Troubles respiratoires

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur pose chirurgicalement une pompe diffusant de la bléomycine pour induire une sclérodermie, puis on administre les composés à tester par des voies variées et on prélève 7,5 % de leur sang chaque semaine, avant la mise à mort. Le porteur revendique un modèle répondant à un "besoin important de santé" et affirme qu'aucune approche in vitro ne peut remplacer l'animal. La souffrance déclarée reste au niveau sévère, ce qui soumet le projet à une évaluation rétrospective.

Objectifs

La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie orpheline atteignant le tissu conjonctif. Son origine n’est pas connue mais son apparition et sa progression impliquent très certainement des facteurs environnementaux sur un fond génétique de susceptibilité. La physiopathologie est dominée par des lésions microvasculaires responsables de lésions endothéliales couplées à la production de nombreux médiateurs pro-inflammatoires favorisant un remodelage vasculaire. Un processus d’auto-immunité serait également impliqué supportant l’entretien, la progression et le maintien de la pathologie. Ces différents éléments soutiennent l’apparition de lésions fibrotiques liées à l’accumulation de dépôt multi-viscéral de matrice extracellulaire résultat d’une rupture de l’équilibre synthèse/dégradation de ces composés matriciels. La SSc est responsable d’une réduction significative de la survie, en particulier dans les formes diffuses au cours desquelles les atteintes viscérales sont fréquentes. Une meilleure compréhension de la physiopathologie de cette maladie permet de proposer des approches thérapeutiques afin d’optimiser la prise en charge des patients. Ce projet s’inscrit donc dans une étude préclinique visant à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients atteints de sclérodermie systémique. Ce travail permettra également de comparer les candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, le Tofacitinib. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagées afin de couvrir au mieux les potentiels effets recherchés sur la sévérité et la progression de cette maladie dans le modèle murin utilisé.

Bénéfices attendus

Le modèle animal de sclérodermie systémique (SSc) utilisé dans cette étude est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de la maladie afin de répondre à un besoin important de santé.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie préalable pour la pose d'une pompe Alzet par le fournisseur. La pompe Alzet est nécessaire au délivrement de la bléomycine en sous-cutanée afin d'induire la sclérodermie du modèle. Selon la demande de notre partenaire, la molécule à tester pourra être administrée dans l’eau de boisson, dans l’alimentation, par gavage, inhalation, injections intra péritonéale (à l'aide d'une aiguille 25-27G), intravasculaire (à l'aide d'une aiguille 29-30G), sous-cutanée (à l'aide d'une aiguille 25-27G), intradermique (à l'aide d'une aiguille 30G) intramusculaire (à l'aide d'une aiguille 29-30G). La fréquence/durée de l'administration est variable en fonction de la demande de nos partenaires, tout en respectant les caractères de l'éthique animale. Un volume maximum de sang de 7,5% du volume total sera collecté 1 fois par semaine. Un prélèvement en point final de sang, et d'autres organes/fluides auront lieu après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo afin d'évaluer l'efficacité des composés testés.

Impact sur les animaux

Les effets directs et indirects de la procédure chirurgicale de pose de la pompe Alzet par les fournisseurs des animaux sont décrit au sein de leur autorisation de projet (Voir numéro indiqué en 4.2). Ils regroupent la récupération post-opératoire (douleur et stress) dû à l’anesthésie et à la procédure chirurgicale. Cette chirurgie peut également induire une possible perte de poids, une mise en tension de la peau et un possible risque de nécrose en cas de tension trop importante, la création d’un espace vide en sous cutané, une gêne mécanique et une gêne dans les déplacements (troubles légers de l’équilibre dus à la présence d’un poids sur un côté). C'est pourquoi les animaux seront surveillés quotidiennement post-induction de la maladie et pendant toute la durée de l'étude. L'aspect général et le poids des souris seront évalués post-induction sous la forme d’un score prédictif de la douleur. Ce projet étant classé à un stade sévère, il fera l'objet d'une évaluation rétrospective.

Devenir

A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.

Remplacement

Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Aucune étude pilote ne sera effectuée de part la robustesse du modèle utilisé (description et publications). Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante (test non-paramétriques de Mann-Whitney et Kruskal Wallis) pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Le nombre de 10 animaux par condition test correspond à la quantité minimale nécessaire pour cet objectif.

