Troubles respiratoires

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris est anesthésiée et intubée pour recevoir dans les poumons une injection unique d'un composé induisant une inflammation de type BPCO. Le porteur indique une possible blessure de la trachée et des difficultés respiratoires liées au développement de l'emphysème. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne reproduit la complexité de la maladie et de la circulation des cellules immunitaires, les applications thérapeutiques étant renvoyées au long terme.

Objectifs

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une maladie chronique respiratoire. Chez les personnes atteintes, une inflammation des voies aériennes entraîne des perturbations dans le fonctionnement normal des poumons. Les alvéoles pulmonaires qui permettent les échanges gazeux lors de la respiration sont progressivement détruites, conduisant à un emphysème. On estime que la BPCO atteint 3,5 millions de personnes en France, soit 7,5% de la population. La maladie est plus fréquente chez les fumeurs, le tabac étant le principal facteur de risque. Les cellules du système immunitaire participent à la maladie et pourraient constituter une cible thérapeutiques intéressante. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la BPCO.

Bénéfices attendus

A court terme sur un plan fondamental, ce projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques concernant la circulation et la prolifération des cellules immunitaires. Sur un plan pathologique, ce projet pourra déterminer la contribution des cellules immunitaires dans la BPCO. A plus long terme, cela permettra de proposer des applications thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires dans cette pathologie.

Procédures

La BPCO est induite chez les souris par une injection unique, directement dans les poumons, d'un composé provoquant une inflammation. Pour cela les souris sont anesthésiés (environ 20 minutes) et intubées le temps de l'injection (environ 5 minutes).

Impact sur les animaux

En de rares occasions, une blessure de la trachée pourra être observée . Le développement de l’emphysème pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Une évaluation exhaustive de la bibliographie nous a confirmé qu'il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre au cours de la BPCO et de la circulation des cellules immunitaires entre les organes. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons utilisé une analyse statistique a priori afin de limiter le nombre d’animaux au strict minimum.

Raffinement

La méthodologie utilisée a été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. Avant la procédure expérimentale, les souris seront anesthésiées afin d’éliminer la souffrance potentielle due à la procédure. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme le modèle le plus proche de l'Homme pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes est indispensable puisque l’altération des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait impacter sur les résultats.

288 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la trachée de la bléomycine puis des cellules bronchiques issues de patients, suivies de quatre à cinq injections et, pour certaines, de deux gavages par jour pendant treize à dix-sept jours. Le porteur indique que les instillations provoquent une gêne respiratoire, que la maladie induite peut aggraver la difficulté respiratoire en fin de protocole et que le gavage peut entraîner une inflammation de l'œsophage voire des saignements. Il conclut que l'étude ne peut se faire qu'in vivo car les réactions dépendent de l'"organisme entier" intact, l'usage clinique de l'anticorps étant renvoyé à un horizon de trois à cinq ans.

Objectifs

Ce projet est une étude pharmacologique visant à tester un anticorps thérapeutique dirigé contre une protéine humaine exprimée dans les poumons et pour le traitement de la fibrose pulmonaire dans un modèle de souris humanisées. La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) chez l'homme est caractérisée par une perte irréversible et progressive de la capacité pulmonaire due à un remodelage de l'arbre pulmonaire avec développement de tissus cicatriciels. Le pronostic de cette maladie est extrêmement limité avec une survie médiane de 2-3 ans. En dehors de la transplantation pulmonaire, aucune option thérapeutique convaincante n'est actuellement disponible. Seules certaines molécules permettent de ralentir la progression de la maladie. Le développement de médicaments pour cette maladie mortelle est donc essentiel. Dans cette maladie, la prolifération aberrante des certaines cellules appelées cellules basales bronchiques contribue au mécanisme pathologique central de la FPI. Ces cellules basales bronchiques humaines (cellules basales des voies aériennes ou cellules ABC) sont des cellules de l'arbre bronchique qui peuvent proliférer in vitro après avoir été prélevées par frottis. Des travaux préliminaires ont démontré qu’un modèle de souris humanisées de FPI peut être établi par administration de ces cellules ABC issues de patients atteints de FPI dans les poumons des souris. En revanche, l'administration de cellules ABC provenant de volontaires sains n'entraîne pas de maladie. À l'aide de ce modèle de souris humanisées de FPI, nous souhaitons tester l’efficacité d’un anticorps thérapeutique qui s’est déjà montré efficace pour le traitement d’autres pathologie du foie et des reins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait développer une stratégie thérapeutique pour les patients qui souffrent de fibrose pulmonaire idiopathique. Cet anticorps est déjà en développement clinique pour le traitement de maladies du foie et des reins. Les résultats positifs de ce projet permettraient utilisation de cet anticorps chez les patients atteints de FPI à moyen terme (3 à 5 ans).

