Troubles respiratoires
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
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- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Étude de pharmacocinétique, de bio-distribution et d’innocuité d’un transporteur d’oxygène par voie systémique dans un modèle de primate non humain.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles respiratoires
13 macaques à longue queue vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Repris d'un projet précédent, ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter fémoral, l'injection d'un transporteur d'oxygène issu d'un ver marin, une anesthésie maintenue huit heures et sept prélèvements sanguins, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur vise à évaluer la pharmacocinétique et l'innocuité de la molécule avant un essai chez l'humain. Il affirme que le macaque est l'espèce "de choix" et que cette évaluation "ne peut pas être remplacée" par des modèles in vitro.
Objectifs
L’infection à SARS-CoV2 (Covid19) se manifeste dans sa forme compliquée par un Syndrome de Détresse Respiratoire Aigüe (SDRA). En l’absence de traitement étiologique validé, l’essentiel de la prise en charge des patients en SDRA est purement symptomatique et commune à l’ensemble des étiologies. Elle repose sur la ventilation protectrice, sur l’utilisation de myorelaxants en cas de désadaptation au respirateur, et sur le positionnement en décubitus ventral des patients les plus hypoxémiques afin de recruter du parenchyme pulmonaire atélectasié et d’améliorer les rapports ventilation/perfusion. En cas d’échec de la prise en charge classique, le recours à une ECMO (ExtraCorporeal Membrane Oxygenation) est envisagé. Malgré cette prise en charge optimale, la mortalité reste élevée. L’hémoglobine de ver marin est un transporteur d’oxygène universel qui a la capacité de transporter une grande quantité d’oxygène et pourrait améliorer le contenu artériel en O2 dans une situation où l’échangeur pulmonaire est défaillant. Cette molécule est une hémoglobine extracellulaire dont la séquence est très proche de la forme humaine (HbA). Initialement développé comme un dispositif médical favorisant l’oxygénation des greffons en transplantation d’organes, le transporteur d'oxygène semble intéressant pour améliorer les hypoxémies réfractaires rencontrée dans le SDRA. Les expériences pré cliniques in vitro puis in vivo dans le modèle murin ont montré que ce composé a une capacité oxygénante 40 fois supérieure à l’hémoglobine des vertébrés. Les études in vitro ont démontré la biocompatilité de ce composé chez l’humain et les mammifères et les études de tolérance dans les modèles murin et canin n’ont pas montré d’effet indésirable notable. L’objectif principal de notre étude est d’évaluer la pharmacocinétique (PK) et la pharmacodynamique (PD) du transporteur d’oxygène et en particulier ses effets biologiques sur l’immunité, l’inflammation et la fonction plaquettaire, ainsi que sa biodistribution au niveau des organes. Les objectifs secondaires de notre étude sont d’évaluer l’innocuité de l’injection de la molécule d'intérêt chez le primate non humain, ainsi que d’évaluer son effet sur les fonctions d’organe dans les 6 premières heures suivant l’administration du produit en vue de premières expérimentations dans la clinique humaine.
Bénéfices attendus
L’obtention de données évaluant la pharmacocinétique et l’élimination de la molécule permettront de préciser les modalités d’injection en vue d’une première injection chez l’homme. Si notre étude montre l’innocuité de la molécule d'intérêt par voie systémique, une étude de toxicologie règlementaire sera développée puis une recherche interventionnelle de phase 1 impliquant la personne humaine sera soumise afin d’évaluer la sécurité du candidat médicament chez l’homme. Ces études seront suivies ensuite d’une étude comparative (phase 2) afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de ce traitement. L’objectif attendu du traitement est une diminution de la morbi-mortalité des patients atteints de SDRA.
Procédures
Sous anesthésie générale : - Anesthésie à T-1H- Installation d’un cathéter central au niveau de la veine fémorale par voie chirurgicale (30-45 min) -Injection médicamenteuse d’un transporteur d’oxygène par voie veineuse centrale sur une durée d’une heure - Maintien de l’anesthésie durant 6h post-injection - 7 prélèvements de sang sur cathéter périphérique (5 min) sous anesthésie générale durant les 7h de suivis d’injection- Mesure des paramètres vitaux sous anesthésie durant les 7h de suivi (toutes les 5 minutes de T0 à H1 puis toutes les 20 minutes de H1 à H6) - Procédure sans réveil
Impact sur les animaux
Bien que toutes les procédures soient réalisées sous anesthésie générale (dès T-1H), la chirurgie (courte) ainsi que l’anesthésie longue de 8h avec injection de la molécule d’intérêt sur 1h et prélèvements sanguins fréquents (de faible volume) peuvent causer du stress, de l’inconfort et une certaine douleur. Aussi un traitement analgésique sera donné en amont du protocole et un suivi attentif de l’animal sera effectué tout au long de l’anesthésie. Cependant, l’injection de la molécule d’intérêt chez les rongeurs et chez le chien n’a pas montré d’effets secondaires particuliers.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, sous procédure complète d’anesthésie profonde pour prélèvement d’organes post-mortem permettant l’analyse de la distribution tissulaire de la molécule d'intérêt.
Remplacement
L’évaluation de la pharmacocinétique et de l’innocuité d’une nouvelle molécule dans des conditions in vivo en vue d’une expérimentation chez l’homme ne peut pas être uniquement remplacée par des études in vitro. La littérature évaluant la molécule d'intérêt dans des conditions in vitro chez le rongeur est en faveur de sa tolérance systémique, rénale, hépatique, cardiaque, pulmonaire et immunologique. Le dépôt d’un projet de recherche évaluant une nouvelle molécule thérapeutique chez l’homme impose au préalable de justifier de son innocuité chez l’animal. Cette évaluation au niveau systématique ne peut pas être remplacée par des modèles in vitro.
Réduction
Les primates non humains intégrés dans ce protocole seront uniquement des animaux réutilisés d’un projet précédent et ce dans un cadre de procédure de classe sans réveil. Bien qu’aucune étude statistique ne soit possible et par homologie avec les évaluations de PK/PD-Innocuité en médecine humaine où le nombre de 3 sujets par palier est majoritairement admis comme suffisant, le nombre maximum de n= 4 animaux par palier de dose différente est apparu comme suffisant pour évaluer à la fois la pharmacocinétique et la bio-distribution de la molécule selon différentes posologies (objectif principal) ainsi que l’innocuité lors de l’injection systémique de la molécule (objectif secondaire). De manière à réduire, le nombre d’animaux, le groupe contrôle ne comptera qu’un animal. Il est à noter que si des évènements indésirables surviennent après l’injection des 50mg, le reste de la dose ne sera pas injecté et les autres groupes (paliers supérieurs) ne seront pas réalisés. De plus, après chaque palier, le recueil et l’analyse d’éventuels événements indésirables permettront de décider ou non de la poursuite de l’étude afin d’évaluer la pharmacocinétique et l’innocuité d’une dose supérieure du transporteur d'oxygène. En cas d’évènement indésirable imputé à l’injection de la molécule, l’étude sera arrêtée au pallier étudié.
Raffinement
Les animaux en réutilisation ne seront introduits dans ce protocole, qu’après validation pas le vétérinaire référant. Pendant les procédures les animaux seront installés sur table chauffante. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et la douleur sera dans la mesure du possible gérée par injection d’analgésiques. Les paramètres vitaux seront surveillés très fréquemment pendant la procédure. Il est à noter que si les évènements indésirables apparaissent après l’injection des 50mg de la molécule d’intérêt, le reste de la dose ne sera pas injecté et en cas d’évènement indésirable imputable à l’injection de la molécule, l’étude sera arrêtée au palier étudié. Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.
Choix des espèces
L’évaluation de la pharmacocinétique/ bio-distribution et de l’innocuité du candidat médicament par voie systémique dans un modèle primate non humain est nécessaire afin de garantir une sécurité d’utilisation maximale avant utilisation en clinique humaine. Les primates non humains, particulièrement les macaques, représentent l’espèce animale de choix dans les modèles pré-cliniques de par leur taille, leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude physiologique et avec le système immunitaire de l’homme. Il s’agit d’animaux jeunes adultes (4 à 8Kg) dont le système immunitaire est mature.
Evaluation de stratégies de prévention et de traitement de l’infection par SARS-CoV-2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur ACE2 humain, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 dans un modèle décrit comme létal, avec une perte de poids pouvant atteindre 30 % et une survie moyenne de cinq jours, puis reçoivent en moyenne cinq injections et des prélèvements sanguins, une fraction subissant une chirurgie thoracique sous anesthésie sans réveil. Le porteur vise à tester vaccins, anticorps et antiviraux avant un passage chez l'humain. Il affirme que l'étude de la réponse immunitaire rend le recours à la souris "indispensable" et qu'il est "impossible" de la remplacer par un modèle "ne représentant que partiellement un organisme".
Objectifs
Depuis la fin de l'année 2019, la pandémie de COVID-19 s'est propagée dans le monde entier, causant plus de six millions de décès et affectant plusieurs centaines de millions de personnes. Cette maladie, causée par la transmission du virus SARS-CoV-2, se manifeste par différents symptômes. Les formes légères se caractérisent principalement par de la fièvre, de la toux, de la fatigue, des pertes de goût et d'odorat. Les formes les plus graves sont associées à un syndrome de détresse respiratoire aiguë, et une défaillance de plusieurs organes de très mauvais pronostic. Des recherches intensives ont permis des progrès importants dans la compréhension des mécanismes sous-tendant les manifestations cliniques. Cependant, il n’existe toujours pas de traitement totalement efficace contre la COVID-19. Le récepteur ACE2, nécessaire à l’entrée du virus SARS-CoV‑2 dans les cellules de l’hôte, est une protéine clé dans les mécanismes à l’origine de la maladie. Parmi les différents modèles d’étude précliniques utilisés dans la recherche de vaccins et molécules thérapeutiques, les modèles de souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain sont sensibles à l’infection par le virus SARS-CoV-2, et permettent une analyse expérimentale du comportement du virus dans l'organisme. Certains de ces modèles dits ‘sévères’ développent après infection une forme létale de la maladie causée notamment par une réponse hyper-inflammatoire hors de contrôle. D’autres, dits ‘modérés’, développent une forme légère de la maladie. L’objectif de ce projet vise à la mise en place de modèles souris d’infection (sévère et modérée) au SARS-Cov-2 pour permettre d’étudier l’infection d’une part, et d’évaluer d’autre part une large gamme de stratégies de prévention et de traitements potentiels (vaccins, anticorps, anti-viraux, anti-inflammatoires) avant passage en phase clinique chez l’humain. Ce modèle, génétiquement modifié pour exprimer le récepteur ACE2 humain, permettra le suivi des paramètres immunologiques de l’infection, y compris avec des variants d’intérêt récents du virus. Du fait de sa petite taille de l’accessibilité facilitée à des modèles génétiquement modifiés, le modèle murin permet d’évaluer une large gamme de candidats médicaments pour traiter la cause (l’infection par le virus SARS-CoV-2) et les symptômes de la maladie induite après infection. Il permet donc en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre.