Raffinement

Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Le projet étant classé à un grade sévère, la Structure en charge du Bien-Etre Animal sera impliquée dans le bon déroulé de l'expérience et ce projet fera l'objet d'une évaluation rétrospective. Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs ayant connaissance du modèle (signes cliniques attendus) afin d'apporter les meilleurs soins aux animaux. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la sclérodermie systémique sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Dans ce projet, les expériences in vivo sont donc indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance de composés mais également leur efficacité sur la maladie. La souris est largement décrite pour être une espèce de choix dans ce modèle compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. La majorité des expériences sera réalisée chez la souris C57Bl/6J. Cependant, la souche peut différer en fonction des souhaits des sponsors. Les souris utilisées auront entre 7 et 12 semaines afin d'avoir des sujets adultes avec un système immunitaire mature.

1200 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sous anesthésie, la trachée est dégagée pour injecter de la bléomycine qui déclenche sur trois semaines une inflammation puis une fibrose pulmonaire pouvant provoquer une détresse respiratoire, avant enregistrement de la respiration puis mise à mort pour prélever les poumons, dans le développement préclinique de médicaments. Le porteur reconnaît que le modèle n'a jamais été réalisé dans ces conditions au laboratoire et qu'aucun calcul de puissance n'est possible, tout en revendiquant 8 à 10 animaux par groupe. Il présente ce modèle comme "nécessaire" à la mise sur le marché de nouveaux traitements et retient le cobaye pour la sensibilité de ses voies aériennes.

Objectifs

L’inflammation pulmonaire est une réponse biologique complexe du tissu pulmonaire à divers stimuli néfastes : pathogènes, cellules endommagées, substances irritantes, etc. L’inflammation est un mécanisme immunitaire protecteur impliquant les cellules immunitaires, les vaisseaux sanguins et différents messagers cellulaires. Depuis ces dernières décennies, on assiste à une augmentation significative des maladies inflammatoires du poumon, telles que l’asthme ou la broncho-pneumopathie chronique obstructive , maladie chronique d'origine respiratoire atteignant les bronches. L’inflammation peut être aiguë, c’est-à-dire temporaire, ou devenir chronique et donc persister un long moment. Le plus souvent, cette inflammation chronique va évoluer vers une fibrose du tissu pulmonaire qui modifiera la fonction pulmonaire. Les tests décrits dans ce projet ciblent l’inflammation et la fibrose du système respiratoire dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments à lutter contre certaines infections pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce modèle d'inflammation/fibrose pulmonaire est nécessaire à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certaines pathologies Ce modèle d'inflammation/fibrose pulmonaire est nécessaire à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certaines pathologies pulmonaires. Les traitements ont pour objectif de réduire les symptômes et d’améliorer la tolérance à l’effort des patients. Le traitement antifibrosant par pirfénidone ou nintédanib ralentit l’aggravation de la maladie, mais n’entraîne pratiquement pas d’amélioration des symptômes (toux persistante par exemple). Dans ce contexte, il est nécessaire de poursuive la recherche de nouveaux traitements efficaces et sans effets secondaires majeurs.

Procédures

Lors de l'injection de bléomycine, une phase de chirurgie en condition d'asepsie est nécessaire. Les animaux sont anesthésiés et leur trachée est dégagée pour injection du réactif. L'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil et un antisedan est administré pour accélérer le réveil. La durée de l'intervention de l'anesthésie à l'injection de l'antisédan est de 45 minutes maximum. L’inflammation et la fibrose pulmonaire se développe progressivement sur une période de 21 jours (durée maximale de l’expérience). En fin d’étude (généralement le dernier jour, jour 21), les animaux sont placés dans des chambres de pléthysmographie pour l’enregistrement des paramètres respiratoires (stabilisation, puis enregistrement sur une période de 3-4 heures). Pendant l’étude, des prélèvements sanguins (veine saphène) intermédiaires sous anesthésie peuvent être réalisés (maximum 2, pour un volume inférieur à 15% de la volémie de l’animal). Enfin, un prélèvement sanguin ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie est réalisé juste avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédures, il est attendu une réaction inflammatoire principalement localisée au niveau pulmonaire. Quand on cherche à moduler la réponse inflammatoire à l'aide d'agents pharmacologiques, il est possible d'établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi des médicaments de demain. L'inflammation est liée aux effets de substances administrées par voie intra-trachéale dont les effets sont bien caractérisés. Dans le cas de l'inflammation pulmonaire, les paramètres respiratoires peuvent être altérés et induire une détresse respiratoire. Dans la mesure du possible, les études sont réalisées sur des animaux hébergés en groupe (sauf lors de la mesure des paramètres respiratoires, mais sur une période de 4h maximum).