Procédures

Les animaux subiront le premier jour une instillation dans la trachée de bléomycine pour induire la maladie pulmonaire, et le 4ème jour de cellules bronchiques issus de patients. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale gazeuse et dure environ 1 minute. Les animaux recevront ensuite 4 ou 5 injections sur une période de 13 à 17 jours. Ces injections sont faites sur animaux vigiles et prennent moins d’une minute à être réalisées. Certains animaux recevront un gavage oral 2 fois par jour pendant 13 à 17 jours. Le gavage oral est également réalisé en moins d’une minute et est réalisé sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les instillations dans la trachée vont engendrer une gêne respiratoire qui peut perdurer quelques heures (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder au prélèvement des poumons.

Remplacement

Les processus réactionnels étudiés dans ce projet dépendent de l'organisme entier intact. Il s'agit d'une analyse structurelle et fonctionnelle de l'architecture pulmonaire, qui ne peut être étudiée dans son intégralité dans des cultures cellulaires. Il n’est donc pas possible de remplacer l’étude sur les animaux pour ce projet.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’efficacité de notre approche. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire. La taille des effectifs a été déterminée à priori en se basant sur les résultats d’une expérience menée par des collaborateurs et en utilisant une approche statistique préalable. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques paramétriques et/ou non paramétriques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre de manière précoce les procédures permettant de soustraire les animaux à la souffrance si besoin. Une méthode anesthésique (isoflurane) est appliquée lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation scorée est réalisée 2 fois par semaine.

Choix des espèces

Le modèle de fibrose pulmonaire induite chez la souris est un des modèles les plus utilisé pour étudier cette maladie. Les souris utilisées sont immunodéficientes et ne rejettent pas les cellules humaines greffées. Ce modèle nous permet ainsi d’étudier le comportement de cellules pulmonaires (cellules basales des bronches ou cellules ABC) issues de patients atteints de maladie pulmonaire et de tester des approches thérapeutiques dans un contexte humain. Les animaux d’un âge adulte de 10-15 semaines seront utilisé, cette pathologie étant une maladie apparaissant à l’âge adulte, surtout chez les personnes de + de 50 ans.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Elles sont sensibilisées puis exposées à un allergène d'acarien par voie intranasale, ce qui peut provoquer inflammation pulmonaire et difficultés respiratoires, avant une ponction cardiaque terminale sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine PCSK9 dans l'asthme allergique. Le porteur décrit une grille de points limites déclenchant l'injection de buprénorphine ou la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'évaluer ce traitement et que seul un modèle murin asthmatique le rend possible.

Objectifs

Ayant déjà débuté un projet sur l’étude de PCSK9 dans l’allergie alimentaire, nous souhaitons continuer cette approche et vérifier l’impact de celle-ci dans un contexte d’asthme allergique. De plus, il n'existe pas de méthodes alternatives d'étude des mécanismes appondis de PCSK9 et de l'allergie respiratoire. Le modèle PCSK9 KO associé à l’allergie respiratoire n'est que peu ou pas décrit dans la littérature. C'est pourquoi un modèle d’allergie respiratoire à l’acarien permettra de se rapprocher de la physiopathologie présente chez l'homme tout en évaluant les effets de l'absence ou non de PCSK9 sur l'inflammation.

