Troubles cardiaques

398 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une invalidation du gène Bmp9 reproduisant la maladie de Rendu-Osler, sont isolées seize heures par mois pendant quatre mois pour recueillir leur urine et reçoivent des injections sous anesthésie sans être réveillées. Le porteur indique qu'environ 40 % des mâles peuvent perdre du poids rapidement et présenter des atteintes du foie et du rein, et que l'isolement peut les angoisser, tous les animaux étant tués pour prélever organes et tissus. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reconstitue une maladie touchant plusieurs organes et s'aggravant avec l'âge.

Objectifs

La maladie de Rendu-Osler est une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste par des hémorragies, l’élargissement des vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes (atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, rupture de vaisseaux au niveau du foie, des poumons et dans des cas très rares dans le cerveau). Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Des gènes responsables de cette maladie ont été identifiées chez les patients atteints de Rendu-Osler. Le modèle de souris du laboratoire permet de reproduire la plupart des symptômes des patients. L’objectif du projet est de comprendre comment les vaisseaux sont perturbés chez les patients et à partir de nos observations de proposer de nouvelles pistes de traitement pour une meilleure prise en charge. Nous étudierons les vaisseaux de différents organes, et notamment ceux touchés dans la maladie de Rendu-Osler (poumons, foie, cerveau).

Bénéfices attendus

Notre étude vise à identifier et caractériser des manifestations phénotypiques chez les souris Bmp9-KO s’apparentant à celles de la pathologie humaine (dilatations de petits vaisseaux sanguins au niveau de la peau et des muqueuses, malformations artério-veineuses dans les différents organes fréquemment touchés par la pathologie). Il est attendu que ces éléments apparaissent et s’intensifient sur les animaux vieillissants comme c’est le cas dans la pathologie humaine. Ces résultats apportent des connaissances fondamentales sur le développement de la maladie. Actuellement les patients ne bénéficient que de traitements pour limiter les symptômes ou leurs effets (traitement contre les saignements de nez, transfusion sanguine pour limiter les effets des hémorragies…) mais il n’y a pas de traitement curatif de la maladie. Les attendus de ce projet sont d’apporter des connaissances scientifiques en recherche fondamentale, publiées pour être rendues accessibles à l’ensemble de la communauté scientifique. A plus longue échéance, l’objectif est, en étroite collaboration avec des cliniciens, d’élargir le champ des possibilités thérapeutiques pour les patients en ciblant des mécanismes de la pathologie qui n’avaient pas été explorés auparavant.

Procédures

Dans une des procédures, une fois par mois pendant 4 mois, les animaux vigiles sont isolés pendant 16h pour le recueil de leur urine. Pour toutes les autres procédures de ce projet, les animaux seront anesthésiés avant toute intervention (5 à 10 minutes avant tout geste invasif). Dans certaines procédures, les animaux recevront en plus un analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Après anesthésie, les animaux peuvent recevoir par injection un produit qui diffuse dans l’organisme pendant 10 à 15 minutes selon les procédures. Les animaux ne sont pas réveillés à l’issue des procédures. Dans une seule des procédures, le groupe d’animaux vigiles recevra une injection d’un réactif (durée du geste n’excédant pas quelques secondes), qui diffusera pendant 3h avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont variables en fonction de la procédure. 1) Dans la procédure d’élevage, environ 40% des mâles peuvent présenter une perte de poids rapide. Les animaux mâles et femelles peuvent aussi présenter de manière variable et non prévisible des atteintes sur différents organes : foie et rein. 2) Dans la procédure de recueil des urines, les animaux peuvent être angoissés par l’isolement pendant 16h.

Devenir

Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, sauf pour celle qui concerne le suivi métabolique, tous les animaux soient euthanasiés , afin de récupérer les organes, les tissus ou les cellules. A l’issue de la procédure de suivi métabolique, les animaux seront inclus dans la procédure «Etude de la prolifération cellulaire et collecte d’organes » au cours de laquelle ils seront euthanasiés pour récupérer les organes.

Remplacement

Il est possible d’obtenir des cellules de patients ayant les mutations responsables de la pathologie. Ces cellules sont utilisées pour des études sur la voie de signalisation in vitro. En revanche, il n’est pas possible à partir de ces cellules isolées (qui sont des cellules de poumon ou de foie) d’étudier la manière dont les jonctions anormales entre les veines et les artères se forment, ni d’étudier le retentissement de ces malformations sur différents organes tels que le cœur, ou les saignements intestinaux par exemple. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant reconstituer la pathologie de Rendu-Osler qui affecte différents organes et dont les symptômes s’intensifient avec l’âge. Il est également très difficile, pour des raisons éthiques, d’obtenir des cellules de foie ou de poumon d’individus sains.