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour recueil du liquide bronchoalvéolaire et des poumons (pas de réveil).

Remplacement

En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro ont pu être réalisés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement positif. Ce modèle est actuellement en développement, masi nos données historiques obtenues dans des modèles similaires indiquent qu'il est nécessaire d'inclure 8-10 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à testés) pour atteindre une sensibilité correcte. Néanmoins, ce modèle n'ayant jamais été réalisé dans les conditions décrites au sein du laboratoire, aucune analyse de puissance ne peut être réalisée. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétique d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré- ou post-opératoires complets.

Choix des espèces

Le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique. Le cobaye reste utilisé dans plusieurs domaines de recherche (électrophysiologie cardiaque, immunologie, fonction respiratoire,...). Le cobaye est ainsi un bon modèle d'asthme ou inflammation pulmonaire, car contrairement à la souris et au rat, ses voies aériennes sont sensibles à l'histamine et il démontre une réaction allergique précoce et tardive comme c'est le cas chez l'humain. C'est également l'espèce classiquement utilisée pour l'évaluation des symptômes de toux. Principalement des cobayes sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par des bactéries multi-résistantes puis reçoivent un anticorps monoclonal par voie intrapéritonéale, avant mise à mort trois à cinq jours plus tard pour prélever rate, foie et poumons. Le porteur indique que l'infection peut provoquer fièvre, difficultés respiratoires et perte de poils, des points limites permettant une mise à mort précoce. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour évaluer le traitement en présence d'un système immunitaire complet et du microbiote.

Objectifs

En 2017, l’OMS a publié une liste des agents pathogènes prioritaires et les a classés en 3 catégories : critique, élevée et moyenne. Dans le groupe le plus critique se trouvent les bactéries multi et pan-résistantes (MDR ou PDR) aux antibiotiques qui sont un problème mondial et qui représentent une menace en particulier dans le milieu hospitalier. Dans ce groupe, on retrouve Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter et de nombreuses Enterobacteriaceae telle que E. coli ou encore Klebsiella qui ont acquis une résistance aux carbapénèmes et aux céphalosporines qui à l’heure actuelle constituent les meilleurs traitements contre ce type de bactéries. Pour remédier à ce problème, l’élaboration de nouveaux traitements est essentielle ce qui à court terme veut dire la synthèse de nouveaux antibiotiques. Or toujours d’après l’OMS, en 2020 seulement 2 candidats parmi 32 ont pour cibles ces bactéries multi-résistantes. C’est pour cela qu’il est crucial d’orienter les recherches vers d’autres molécules tels que les anticorps antimicrobiens. Les anticorps sont des molécules naturellement produites lors d’une infection et constituent une des voies de défense face à un pathogène ; mais on peut également les synthétiser. Il a par exemple été montré dans des études préliminaires la présence d’un polysaccharide de surface chez certaines de ces bactéries multi-résistantes telles que E. coli ou encore S. aureus. Cet antigène pourrait s’avèrer être une piste assez intéressante dans le développement de nouveaux traitements. De précédents travaux utilisant la vaccination passive (anticorps monoclonaux) ou active (vaccination classique) ciblant cet antigène ont permis de montrer l’efficacité de ce dernier en induisant spécifiquement la mort des bactéries présentant à leur surface ce sucre mais également en protégeant des souris contre ces bactéries. Notre projet de recherche s’inscrit donc dans la continuité de ces données préliminaires et vise à développer de nouvelles méthodes de traitement contre les bactéries multi-résistantes.

Bénéfices attendus

Ces travaux couplés à une étude in vitro nous permettront de déterminer précisément l’action favorable liée à l’utilisation de thérapeutiques innovantes comme les anticorps monoclonaux, en présence ou en absence d’une antibiothérapie lors d’une infection par des bactéries, y compris multi-résistantes. Ces nouvelles thérapeutiques visent non seulement à lutter efficacement contre les infections causées par les bactéries multi-résistantes mais aussi à réduire la pression de séléction induite par les antibiotiques, ce qui permettra de diminuer l’émergence et la dissémination de la résistance aux antibiotiques.