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement ne permet soigner la cause de l’asthme allergique, de plus, les effets secondaires liés aux corticoïdes sont notables et la désensibilisation n’est pas efficace chez tous les patients. PCSK9 devient une cible de plus en plus privilégiée dans le cadre de maladies inflammatoires, de plus, notre première étude sur le traitement anti-PCSK9 soigne les symptômes de l’allergie alimentaire chez la souris. Étant donné les fortes similitudes entre l’asthme allergique et l’allergie alimentaire, nous pensons que le traitement anti-PCSK9 chez des souris asthmatiques sera bénéfique.

Procédures

Les souris sont soumises à des sensibilisations par voie percutanée ( 4 sensibilisations de 45 minutes), et à des déclenchements par voie intranasale (2 déclanchements de 45 minutes). A la fin du protocole, un prélèvement du sang terminal sera effectué par ponction intracardiaque après anesthésie sous isoflurane.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une perte de poids, une inflammation pulmonaire ou difficultés respiratoires au moment des challenges intranasaux.

Devenir

A la fin du protocole d'allergie au jour 35 post sensibilisation, toutes le souris seront mises à mort pour analyses. Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane et un maximum de sang sera prélevé.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant d’évaluer le bénéfice du traitement anti-PCSK9 dans le cadre de l’asthme allergique. Seul un modèle murin asthmatique nous permettra de mesurer l’amélioration des symptômes via ce traitement et comprendre les effets de PCSK9 dans la physiopathologie de l’asthme. Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le projet étudiera l’allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire.

Réduction

Le modèle animal utilise a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera realisé. Une p-value inferieur a 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Au cours de la procédure d’induction de l’asthme allergique, les souris sont anesthésiées sous isoflurane. Elles sont surveillées jusqu’à leur réveil. Durant la phase de réveil les souris elles sont placées sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et sont hébergées en groupe dans des cages enrichies par des frisottis ou une petite maison en carton. Une observation quotidienne des souris sera effectuée, et les souris seront pesées 3 fois par semaine ce qui permettra de détecter tout changement de comportement. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délai. Les signes spécifiques et notables sont les suivants : - Notables : Aspects extérieur : Pelage sale, Position recroquevillée à la manipulation Réticent à se déplacer, Zone urogénitale souillée, respiration difficile Évolution pondérale : Perte de poids10% En présence d'un signe notable: administration de buprénorphine à 0,1 mg/kg en sous-cutanée 2 fois/jour.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche C57/Bl6 et Balb/c. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire et du métabolisme lipidique du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires et métaboliques seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages ainsi qu'à de nombreux outils de biochimie (ELISA, dosage colorimétrique...). Souris C57/B6 et Balb/c femelles âgées de 5 semaines au début du protocole ce qui correspond à des souris sevrées donc adultes ayant un système immunitaire mature ou quasi-mature.

2444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux et des adultes reçoivent des vaccins, des injections d’anticorps et une infection nasale par un grand nombre de bactéries de la coqueluche, avant le prélèvement de leur nez, de leurs poumons et de leurs organes lymphoïdes, pour identifier des anticorps maternels protecteurs. Le porteur indique que l’infection peut tuer l’animal, souiller son pelage et gêner sa respiration, la perte de poids survenant juste avant la mort. Il précise que les mères sont tuées au sevrage et affirme qu’aucun modèle in vitro ne peut remplacer cette étude.

Objectifs

Prévenir les maladies infectieuses chez l’enfant par l’immunisation maternelle et l’immunisation de l’enfant s’avère être une nécessité pour les maladies à taux infectieux (R0) élevé. Le nombre de maladies que l’on peut prévenir par la vaccination a considérablement chuté ces dix dernières années. Néanmoins, les maladies infectieuses constituent la première cause de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans, en particulier dans les pays en voie de développement. Le développement de nouveaux vaccins fondés sur l’identification d’anticorps protecteurs est nécessaire pour parvenir à réduire la mortalité infantile. La coqueluche figure parmi les maladies avec un R0 très élevé et pour lesquelles le taux de mortalité infantile est élevé. Les formes graves de la coqueluche touchant les nouveau-nés sont associées à une augmentation du nombre de globules blancs dans le sang (hyperleucocytose) entraînant une hypertension artérielle pulmonaire, conditionnant le pronostic vital notamment lorsqu’une défaillance cardiovasculaire apparaît. Par le passé la mise en place d’un modèle d’hyperleucocytose chez le souriceau a permis de montrer le rôle de la toxine pertussique (PT) dans ce phénomène. Les objectifs de ce projet sont les suivant : - Objectif 1 : Identification d’anticorps anti-PT conférant une immunité contre la coqueluche. - Objectif 2 : Etude du passage sélectif des anticorps de la mère à la progéniture et de la contribution des anticorps à la clairance du pathogène chez la progéniture infectée. - Objectif 3 : Immuno-modulation de la réponse immune de la progéniture par les anticorps maternels.