Bénéfices attendus
Dans le contexte actuel de la pandémie COVID-19, il est urgent de pouvoir procéder à l’évaluation de traitements contre le virus lui-même ou contre les atteintes conséquentes à l’infection (respiratoires, vasculaires, neurologiques, cardiaques, inflammatoires). En permettant d’accroitre la capacité d’accès à plusieurs modèles pertinents de la maladie induite par l’infection au SARS-CoV-2, ce projet permettra d’augmenter significativement les options d’évaluation de nouvelles stratégies de traitement variées et adaptées à des situations cliniques (modérées et sévères) diverses. Dans le cadre de ce projet, nous mènerons à bien les campagne d’évaluation de composés candidats, avec l’objectif de permettre l’identification rapide de nouveaux produits efficaces contre SARS-CoV-2. A plus long terme, et ce, dans le cadre du projet collaboratif entre les différents partenaires du projet, de nouvelles approches technologiques en imagerie seront établies, permettant d’accroitre nos connaissances sur la réponse immunitaire mise en œuvre chez la souris dans le cadre d’infections causées par des pathogènes aéroportés.
Procédures
Les animaux de chaque étude seront soumis à un campagne de traitement pouvant représenter plusieurs inoculations de composés tests, et ce, via diverses routes d’inoculation (moyenne de 5 injections avec des candidats médicaments et 2 injections avec des candidats vaccins ; durée des interventions
Impact sur les animaux
Deux types de modèles murins de l’infection au SARS-CoV-2 (sévère et modérée) seront établis. Tous les modèles seront suivis cliniquement de la même manière pour permettre une comparaison des critères d’évaluation. La grande majorité des études fera appel à un modèle d’infection sévère. Dans les modèles sévères, l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie létale (aboutissant à la mort) qui s’accompagne d’une perte d’activité et de poids (jusqu’à 30%), avec une survie moyenne de 5 jours. Un traitement efficace devra permettre une amélioration significative des atteintes cliniques et de la survie au-delà de 5 jours post-infection. Dans les modèles modérés (moins bien décrits dans la littérature scientifique), l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie limitée qui se résout d’elle-même en 1-2 semaines, sans signe clinique macroscopique particulier chez les jeunes animaux. Une perte de poids transitoire (de l’ordre de 10% à 3 jours post-infection) a été rapportée chez les animaux plus âgés (30 semaines). De plus, des effets indésirables peuvent être observés suite à des traitements (inflammation ou nécrose au site d’inoculation, intolérance et toxicité des traitements).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, afin de procéder à la collecte d’échantillons biologiques d’intérêt (notamment des tissues des voies aériennes).
Remplacement
L’utilisation des modèles de souris COVID-19, organismes vivant complexes à même de reproduire différents aspects de la maladie humaine, est indispensable pour faire progresser le programme d’évaluation de candidats thérapeutiques dans un contexte où la balance bénéfice/risque de nombreuses molécules peut se révéler négative in vivo malgré des résultats prometteurs obtenus in vitro. Le projet portant sur l’étude de la réponse immunitaire de l’organisme et l’évaluation de traitements, il est impossible de remplacer l’animal par un modèle ne représentant que partiellement un organisme. L’utilisation de ces modèles intervient en seconde ligne après l’évaluation des candidats médicaments in vitro dans plusieurs systèmes expérimentaux (biochimie, culture de lignées cellulaires, avec utilisation de plusieurs variants d’intérêt du SARS-CoV-2). En l’absence d’une efficacité auparavant démontrée in vitro, les candidats médicaments ne seront pas testés in vivo. La sélection préalable des candidats in vitro permet de réduire drastiquement le nombre de produits à tester in vivo.
Réduction
En nous basant sur nos études antérieures sur le modèle hamster COVID d’une part, et sur les études effectuées par nos collaborateurs académiques sur un modèle murin sévère d’infection d’autre part, nous avons établi des effectifs de lots de 15 animaux pour pouvoir observer des différences statistiques entre groupes. Dans chaque lot, une fraction des animaux sera utilisée pour évaluer la charge virale pulmonaire et des paramètres de réponse immunitaire, et une autre fraction sera utilisé pour évaluer la survie à long terme (2 semaines) prodiguée par le traitement en cours d’évaluation. Les comparaisons des données des différents groupes d’animaux seront réalisées au travers d’analyses statistiques adéquates.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des portoirs ventilés permettant l’hébergement maximal simultané de 405 animaux par portoir (5 souris par cage). Suivant nos observations, nous pourrons augmenter l’enrichissement des cages (deux cylindres au lieu d’un) ou diminuer le nombre d’animaux par cage (tout en évitant les individus seuls). Aucune anesthésie n’est prévue pour les inoculations par voie per os (risques de fausse route), sous-cutanée ou intrapéritonéale (allongement considérable de la durée de la procédure induisant plus de stress). Un suivi clinique quotidien (a minima sur les 7 premiers jours de l’infection) des animaux avec pesée & évaluation des paramètres cliniques permet de s’assurer de l’évolution des signes cliniques de l’infection. Une grille de score clinique sera mise en œuvre, en nous basant sur les observations et pratiques déjà établies par d’autres collaborateurs académiques. Les critères suivis incluent l’apparence physique, la perte de poids, la mobilité et le comportement et permettent de déterminer un score clinique non dommageable, léger, modéré ou sévère. Une euthanasie préventive sera effectuée pour éviter des souffrances inutiles si les animaux présentent une forte perte poids ou un score clinique sévère. En cas de perte de poids intermédiaire, la nourriture et de l’eau gélifiée seront disposées en fond de cage. Une réhydratation par injection sous-cutanée quotidienne sera effectuée à partir d’une perte de poids intermédiaire.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain permettent d’accéder à une gamme de modèles expérimentaux reproduisant une pathologie soit sévère, soit modérée, après infection au SARS-CoV-2. Elles présentent l’avantage de pouvoir être explorées expérimentalement grâce à de très nombreux outils de biologie cellulaire et moléculaire, ce qui n’est pas le cas du modèle hamster syrien doré. Du fait de sa petite taille, de son coût réduit et de l’accessibilité facilitée via des éleveurs agréés, le modèle permet, en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre, comme les primates non-humains. Il est à noter que les modèles chez lesquels une pathologie sévère est obtenue n’ont pas d’équivalent dans d’autres espèces animales, et représentent donc une opportunité unique pour étudier une pathologie de type COVID. Ces lignées d’animaux ne présentent pas d’atteintes physiques et/ou de comportement sévère (phénotype dommageable) dans les conditions normales d’hébergement, et, dans le cadre de ce projet, ne montreront un phénotype dommageable que suite à une infection par le virus SARS-CoV-2. Les animaux utilisés pour ce projet seront âgés de 8 à 12 semaines (stade adulte), comme décrit jusqu’à maintenant dans la littérature scientifique disponible sur le sujet. Dans certains cas, il pourra être envisagé d’utiliser des animaux plus jeunes ou plus âgés, pour potentiellement reproduire des aspects de la maladie spécifiquement observés chez des individus humains jeunes ou âgés, respectivement.
Evaluation de l’efficacité de vaccins innovants contre le SARS-CoV2 chez le primate non humain.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
240 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 160 étant tués à l'issue et 80 réutilisés dans d'autres études. Ils sont vaccinés par diverses voies puis infectés par le SARS-CoV-2 par voie nasale, trachéale ou en aérosol, et subissent des prélèvements de sang jusqu'à cinq fois par semaine, des lavages des poumons, des biopsies pulmonaires, intestinales, de moelle et de peau, ainsi que des ponctions lombaires. Le porteur affirme n'avoir détecté aucune souffrance liée à l'infection après un an et demi d'expérience, tout en reconnaissant des risques de pneumothorax ou de saignements lors des biopsies. Il teste des candidats vaccins présentés comme un "enjeu international majeur" et justifie le macaque par la proximité de sa réponse immunitaire avec celle de l'humain.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’évaluer la capacité à provoquer une réponse immunitaire et l’efficacité de différents candidats vaccins innovants contre le virus SARS-CoV2, dans un contexte où les vaccins actuels ne sont que partiellement efficaces pour lutter contre la pandémie de Covid-19 que nous connaissons maintenant depuis deux ans. Plusieurs vaccins contre le SARS-CoV2 sont disponibles chez l’humain depuis 1 an environ, toutefois leur efficacité à long-terme est aujourd’hui remise en cause. En effet, la réponse immunitaire induite semble s’estomper au bout de quelques mois, ce qui nécessite l’administration de doses de rappel régulières. De plus, l’émergence de variant diminue l’efficacité de ces vaccins, qui devront certainement être modifiés pour rester suffisamment efficaces. En outre, les vaccins actuellement disponibles ne bloquent pas totalement la dissémination du virus. Il ne faut donc pas que les candidats vaccins moins avancés dans leur développement soient précocement abandonnés alors qu’ils pourraient suppléer à d’éventuels points faibles des vaccins déjà établis. Dans ce contexte, nous testerons dans un modèle animal de Covid-19 différents types de vaccins tels que de nouveaux vaccins à base d’ARN messager, des vaccins à base de séquences d’ADN, de virus atténués ou inactivés ainsi que des vaccins plus classiques de type protéique. Ces derniers pourraient représenter une alternative efficace pour stimuler la réponse immunitaire suite aux vaccins à ARN messager actuellement utilisés. Nos recherches précliniques actuelles devraient permettre de rentrer rapidement en phase d’essai clinique et nous faisons en sorte de pouvoir répondre aux exigences des critères d’entrée en essai clinique. Certaines études sont même des demandes explicites des agences.
