La cible de cet agent d’imagerie (VCAM-1) est exprimée dans d’autres pathologies caractérisées par des phénomènes inflammatoires. Evaluer le potentiel de cet agent d’imagerie dans d’autres contextes physiopathologiques tels que le post-infarctus du myocarde permettra donc potentiellement d’étendre son champ d’applications diagnostiques. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.
Procédures
Les animaux subiront une unique procédure chirurgicale (
Impact sur les animaux
La procédure a été classée en sévère du fait de la chirurgie et de l’induction d’une ischémie myocardique. Toutefois, le modèle est bien maitrisé par le laboratoire en charge de sa réalisation. Ainsi, la taille de l’infarctus est bien contrôlée, et le vide pleural correctement réalisé. De ce fait la mortalité associée à la procédure chirurgicale se trouve dans la fourchette basse de ce qui est classiquement reporté dans la littérature (20%). Une médication et des points limite adaptés permettent de prendre en charge efficacement la douleur et le stress.
Devenir
A l’issu de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.
Remplacement
La réponse inflammatoire dans le post-infarctus ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine recombinante et sur cellules. Sa spécificité et sensibilité pour lier sa cible exprimée par des cellules endothéliales ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.
Réduction
Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. En effet un faible effectif sera utilisé pour évaluer la faisabilité de la méthode lors d’une étude pilote, et l’étude principale ne sera réalisée que si cette première étude est concluante. Par ailleurs l’imagerie non invasive permet de suivre la réponse inflammatoire sur un même animal au cours du temps, est ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce. Une médication et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence, avec le rat, pour l’étude du post-infarctus chez le petit animal. L’agent d’imagerie évalué est un fragment d’anticorps reconnaissant la protéine de souris et la protéine humaine, mais pas la protéine de rat. De ce fait l’espèce retenue est la souris, et plus particulièrement la souche c57Bl/6J fréquemment utilisée dans la recherche cardiovasculaire. Des souris c57Bl/6J adultes seront utilisées afin de se rapprocher du contexte clinique.
Imagerie non invasive de l’inflammation myocardique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie d'ouverture du thorax provoquant un infarctus du cœur, puis des injections d'un agent d'imagerie sous anesthésie à deux et sept jours, pour vérifier si cet agent visualise l'inflammation cardiaque. Le porteur indique une mortalité liée à la chirurgie d'environ 20 %, qu'il situe dans la fourchette basse de la littérature. Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, et le porteur affirme que la réponse inflammatoire ne peut être évaluée qu'in vivo.
Objectifs
L’infarctus du myocarde (muscle cardiaque) induit une réponse inflammatoire qui est nécessaire à la cicatrisation. Cette inflammation peut cependant parfois avoir un effet délétère. Des thérapies visant à moduler la réponse inflammatoire, soit en la stimulant soit en l’inhibant selon le contexte et la fenêtre temporelle, sont donc à l’étude. Un agent d’imagerie permettant de visualiser de manière non invasive la réponse inflammatoire permettrait de mieux appréhender sa cinétique, et d’évaluer des thérapies ciblant celle-ci. L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué dans ce contexte a déjà fait ses preuves chez la souris pour l’imagerie de lésions qui se développent dans la paroi des artères, ainsi que pour l’évaluation de l’inflammation du foie. Il est en cours d’évaluation clinique. L’objectif ici est donc de déterminer s’il est suffisamment spécifique et sensible pour permettre la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque dans le contexte du post-infarctus. Si oui, il pourra être utilisé dans le cadre de la recherche ou de la pratique clinique pour évaluer cette inflammation et pour tester de nouvelles thérapies. Cela ouvrira également la voie à l’exploration d’autres pathologies caractérisées par de l’inflammation du muscle cardiaque telles que le rejet de greffe.
Bénéfices attendus
L’agent d’imagerie étudié fait a déjà fait ses preuves pour l’imagerie de lésions des artères et il fait actuellement l’objet d’un essai clinique pour cette application. La cible de cet agent d’imagerie est exprimée dans d’autres pathologies caractérisées par des phénomènes inflammatoires. Evaluer le potentiel de cet agent d’imagerie dans d’autres contextes physiopathologiques tels que le post-infarctus du myocarde permettra donc potentiellement d’étendre son champ d’applications diagnostiques. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.