Bénéfices attendus

Les bénéfices apportés par ce projet seront multiples. Nous caractériseront les anticorps anti-PT protecteurs contre la coqueluche et contribuant à la clairance du pathogène. Nous déterminerons l’impact du transfert d’anticorps anti-PT sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination contre la coqueluche ou à un challenge infectieux. Dans cette optique, nous étudierons l’effet de différents vaccins anticoquelucheux dans le but d’identifier la meilleure stratégie vaccinale et de concevoir des vaccins plus performants.

Procédures

Les vaccinations seront réalisées sur animaux vigiles, par injection sous-cutanée, qui est l'injection la plus indolore ayant prouvée son efficacité. L'injection en sous-cutané dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection). Deux séries de vaccinations à 4 semaines d'interval sont réalisées. Cela concerne 174 animaux. Les injections d'anticorps sont réalisées sur des souriceaux vigiles, en intrapéritonéal et dans un volume minimal de 50 uL ou bien à des souris adultes endormies, en retroorbital, dans un volume minimal de 100 uL de façon à limiter la douleur de l'animal. L'injection dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection) Une seule injection par animal est réalisée. Cela concerne 1860 animaux. Les infections en intranasal sont réalisées sur des souris endormies et dans des volumes minimaux pour éviter que l'animal se noie. L'injection en intranasal des bactéries prend 2 minutes/animal (temps de la contension et du maintien de l'animal après inoculation pour éviter qu'il se noie et vérifier son rythme cardiaque). Un animal est infecté une seule fois au cours des expériences. Cela concerne 2444 animaux. Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sur des animaux euthanasiés à l'issu des expériences. L'euthanasie dure 1 à 2 min/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection et le temps que le produit fasse effet). Cela engage la totalité des animaux inclus dans les expériences (2444).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, seule l'infection est susceptible d'induire de fortes nuisssances aux animaux. En effet, pour induire une hyperleucocytose chez les souris nous devrons inoculer un nombre élevé de bactéries virulentes ce qui peut causer la mort de l’animal. Les souris malades ont le pelage souillé et des difficultés à respirer et elles perdent du poids.

Devenir

Pour évaluer la protection des anticorps glycosylés anti-PT contre la coqueluche dans le modèle murin nous devons euthanasier l'animal et prélever son sang afin de mesurer l'augmentation du nombre de leucocytes circulants, symptôme le plus précoce associé à la maladie dans le modèle murin. La perte de poids apparaît tardivement et quasi de façon concommitente avec la mort de l'animal. De plus, nous récolterons le nez et les poumons des animaux euthanasiés pour mesurer la charge bactérienne ou la réponse immune locale. Des organes lymphoides primaires ou secondaires tels que la rate et le thymus seront également prélevés pour étudier la réponse immune en périphérie. Les mères sont euthanasiées au moment du sevrage (4 semaines) et leur sang est collecté pour mesurer le taux d'anticorps circulant et les caractériser.

Remplacement

L’étude des effets de la vaccination maternelle sur la réponse immune de la progéniture ne peut être substituée par des modèles in vitro.

