Troubles respiratoires

Chacun des 180 macaques à longue queue de ce projet peut subir une quarantaine d'anesthésies générales, autant de prélèvements sanguins, une trentaine d'écouvillonnages nasaux, trachéaux et rectaux, quatre ponctions de moelle osseuse, quatre biopsies de ganglions et jusqu'à dix lavages broncho-alvéolaires, le tout classé en souffrance modérée. Une puce de télémétrie est implantée sous la peau, et les animaux exposés au SARS-CoV-2 ou à la grippe passent jusqu'à huit semaines seuls en cage. La modification déposée pour cette version ajoute quatre biopsies de peau, quatre biopsies de muqueuse rectale ou buccale et quatre prélèvements de liquide séminal, pour "avoir accès à plus de compartiments". 108 macaques sont tués pour prélever leurs tissus, les 72 autres gardés comme modèles de réinfection ou comme convalescents, avec une réattribution à d'autres études que le porteur n'exclut pas.

Objectifs

La grippe et le Covid sont des maladies respiratoires causés respectivement par les virus influenza et le SARS-CoV-2. La transmission interhumaine de ces virus se fait principalement par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration).Les personnes à risque et les stratégies thérapeutiques de ces deux maladies étant assez similaires, nous avons choisi de mener nos recherches à l’intérieur d’un seul projet. Actuellement, aucun traitement spécifique ne permet d’atténuer efficacement et systématiquement les maladies causées par le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. De nombreuses personnes notamment les personnes immunodéprimées (personne au système immunitaire fragile) ou âgées sont encore lourdement impactées par la Covid-19 ou la grippe avec des effets secondaires qui demeurent importants. De plus, dans le cas du SARS-CoV-2, l’émergence continuelle de variant d’intérêt (VOC) et l’absence de vaccins efficaces contre l’ensemble de ces variants anciens ou émergents nécessite le développement permanent de nouveaux traitements par immunothérapie. Dans le cas de la grippe, les souches qui circulent en hivers sont différentes d’une année sur l’autre. Cette diversité impose d’ajuster chaque année la composition du vaccin pour y introduire les souches les plus récentes en circulation et qui circuleront aussi probablement dans les mois suivants. De plus, ces virus saisonniers diffèrent en termes d’impact sur la population et de sévérité. Le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nous permettrait de mieux faire face à une épidémie de grippe en cas de faible efficacité du vaccin. Dans ce contexte, nous testerons différentes types de traitements comme des anticorps permettant d’améliorer la réponse adaptive ou ciblant directement les virus du SARS-CoV-2 ou les virus grippaux. La mise en place de traitements par immunothérapie efficaces contre ces virus respiratoires pourrait aussi représenter une alternative capable de stimuler la réponse immunitaire en cas de baisse d’efficacité des vaccins (population immunodéprimée, apparition d’une souche génétiquement très éloignée…). Ces traitements sont en phase de développement préclinique et la démonstration d’une efficacité dans notre modèle macaque permettrait une avancé en phase clinique. MODIFICATION : Nous avons effectué des modifications pour pouvoir prélever plus de type d’échantillons différents lors des étude de biodistribution pour avoir accès à plus de compartiments.

Bénéfices attendus

Les molécules thérapeutiques qui auront montré des résultats satisfaisants chez le primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’Homme. Elles pourront notamment, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre les virus respiratoires tels que le SARS-CoV2 ou la grippe.

Procédures

Les différentes interventions dans ce projet sont : - Anesthésie générale (40 fois environ, 30min, tous les groupes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (4 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus de la grippe ou de la covid (1 fois, 15 minutes, groupes exposés) - Prélèvement de sang (40 fois environ, 5 minutes, tous les groupes). - Prélèvement de moelle osseuse (4 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Biopsie de ganglions lymphatiques (4 fois environ, 30 minutes, groupes exposés) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux ET RECTAUX (30 fois environ, 2 minutes, tous les groupes) - Lavage broncho-alvéolaire (10 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Prélèvement de LCR (liquide cérébrospinal) (4 fois environ, 20 minutes, animaux de l’étude pilote) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Imagerie in vivo (10 fois environ, 45 minutes, tous les groupes) - Pléthysmographie (mesure de l'ensemble des volumes pulmonaires) (10 fois environ, 10 minutes, groupes exposés) - Hébergement individuel (1 fois, 8 semaines maximum, groupes exposés) - MODIFICATIONS : -Biopsie de peau (4 fois maximum, 30 minutes)-Biopsie de muqueuse rectale ou buccale (4 fois maximum, 20 minutes). -Prélèvement de liquide séminal (4 fois maximum, 20 minutes, animaux de l’étude pilote)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux traitements: Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza ou le SARS-CoV2 : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux traités. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélever différents tissus et procéder à des analyses (charge virale, lésions pulmonaires…). L’autre partie des animaux sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents. Il n’est pas exclu que ces animaux soient réattribués à d’autres études après avis vétérinaire.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer la protection induite par différents traitements par immunothérapie contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2 ou les virus influenza. Ce type d’évaluation nécessite un modèle expérimental proche de l’Homme, permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite au traitement et à l’infection virale. A ce jour, le macaque est le modèle qui représente le mieux ces infections respiratoires chez l’Homme. Du fait de sa proximité génétique avec l’Homme, les cibles des immunothérapies sont aussi exprimées chez le macaque, et pas nécessairement dans le modèle des petits animaux. Toutefois, les traitements par immunothérapie évalués ont été préalablement testés in vitro et dans un modèle de petits animaux avant d’être testés chez le PNH.