Réduction

Nous avons effectué une analyse précise permettant de déterminer la taille des groupes nécessaires. 10 souris par groupe seront nécessaires. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tous les animaux ayant été utilisés dans la procédure pour le recueil des urines, pourront être utilisés dans une autre procédure. De la même manière, les animaux reproducteurs seront également réemployés dans d’autres procédures.

Raffinement

Afin de surveiller le bien-être des animaux, la mise en place de points limites et une visite quotidienne pour évaluer les différents points seront effectuées. Les points limites décrits sont des signes qui pourraient être observés pendant l’élevage de l’animal dans l’animalerie. L’ensemble des interventions sera effectué sous anesthésie.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet seront des souris qui présentent une mutation génétique donnant les mêmes symptômes que les patients de Rendu-Osler. Ce modèle murin est le seul existant actuellement permettant d’analyser le rôle de ce gène dans le développement de la maladie de Rendu-Osler. Les souris sont suivies tout au cours de leur vie. La maladie de Rendu-Osler est une maladie dont les symptômes apparaissent avec l’âge. Pour évaluer l’évolution des symptômes chez les souris, des groupes d’animaux seront constitués et analysés à différents âges pour comprendre le développement des anomalies et les premiers mécanismes qui se développent avant même l’apparition de symptômes.

138 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une microchirurgie avec clampage de l'artère et de la veine rénale pendant 22 minutes puis trois prélèvements sanguins, pour mettre au point un modèle de vieillissement rénal destiné à tester des candidats médicaments. Le porteur indique que l'anesthésie profonde peut provoquer la mort chez ces animaux de 70 à 72 semaines, et que toutes seront tuées 28 jours après la chirurgie pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme que les cultures de cellules rénales humaines ne peuvent pas reproduire la complexité physiologique ni les réponses systémiques, et conclut au recours à la souris.

Objectifs

10% de la population mondial est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique est caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale résultant à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Ces problèmes rénaux sont particulièrement exacerbés chez les personnes âgées. Il a été démontré que le vieillissement rénal accélère le développement de maladies rénales chroniques à la suite de lésions aigües de l’organe. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie chez les sujets âgés sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments à visés rénale. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité et de toxicité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques. De plus, le principe de cette procédure repose sur une microchirurgie relativement moins invasive comparée aux procédures existantes qui sont beaucoup plus lourdes pour l’animal (ex : néphrectomie unilatérale et incision des 2/3 du rein controlatéral, obstruction unilatérale de l’uretère…). Enfin, comme le vieillissement accélère l’établissement de maladies rénales chroniques, ce nouveau modèle in vivo permettra de réduire considérablement les délais d’expérimentations et les contraintes associés subit par les animaux.

Procédures

Chaque animal subira : - 1 procédure de microchirurgie : Laparotomie puis clampage de l'artère et de la veine rénale pendant 22 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - 3 prélèvements sanguin à d0 (avant chirurgie), à d2 et d6-7 post-chirurgie. Prélèvement d'environ 20 microlitre de sang par légère incision au niveau de la queue

Impact sur les animaux

Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe

Devenir

28 jours apès la procédure de microchirurgie, toutes les souris seront euthanasiées et leurs organes collectés pour analyses.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), notre société travaille sur le développement de modèle in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques ne peuvent pas être reproduit in vitro.

Réduction

Dans la première phase de mise au point du modèle, un nombre restreint de souris sera utilisé (environ 8) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Plusieurs facteurs clés pourront être alors déterminé tels que le temps idéal de chirurgie, d'ischémie et de suture. Sur la deuxième phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène de l'ischémie. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse à l’ischémie. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. La stratégie d'ischémie reperfusion unilatérale permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, dans les observations comparatives, le "groupe" contrôle sera constitué du rein controlatéral n'ayant pas subi d'ischémie-reperfusion.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur très expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, la procédure de microchirurgie sera réalisée sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (100mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. La souris sera aussi maintenue sous oxygène lors de la procédure chirurgicale. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture. Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effet secondaire lié au traitement et minime.

Choix des espèces

La souris est largement utilisé par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’ischémie-reperfusion au niveau rénal et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. Les souris utilisées lors de cette procédure seront très âgées (70-72 semaines). Comme décrit dans la partie introductive, les souris âgées présentent un phénotype rénal qui se rapproche des conditions retrouvées lors des maladies rénales chroniques. Afin d’accélérer le processus et d’exacerber ce phénotype, celles-ci subiront une procédure d’ischémie-reperfusion. Cette microchirurgie sur ce type d’animal permettra d’obtenir un modèle expérimental qui présentent beaucoup de similitudes avec les conditions physio-pathologiques retrouvés chez l’Homme.