Bénéfices attendus
La recherche d’un vaccin efficace contre le SARS-CoV2 est un enjeu de santé publique, dans la mesure où cette pandémie continue d’affecter notre société, en créant un afflux de malade dans les hôpitaux malgré les vaccins actuellement disponibles. La limite des vaccins actuels face aux nouveaux variant émergents nous encourage à trouver des moyens de lutte plus efficaces. En effet, ces vaccins voient leur efficacité décroître au bout de quelques mois et des rappels réguliers sont nécessaires pour maintenir une immunité efficace contre le virus. De plus, ces vaccins n’empêchent ni la dissémination du virus, ni même l’apparition de symptômes chez les personnes vaccinées. Aujourd’hui, de nouvelles stratégies vaccinales à l’aide de vaccins candidats de type protéique ou à ARN/ADN doivent être développées pour protéger plus efficacement de l’infection par le SARS-CoV2 et réduire sa propagation La pandémie perdure depuis 2 ans, elle a causé la mort de millions de personnes et impacte fortement la société, trouver un vaccin pour l’endiguer définitivement et y mettre fin est un enjeu international majeur.
Procédures
L’ensemble des procédures seront effectués sur des animaux anesthésiés pour éviter toute souffrance. L’immunisation des PNHs sera effectuée par voies (intramusculaire, intranasale et autres voies muqueuses, sous-cutanée, intradermique, délivrance par endoscopie): mise à part l’endoscopie le temps de l’intervention est inférieur à 30 minutes. Immunisation par voie intestinale ou gastrique peut prendre jusqu’à 1h30. Nous effectuerons le challenge viral par voie nasale et trachéale ou par voie aérosol et cela durera 30 minutes. Des puces de température pourront être implantés pour suivre la température corporelle en continu (intervention 45 minutes) Afin de caractériser nos candidats vaccins et l’infection SARS-CoV2, nous effectuerons des prélèvements de sang au maximum 5 fois par semaine par voie veineuse en limitant la quantité prélevée à 7.5% de la volémie sanguine totale/semaine. Ceci nécessitera un temps d’anesthésie de 20 minutes. Pour suivre l’évolution de la charge virale, nous effectuerons des prélèvements ou lavages aux/des sites infectieux et muqueuses (tractus respiratoire) au maximum 5 fois par semaine (10 minutes). Pour accéder au tractus respiratoire inférieur, nous effectuons des lavages broncho-alvéolaires (LBA) avec 4 jours d’intervalle minimum entre chacun des lavages (30 minutes). Différents types de biopsie pourront être réalisés en fonction des besoins de l’étude, comme des prélèvements de ganglions lymphatiques avec deux semaines d’intervalle minimum (45 minutes). Nous pourrions avoir besoin d’effectuer des biopsies pulmonaires pour évaluer la réponse locale ainsi que des biopsies de moelle osseuse et des biopsies intestinales par endoscopie (90 minutes d’intervention maximum). Des ponctions lombaires pour accéder au liquide cérébrospinal (1 fois par semaine au maximum) et des biopsies de peau pourraient être envisager (20 min d’intervention). Nous utiliserons aussi des méthodes non invasives pour l’analyse de nos candidats vaccins en utilisant l’imagerie CT et PET-CT avec injection de Fluor 18 (90 minutes maximum). Dans des cas très particuliers, nous pourrions effectuer une plasmaphérèse pour éliminer des anticorps spécifiques (1 fois par mois, 4 heures). De l’urine pourrait être aussi récupérée par sondage, pour mesurer la concentration urinaire du vaccin (20 minutes pour les 2 semaines). Enfin, des empreintes conjonctivales pourraient permettre d’accéder aux cellules immunitaires (1 fois/semaine pendant 20 minutes)
Impact sur les animaux
Après plus d’un an et demi d’expérience, nous n’avons pas détecté de souffrance suite à une infection par le SARS-CoV2 de notre modèle de PNH et cela quel que soit le variant utilisé (Wuhan/Beta/Delta…). Toutefois, l’hébergement individuel lors des phases de challenge pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Au niveau des procédures expérimentales, peu d’effets indésirables sont attendus. Dans de très rares cas, un pneumothorax (présence anormale d'air dans la cavité pleurale) ou un hémothorax (épanchement de sang dans la cavité pleurale) sont possibles à la suite des biopsies pulmonaires et seront observables en direct lors de l’endoscopie. Les animaux seront suivis sur des paramètres cliniques comme l’oxymétrie et la fréquence cardiaque pendant et après l’intervention pour s’assurer de l’absence de lésion. Les biopsies digestives par endoscopie sont parfois associées à des saignements digestifs. Lors de la réalisation de l’endoscopie, le site biopsié sera observé pour identifier et traiter tout saignement. Il est possible que les biopsies entrainent des inflammations et plaies locales qui seront surveillées quotidiennement jusqu’à la récupération complète de l’animal.
Devenir
Certains animaux vaccinés et non infectés par le SARS-CoV2, suite à l’inefficacité de l’immunisation, pourront être euthanasiés pour prélever différents tissus et procéder à des analyses de biodistribution, par exemple. Toutefois, dans la majorité des cas, les animaux ayant subi une immunisation inefficace pourront être réutilisés dans différentes études au sein du département afin de limiter le nombre total d’animaux utilisé. Les animaux infectés pourront être euthanasiés pour accéder aux tissus et mesurer par exemple la charge virale dans les poumons et d’autres tissus cibles ou encore pour caractériser les lésions pulmonaires par analyses histologiques (charge virale, lésions pulmonaires…) L’autre partie des animaux infectés par le SARS-CoV2 sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents.
Remplacement
L’évaluation de vaccins contre le SARS-CoV-2 nécessite un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite à l’immunisation et à l’infection virale. A ce jour, ces différents éléments ne peuvent pas être étudiés à l'aide de simulations informatiques ou dans des modèles in vitro. L'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour reproduire les symptômes et réponses immunitaires induits pas un virus respiratoire. Le primate non humain est choisi comme modèle animal dans cette étude, car il présente une réponse immunitaire et vaccinale semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires. De plus, les outils nécessaires sont disponibles et maitrisés chez cette espèce.
Réduction
Nous recevons de nombreuses demandes de partenaires pour tester des candidats vaccins. Notre expérience nous a montré que pour le développement d’un type de vaccin, les différentes phases de développement nécessitent plusieurs études pour ajuster la dose et la composition du vaccin, et dans ce cas précis la séquence ADN, dans un contexte d’émergence continuelle de variant. Nous considérons que nous aurons au moins besoin de 5 protocoles par candidat vaccin et nous anticipons 6 études à venir rapidement au cours de l’année 2022/2023. La majorité des candidats-vaccins sont d'abord évalués dans des modèles animaux murins, afin de réduire au maximum l'utilisation de primates non-humains. Ainsi nous anticipons 30 protocoles avec un maximum de 6 primates non-humains par groupe. Ce chiffre, qui permettra une analyse statistique fiable des résultats, représente le nombre maximum de primates non-humains par groupe. Dans certains cas, il pourra être réduit pour des phases pilotes comparant des doses ou des voies d’administration par exemple. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous limiterons le nombre d’animaux contrôle non vaccinés en incluant des contrôles historiques au sein des études.
Raffinement
Tous les animaux sont des animaux d’élevage de seconde génération toutes les procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés. De plus, des protocoles d’analgésie ont été définis et validés par l’équipe vétérinaire afin de minimiser la douleur à chaque intervention en fonction de l’espèce utilisée. Les hébergements en individuel sont limités au maximum. ils seront hébergés en individuel contigus uniquement après la phase d’infection. Cet hébergement individuel contigu permet des interactions sociales (conservation du contact physique par le haut de la cage et sensoriel par la mise en place de plaques translucides entre les cages latérales, et cages face à face séparées d’environ 2m). L’enrichissement sera augmenté (distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles au lieu d’1). Les interventions par chirurgie mini-invasive, ciblant des organes et tissus préalablement identifiés par imagerie médicale seront privilégiées afin de raffiner les méthodes expérimentales employées et ainsi réduire la douleur postopératoire. Grâce à l’utilisation de différentes techniques d’endoscopie (bronchoscopie) les tissus cibles seront prélevés avec précision en un nombre réduit d’incisions. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire. En cas d’apparition de signes locaux suites aux prélèvements, un traitement symptomatique local pourra être instauré après examen par le vétérinaire. Pour les prélèvements des fluides bronchiques une attention sera portée aux animaux lors de ce geste. Un anesthésique local sera utilisé lors de l’intubation et les animaux seront étroitement surveillés jusqu’à leur réveil. Lors des séances d’imagerie in vivo, l’animal sera placé sur un matelas chauffant avec un maintien hydrique et ses constantes biologiques seront surveillées. Si l’animal présente des signes cliniques (difficultés respiratoires, vomissement, tachycardie, arythmie, hypoglycémie) avant ou lors de la séance d’imagerie, la session sera interrompue. Si l’animal montre des signes de douleur trop importante, un traitement symptomatique pourra être mis en place par le vétérinaire responsable. Si l’état général de l’animal ne s’améliorait pas malgré la prise de mesures, alors l’euthanasie de l’animal serait envisagée.
Choix des espèces
Les espèces de primates non-humains retenues pour cette étude ont été sélectionnées pour deux raisons : - elles représentent le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de vaccins : les réponses immunitaire et vaccinale sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale sont disponibles et maitrisés chez ces espèces, contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires régulièrement utilisées comme le furet. - elles ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles d’infection par le SARS-CoV2, et présentent des symptômes semblables à ceux observés chez l’Homme. Les espèces choisies présentent un système immunitaire et une physiopathologie de l’infection par le SARS-CoV2 très proches. Le système immunitaire et la réponse vaccinale évoluent en fonction du stade de développement et de l’âge des individus. Les candidats vaccins étudiés étant susceptibles de faire l’objet d’essais cliniques chez l’adulte, il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal au système immunitaire « mature », soit de plus de 2 ans.