Réduction

Différentes mises au point seront réalisées afin d’identifier les conditions optimales pour répondre aux problématiques posées; ce qui permettra de réaliser les expériences de grande échelle (telle que le criblage d’une banque d’anticorps glycosylés) sur un nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Des points limites ont été définis, qui seront surveillés quotidiennement tels que le comportement apathique des souris, leur pelage souillé, leur difficulté à respirer et la perte de poids. Les souris gestantes ne seront pas transportées pour limiter le stress à l’animal. Les souris gestantes auront un régime alimentaire adapté (croquettes enrichies). Du coton sera mis dans les cages pour permettre aux souris de faire un nid.

Choix des espèces

Dans un but d'étude de potentialité vaccinale et d'immunorégulation induite par les anticorps, il n'existe pas d'autres possibilités que le recours à l'In vivo, et donc aux souris dans notre cas puisqu'elles représentent un bon modèle adapté à nos études. Il est connu que la coqueluche touche tous les âges de la population et elle est mortelle chez les nourrissons non encore correctement protégés par la vaccination. Pour faire le parallèle avec le modèle murin, nous travaillerons sur des souriceaux de 7 à 9 jours, âges auquels le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un nouveau-né. Nous emploierons des souris de 4 semaines, âge auquel le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un enfant pour étudier l'effet des anticorps maternels sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination. Des souris adultes de 7 semaines, au système immunitaire mature, seront également employées comme outil de criblage, la reproductibilité et la faisabilité des expériences étant meilleure comparé au modèle d'infection néonatale.

639 rats bruns et rats noirs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une infection intranasale par le SARS-CoV-2 sous anesthésie, jusqu'à sept lavages nasaux, des prises de sang répétées et un gavage oral, pour évaluer si ces rongeurs peuvent constituer un réservoir sauvage du virus. Le porteur indique que l'infection respiratoire peut provoquer une baisse d'appétit et une perte de poids, les difficultés respiratoires ou une perte de poids au-delà de 20 % déclenchant la mise à mort. Il affirme que l'étude du potentiel de réservoir ne peut être menée que par des expériences in vivo.

Objectifs

Dès le début de la pandémie de COVID-19, la question de la contamination des animaux proches de l'homme a été posée. Plusieurs études expérimentales ont été menées pour déterminer le spectre d'hôtes du SRAS-CoV-2 apparu à Wuhan, en Chine. Il a été démontré que la sous-famille des Murinae, qui comprend les rats et les souris, n'était pas réceptive (la réceptivité étant la capacité de réplication virale) à l'infection par le SRAS-CoV-2, probablement en raison de différences essentielles au niveau du récepteur utilisé par le virus pour infecter son hôte. L'émergence de nouveaux variants du SARS-CoV-2, en particulier les variants préoccupants B.1.351 et P.1, qui peuvent infecter expérimentalement de jeunes souris, a modifié cette situation, d'où la nécessité de surveiller le risque que les rongeurs sauvages deviennent des réservoirs du virus, à partir desquels il pourrait évoluer et se propager à l'homme. Les rats, en particulier Rattus norvegicus sont devenus des habitants importants de nos villes, tandis que Rattus rattus est plus fréquent dans les zones agricoles et portuaires. Dans les villes où les égouts ne sont pas bétonnés, les estimations sont de 1,5 à 1,7 rats par habitant avec des pullulations reconnues dans les grandes villes comme Paris et Marseille, ou lors de conditions particulières comme les grèves des éboueurs. La proximité de ces espèces sauvages avec les humains ainsi que la possibilité de détecter du matériel génétique du SRAS-CoV-2 dans les effluents incitent à poursuivre les recherches sur le rôle que ces espèces pourraient jouer en tant que réservoir secondaire des variants du SARS-CoV-2, avec des implications dramatiques pour les risques de propagation et les efforts d'éradication putatifs et une mauvaise interprétation des concentrations virales dans les eaux usées si le virus est également excrété par les rongeurs vivant dans les égouts. L'objectif de ce projet est d'étudier le risque d'émergence de réservoirs de rongeurs par une approche d’essai de réceptivité et de transmission.