Procédures

Infection bactérienne et administration de l’anticorps monoclonal par voie intra-péritonéale. Les animaux provenant de la procédure 1 seront sacrifiés au maximum 5 jours après le début de l'infection puis la rate et le foie seront prélevés. Concernant les animaux de la procédure 2, la mise à mort sera effectuée 3 jours au maximum après l'infection et à la fin de la procédure les poumons seront prélevés.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer des infections à des bactéries pathogènes y compris multi-résitante aux antibiotiques. Ces infections peuvent provoquer une augmentation de la température corporelle, des difficultés respiratoires ou encore une perte des poils. Dans le cadre d’un traitement aproprié on s’attend à voir ces effets regresser dans le temps. En revanche pour les conditions ou le traitement sera inaproprié ces effets vont s’aggraver mais la mise en place de points limites spécifiques vont permettre d'euthanasier les souris de façon précoce.

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Des études in vitro préliminaires ont permis d’établir les doses optimales d’anticorps à utiliser. Cependant l’emploi du modèle animal nous est indipensable afin d’étudier son effacité en présence ou en absence d’un système immunitaire complexe, l’impact du microbiote ou une antibiothérapie couplée à l’utilisation d’anticorps monoclonal. De plus, s’agissant du développement d’une nouvelle stratégie curative l’expérience sur l’animal est justifiée avant l’application sur l’homme.

Réduction

Nous utiliserons une lignée consanguine dont le fonds génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. Nous limiterons notre projet à l’étude de quatre souches bactériennes. Nous utiliserons pour chaque expérience le nombre minimal d'animaux permettant d'observer une différence significative. Par nos expériences passées, il est estimé qu’un groupe de 8 animaux est suffisant pour obtenir une étude statistique.

Raffinement

Pour réduire le stress et l’angoisse des souris, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton). L’objet de notre étude est de trouver un traitement efficace lors d’infection par des bactéries multi-résistantes. Pour limiter au maximum la douleur et la souffrance associée au sepsis sévère et notamment lors de la fin de vie, nous avons choisi d'euthanasier les animaux bien avant la mort induite par l’infection.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée et reconnue comme modèle d’infection systémique à E. coli et d’autres bactéries. Cette approche expérimentale permettra d'étudier non seulement le moyen optimal de déployer les anticorps monoclonaux (ou autres thérapies innovantes) en même temps que les thérapies par antibiotiques standard. Elle permettra également de tester l'efficacité de ces nouvelles thérapies, en particulier lorsqu'elles sont administrées après le début de l'infection tout en évaluant l’impact du microbiote ou du rôle du système immunitaire. Afin de réduire au maximum la variabilité de nos résultats nous n’utiliserons que des animaux adultes du même âge (6 à 8 semaines).

2010 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, puis reçoivent des molécules antivirales ou des vaccins, pour évaluer les propriétés des variants et tester des traitements. Le porteur décrit une pathologie pulmonaire avec perte de poids et indique que les variants pourraient provoquer des formes plus graves. Il affirme que le recours au modèle animal est obligatoire après une évaluation in vitro, tous les animaux survivants étant tués en laboratoire de haute sécurité.

Objectifs

L’émergence récente de variants du SARS-CoV-2 contraint la communauté scientifique à suivre l’évolution naturelle du virus quasiment au jour le jour. Il est donc indispensable de pouvoir évaluer les propriétés biologiques in vivo de ces virus, le plus rapidement et le plus efficacement possible. Presque deux ans après l’émergence de ce virus, le développement de thérapeutiques antivirales (antiviraux, anticorps, vaccins) reste d’un intérêt majeur. Encore une fois, cet objectif est renforcé par l’émergence de variants d’intérêts. Ce projet propose donc: -D’évaluer les propriétés biologiques du SARS-CoV-2 et de ses variants -De tester des thérapeutiques antivirales (antiviraux, anticorps, vaccins) contre ce virus et ses variants.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer les propriétés biologiques des variants du SARS-CoV-2 et de poursuivre les travaux de la communauté scientifique sur le développement de thérapeutiques, après validation in vitro, qui pourront ensuite potentiellement être utilisées chez l’Homme. Cette étape est indispensable à tout développement pharmaceutique.