Modèles conditionels pour étudier la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance surtout modéré. Un modèle de dystrophie myotonique est induit par la doxycycline, y compris chez des souriceaux étudiés jusqu'à sept jours de vie pour leurs vocalises, leur respiration et leur alimentation, 160 animaux étant tués sans réveil par perfusion d'un fixateur. Le porteur indique que les effets attendus des souris induites sont neurologiques et présente les autres actes comme légers. Il cherche à créer un modèle "plus performant" de la forme congénitale de la maladie et qualifie ce développement d'étape "incontournable".
Objectifs
Les objectifs du projet sont: 1) la création d'un nouveau modèle murin (souris) conditionnel de la Dystrophie Myotonique de type 1, spécifique du cerveau permettant de décortiquer les mécanismes physiologiques, histologiques et moléculaires observées chez l'homme 2) la validation de ce modèle et l'optimisation des conditions d'induction de la mutation 3) étudier les impacts physiopathologiques des ARN DMPK mutants exprimés dans les motoneurones de souris nouveau-nés transgéniques: analyses phénotypiques, histologiques, moléculaires et fonctionnelles.
Bénéfices attendus
Ce nouveau modèle permettra de déterminer l'implication des motoneurones des nerfs craniaux et spinaux dans la pathologie notamment dans la forme grave néonatale. L'obtention et l'étude de ce nouveau modèle murin plus performant ouvrira la voie à une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires à l'origine de la pathologie et des conséquences physiologiques. Enfin l'utilisation de ce modèle devrait permettre de tester et de valider chez la souris le développement de nouvelles thérapies de traitement de la DM1 développées au laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur cette maladie.
Procédures
Les 848 souris de ce projet seront impliquées dans des procédures de sévérité légère, modérée et sans réveil. De séverité légère, sont concernées 96 souris qui seront utilisées pour l'étude des vocalises à 7 jours avec 3 minutes comme durée d'acte . De sévérité modérée, sont concernéees 592 souris: - les souris meres (128 souris) qui recevront la doxycycline au stade E11et P1 jusqu’à 7 jours, - les 16 souris qui permettront la validation du modèle après injection de l'inducteur doxycycline en injection intra-péritonéale sur une durée de 4 jours. - les 96 souris utilisées pour optimisation de la concentration de doxycycline. Cet acte durera jusqu à 7 jours de vie. - les 96 souris utilisées pour l'étude de la respiration par pléthysmographie à 7 jours. Cet acte dure au maximum 1h - les 96 souris utilisées pour l'étude de l’alimentation sur une durée de 7 jours. - les 160 souris utilisées qui recevront la doxycycline pour les etudes moléculaires jusqu’à 7 jours de vie. De classe sans réveil, sont concernées les 160 souris utilisées pour les études histologiques , perfusées au PAF pendant une durée d environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les symptômes ou effets attendus pendant ou à l'issue de la procédure P1 (classée modérée) sur les souris induites uniquement (cad ayant recu de l'inducteur: doxycycline) sont exclusivement neurologiques compte tenu de la specificité d'expression de l'ARN mutant. Les effets indésirables attendus pendant les autres procédures sont classés légers et sont un stress léger lors des manipulations et test d'évaluation fonctionnelle non invasifs ou de l'ordre de la gène ressentie lors d'une piqure (injections de doxycycline ou d'anesthésique).
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements qui sont nécessaires pour les analyses post-mortem.
Remplacement
La compréhension des mécanismes à l’origine de la DM1 et le développement d’approches thérapeutique nécessitent d’avoir recours à des modèles animaux de cette pathologie qui expriment la mutation DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. A ce jour, les modèles murins de la DM1 existants ne reproduisent que partiellement les anomalies moléculaires et physiologiques observées chez les patients. Le développement d’un nouveau modèle murin de la DM1 présentant davantage de similitudes avec la pathologie chez l'homme est un enjeu majeur et une étape incontournable dans la compréhension de la pathologie humaine et l'évaluation des approches thérapeutiques développées dans notre laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur la DM1.
Réduction
Afin d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux, tous les animaux issus des croisements (mâles et femelles) seront utilisés soient 848 animaux. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, histologie et biologie moléculaire. Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation d’animaux supplémentaire prévue dans la seconde étape, et ainsi de suite. Les analyses physiologiques finales seront réalisées avec des lots suffisants dont le nombre a été établi par un calcul mathématique lors d’études precedents. Nous avons ainsi déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données. Il sera ensuite nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats
Raffinement
En conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux sera amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu avec des nid de lanière kraft. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30- 18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids de 20% seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Il est à noter que les souris transgéniques n’ont aucun phénotype avant l’addition de doxycycline au régime alimentaire. Les tests invasifs seront réalisés sous anesthésie et seront sans réveil. Des études histologiques et moléculaires seront réalisées à partir d’échantillons de tissus prélevés sur les mêmes animaux après euthanasie de l’animal selon les procédures standard, réalisées dans le respect de l'éthique animal.
Choix des espèces
Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques que nous avons créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie, nous permettent d'étudier les mécanismes moléculaires au niveau ADN, ARN et protéines dans différents tissus, chez l'embryon et la souris adulte. Ce projet vise à comprendre les mécanismes et impacts physiopathologiques des expansions CTG dans le système nerveux d'un modèle murin conditionnel de la forme congénitale de la dystophie myotonique de type 1. La forme congénitale est “reproduite” chez les souriceaux d’ou le choix des analyses à 7 jours de vie.
Evaluation de l’efficacité de traitements anti-curare chez le Primate Non Humain (macaque cynomolgus)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
64 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés après avis vétérinaire plutôt que tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque macaque reçoit trois fois une injection de curare qui paralyse sa respiration, compensée par une ventilation assistée, puis des prélèvements de sang répétés, jusqu'à cinq fois par semaine. Le projet teste des anticorps censés lever le blocage neuromusculaire après curarisation, en vue d'un usage chez l'humain. Le porteur affirme que ces réactions affectent "l'organisme entier" et que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité".
Objectifs
Les curares sont des composés fréquemment utilisés comme anesthésiants dans les services de chirurgie ou de réanimation. Leurs propriétés paralysantes induisent un blocage neuromusculaire, indépendamment de la sédation, qui facilite notamment les procédures d'intubation et évitent les réflexes musculaires lors des interventions chirurgicales. Même si les curares utilisés en anesthésie sont des molécules relativement sûres induisant peu de réactions adverses sévères (1 patient sur 10 000), il est impossible de prédire leur durée d'action. La curarisation résiduelle, qui ne peut être écartée qu'à l'aide d'un monitorage instrumental quantitatif, est une complication majeure (jusqu'à 83% des patients), responsable d'insuffisances respiratoires et de troubles de la déglutition à l'origine d'une inhalation pulmonaire de liquide gastrique, entraînant un allongement de la durée de séjour à l'hôpital, un engorgement inutile des services de réanimation et une hausse de la mortalité. Pour stopper rapidement la curarisation d'un patient, un antidote est administré après l'intervention pour lever le blocage neuromusculaire. Dans la majorité des cas de curarisation, la décurarisation est obtenue par injection d’une molécule synthétique efficace dès les premières minutes qui suivent l'injection du curare. Cependant, des réactions allergiques ayant été rapportées, ce composé est de moins en moins utilisé en routine clinique. Il est donc particulièrement intéressant d'identifier de nouvelles molécules.. Leur efficacité sera évaluée à l’aide de la méthode de « train of four », utilisée quotidiennement dans les services d’anesthésie qui permet le suivi du niveau de curarisation. Ce projet a pour objectif de caractériser la capacité d'anticorps monoclonaux à lever le blocage neuromusculaire induit par une curarisation au rocuronium. Des études chez des souris immunisées contre le rocuronium ont permis d'identifier plusieurs anticorps qui captent le rocuronium avec des affinités très élevées. Dans ce projet, l'efficacité de ces anticorps sera évaluée chez le Primate Non-Humain, pour, à terme envisager une utilisation chez l'humain, soit en urgence (échec d'intubation), soit en routine clinique afin de lever rapidement le blocage neuromusculaire. Des anticorps monoclonaux dirigés contre d’autres curares (vecuronium, atracurium, succinylcholine et cisatracurium) seront évalués selon le même schéma expérimental.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de caractériser la capacité d’anticorps à lever le blocage neuromusculaire induit par des curares utilisés en anesthésie. En effet, pour faciliter l’intubation et la chirurgie, on cherche à relâcher les muscles du patient en particulier les muscles respiratoires. Jusqu’à la fin de l’intervention médicale, l’effet des curares doit être maximal, mais le patient reste sous l’effet des curares pendant des périodes plus ou moins longues (30-90min), ce qui empêche de le réveiller de son anesthésie. Cette persistance de l’action des curare conduit à encombrer les services de réanimation. On cherche à diminuer cette durée par l’administration de composés capables de capturer le curare (« antidote ») et de lever le blocage neuromusculaire. Une conséquence à plus long terme de ce projet permettrait de limiter le temps de passage des patients en salle de réveil dans les services de réanimation. Plusieurs anticorps monoclonaux anti-curareont été identifiés à partir de souris immunisées. Leurs très fortes affinités in vitro suggèrent que des anticorps anti-curare pourraient être utilisés dans le cadre de la décurarisation soit en urgence (échec d’intubation), soit en routine clinique afin de de lever rapidement le blocage neuromusculaire.
Procédures
Ce projet contient 2 procédures pour lesquelles les animaux recevront, sous anesthésie générale, une injection de curare pour provoquer le blocage neuromusculaire. La paralysie de l'activité respiratoire provoquée par une dose proche ou supérieure à la dose nécessaire pour l'obtention d'un bloc neuromusculaire à 90 % sera compensé par la mise en place d’une ventilation assistée. Chaque animal subira une série de 3 anesthésies avec curarisation et respiration sous ventilation assistée. Cette procédure ne dépassera pas une heure. Des prélèvements sanguins seront réalisés durant les 72 heures suivant l’administration, mais des prélèvements a plus long terme sont envisageables pour évaluer la persistance du produit dans les semaines qui suivent. Des prélèvements de sang par ponction veineuse (7.5% de la volémie sanguine totale/semaine maximum), 5 fois/semaine sous anesthésie seront effectués pour le suivi clinique, hématologique et biochimique des PNH.