Bénéfices attendus

L’approche expérimentale couplée à une recherche du virus chez les rats piégés dans de grandes métropoles françaises permettra de répondre à la question de la possibilité de constitution d’un réservoir sauvage d’un des variants du SARS-CoV-2. L’approche expérimentale pemet de savoir si les animaux sont récéptifs et capables de se transmettre l’infection soit de façon directe (par projection d'aérosol entre individus), soit de façon indirecte par voie orale (par le biais des matières fécales). Les études sur le terrain permettront de voir si les rongeurs sont effectivement exposés car il reste toujours une incertitude sur le caractère infectieux du virus retrouvé dans les effluents.

Procédures

1/Lavage nasal sous anesthésie gazeuze (entre 1 à 7 fois selon les procédures et les groups de rats, à raison d'une durée de 30 secondes). 2/Infection intranasale sous anesthésie gazeuse (environ 15 secondes) .3/ Prise de sang à la veine caudale (durée 1 à 2 minutes) sous anesthésie gazeuse (5 répétitions à 3/4 jours d'intervalle sur un seul groupe de 6 rats) 4/ Prise de sang intracardiaque terminale (durée d'une minute environ) sous anesthésie (induction à l’isoflurane et injection intrapéritonéale de kétamine et de Xylazine) + analgésique. 5/ gavage oral sous anesthésie gazeuse (quelques secondes).

Impact sur les animaux

L’infection chez les rongeurs peut provoquer une baisse d’appétit et une perte de poids. Le contrôle visuel sera quotidien et le contrôle du poids effectué tous les 2 jours pour ne pas perturber les rats (Rattus rattus particulièrement). Tout signe inhabituel (tel qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. L’infection étant respiratoire, un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires, d'une toux très importante ou d'une perte de poids au delà des 20%, entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les lavages nasaux seront effectués sous anesthésie gazeuse (isoflurane)

Devenir

mise à mort de tous les rats afin d'effectuer des prélèvements (organes et sang)

Remplacement

L'étude du potentiel de constitution d’un réservoir de SARS-CoV-2 sur une espèce sauvage ne peut être réalisée que par des expériences in-vivo. Des études in silico et in vitro d’inoculation de cellules de rats ont déjà montré une possible réplication du virus en fonction du variant.

Réduction

La construction du projet en procédures successives dont la mise en œuvre ne se fait que si la précédente est efficace permet de limiter le nombre d’animaux. L’utilisation de lot de 5 à 6 animaux permet en minimisant leur nombre d’appliquer des tests statistiques non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront observés et approvisionnés en nourriture fraîche quotidiennement. Ces rongeurs seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette particulièrement les rats noirs et les rats bruns), et de bâtonnets de bois à ronger. Tout signe inhabituel (telle qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. Un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires (dyspnée, tirage costal, toux très importante, perte de poids au delà des 20%) entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les seuls prélèvements sont des lavages nasaux qui seront effectués sous anaesthésie gazeuses à l’isoflurane. La mise à mort des rongeurs sera effectuée suite à une anesthésie (induction à l’isoflurane puis injection intrapéritonéale de kétamine à 150mg/kg et de Xylazine à 10 mg/kg associée à une prise de sang terminale intra-cardiaque et une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Rattus norvegicus et rattus rattus sont les 2 espèces de rats vivant dans les égouts ou espaces anthropisés suceptibles d’être exposés par les effluents contaminés ou proximité d’avec l’homme. Les rattus norvegicus de laboratoire seront issus d'un éleveur agréé. Les rats bruns et les rats noirs, bien que de type sauvage seront issus d'un élevage également. Seul le rat noir, dont aucun animal de laboratoire ne dérive, nécessite un certificat de capacité puisqu'il est considéré par les autorités comme un animal sauvage. Les essais de réceptivité/sensibilité chez les murinés ayant été menés chez des rongeurs adultes, les rats choisis ici sont des adultes d'un poids compris entre 200 et 300 grammes.