Réduction

Les études pilotes de distribution et persistance du traitementse font sur 2 animaux et nous permettent de sélectionner les traitements par immunothérapie les plus pertinents, la dose et la voie d’administration. Nous maitrisons les modèles de grippe et de SARS-CoV-2, cette expérience nous permets d’utiliser des contrôles historiques dans les études d’efficacité ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux contrôles tout en permettant une analyse statistique robuste. Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

L’ensemble des interventions et les prélèvements seront réalisés regroupés au maximum et sous anesthésie générale des animaux. Une diversification de l’alimentation et complémentation de celle-ci pourra être instaurée en cas d’une baisse de l’alimentation due à des anesthésies répétées Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être appliquée par une désinfection et une analgésie locale. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de la température peut induire une réaction tel qu’un gonflement et un suintement de la plaie. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique comme une désinfection et une analgésie locale. L’administration des traitements pouvant entrainer une réaction locale comme des démangeaisons et douleurs, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. L’exposition aux virus influenza et SARS-CoV2 peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. Si apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé.. Une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Les modèles d’infection par le SARS-CoV2 ou par les virus grippaux chez le macaque sont déjà mis au point dans notre département. Des grilles de score avec des points limites ont déjà été établis et utilisés au sein de notre département lors de différentes infections avec ces virus. L’hébergement se fera en groupe pour les études pilotes. Pour les études d’efficacités, les animaux seront mis en individuel pour la période d’adaptation avant l’exposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée, ils seront remis en groupe. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition virale.

Choix des espèces

Les modèles de petits animaux comme la souris ne sont pas un hôte naturel du SARS-CoV-2 et des virus influenza et leur le système immunitaire est très différent de celui de l’humain. Toutefois, la majorité des candidats sont déjà testés dans un modèle petit animal ou in vitro avant d’être testés chez le macaque PNH. Le macaque a été choisi comme modèle animal, car il présente une réponse immunitaire et physiopathologique semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires similaires. A ce jour, a été mis au point un modèle d’infection efficace des macaques cynomolgus par voie respiratoire. Les macaques sont d’excellents modèles pour reproduire la forme non sévère des maladies COVID19 et grippes, ils sont donc pertinents pour tester des molécules thérapeutiques. Ces espèces représentent le modèle le plus pertinent réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de traitements par immunothérapie contre les virus respiratoires : la réponse immunitaire et la réponse aux traitements sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire est maitrisés chez ces espèces contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires comme le furet. La grippe et le Covid infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum 2 ans. Enfin, les traitements candidats pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