Procédures
Les animaux subiront les conséquences de la chirurgie. A J2 et J7 les animaux recevront une injection intraveineuse d’un agent d’imagerie suivi d’une anesthésie volatile de courte durée (
Impact sur les animaux
La procédure a été classée en sévère du fait de la chirurgie et de l’induction d’une ischémie myocardique. Toutefois, le modèle est bien maitrisé par le laboratoire en charge de sa réalisation. Ainsi, la taille de l’infarctus est bien contrôlée, et le vide pleural correctement réalisé. De ce fait la mortalité associée à la procédure chirurgicale se trouve dans la fourchette basse de ce qui est classiquement reporté dans la littérature (20%). Une médication et des points limite adaptés permettent de prendre en charge efficacement la douleur et le stress.
Devenir
A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.
Remplacement
La réponse inflammatoire dans le post-infarctus ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine recombinante et sur cellules. Sa spécificité et sensibilité pour lier sa cible exprimée par des cellules endothéliales ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.
Réduction
Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. En effet un faible effectif sera utilisé pour évaluer la faisabilité de la méthode lors d’une étude pilote, et l’étude principale ne sera réalisée que si cette première étude est concluante. Par ailleurs l’imagerie non invasive permet de suivre la réponse inflammatoire sur un même animal au cours du temps, est ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce. Une médication et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence, avec le rat, pour l’étude du post-infarctus chez le petit animal. L’agent d’imagerie évalué est un fragment d’anticorps reconnaissant la protéine de souris et la protéine humaine, mais pas la protéine de rat. De ce fait l’espèce retenue est la souris.
Rôle de l’Amphiréguline dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un choc cardiogénique post-arrêt cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant de l'anesthésie sans réveil ou un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est posé sous anesthésie, puis un arrêt cardiaque de huit minutes est provoqué et suivi d'une réanimation, certaines étant tuées une heure après pour prélèvements, d'autres suivies pour évaluer leur survie. Le porteur soutient, littérature à l'appui, que le coma consécutif à l'arrêt cardiaque n'entraîne pas d'inconfort, et prévoit une analgésie préventive. Il présente le contrôle de la fuite capillaire comme répondant à un "besoin médical majeur".
Objectifs
Ce projet de recherche fondamentale vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire (fuite de plasma au travers des vaisseaux) au cours des états de choc cardiogénique chez l’homme. Les états de choc constituent un enjeu de santé publique. Les admissions pour états de choc représentent un tiers des admissions en réanimation (environ 20.000 patients par an), et la mortalité associée reste de l’ordre de 40% actuellement. Il existe au cours des états de choc une fuite capillaire importante). Cette fuite capillaire est due à une augmentation de la perméabilité des vaisseaux du fait de l’activation de l’inflammation (syndrome de réponse inflammatoire systémique : SRIS). Lorsqu’elle est généralisée, cette fuite capillaire aggrave l’insuffisance circulatoire du fait de la baisse du volume sanguin, et participe à l’apparition de lésions sur l’ensemble des organes (syndrome de défaillance multiviscérale). Le contrôle de la fuite capillaire s’est avéré très bénéfique dans plusieurs modèles de choc chez l’animal. Cependant, les déterminants de cette fuite capillaire au cours des états de choc restent très peu connus chez l’homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons isolé plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire chez 19 patients atteints de SRIS. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’amphiréguline comme cible d’intérêt particulier du fait de son tropisme vasculaire. L’association entre la concentration plasmatique d’AMPHIREGULINE et la fuite capillaire a été confirmée dans une cohorte indépendante de 77 patients. Notre objectif est de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’AMPHIREGULINE permet de diminuer la fuite capillaire et la mortalité au cours du SRIS.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de caractériser le rôle de l’AMPHIREGULINE dans la fuite capillaire associée au choc cardiogénique post-arrêt cardiaque, et le potentiel intérêt de sa modulation. Le contrôle de la fuite capillaire au cours de ce syndrome est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, l’arrêt cardiaque restant associé à plus de 50% de mortalité actuellement, et la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients.