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu de douleur particulière liée aux interventions. En cas de réaction allergique au produit injecté, un traitement corticoïde et une prise en charge symptomatique sera envisagée. Il pourrait il y avoir un syndrome fébrile d’environ 1 à 2 semaines avec fièvre, diminution de l’activité et perte d’appétit. L’utilisation d’antalgique n’est pas prévue de façon systématique mais elle pourra être mise en œuvre en fonction d’éventuels signes cliniques de douleur - non attendue - (comportement anormal de l’animal : position antalgique, poil hérissé, gémissement).
Devenir
Tous les PNH seront réutilisés après avis vétérinaire
Remplacement
Les thérapies étudiées dans ce projet font intervenir des réactions qui affectent l'organisme entier, et qui se déploient notamment dans la circulation ainsi que plusieurs tissus et organes. Il est donc impossible de les modéliser de façon pertinente ni de les étudier dans des modèles in vitro. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des anticorps testés chez le Primate Non-Humain auront été préalablement sélectionnés in vitro sur des lignées cellulaires de muscles ou de tissus puis dans un modèle rongeur sur des critères de sécurité et d’efficacité.
Réduction
De nombreux tests in vitro ont permis de sélectionner, parmi la trentaine d’anticorps anti-rocuronium candidats, les cinq présentant la meilleure affinité. Ces cinq anticorps ont été testé en prophylaxie chez la souris pour la prévention de curarisation, afin d’en identifier deux avec le potentiel le plus important. De la même façon, les anticorps contre succinylcholine, cisatracurium atracurium et vecuronium les plus prometteurs seront sélectionnés. À partir de plus d’une centaine d’anticorps, nous réduisons ainsi le nombre d'anticorps à tester chez le primate non-humain à seulement 8. De plus, pour réduire encore d’avantage le nombre d'animaux prévu dans ce projet, la méthode choisie nous permettra de réaliser plusieurs injections séquentielles sur un même animal.
Raffinement
La méthode nécessitant une anesthésie générale par définition, les animaux ne sont pas vigiles durant la durée de l’expérience. Les mesures sont non-invasives. L’animal n’est pas euthanasié durant la procédure. Des points limites ont été définis. L’état général des animaux est suivi quotidiennement. En cas de modification du comportement un signalement est fait au vétérinaire. Nous allons observer particulièrement les réactions locales sur la peau (démangeaisons, rougeurs, gonflements). Le poids et la température seront suivi à chaque anesthésie. Les animaux seront hébergés en groupe permettant des interactions sociales pendant l’étude avec un programme d’enrichissement décrit par la structure de bien-être animal de l’établissement : distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles de type peebletoy ou sachet surprise. La structure du Bien Etre Animal pourra être alertée en cas d’évènement anormal.
Choix des espèces
Les Primates Non Humains adultes, grâce à leur proximité phylogénétique avec l'humain, leur système cardiovasculaire et leur réponse immunitaire matures, permettent de reproduire la physiopathologie observée chez l'humain en cas d’administration de curares à des doses similaires à celles administrées chez l'humain. De plus, les outils d’évaluation de l’efficacité de curarisation utilisés chez l'humain sont utilisables chez le primate en parallèle de la mise en place d’un ventilation assistée, reproduisant ainsi le contexte clinique chez l'humain.
Etude d’immunogénicité, protection et suivi en stabilité d’un vaccin universel contre la grippe chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent deux injections dans la patte sans anesthésie, et 30 % d'entre elles sont infectées par la grippe par voie nasale sous anesthésie, l'infection pouvant provoquer une perte de poids, les souris atteignant -20 % de leur poids étant alors mises à mort. Le projet vise à tester un candidat-vaccin ciblant la nucléoprotéine du virus et à contrôler des lots destinés au marché humain. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro ne peut reproduire la réponse immunitaire et que le modèle souris est imposé par les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.
Objectifs
La grippe est une maladie virale aiguëe, fréquente et très contagieuse causée par des virus grippaux qui circulent dans toutes les régions du monde. On estime à un milliard le nombre de cas, à 3-5 millions le nombre de cas graves et entre 290 000-650 000 le nombre de décès liés à la grippe dans le monde. Des pandémies de grippe surviennent occasionnellement en plus de la grippe saisonnière annuelle, avec un impact sanitaire et économique considérable. La vaccination est la stratégie la plus efficace pour protéger les populations. Elle fonctionne en induisant des anticorps spécifiques à la souche de grippe circulante, visant à cibler les protéines de surface du virus. Cependant ces vaccins sont partiellement efficaces : 32% pour les personne âgées et 43% sur les adultes en raison du fait que les souches virales en circulation mutent tous les ans. Pour pallier la mutation des protéines de surface, les vaccins sont reformulés chaque année. Cependant, le virus de la grippe possède également une protéine contenue à l’intérieur de l’enveloppe virale, la nucléoprotéine (NP), qui diffère peu d’une souche à l’autre, ce qui fait d’elle une cible pertinente pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. Ainsi un vaccin qui induit une réponse protectrice contre une protéine peu sujette aux mutations pourrait donc conférer une protection plus durable non seulement contre la grippe saisonnière humaine, mais aussi contre une nouvelle pandémie et pourrait donc avoir améliorer l'efficacité du vaccin. Un candidat-vaccin, contenant la nucléoprotéine de la souche A de la grippe est capable d’induire une réponse immunitaire de type cellulaire permettant une protection contre différentes souches du virus de la grippe chez la souris. Ce projet a donc pour objectif d’améliorer les vaccins actuels contre la grippe, en ouvrant la voie vers le développement clinique d'un candidat-vaccin qui pourra être utilisé seul, avec un adjuvant ou en association avec les vaccins saisonniers actuellement sur le marché. Les lots de vaccins destinés aux études cliniques chez l’homme doivent subir des tests concernant leur efficacité et leur activité biologique chez la souris. Enfin il est nécessaire de procéder à des études de stabilité, afin de vérifier que le médicament expérimental sera stable pendant la période de stockage prévue de sa libération à son administration aux patients
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’améliorer l’efficacité des vaccins antigrippaux saisonniers et pandémiques actuels. Ce candidat-vaccin produira, en plus de la réponse humorale habituellement observée à la suite d’une vaccination contre la grippe saisonnière ordinaire, une forte réponse des cellules T ainsi qu’une protection de longue durée contre l’antigène le plus conservé de la grippe : la nucléoprotéine NP. Afin d’obtenir une autorisation d’essai clinique chez l’homme (Phase IIA, III), il est nécessaire de réunir suffisamment de données concernant l’efficacité et l’innocuité de ce candidat-vaccin in vivo. Une preuve de concept de l’efficacité et de l’innocuité du candidat-vaccin seul ou coadministré avec un vaccin saisonnier ou avec un adjuvant sera effectuée dans un modèle physiopathologique infectieux, c'est-à-dire après inoculation de la grippe. La production et le contrôle qualité des vaccins répondent à des normes très strictes (réglementation européenne et bonnes pratiques de fabrication) qui doivent être respectées pour la libération des lots de vaccin, la surveillance de sa sécurité et son contrôle pour une utilisation chez l’homme. Un test chez la souris, comme contrôle de l’activité biologique est imposé à la libération des lots, et également dans les études de stabilité réalisées suivant les ICH pour contrôler une potentielle évolution des vaccins au cours du temps, et dans les conditions de stockage définies (température, humidité de l'air, lumière). Le suivi en stabilité permet de définir la date limite d’utilisation du vaccin.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne). 30% des animaux seront infectés par voie intra-nasales sous anesthésie profonde (70 mg/kg de Kétamine et 9 mg/kg de Xylazine, par injection intra-péritonéale)
Impact sur les animaux
Pour les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe et le dernier etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Le geste de l'immunisation intramusculaire est très peu invasif pour l'animal. Également, les volumes injectés ne dépassent pas 50μl évitant au maximum tout type de douleur musculaire et aucune souffrance n'est attendue en réponse aux formulations vaccinales injectées. La procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, l'infection virale peut entraîner une perte de poids chez les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.
Remplacement
L'efficacité d'un vaccin dépend de sa capacité à induire une réponse immunitaire, avec un mécanisme d’action spécifique, un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types de cellules immunitaires et une organisation particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. De plus, les tests de protection contre une infection virale ne peuvent être menés que par des études in vivo. Pour la procédure: Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, nous étudions et essayons de mettre en place un test in vitro qui puisse répondre aux exigences de la réglementation pour remplacer les études sur les animaux, mais cette étude est toujours en recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires dans les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe ). Des groupes de 10 souris sont nécessaires dans les procédures ( Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins ou pour l'etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) pour l’utilisation d’un test plus performant et une analyse statistique plus stricte pour la libération de lots vaccins. L’analyse et l’estimation du nombre d'animaux à utiliser se font en amont de l’expérimentation.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant une semaine au PBES. L’immunisation est réalisée par voie intra musculaire. C’est une voie permettant l’obtention d’une bonne réponse immunitaire et qui est peu invasive pour l’animal. Les animaux en expérimentation sont observés au moins une fois tous les 2 jours et ce pendant 7 jours après les immunisations. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local sera appliqué. Pour la procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, les infections virales intra-nasales sont réalisées sous anesthésie profonde. De jour 43 à jour 56 après infection les souris feront l’objet d’une surveillance régulière et seront pesées quotidiennement pendant 2 semaines, un point limite est fixé à une perte de 20% de poids du poids initial.
Choix des espèces
Une partie des réponses immunes médiées par les lymphocytes T sont initiées dans les ganglions lymphatiques, qui drainent le site de l’immunisation, et qui vont pouvoir circuler dans les divers organes lymphoïdes et certains tissus comme le parenchyme pulmonaire. Cependant, aucun modèle in vitro n’est actuellement capable de reproduire une telle dynamique de circulation. Egalement, de nombreuses études déjà réalisées sur le modèle souris avec ce pathogène permettent d'optimiser les essais en limitant au maximum le nombre d'animaux, ainsi que la souffrance de l'animal. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques. Nous allons utiliser des animaux sevrés de 6 semaines à 12 semaines. Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge là et non vieillissant.