Des souriceaux reçoivent sept instillations nasales d'allergènes sous sédation à l'isoflurane, geste dont le porteur admet le risque de fausse route et d'étouffement, certains subissant en plus quatorze injections intrapéritonéales. 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La mesure finale des paramètres respiratoires passe par une trachéotomie sous anesthésie, sans que les animaux soient réveillés, avant prélèvement des organes. Le porteur annonce que le modèle d'asthme pédiatrique n'entraîne aucune nuisance particulière et que sa symptomatologie est "sans conséquence sur le bien-être animal", tout en déclarant les 288 souriceaux au niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique (MLB) dans l’asthme pédiatrique sont méconnus. Pourtant, l’augmentation de la taille du MLB chez les enfants asthmatiques est associé à la sévérité de la maladie. Nos travaux, réalisés in vitro à partir de cellules MLB de patients enfants asthmatiques, nous ont permis d’identifier le rôle clé du métabolisme énergétique dans l’hyperprolifération de ces cellules. Nos travaux chez l’homme ne permettent pas d’analyser complètement les mécanismes de prolifération des cellules MLB in vivo. Afin d’étudier le rôle du MLB dans l’asthme pédiatrique, nous souhaitons utiliser un modèle murin d’asthme. Ce modèle est particulièrement pertinent, car il permet de combiner l’exposition de deux aérocontaminants impliqués dans la sévérité de la maladie chez l’Homme. Les objectifs du projet sont donc les suivants : 1) Mettre en place un modèle d’asthme pédiatrique qui permettra d’évaluer le remodelage du MLB in vivo. 2) Interférer avec le développement du MLB en traitant les animaux avec des molécules d’intérêt thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier in vivo les mécanismes de mise en place du remodelage du MLB. L’équipe de recherche travaille déjà in vitro en utilisant des cellules de patients pédiatriques asthmatiques mais l’asthme est une maladie mettant en jeu différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules MLB et cellules inflammatoires) qui ne peuvent à ce jour pas être étudier in vitro. Le modèle murin apparaît donc comme indispensable à la compréhension des mécanismes cellulaires. Le projet permettra également de tester des molécules d’intérêts thérapeutiques, mis en évidence sur les cellules de patients pédiatriques asthmatiques et de tester leur efficacité in vivo sur le remodelage du MLB.

Procédures

Les animaux seront soumis à des instillations nasales (IN) sous sédation à l’isoflurane (7 IN d’une durée de moins de 2 minutes) et certains animaux à des injections intrapéritonéales (IP) (14 IP). Pour les mesures terminales de mesure des paramètres respiratoires, ces expérimentations seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. Il n’y a pas de réveil après les mesures des paramètres respiratoires qui durent environ dix minutes.

Impact sur les animaux

Nous avons identifié 3 nuisances attendues potentielles : 1) Les souriceaux seront manipulés très jeunes, il y a donc un risque de rejet après manipulation des animaux par les mères. 2) L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souriceaux pourraient conduire à une fausse route / étouffement. 3) Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale. En revanche, nous ne nous attendons pas à observer de nuisance particulière liée à la création du modèle d’asthme pédiatrique. La collaboration scientifique menée à Gent a permis de montrer qu’il n’y a pas de mortalité suite à ce protocole ni de modification du comportement ni stress ou perte de poids, il n’y a donc pas d’incidence sur le bien-être animal. Les allergènes utilisés dans le cadre du protocole ne sont pas des molécules toxiques pour l’animal, elles permettent uniquement de développer la maladie asthmatique dont la symptomatologie est sans conséquence sur le bien-être animal.

Devenir

A la fin du protocole d’asthme, chaque animal sera utilisé pour analyser la fonction respiratoire, l’inflammation et le remodelage du MLB. Une fois mis à mort, les organes d’intérêt seront également prélevés ex vivo pour des analyses notamment d’immunofluorescence.

Remplacement

L’asthme est une maladie complexe mettant en jeu différents types cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés in vitro. Le modèle murin d’asthme pédiatrique permettra d’élucider les mécanismes complexes conduisant au remodelage du MLB. Parallèlement à ce protocole in vivo, des études in vitro sur les cellules de patients pédiatriques asthmatiques pourront être réalisées afin de valider les observations réalisées chez les animaux.

Réduction

Chaque protocole nécessite la comparaison de plusieurs paramètres de la fonction respiratoire et ce entre différents groupes de souriceaux exposées à différents traitements. Notre but est de réduire au maximum le nombre d’animaux par expérience tout en conservant la significativité des résultats. Chaque groupe de souris doit être composé de 12 souriceaux minimums afin de mettre en évidence une différence significative entre les groupes sur les différents paramètres analysés notamment la résistance bronchique. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Les expériences seront répétées trois fois afin de s’assurer de leur reproductibilité et de s’assurer d’un éventuel effet bénéfique d’une molécule thérapeutique. De plus, se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, après la mise à mort, nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes.