Procédures
Chaque animal ne sera inclus que dans une procédure. Ces procédures comprendront : - la pose d'un abord vasculaire (cathéter veineux) qui sera réalisé sous anesthésie générale après une analgésie prophylactique. - un arrêt cardiaque long (8min) puis une réanimation cardiopulmonaire - une surveillance de l'animal après cardiaque avec soit une euthanasie à 1h de l'arrêt cardiaque pour quantification de la fuite capillaire, soit une évaluation de la survie. - une surveillance continue du bien être animal avec si nécessaire une analgésie supplémentaire L'ensemble de l'intervention dure entre 1 et 24 heures en fonction de la procédure.
Impact sur les animaux
L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Ceci est confirmé par notre suivi des animaux au cours de la mise au point du modèle (DAP 23817). Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : Pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours de ces cinq procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure. Pour les procédures 2, 3 et 5, l’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures (soit jusque H+8 de l’arrêt cardiaque puis toutes les 4 heures le jour et toutes les 8h la nuit.) L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sérum et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS. La fuite capillaire est en effet d’origine multi-factorielle et l’AMPHIREGULINE régule de nombreuses voies physiologiques. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le nombre d’animaux nécessaires est calculé a priori. - Procédure 1 : Effectif fixé à 117 souris - Procédure 2 : Effectif fixé à 92 souris - Procédure 3 : Effectif fixé à 40 souris - Procédure 4 : Effectif fixé à 117 souris - Procédure 5 : Effectif fixé à 92 souris Le plan expérimental a été optimisé de façon à combiner les données obtenues pour chaque animal et réduire l’effectif nécessaire - Une analyse échographique sera couplée à l’analyse lors de la procédure 1 - Les analyses sanguines et histologiques seront effectuées sur le sang et les organes non prélevés 3) Notre équipe poursuit une veille bibliographique continue sur le sujet et le modèire : le, de façon à ne par duppliquer d’éventuelles nouvelles données. De la même façon, l’ensemble des résultats du projet sera publié, pour les rendre accessibles aux autres équipes.
Raffinement
Nous tendrons vers les objectifs préconisés de raffinement. L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : - Pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours de ces cinq procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure. - L'ensemble de la procédure de pose d'abord vasculaire sera réalisée sous anesthésie générale - Les procédures 1 et 4 sont entièrement réalisées sous anesthésie générale - Pour les procédures 2, 3 et 5, l’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures (soit jusque H+8 de l’arrêt cardiaque puis toutes les 4 heures le jour et toutes les 8h la nuit. - L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin. - Les euthanasies seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS secondaire à un arrêt cardiaque est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de notre cible d’intérêt dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si le gène d’intérêt peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement, ainsi que lors de nos expérimentations préliminaires sur ce modèle (APAFIS#23817)
Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans la mégacaryopoïèse et l’activation plaquettaire chez la souris : impact des mutations d’un canal ionique dans l’hémostase
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
516 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les souris étant tuées avant tout réveil. 66 subissent une coupure de l'extrémité de la queue pour mesurer le temps de saignement, 66 une thrombo-embolie pulmonaire provoquée par injection, et 384 une exsanguination, pour étudier le rôle d'un canal ionique dans la coagulation. Le porteur indique que toutes les souris meurent pendant l'expérience ou sont mises à mort juste après, sous anesthésie et analgésie, car elles perdent trop de sang ou développent des thromboses. Il affirme que le modèle transgénique est plus spécifique qu'un activateur chimique et juge le recours à la souris "indispensable" pour reproduire l'activation du canal par le flux sanguin.
Objectifs
Les plaquettes sanguines sont des éléments essentiels de l’hémostase qui conduit à la formation du caillot et arrête le saignement. Elles sont également impliquées dans plusieurs pathologies. Ce projet concerne la caractérisation du rôle d’un canal ionique. A ce jour, cette protéine est très peu étudiée en hémostase et en particulier dans les plaquettes, bien que les mutations observées chez des patients pourraient être à l’origine d’événements thrombotiques. Nos travaux préliminaires effectués in vitro sur du sang humain, sont en faveur d’un rôle important de cette protéine dans l’activation plaquettaire. Cependant, ces travaux sont basés sur l’utilisation d’un activateur chimique, plus ou moins spécifique. Or physiologiquement la protéine que nous étudions est activée par un mécanisme complexe qui fait intervenir les forces mécaniques qui accompagnent le flux sanguin. C’est pourquoi, il est important de valider ces résultats en étudiant in vivo et ex vivo l’activité fonctionnelle des plaquettes de souris génétiquement modifiées exprimant sur cette protéine une des mutations fréquemment retrouvées chez les patients. Ainsi, la comparaison des réponses des plaquettes de souris témoins à celles des souris transgéniques nous permettra de caractériser les mécanismes à l’origine des thromboses observées chez les patients.