212 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation de plutonium dans la trachée sous anesthésie, provoquant une irradiation pulmonaire chronique, puis des traitements par inhalation, injection ou gavage et des séjours en cage métabolique, pour tester des associations destinées à éliminer le radioélément. Le porteur indique que des signes précurseurs de fibrose devraient apparaître et que les animaux sont tués après six semaines ou trois mois pour prélever leurs organes. Il justifie le recours à un "organisme entier" par la biocinétique complexe du plutonium, difficile à reproduire in vitro.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’améliorer la prise en charge thérapeutique suite à une contamination interne avec du plutonium (Pu). Ces situations peuvent se rencontrer dans les domaines civil et militaire (travailleur du nucléaire, accident, acte de malveillance etc.). Les traitements utilisés actuellement consistent à favoriser l’élimination du radioélément (décorporation) avec une molécule capable de le piéger (chélateur), tel que l’acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA) dans le cas du plutonium. Cependant, ce traitement a une efficacité limitée sur les formes peu solubles de plutonium et son effet sur les conséquences biologiques induites à long terme par la contamination n’a pas été étudié à ce jour. Notre approche innovante consistera donc à combiner ce traitement de référence avec des molécules possédant des mécanismes d’action complémentaires afin de favoriser l’élimination du plutonium et de limiter ses effets biologiques. Deux molécules candidates ont été retenues pour ce projet : un anti-inflammatoire, qui devrait permettre de limiter l’inflammation résultant de la contamination et les pathologies associées (fibrose pulmonaire notamment) et un mucolytique, qui devrait favoriser l’élimination du plutonium en fluidifiant les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux. L’association de ces molécules avec le DTPA permettra, en cas de libération de Pu à partir des lésions inflammatoires par exemple, de favoriser son élimination sous forme de complexe Pu-DTPA et d’empêcher sa fixation à d’autres organes. Des expériences préliminaires prometteuses avec ces associations thérapeutiques ont été réalisées sur des modèles cellulaires in vitro. Dans ce projet, nous étudierons l’influence de ces associations thérapeutiques sur la biodistribution du plutonium dans l’organisme et sur les effets biologiques induits, tels que l’apparition de fibroses pulmonaires dans le cas de contaminations pulmonaires.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu suite à ce projet porte sur l’amélioration de la prise en charge thérapeutique en cas de contamination pulmonaire par du plutonium. Cette nouvelle stratégie thérapeutique aura pour objectif de limiter les conséquences biologiques de la contamination à moyen et long terme, au premier rang desquelles l’apparition de fibroses pulmonaires. Les résultats obtenus pourront, à terme, contribuer à l’élaboration de nouvelles recommandations thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront contaminés, sous anesthésie, par une instillation intra-trachéale unique (durée maximale 5 secondes). Les traitements seront délivrés par inhalation (bi-hebdomadaire, durée 15 minutes) et/ou injection (hebdomadaire, durée maximale 5 secondes) et/ou gavage gastrique (administration unique après la contamination, durée maximale 10 secondes) après induction d’une anesthésie générale puis per os (dans l’eau de boisson) durant 6 semaines ou 3 mois.

Impact sur les animaux

Les séjours en cage à métabolisme, d’une durée de 1 à 5 jours maximum, génèreront du stress et de l’inconfort pour les animaux. Les cages à métabolisme sont des hébergements individuels permettant le recueil des excrétas (urines et selles) des animaux en vue d’analyses futures (mesures de la radioactivité par exemple). Les animaux sont placés sur des grilles sous lesquelles un système de séparation et de collecte des excrétas est installé. Ces effets indésirables seront temporaires et disparaitront lors du retour des animaux en hébergement classique. Le plutonium possède une toxicité radiologique, mais pas de toxicité chimique. Il induira une irradiation pulmonaire chronique durant 3 mois au maximum. Ce délai est trop court pour donner lieu à l’apparition de pathologies cancéreuses ou des fibroses pulmonaires déclarées. Des signes biologiques précurseurs devraient néanmoins être observés (lésions préfibrotiques, sécrétion de certaines cytokines, accumulation de collagène, etc.).

Devenir

Tous les animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés 6 semaines ou 3 mois après la contamination afin de prélever différents organes et tissus. Ces prélèvements seront nécessaires pour étudier la biodistribution du plutonium dans l’organisme et l’apparition de phénomènes inflammatoires ou fibrotiques en présence des différents traitements.