Mise au point d’un système de conservation statique actif des greffons pulmonaires : création d’une glacière perfusante connectée
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
12 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal subit un prélèvement du bloc cœur-poumon pour évaluer un nouveau dispositif de conservation des greffons pulmonaires par perfusion à froid. Le porteur présente le porc comme l'animal de référence pour l'étude du poumon isolé, ses organes étant proches de ceux de l'humain. Il justifie la mise à mort par la nécessité d'évaluer la fonction pulmonaire et d'éviter une transplantation tant que le bénéfice du dispositif n'est pas prouvé.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de créer un nouveau dispositif médical de transport d’organe, capable de perfuser du liquide de conservation, avec une température contrôlée, afin de diminuer le risque de défaillance primaire du greffon. Il comprendra un monitorage continu des paramètres de perfusion transmis aux chirurgiens via une application Bluetooth, offrant un outil de première évaluation de la qualité de l’organe. L’application intégrera un GPS permettant aux différents intervenants (chirurgiens du prélèvement et de l’implantation, anesthésistes) de connaitre la position de greffon en temps réel afin de mieux coordonner les équipes et donc de réduire le temps d’ischémie. Avant de chercher un investissement industriel, nous souhaitons faire une étude de faisabilité pour vérifier que la perfusion hypothermique n’est pas nocive pour le poumon.
Bénéfices attendus
Les avantages attendus de la glacière perfusante connectée sont nombreux: monitorage continu des constantes du greffon ce qui permettra de l’évaluer et d'anticiper ses performances chez le receveur; alarmes paramétrables: en cas de détection d’une anomalie, la perfusion s’arrêtera pour éviter toute lésion d’hyperpression mais la température cible restera maintenue afin de protéger le greffon; perfusion par un soluté dédié permettant un lavage des débris intravasculaires pulmonaire, une diminution de la charge immunologique du greffon du donneur vers le receveur et un effet anti-oedémateux et anti-inflammatoire. De plus cette glacière permettra un refroidissement homogène de l’organe à la température optimale de +10°C (la température n’est pas surveillée dans les glacières et une importante hétérogénéité de température des greffons est constatée) et ce pour tous les greffons.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 20 minutes, réalisée sous anesthésie générale, consistant au prélèvement du bloc coeur-poumon à l'issue de laquelle les animaux ne seront pas réveillés. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. S'agissant de procédures expérimentales sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure. En cas d’échec de l’anesthésie/analgésie au cours de l’expérimentation, l’animal sera euthanasié. La mort de l’animal sera confirmée par l’arrêt permanent de la circulation (arrêt d’activité cardiaque suivie par ECG).
Devenir
La finalité de l'étude est d'évaluer la fonction pulmonaire et les lésions du greffon pulmonaire après perfusion hypothermique. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour évaluer la fonction pulmonaire lors de notre protocole (durée 6h). Il n'existe pas d'autre modèle pour étudier ce système de conservation. Le sort prévu à ces animaux permet d'éviter une transplantation des organes prélevés tant qu'il n'existe pas de preuve du bénéfice de ce système de préservation pulmonaire.
Remplacement
Du fait de son anatomie et sa physiologie respiratoire, le porc est l’animal de référence pour l’étude de la perfusion de poumon isolé. Le matériel dont nous nous servons (glacière et machine de perfusion, avec sa connectique) est celui utilisé chez l’homme afin d’assurer une bonne applicabilité future. Ils imposent d’utiliser des poumons similaires anatomiquement et physiologiquement à ceux d’un humain.
Réduction
Nous avons choisi de réaliser une évaluation physiologique, biologique et scannographique des organes isolés seulement pour comparer les deux méthodes de conservation. Nous évitons ainsi le recours à un modèle de transplantation pulmonaire qui aurait nécessité le double du nombre d’animaux (un donneur et un receveur). Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est évalué à 12, soit 6 par groupe, afin de pouvoir réaliser des comparaisons entre les groupes via des tests statistiques.
Raffinement
Période d’acclimatation de 7 jours entre l’arrivée dans le service et l’inclusion dans le protocole. Arrivée et hébergement en groupe pour vivre entre congénères. Environnement enrichi avec : promenade régulière, planche à gratter, distributeur de nourriture. Evaluation quotidienne du bien être animal seon plusieurs grilles d'avaluations. Ce protocole ne comprend aucune expérimentation ou acte invasif sur un animal conscient (anesthésie générale sans réveil).
Choix des espèces
La machine de perfusion que nous utilisons est faite pour des organes humains et impose donc d’utiliser des organes similaires, tant sur le plan des paramètres de perfusion que de la connectique. Le porc charcutier a des poumons proches de ceux d’un humain sur le plan anatomique et physiologique (fréquence cardiaque 100 battement/mn, débit cardiaque 3-5 L/mn, pression artérielle pulmonaire moyenne < 15mmHg). Le porc permet donc de réaliser une modélisation chirurgicale et expérimentale de haute fidélité pour une meilleure applicabilité des résultats à la pratique clinique. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une physiologie cardio-pulmonaire semblable à l’homme et des poumons du même ordre de grandeur.
Rôle d’une protéine de réponse au stress oxydatif de Pseudomonas aeruginosa dans l’infection pulmonaire aiguë chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa par instillation intra-nasale sous anesthésie, puis mises à mort 24 heures après pour analyser leurs poumons, afin d'étudier une protéine bactérienne comme cible thérapeutique. Le porteur indique des signes d'infection respiratoire, dyspnée et poil hérissé, et une surmortalité possible de 20 % lors de l'instillation. Il affirme qu'un modèle in vitro d'épithélium humain reste "très limité" et ne rend pas compte de la réponse immunitaire globale.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie de l’environnement induisant des infections respiratoires chez les sujets fragilisés comme ceux se trouvant en réanimation, ceux atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive ou encore ceux atteints de mucoviscidose. L’émergence de souches de P. aeruginosa de plus en plus résistantes aux antibiotiques est observée partout dans le monde. La resistance aux antibiotiques est un problème car cela risque d’entrainer des impasses thérapeutiques pour les patients. L’objectif est d’étudier si une proteine protégeant P. aeruginosa contre la défense de l’hôte peut servir de cible thérapeutique alternative ou adjuvante aux antibiotiques pour traiter les infections à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques : ce projet scientifique a pour objectif (i) de déterminant les charges bactériennes dans les poumons infectés par les bactéries hyperexprimant ou non la proteine, (ii) d’étudier l’impact de l’infection sur la destruction de l’architecture du poumon et sur la réaction inflammatoire et immunitaire.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra de caractériser plus précisement la virulence accrue au niveau pulmonaire induite par la proteine d’intérêt chez la bactérie P. aeruginosa résistante aux antibiotiques utilisés couramment en médecine humaine. Cette caractérisation histologique et bactérienne est indispensable pour affirmer l’implication de cette protéine dans la différence de survie observée chez les souris dans nos travaux précédents et elle est nécessaire pour expliquer le mécanisme global de la virulence augmentée de ces souches. Cette protéine participe à la virulence à la bactérie. Elle constitue donc une cible potentielle pour le développement à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les infections pulmonaires à P. aeruginosa résistants à de nombreux antibiotiques. Le développement d’inhibiteurs de cette proteine peut être envisagé pour constituer une thérapeutique alternative et adjuvante aux antibiotiques en médecine humaine. Son inhibition pendant l’infection respiratoire permettrait de limiter la prolifération de P. aeruginosa en le rendant sensible à la réponse de l’hôte.
Procédures
Pour chaque animal, il sera réalisé : - Une infection respiratoire par instillation intra-nasale : geste réalisé sous anesthésie générale. - Une administration d’un antalgique de palier III par injection intrapéritonéale à 6h post infection. - L’euthanasie à 24h post infection pour prélévement et analyse des poumons (études bactérienne, histologique et cytologique)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont ceux résultants de l’infection pulmonaire bactérienne. Il pourra être observé des signes d’infections respiratoires : dyspnée, mobilité réduite, dos vouté et poil hirissé. Une sur-mortalité possible de 20% lors de l’instillation intranasale est également attendue.
Devenir
Les animaux de la procédure seront mis à mort 24h après l’infection afin de réaliser le dénombrement de la charge bactérienne pulmonaire, les analyses d’histologie/immunomarquage sur poumons et les analyses cytologiques sur LBA
Remplacement
Ce projet requérant un modèle murin a été considéré après une étude in vitro préalable. En effet, la première partie de notre projet, qui a permis la mise en évidence de la virulence augmentée de la souche résistante aux antibiotique et le rôle d’une protéine d’intérêt, a été réalisée sur un modèle in vitro d’épithélium respiratoire humain. Cependant, malgré son utilité, ce modèle reste très limité car il ne permet pas d’étudier la virulence bactérienne à l’échelle du poumon dans son ensemble et il ne prend pas en compte la réponse immunitaire globale de l’hôte vis-à-vis de P. aeruginosa. Seule une partie de la réponse immunitaire innée est assurée mais la réponse immunitaire innée médiée par les phagocytes (polynucléaires, macrophages, …) ainsi que la réponse immunitaire adaptative (humorale et cellulaire) est absente dans ce modèle. Au contraire, dans le modèle murin de pneumonie aiguë, la réponse globale de l’hôte au niveau pulmonaire est assurée et cette étape in vivo est essentielle à la validation du rôle la protéine d’intérêt dans l’infection à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé pour répondre à l’objectif scientifique selon le nombre d’expériences prévues, les besoins en données selon les analyses statistiques envisagées et les données de la litterature. Pour comparer les résultats de charges bactériennes, des tests non paramétriques de Mann-Whitney seront appliqués, ces tests non paramétriques étant adaptés à notre étude comprenant un faible nombre d’individu. Une réflexion biostastistique (utilisant le logiciel G-Power) a été réalisée afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Nous avons également pris en compte le risque de surmortalités, c’est-à-dire la sortie précoce d’animaux avant la fin de la procédure (mortalité lors de l’instillation nasale, atteinte des points limites avant 24h, …), selon les données de la littérature et notre expérience acquise lors de précédentes manipulations. Les groupes ont donc été réduits à la taille minimum nécessaire à l’interprétation des résultats. Pour essayer de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous allons exploiter le plus possible les organes prélèvés, en essayant par exemple de mettre au point l’immunomarquage de P. aeruginosa sur les coupes en paraffine utilisées pour l’étude histologique classique. Si le marquage fonctionne, l’expérimentation (infection 4) prévue pour la cryoconservation/immunomarquage ne sera finalement pas utilisée, permettant de diminuer le nombre d’animaux (16 animaux en moins).