Bénéfices attendus
Identifier de manière plus précise la physiopathologie associée aux mutations de ce canal ionique, permettra une avancée majeure dans la connaissance de la pathologie et du rôle de ce canal ionique dans l'hémostase et l'apparition d'événements thrombotiques. Notre étude devrait également permettre d'ouvrir éventuellement la voie vers de nouvelles recherches comme le développement de nouvelles molécules antiplaquettaires.
Procédures
66 souris auront une coupure de l'extrémité de la queue (temps de saignement) ; 66 souris seront utilisées pour le modèle de thrombo-embolie pulmonaire induit par l’injection d’activateurs plaquettaires et - une exsanguination sera effectuée sur 384 souris. Toutes ces expériences sont de courtes durées (moins de 10 min) et sont réalisées sur des souris prémédicalisées afin de diminuer leur stress et améliorer l'efficacité de l'anesthésie effectuée avec un mélange d’anesthésique - analgésique.
Impact sur les animaux
Toutes les souris utilisées dans les expériences décèderont : soit pendant l'expérience , soit seront mises à mort immédiatement à la fin de l'expérience (toujours sous anesthésie-analgésie)
Devenir
Toutes les souris qui seront utilisées pour les expériences seront mises à mort sous anesthésie-analgésique, directement suite à l'expérience, car en fonction des expériences, les souris perdent trop de sang, ou présentent des thrombo-embolis entrainant des phénotypes dommageables (incompatibles avec la réutilisation de ces souris), ou le décès de l'animal. De plus, à la fin des expériences des prélèvements d'organes (poumon, moelle osseuse, ...), sur les souris mises à mort, seront également effectués afin d'étudier les thombo-embolies, et mettre en culture les cellules de la moelle osseuse pour étudier l'erythropoïèse et la mégacaryopoïèse.
Remplacement
Suite à l’étude de l’impact d’un activateur chimique du canal ionique sur les plaquettes humaines, il est crucial de confirmer le rôle du gain de fonction de ce canal dans l’hémostase grâce au modèle de souris transgénique qui est plus spécifique. Par ailleurs, les mécanismes impliqués dans l’hémostase mettent en jeu différentes cellules et molécules ainsi que diverses interactions (cellule-cellule et cellule-matrice), il est donc indispensable d’associer aux études in vitro des études in vivo chez l'animal. Enfin, le canal étudié étant activé par le flux sanguin, le modèle in vivo nous permet de nous affranchir de l’utilisation d’activateurs chimiques plus ou moins spécifiques.
Réduction
Si aucune différence dans les réponses plaquettaires n’est observée entre les mâles et les femelles, pour l’étude de la caractérisation de la signalisation, métabolome... (études moléculaires) un seul groupe sera alors étudié incluant mâles et femelles (au lieu de 2 groupes séparés). Ainsi, l’approche par étapes nous permettra peut être selon les résultats obtenus de ne pas atteindre le nombre d’animaux estimés pour l’ensemble de ce projet. En s’appuyant sur notre expérience dans ces modèles et ce qui est habituellement réalisé dans la littérature et en utilisant des tests statistiques à l’aide du logiciel invivostat, ceci nous permettra d’utiliser le nombre minimal d’animaux tout en atteignant la significativité, importante pour assurer la robustesse de notre étude. Ainsi, afin d'avoir une puissance suffisante, nous estimons le besoin de 11 animaux par groupe pour les études in vivo et 6 à 8 animaux par groupe pour les études ex vivo et les études de signalisation. De plus, nous développons régulièrement des méthodes d’études de l’hémostase nécessitant moins de sang. Ces tests, appliqués au modèle murin, nous permettent de diminuer le nombre de souris pour effectuer l’ensemble des études nécessaires à la caractérisation de l’activité des plaquettes des souris.