Remplacement

La contamination interne par des radioéléments résulte principalement d’une exposition accidentelle par inhalation ou via une blessure. Cette contamination interne implique un passage à travers plusieurs barrières physiologiques indicatives d’un système complexe et intégré. Les approches de décorporation doivent agir à la fois localement (au niveau du site d’entrée) et de façon globale dans l’organisme afin de diminuer la rétention des radioéléments dans les organes cibles (foie et os notamment), et de faciliter leur élimination par les voies naturelles. En raison de la biocinétique complexe des radioéléments dans l’organisme, l’évaluation de l’efficacité des traitements ne peut se limiter à étudier leurs effets sur un type cellulaire particulier ou sur un modèle in vitro non intégré. De même, les anti-inflammatoires sont des molécules agissant sur plusieurs cibles et les mucolytiques fluidifient les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux, phénomène qui ne peut être obtenu sur des modèles in vitro. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier (in vivo). Des expériences préliminaires à ce projet ont par ailleurs été menées in vitro afin de confirmer la pertinence des traitements envisagés en amont du recours à l’expérimentation animale.

Réduction

La stratégie adoptée s’appuie sur les données du laboratoire. L’expérience suggère que des groupes de 5 à 7 animaux sont suffisants pour démontrer une efficacité thérapeutique du DTPA ou d’autres traitements par voie veineuse, par voie pulmonaire ou par voie orale chez le rat après analyse statistique. Un effectif de 6 animaux par groupe a donc été retenu pour la conduite de notre projet. Pour des raisons réglementaires inhérentes au travail en installation nucléaire il n’est pas possible de réaliser une campagne de contamination sur plus de 30 animaux simultanément. Ces contraintes justifient la conduite de plusieurs campagnes de contamination. Par ailleurs, en raison de la variabilité inhérente à la préparation des solutions de plutonium et à la contamination, chaque campagne devra inclure un groupe contrôle contaminé non traité ainsi que les traitements simples avec une seule molécule (6 animaux par groupe). L’analyse statistique comparera chaque groupe traité au groupe non traité et au groupe traité avec une seule molécule (dans le cas des associations de traitements) au sein d’une même campagne.

Raffinement

Après contamination les animaux sont hébergés individuellement dans des cages à métabolisme (5 jours maximum) en plastique transparent à travers desquelles les rats peuvent se voir les uns les autres, s’entendre et se sentir. Un enrichissement de type jouet à ronger est ajouté dans les cages à métabolisme. Par la suite, les animaux sont hébergés en groupe (3 animaux par cage) avec des enrichissements matériels et nutritionnels (tunnel ou boule en plastique, bâtonnets en bois, papier, grosse croquette etc..). La contamination et le gavage des animaux seront réalisés après induction d’une anesthésie générale afin de limiter le stress et l’inconfort lié à ces actes. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine minimum (ou plus si besoin pour expérimentation ou surveillance accrue). Mise en place de points limites identifiés pour ce projet et l’utilisation d’analgésique pour soulager l’animal en cas de souffrance. Une vigilance particulière sera également portée à l’apparition de potentiels symptômes respiratoires (dyspnées, essoufflements, éternuements et toux), une réponse inflammatoire pulmonaire pouvant faire suite à la contamination.

Choix des espèces

Le rat est l'espèce animale retenue pour nos études du fait de la richesse des données issues de la littérature sur la contamination par les radioéléments de la même famille que le plutonium, d'un point de vue de la biocinétique et des tests de traitements de décorporation des radioéléments. En effet, le rat est un modèle pertinent pour la contamination interne pulmonaire : sa taille, supérieure à celle de la souris, permet de réaliser des prélèvements biologiques suffisamment conséquents pour obtenir des niveaux de radioactivité mesurables et des informations exploitables sur un certain nombre de paramètres biologiques. De plus, de nombreuses données historiques obtenues sur cette espèce sont disponibles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront âgés de 4 à 6 semaines au moment de la réception car les risques de contamination interne avec des radioéléments concernent principalement les travailleurs jeunes adultes et adultes). Les rats présenteront initialement des poids allant de 150 à 200 g, de façon à faciliter leur hébergement en groupe et leur assurer un meilleur confort lors du séjour en cage à métabolisme.