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être de l’animal, plusieurs mesures seront réalisées : - l’anesthésie par injection intrapéritonéale de Kétamine (50 mg/Kg) / Xylazine (5 mg/Kg) lors de l’instillation intra-nasale de l’inoculum bacterien, avec l’utilisation d’un dispositif chauffant lors de l’anesthésie des souris pour éviter l’hypothermie. - une surveillance rapprochée pendant la procédure (toutes les 2 à 4 heures en journée (8h à 18h) et une visite nocturne). Cette surveillance permet le suivi des animaux et la vérification des points limites, requérant l’euthanasie. - l’administration d’un antalgique de palier III (Buprénorphine, 50µg/kg) en intra péritonéal à 6h post-infection pour limiter la douleur et la dyspnée chez l’animal. - un enrichissement des cages et le regroupement des souris dans les cages pour préserver les interactions sociales
Choix des espèces
La souris est une espèce pour laquelle de nombreux protocoles de pneumonie aiguë d’étiologie bactérienne ont été optimisés et validés. Le modèle murin utilise des souris âgées de 6 à 8 semaines et permet d’étudier la pathogénicité bactérienne lors de l’infection pulmonaire aiguë (i) en établissant les courbes de survie (se basant sur l’atteinte des points limites), (ii) en réalisant des coupes histologiques pulmonaires et (iii) en déterminant la charge bactérienne infectante dans les poumons.
Évaluation de la biodistribution de bactéries thérapeutiques (LBP : Live Biotherapeutic Products) après leur administration dans les voies respiratoires du macaques cynomolgus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
150 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque macaque, maintenu vigile sur une chaise à contention, reçoit une administration de bactéries dans les voies respiratoires, puis subit jusqu'à cinq lavages bronchiques et dix prises de sang sous anesthésie, avant d'être tué pour prélever ses organes. Le porteur reconnaît que la contention représente la principale contrainte pour l'animal. Il justifie le recours au macaque par la proximité de son système respiratoire avec celui de l'humain, un passage préalable par des rongeurs étant prévu.
Objectifs
Les maladies inflammatoires respiratoires représentent un ensemble de syndrome dont le développement est croissant avec l'augmentation de la pollution athosméphique et d'autres facteurs d'environnement. Ces maladies invalidantes sont souvent bien contrôles chez les malades, mais les traitements peuvent être lourds ou présentent des effets indésirables. Actuellement, les traitements des maladies inflammatoires du système respiratoire font appel à des thérapeutiques anti-inflammatoires chimiothérapeutiques ou à des immunothérapies classiquees administrées par voie générale. Ce projet a pour but d'étudier l'innocuité, la biodistribution et la biodisponibilité de produits de type Live Biotherapeutics Product administré par voie pulmonaire. Ces produits sont en cours de développement, leur effet aura été prouvé au préalable in vitro et doit être testé in vivo chez le singe macaque cynomolgus.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de mieux caractériser produits immunostimulants innovants, et de mieux les connaître avant de les utiliser pour le traitement des maladies inflammatoires pulmonaires. Les informations obtenues chez les singes, dont la physiologie et l'immunologie des voies respiratoires sont très proches de l'homme.
Procédures
L'administration des produits se fait avec un animal vigile, maintenu sur une chaise à contention. Les prélèvements prévus sont des lavages broncho-alvéolaires, et des prélèvements de sang, d'urine ou de fécès. La fréquence et le durée des prélèvements sont fonction des caractéristiques estimées du produit, avec un maximum de 4 semaines. Au total, on peut envisager 5 lavages bronchiques et 10 prises de sang au maximum.
Impact sur les animaux
L'adminstration du produit représentante un stress pour les animaux, mais elle n'est pas douloureuse. La principale contrainte est que l'animal est immobilisé dans une chaise à contention. Les prélèvements réprésentante une contrainte, mais ils sont réalisés sous anesthésie générale. Il est prévu de pouvoir réaliser dees prélèvements sanguins ou des lavages bronchiques principalement.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés sous anesthésie à la fin des protocoles pour pouvoir prélever les organes.
Remplacement
L'administration de LBP dans les voies pulmonaires pour lutter contre des maladies inflammatoires chroniques nécessite des développements précliniques spécifiques, permettant de mesurer la quantité de bactéries nébulisées dans les voies respiratoires, il est nécessaire de disposer d’un modèle animal pertinent. En effet, la nécessite de pouvoir observer des interactions complexes et fines entre organes n’est aujourd’hui possible que sur modèle animal, dans ce cadre d’étude. Même si des modèles in vitro de poumons existent, ils ne permettent pas de prédire la distribution et la viabilité d'un produit biologique aussi spécifique qu'un LBP, ni la réponse de l'organisme a l'influx soudain d'une large quantité de bactéries, même non pathogènes. Une approche sur des modèles de rongeurs est préalable aux essais sur Singes.
Réduction
Le nombre d'animaux est limité au minimum nécessaire. Pour tester un LBP, un groupe de 3 à 5 animaux au maximum est suffisant. Nos études sont exploratoires, très en amont dans le développement des produits. L'évaluation de l'effet se fait sur la base de l'analyse hostologique microscopique et de l'évaluation des populations cellulaires détectées après administration du produit. Avec un groupe de 3 à 5 animaux, seules des statistiques descriptives sont possibles, sachant que nous n'utilisons pas d'animaux témoins non traités. Nous comparons les résultats obtenus avec nos données de base, en comparant les données et parfois les moyennes pour évaluer une tendance. Le nombre d'animaux présenté dans ce projet est une estimation qui tient compte du nombre de produits qui pourraient être confiés à notre société pour en évaluer la biodistribution et l'innocuité. Si la demande est faible, il est évident que seuls les animaux nécessaires (3 à 5 par produit) seront utilisés.
Raffinement
Chacun des actes techniques mis en oeuvre pour ce projet ont été mis au point, étudiés et raffinés pour limiter le stress ou la douleur des animaux. La plupart des prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale. L'administration se fait avec un système de contention auquel les animaux sont habitués au préalable pendant plusieurs jours, sans administration. Les techniques analytiques auxquelles nous faisont appel sont suffisamment sensibles pour réduire la quantité de prélèvement nécessaire. Ainsi, les volumes des prises de sang ou des lavages alvéolaires sont très faibles.
Choix des espèces
La macaque cynomolgus possède une proximité physiologique et immunitaire avec l’homme ainsi qu’une anatomie des grandes fonctions extrêmement proche de l’homme. En effet, l’anatomie de son système respiratoire (en partie liée à sa posture verticale (semi-bipède- par opposition aux modèles rongeurs ou porcins) est très proche de celle de l’homme, ou encore un système digestif ou urinaire sensiblement similaire également. Ces similitudes permettent de tester la distribution et la viabilité d’un produit biologiques pour une transposition future chez l’Homme (thérapie par nébulisation, administration par voie orale). Selon le type de LBP choisi et sa cible thérapeutique, des animaux jeunes (2 ans) ou plus âgés (à partir de 3 ans) pourront être utilisés pour des raisons de maturité du système immunitaire et de poids. Cependant, le stade de développement pourra être affiné avec le donneur d’ordre selon le type d’individus visé par la thérapie.
Étude de l’activité anti-Pseudomonas aeruginosa d’une souche clinique de Porphyromonas instillée en prophylaxie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit deux instillations nasales de suspensions bactériennes à dix-huit heures d'intervalle, puis est tuée vingt-quatre heures plus tard pour récupérer ses poumons ou réaliser des lavages, les groupes recevant Pseudomonas aeruginosa pouvant perdre du poids et devenir inactifs. Le porteur affirme ne pas pouvoir répondre à sa question avec des outils de culture cellulaire et choisit donc de conserver le modèle animal. Il retient la souris pour sa sensibilité permettant de provoquer une pneumonie sans mortalité trop importante.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer le mécanisme d’action de cette souche potentiellement bénéfique avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart. 24h plus tard, les animaux sont mis à mort avant récupération des poumons ou réalisation de lavages broncho alvéolaires.
Impact sur les animaux
Ce projet a été conçu pour minimiser les effets indésirables. Ce projet peut induire un stress chez les animaux. Un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec une table de suivi de soins permettent également une diminution de ses effets. Les groupes recevant seulement Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 ou Pseudomonas aeruginosa résitant à plusieurs antibiotiques (PA MDR) peuvent être sujets à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec la table de soins. Pour les groupes recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.
Devenir
Les 90 souris C57BL/6 mâles survivantes sont mis à mort à l’issu du protocole
Remplacement
Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer son effet sur le système immunitaire. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
Approche statistique : Le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P. aeruginosa entre le groupe recevant uniquement du P. aeruginosa et celui recevant du Porphyromonas préalablement à l’instillation de P. aeruginosa. Nous avons choisi de suivre nos souris uniquement jusqu’à 24 h post-infection et non 7 jours pour limiter le nombre d’individus en nous basant sur l’expérience apportée par notre équipe lors de DAP précédentes. Nous nous limitons à une seule espèce de Porphyromonas (P. catoniae) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon et une seule souche clinique parmi les 7 isolées par notre équipe.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table de suivi de soins. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Respir’Ante: Etude de l’alvéolisation chez la souris en cas de retard de croissance intra-utérin induit par un régime hypoprotidique per gestationnel.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au modéré. Les mères gestantes reçoivent un régime appauvri en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance, et une partie des souriceaux subit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant dix jours avant d'être tués pour prélever leurs poumons entiers, d'autres étant anesthésiés puis curarisés pour explorer leur fonction respiratoire. Le porteur affirme que ce régime est le modèle le moins invasif et que l'étude d'un organe aussi complexe que le poumon ne permet pas pour le moment de méthode de remplacement. Les retombées annoncées, un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains, sont renvoyées au moyen terme.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une adaptation à un environnement intra-utérin défavorable et a comme conséquence des altérations permanentes du métabolisme, de la croissance et du développement notamment pulmonaire et cérébral. Les conséquences du RCIU sont nombreuses et durables dans le temps. Le RCIU chez l'Homme multiplie par 6 la probabilité d'avoir une alvéolisation pulmonaire anormale chez le nouveau-né prématuré. L'alvéole pulmonaire forme une niche de cellules en interaction et en communication. Les principales cellules participant à la croissance alvéolaire sont les pneumocytes de type 2 et les lipofibroblastes. Ces cellules sont régulées par des gènes jouant un rôle sur le métabolisme lipidique notamment le gène du Peroxisome Proliferative Activated Receptor (PPAR). Cette voie est modifiée en cas de RCIU. Le seul modèle chez l'animal reproduisant un RCIU et des troubles de l'alvéolisation est le régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant la gestation. Ce projet a pour but i) d'étudier les conséquences du régime LPD sur le développement pulmonaire de souris en étudiant la morphométrie et la fonction respiratoire ii) de mieux caractériser les différents types cellulaires dans le poumon et leur répartition grâce à la technique du Single Cell RNA seq et iii) de proposer des traitements innovants pour favoriser la croissance et la régénération alvéolaire grâce à des analogues de la voie PPAR ou SREBP (Sterol Response Element Binding Protein) en se basant sur une culture cellulaire en 3D créant in vitro un poumon aussi appelé organoïde alvéolaire.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera la compréhension des anomalies de l'alvéolisation liées au retard de croissance intra-utérin et permettra d'aboutir à moyen terme à un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains.