Raffinement
Bien que nous ne nous attendions pas à ce que ce modèle de souris transgénique en soi soit associé à la douleur et à la souffrance, dans un premier temps nous vérifierons, à l'aide d'une fiche d’observation, que ce modèle n’est pas dommageable et si nécessaire, la mise en place de points limites nous permettra de prendre en charge et/ou mettre à mort, tout animal présentant des signes de souffrance. Toutes les expériences effectuées sur les souris sont de courte durée (maximum 10 min) et sans réveil. Elles seront réalisées sur des souris prémédicalisées par une injection d'analgésique (Buprénorphine 0.1 mg/kg par voie SC) ce qui permet de diminuer leur stress et d'augmenter l'efficacité de l'anesthésie (isoflurane 2,5% ou mélange de kétamine (125 mg/kg)- xylazine (12,5mg/kg). La profondeur de l’anesthésie sera vérifiée par la laxité de la queue, l’absence de mouvement au niveau des vibrisses, l’absence de réflexe oculaire, de retrait de la patte à la stimulation et/ou de réaction au pincement de la queue. La qualité de l’anesthésie sera contrôlée régulièrement au cours de l'expérience Tout signe de douleur (petits mouvements des vibrisses, agitations, augmentation de la fréquence respiratoire) entrainera un renouvellement de l’injection par voie intra-péritonéale.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant de réaliser à la fois des expériences d’hémostase in vivo (thrombose et saignement sur les vaisseaux artériels) et d’obtenir suffisamment de sang et de progéniteurs hématopoïétiques nécessaires à l’étude ex vivo de l’hémostase, de la mégacaryopoïèse, et l’érythropoïèse. Par ailleurs, le modèle murin permet la construction de modèle transgénique utilisée dans notre étude . Cette étude doit se faire sur des souris adultes âgées d’au moins 10 semaines. Ce stade de développement a été choisi par analogie avec la littérature.
Etude des complications rénales du diabète chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne pendant six semaines, subissent l'ablation chirurgicale d'un rein, puis des prélèvements d'urine en cage à métabolisme et un prélèvement de sang terminal, pour étudier l'atteinte rénale du diabète. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur post-opératoire traitée par analgésiques et que le diabète peut atteindre cœur, reins et rétines. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever et analyser les reins.
Objectifs
Le diabète est la première cause de mise sous dialyse en Europe. L’insuffisance rénale est de sévérité variable au moment de la découverte de la maladie, mais la règle est que la néphropathie diabétique conduit à une altération lente et progressive des unités de filtration du rein, les glomérules. Nous recherchons les stimuli à l’origine des lésions des glomérules induites au cours du diabète. Nous avons identifié récemment un mécanisme de protection des glomérules au cours du diabète, l'autophagie. En recherchant des régulateurs de l'autophagie, nous avons identifié d'autres molécules qui sont impliquées dans une régulation négative de l'autophagie. Nous allons maintenant étudier de façon plus précise le lien entre l'autophagie et ces régulateurs dans le rein, à la fois en contexte normal et en contexte pathologique.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la néphropathie diabétique et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette complication sévère du diabète.
Procédures
Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 6 semaines (20 secondes/ jour). Une procédure chirurgicale: uni-néphrectomie (20 minutes). 6 Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). Un prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié (1 minute) .
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire soulagée par des analgésiques. Effets du modèle pathologique de diabète: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines).
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes rénales.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur le logiciel en ligne https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/ avec un risque alpha de 5%, une puissance de 80%, une moyenne du groupe contrôle de 22, une moyenne pertinamment différente attendue de 26 dans le groupe traité, une déviation standard de 3 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 15 animaux par groupe requis. 5 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental (pénétrance incomplète de la streptozotocine, mortalité liée à la chirurgie, point limites atteints). Nous optimisons l'utilisation des reins pour les différentes analyses réalisées dessus afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane 2%) avec une analgésie péri-opératoire (bubrénorphine 0,1mg/kg sc).
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Souris adultes agées de 8-12 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.