Procédures

Les animaux, anesthésiés au préalable, seront infectés par le SARS-CoV-2 par voix intranasale. Cette intervention dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + infection) et ne s'effectue qu'une seule fois. L'administration de molécules antivirales ou de vaccins s'effectuera par voie intranasale, intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire ou par gavage sur les animaux anesthésiés. Le traitement s’effectuera au maximum deux fois par jour, durant le temps de l’expérimentation. L’administration des vaccins s’effectuera selon deux schémas : une dose ou deux doses à 10-25 jours d’intervalle. Cette intervention dure en moyenne 3 minutes (anesthésie + traitement). Un seul prélèvement sera effectué sur animal vivant: le lavage nasal. Il sera réalisé une seule fois par jour, au maximum deux jours consécutivement et dure en moyenne 4 minutes (anesthésie + lavage nasal).

Impact sur les animaux

Le SARS-CoV-2 entraine une pathologie pulmonaire non mortelle et spontanéemment résolutive chez le hamster. Le principal symptôme observé est une perte de poids survenant généralement entre le 4ème et le 7ème jour post-infection. Néanmoins, l'étude de l'infection par des variants du SARS-CoV-2 pourrait conduire à des formes cliniques/symptomatologiques différentes de celles déjà observées. Par conséquent, les animaux seront surveillés cliniquement et pesés quotidiennement durant la période d’expérimentation, afin de détecter précocément cette perte de poids et/ou tout autres symptômes (notamment pulmonaire).

Devenir

Les manipulations s'effectuant avec un virus infectieux et ayant lieu dans un laboratoire NSB3, l'ensemble des animaux survivants sont mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’étude de l’efficacité d’une molécule antivirale, d’un anticorps ou d’un candidat vaccin sur un virus et ses variants passe obligatoirement par l’utilisation d’un modèle animal, après une évaluation in vitro poussée.

Réduction

D’une part, concernant l’évaluation des propriétés biologiques des virus et la recherche de thérapeutiques antivirales (antiviraux, anticorps), nous avons déterminé l’effectif nécessaire de 6 hamsters par lot. D’autre part, nous avons déterminé l’effectif nécessaire de 8, 12 et 9 hamsters par lot concernant les études vaccinales, de fitness réplicatif et de pharmacocinétique, respectivement. Ces effectifs ont été calculés pour une puissance de 80% pour un risque alpha de 5% et de 95% pour un risque beta. Nous nous sommes également basés sur les écart types obtenus dans la littérature et sur nos précédents projets APAFIS.

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les animaux seront anesthésiés (isofluorane) avant toute inoculation de virus et administration de thérapeutiques. D’autre part, un traitement analgésique (buprénorphine) sera administré chez les hamsters présentant des signes d’infection trop sévères (évalués grâce à une grille de score). Par ailleurs des points limites adaptés ont été choisis afin de détecter précocement ce type d’atteinte. Les animaux seront maintenus en cage et ne seront soumis à aucune privation de nourriture ou d’eau. Ils seront surveillés cliniquement et pesés quotidiennement durant la période d’expérimentation.

Choix des espèces

Mesocricetus auratus est le modèle de référence pour le virus du SARS-CoV-2. Animaux âgés de 3 à 9 semaines. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études pré-cliniques sur le SAR-CoV-2.

120 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par administration dans la trachée d'un virus, avant leur mise à mort pour prélever le sang, le liquide pulmonaire et les poumons, afin d'évaluer le rôle d'un gène régulant une protéine impliquée dans la fibrose. Le porteur ne détaille pas les procédures dans la rubrique prévue, qui reprend le texte des objectifs, mais mentionne un suivi de la douleur par une échelle intégrant la perte de poids et les difficultés respiratoires. Il affirme travailler in vitro "si possible" tout en jugeant "indispensable" le recours au poumon entier vivant.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est un processus pathologique létal aboutissant à une destruction fibreuse des poumons. C’est une maladie rare avec une prévalence de 10 à 20 cas pour 100 000. Elle conduit à une insuffisance respiratoire et au décès avec une médiane de survie de 3 à 5 ans après diagnostic. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. La fibrose pulmonaire est le fait d’une cicatrisation exagérée avec accumulation de collagène et remodelage de la matrice extracellulaire. Le Transforming Growth Factor (TGF)-β1 est une cytokine clé impliquée dans la fibrogenèse. Nous proposons d’utiliser des souris C57bl/6J avec une délétion génétique d’une protéine cible qui est impliquée dans la régulation de la voie du TGF-β1. Plusieurs publications ont récemment démontré que l’activation de cette protéine permettait de limiter le développement de la fibrose. L’objectif principal de ce projet consiste à étudier l’impact de la délétion génique d’une protéine cible (identité confidentielle) sur la gravité de la fibrose pulmonaire induite par administration intra-trachéale d’un adénovirus codant pour le TGFbeta.