Procédures
Les souris femelles adultes gestantes seront soumises à un régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant toute la durée de la gestation (21jours) Une partie des souriceaux (n=32 sera anesthésiée puis curarisée pour explorer leur fonction respiratoire (âge aux eplorations fonctionnelles: 21 à 60 jours, durée des explorations: 1 jour). Une partie des souriceaux (n=288) recevra du premier jour de vie au 10ème, une injection intrapéritonéale médicamenteuse de 100µL maximum (injections une fois par jour pendant 10 jours) . Les animaux seront mis à mort ensuite pour analyser leurs poumons entiers en utilisant des organoïdes alvéolaires. Le reste des animaux (n= 200) sera anesthésiée avant mise à mort pour analyse de poumons selon les différentes techniques proposées (ScRNAseq, morphométrie ou organoïdes alvéolaires) (Mise à mort au 120ème jour de vie maximum sans procédure durant leur vivant).
Impact sur les animaux
Le régime Low Protein Diet a déjà été administré chez les rates gestantes sans complication observée pour elles-mêmes ou leurs petits. Le nombre de ratons par portée était identique à celui obtenu en cas d'utilisation d'un régime contrôle. Les animaux naissent avec un retard de croissance. Ils ne présentent pas de malformation associée. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul in utero ou après la naissance. Les injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale sont couramment utilisées et n'induisent pas d'effet indésirable particulier pour les molécules étudiées en dehors de la douleur induite par l'injection elle-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 10%), les souriceaux seront mis à mort.
Devenir
Les souris gestantes seront gardées en vie à la fin de la procédure 1 (régime) pendant au moins 3 semaines. Les souriceaux recevant les injections (procédure 3) seront gardés en vie au maximum jusqu'à J120. Les souriceaux de la procédure 2 (EFR) seront mis à mort à la fin de celle -ci. Les animaux seront mis mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement de l'ensemble des poumons.
Remplacement
La principale cause de RCIU chez l’Homme est la prééclampsie. Il s’agit d’une pathologie exclusivement humaine. Plusieurs modèles de RCIU ont donc été mis au point chez l’animal. Le modèle de RCIU reproduisant au mieux les lésions observées chez l’Homme et le moins invasif pour l’animal est le régime Low Protein Diet (LPD). Notre première étude l'a démontré chez le rat où nous avons montré la ressemblance entre les lésions pulmonaires et cérébrales observées chez le rat et les RCIU humains. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation à un modèle de restriction protidique LPD ou à un régime contrôle. Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J4, J7, J10, J21, J60 ou J120 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour chacune de nos analyses statistiques lors de nos études morphométriques, immunohistochimiques et moléculaires précédentes (qPCR, Western blot etc...). Une fois les données relevées, les tests statistiques prévus sont le Mann - Whitney test pour la comparaison des 2 groupes entre eux : comparaison de la masse des souriceaux (en g), etc... Le test utilisé pour la comparaison de 4 groupes après tests ex vivo sera un Two-way ANOVA (pour tester l'effet du régime et l'effet du traitement, ainsi que la combinaison des deux).
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect, la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne. Aucune sur-mortalité n’avait été enregistrée précédemment et aucune malformation n’a été détectée. En cas de mal être : blessure, poids trop faible (si le poids est de 20% en dessous de la moyenne de la portée), déshydratation, les souriceaux seront euthanasiés. Pour les mères adultes une attention particulière sera portée sur la quantité de nourriture mangée et sur le suivi de leur poids. En cas de perte de plus de 20 % de poids, la souris gestante sera sortie de l'expérimentation et euthanasiée (CO2).
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Notre première étude a montré de résultats reproductibles chez le rat et nous souhaitons le confirmer chez la souris et aller plus loin dans les analyses moléculaires. En effet, les possibilités d’analyse avec des anticorps sont plus importantes chez la souris et la mise au point de KO est plus développée chez la souris que chez le rat.
Etude de la transmission de Bordetella pertussis et de l’efficacité de protection de la souche vaccinale BPZE1P contre les Bordetellae chez le hamster.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 386 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale par la bactérie de la coqueluche, hébergés avec des animaux sains pour étudier la transmission, puis tués pour prélever nez et poumons. Le porteur indique une surveillance quotidienne du poids et du comportement, une perte de plus de 20 % du poids pouvant déclencher la mise à mort. Il présente le hamster comme un modèle permettant, contrairement à la souris, d'étudier la transmission par aérosol, et revendique le recours à l'animal pour valider son vaccin vivant.
Objectifs
Ce projet a pour but d'étudier une phase critique de la coqueluche qui est la phase de transmission et la potentialité de notre vaccin vivant à protéger contre l’infection bactérienne par aérosolisation naturelle.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’étudier et comprendre la phase de transmission de Bordetella pertussis dans un modele Hamster et de potentialiser notre vaccin vivant pour définir la protection médiée contre une infection par transmission naturelle par infection nasale.
Procédures
1) administration intranasal de Bordetella chez le hamster (5 min par animaux). Les animaux seront euthanasiés 0, 3, 7, 14,21, 28 et 56 jours post administration pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 2)exposition des animaux sains à l'infection par co-hebergement avec les animaux infectés. Le temps de co-hebergements est de 0, 7, 14, 28 et 56 jours, ensuite les animaux sains et infectés initialement seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 3) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3h et 7j après ce challenge, les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons. 4) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront mis en contact avec des hamsters préaleblement infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3 heures, 14 jours, 28 jours et 56 jours après la mise en contact les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons.
Impact sur les animaux
Nous avons déjà démontré que l’infection nasale par BPZE1 dans un modèle hamster ne provoque aucun symptôme bien que les bactéries puissent coloniser le nez pendant 56 jours. En revanche bien que la littérature montre une résistance naturelle des hamsters à Bordetella bronchiseptica, nous ne connaissons pas la virulence des souches cliniques de Bordetella pertussis ni des souches de Bordetella parapertussis dans le modèle hamster.
Devenir
Les hamsters seront mis à mort à la fin de chaque expérience pour la récupération des nez et poumons ou à l'atteinte des points limites
Remplacement
Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. Les modèles in vitro ou in silico ne suffisent pas pour comprendre les phénomènes de colonisation et d’induction de l’immunité induits par l’infection. En outre, dans l’optique de positionner le vaccin BPZE1P comme protecteur contre une infection naturelle, son efficacité doit être validée par une expérimentation animale in vivo. D'autre part l'etude de la phase de transmission necessite de mettre en contact (cocconing) les animaux infectés avec des animaux sains pour tenter de mimer une infection naturelle, cette etape ne peut etre reproduite in vitro.
Réduction
Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse.
Raffinement
Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. nous serons extrêmement vigilants sur le respect de la notion de points limites. Chaque jour, les critères de souffrance seront évalués (changement comportemental, prostration, etc.) à l’aide d’une grille de cotation. Dans le cas où le score atteint le seuil limite fixé, l'animal sera mis à mort. Les résultats de la procedure 2 nous permettra d'affiner les points de prelevement d'organe pour la procedure 5 ce qui limitera le nombre d'animaux utilisés. Le bien-être animal sera vérifié quotidiennement au travers de : - Contrôle du poids de l’animal (si une perte de poids de plus de 20% était observée, nous procéderions à l’euthanasie des animaux concernés) - Comportement général de l'animal (prostration, isolement dans la cage ou au contraire hyperactivité) - Aspect physique, en particulier si le poil est hérissé ou si la respiration est rapide ou saccadée (puisque Bordetella pertussis responsable de la coqueluche est une maladie respiratoire).
Choix des espèces
Le modele animal utilisé pour étudier Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche chez l'humain, est depuis plus de 30 ans le modèle murin. En effet cette bactérie colonise transitoirement le nez et le poumon de la souris. Cependant, la pathologie humaine de la coqueluche met en évidence une infection des voies aériennes supérieures (nez, trachée, bronche) mais très rarement l’entièreté du poumon. Le mode d’infection utilisé pour le modèle murin semble être trop intrusif pour mimer complètement l’infection naturelle humaine. D’autre part, malgré de nombreux essais, le modèle murin ne permet pas d’étudier la phase de transmission car les souris ne toussent pas et n’aérosolisent pas la bactérie. En revanche, le modèle hamster a été mis en évidence comme permettant l’aérosolisation de particule virale du SARS-COV2 et permet l’infection d’animaux naïfs présents dans la même cage avec une séparation physique. l'age de 3 semaines et le sexe sont liés au fait que des hamsters males de 3 semaines ont deja ete utilisés dans un autre protocol APAFIS#27475-2020100514546435 v3 et nous voulons puvoir comparer les resultats experimentaux avec ces deux projets l'age de 3 semaines est aussi liée au fait que les animaux qui seront vaccinés a deux reprises par le vaccin acellulaire auront alors 11 semaines lors du challenge avec les souches de Bordetella