68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis une occlusion de l'artère cérébrale provoquant un accident vasculaire, suivie d'une IRM, pour tester une molécule ciblant un transporteur du folate. Le porteur indique que l'AVC entraîne perte de poids et déficits sensorimoteurs, et que moins de dix pour cent des opérées peuvent mourir d'œdème ou d'hémorragie. Il affirme que l'évaluation d'un traitement suppose un modèle reproduisant l'ischémie puis la reperfusion.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la formation des lésions cérébrales suite à un AVCi est devenu une priorité pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection. L’objectif global du projet est d’évaluer l’impact d'une protéine de transport nommée RFC1 sur les dommages cérébraux dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) transitoire. RFC1 (Reduced Folate Carrier 1) est un transporteur membranaire du folate, notamment au niveau de la barrière hématoencéphalique (BHE). Les variants génétiques (polymorphismes) de RFC1 jouent un rôle dans la survenue des AVCi chez l’Homme, ce qui suggère un rôle de RFC1 dans la pathogenèse de l’AVCi. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et ex vivo sur cette nouvelle cible suggèrent un effet délétère de RFC1 sur l’unité neurovasculaire en condition d’ischémie-reperfusion cérébrale. Afin de confirmer ces résultats et d’aller plus loin dans l’exploration des effets in vivo de RFC1 dans l’AVCi, nous proposons d’évaluer les conséquences d’une mise sous silence transcriptionnelle de RFC1 par imagerie par résonance magnétique (IRM) multiparamétrique. L’objectif spécifique de cette DAP est d’évaluer l’effet de l’administration intracérébrale d’une molécule thérapeutique ciblant RFC1 sur la taille de la lésion cérébrale et l’intégrité de la BHE. Le groupe contrôle recevra une molécule inactive. Notre hypothèse est que ce silençage génique de RFC1 devrait diminuer la taille des lésions, et protéger la BHE.

Bénéfices attendus

Si l’effet neuroprotecteur du silençage de RFC1 est prouvé, cela validera RFC1 comme une nouvelle cible thérapeutique, et il sera possible de tester des molécules permettant d’inhiber RFC1 et de proposer un nouveau traitement de l’AVCi, avec l’espoir à terme de limiter les séquelles neurologiques pour les patients victimes d’un AVCi.

Procédures

L’injection d’un ARN interférent (siRNA) in situ nécessite une injection stéréotaxique, réalisée sous anesthésie générale (

Impact sur les animaux

Suite à l'accident vasculaire cérébrale, les animaux perdent du poids et présentent des déficits neurofonctionnels sensorimoteurs (par exemple hémiparésie et diminution de la sensibilité des vibrisses). La douleur concerne principalement la cicatrice due à l’abord chirurgicale (le cou) car les dommages au niveau du parenchyme cérébral n’engendrent pas de douleur (raison pour laquelle les patients présentant un AVC tardent à se rendre aux urgences). Les animaux sont gardés en vie 24 heures puis ils sont mis à mort à l’issue de l’examen IRM terminal. La principale complication du modèle est le décès par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne (

Devenir

les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses complémentaires post-mortem (imagerie ex vivo haute-résolution, immunohistochimie).

Remplacement

Cette étude in vivo vient compléter des études déjà réalisées in vitro et ex vivo (notamment sur microvaisseaux cérébraux isolés) et montrant le rôle de la protéine RFC-1 dans l'ischémie-reperfusion. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des animaux de plus grande taille (chats, primate) grâce à l’utilisation d’un appareil d’imagerie à haut champ dédié aux petits animaux.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude statistique en prenant en compte la variabilité attendue du modèle et les critères d'exclusion (absence d'infarct cérébral, hémorragie sous-arachnoïdienne). L’utilisation de l’IRM longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion à 24h par la taille de l’atteinte initiale en perfusion ou en diffusion en per-occlusion chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

L’imagerie réalisée pendant l'accident vasculaire cérébral permet de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. L’IRM per-occlusion est également efficace pour détecter les animaux présentant un hémorragie sous-arachnoïdienne précoce (

Choix des espèces

Les souris utilisées pour cette étude seront des souris SWISS car il existe une littérature importante rapportant l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVCi. En particulier, cette souche de souris a peu d'artères collatérales dans le cerveau ce qui permet d'avoir une lésion ischémique plus reproductible d'un animal à un autre. D'autre part, leur pigmentation de peau blanche rend plus facile la pose du cathéter caudal pour les examens IRM nécessitant l’administration d’un agent de contraste (imagerie de perfusion et de perméabilité). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : la maturité cérébrale est atteinte et le poids suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.