Bénéfices attendus

La fibrose pulmonaire idiopathique est un processus pathologique létal. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. Cette expérimentation permettra de mettre en lumière la protéine délétée comme une cible thérapeutique potentielle dans la fibrose pulmonaire.

Procédures

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est un processus pathologique létal aboutissant à une destruction fibreuse des poumons. C’est une maladie rare avec une prévalence de 10 à 20 cas pour 100 000. Elle conduit à une insuffisance respiratoire et au décès avec une médiane de survie de 3 à 5 ans après diagnostic. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. La fibrose pulmonaire est le fait d’une cicatrisation exagérée avec accumulation de collagène et remodelage de la matrice extracellulaire. Le Transforming Growth Factor (TGF)-β1 est une cytokine clé impliquée dans la fibrogenèse. Nous proposons d’utiliser des souris C57bl/6J avec une délétion génétique d’une protéine cible qui est impliquée dans la régulation de la voie du TGF-β1. Plusieurs publications ont récemment démontré que l’activation de cette protéine permettait de limiter le développement de la fibrose. L’objectif principal de ce projet consiste à étudier l’impact de la délétion génique d’une protéine cible (identité confidentielle) sur la gravité de la fibrose pulmonaire induite par administration intra-trachéale d’un adénovirus codant pour le TGF-β1.

Impact sur les animaux

La fibrose pulmonaire idiopathique est un processus pathologique létal. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. Cette expérimentation permettra de mettre en lumière la protéine délétée comme une cible thérapeutique potentielle dans la fibrose pulmonaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang, le liquide lavage broncho-alvéolaire et le tissu pulmonaire dans le but d’étudier l’impact de la délation du gène régulant la voie du TGF-β1 sur le développement de la fibrose pulmonaire.

Remplacement

Nous remplacerons si possible l’expérimentation sur animaux par des expériences in vitro. Mais le tissu pulmonaire est un tissu complexe issu de différentes cellules épithéliales, fibroblastiques, mésothéliales, organisées en tissu et interagissant dans un système dynamique. La fibrose pulmonaire est elle aussi complexe et son développement implique plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire). Tout ceci rend indispensable de travailler in vivo sur l’organe pulmonaire entier pour bien comprendre le rôle du gène d’intérêt dans le développement de la FPI.

Réduction

Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum tout en permettant de remplir nos objectifs. Le nombre d’animaux sera déterminé a priori par une analyse de puissance et représentera le nombre minimal d’animal permettant de produire des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit) au sein d’un centre de zootechnie. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). De plus, ils bénéficieront depuis 7 jours avant le début du protocole et pendant toute sa durée, d’une alimentation enrichie sous forme d’aliments gélatineux déposés sur la litière, ce qui en facilite l’accès pour limiter la perte de poids et la déshydratation qui caractérisent le modèle. Le modèle de fibrose pulmonaire sera appliqué par du personnel qualifié et entrainé. Afin de réduire la douleur, les animaux seront suivis au moyen d’une échelle d’évaluation de la douleur (Apparence physique, perte de poids, altération de la mobilité et difficultés respiratoires). Les points limites fixés nous permettront de décider de la mise à mort ou non des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est très bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. De plus, le modèle murin offre la possibilité de manipulation génétique, et ce projet utilisera des souris génétiquement modifiées (souris KO pour un gène d’intérêt). Nous utiliserons des souris âgées de 10 à 15 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant. Pour minimiser la dégradation de l’état général des animaux induit par le développement de la fibrose pulmonaire, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g.