Raffinement

Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement des animaux. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés si nécessaire en fonction de l’évaluation de l’état des animaux par rapport aux points limites. Nous avons identifié 3 nuisances attendues potentielles : 1) Les souriceaux seront manipulés très jeunes, il y a donc un risque de rejet après manipulation des animaux par les mères. Pour éviter cela, on limitera au maximum le nombre d’expérimentateur au cours du protocole et ils veilleront à toucher la sciure de la cage avant manipulation des animaux. 2) L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souriceaux pourraient conduire à une fausse route / étouffement. Pour éviter cela, l’administration des molécules sera réalisée sous sédation à l’isoflurane avec un volume d’injection réduit au maximum. Le choix d’un volume minimal associé à la bonne gestion de la profondeur de l’anesthésie gazeuse permettra de réduire considérablement un éventuel risque de fausse route. 3) Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale. Pour éviter cela, l’expérimentateur placera la boite d’induction d’isoflurane sous un tapis chauffant pour maintenir les animaux à la bonne température. De plus, le procédé est très cours, moins de 2 minutes avec l’induction de l’anesthésie gazeuse comprise. Les souriceaux seront surveillés par des expérimentateurs qui ont l’habitude des protocoles murins d’asthme jusqu’à leur réveil.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus classiquement utilisée pour l’étude de l’asthme. L’asthme est une maladie touchant différents composants, qui interagissent de façon étroite, tels que le muscle lisse bronchique, l’épithélium bronchique et les cellules inflammatoires. Il n’existe pour l’instant pas de système in vitro permettant de faire coexister ces différents types cellulaires. Par ailleurs, nos travaux chez l’homme montrent une augmentation de la prolifération des cellules musculaires lisses bronchique chez les patients enfants asthmatiques. Grâce à un modèle de souris pédiatrique asthmatique et l’utilisation de molécules thérapeutiques, nous pouvons envisager une meilleure compréhension des phénomènes qui permettent le remodelage du MLB. De plus, le stade de maturation pulmonaire des souriceaux correspond à la catégorie asthme de l’enfant pré-solaire. Au total, le modèle murin apparaît donc comme un modèle indispensable pour évaluer les mécanismes du remodelage du MLB dans l’asthme pédiatrique et pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

1 214 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 24 injections dans l'abdomen et 40 gavages sur deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent deux instillations dans la gorge sous anesthésie, un prélèvement sanguin, une séance d'imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements. Le porteur indique que le modèle peut provoquer des atteintes cutanées à partir de quatorze semaines, puis une perte de poids et une mobilité réduite, pour étudier une sclérodermie déclenchée par la silice. Toutes sont tuées afin de prélever sang, poumon, rate et peau, une partie l'étant simplement faute de porter le génotype recherché.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques. Une partie des animaux seront euthanasiés car sans génotype d'intérêt.

Remplacement

Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.

Cinq à sept minutes d'incision de la peau et des tissus sous-cutanés jusqu'à la trachée, une injection de molécule fibrosante, deux points de suture : 424 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever poumons et sang. Le porteur annonce des difficultés respiratoires, une perte de poids et une mortalité liée à la fibrose entre le septième et le quatorzième jour, qu'il chiffre à moins de 10 % des effectifs. Le projet cherche à comprendre le lien entre l'altération du gène ZCCHC8 et la fibrose pulmonaire idiopathique, faute d'échantillons humains disponibles en quantité. Des organoïdes sont déjà utilisés en parallèle, mais le porteur conclut que la souris reste un animal "incontournable" pour modéliser la réponse d'un organe entier.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique, ou FPI, est une maladie des poumons qui rend la respiration de plus en plus difficile. "Idiopathique" veut dire que l'on ne connait pas précisément l'origine de cette maladie. Parfois, cette maladie se retrouve dans certaines familles. Aujourd’hui, il n’existe pas de médicament qui peut guérir cette maladie, sauf si on remplace les poumons par une greffe. La FPI débute lorsque certaines cellules des poumons, appelées "pneumocytes de type 2", ne fonctionnent pas bien. Cela peut être à cause de l’âge, de l’environnement ou d’un problème dans les gènes. Chez certaines personnes, un gène qui s’appelle ZCCHC8 est altéré, et cela pourrait être une des raisons pour lesquelles elles ont une fibrose pulmonaire. Nous ne comprenons pas bien le lien entre l'altération de ce gène et la fibrose pulmonaire. Comme il est très difficile d’avoir des échantillons de poumons de personnes malades pour les étudier, nous utilisons des souris spéciales qui ont le même problème que les patients dans leurs gènes. Cela nous aide à mieux comprendre comment la maladie se développe et, peut-être un jour, à trouver un traitement. L’objectif de cette recherche est donc de comprendre ce qui se passe dans les poumons quand le gène ZCCHC8 ne fonctionne pas bien.

Bénéfices attendus

Cette étude, réalisée d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins, assurera une meilleure connaissance des mécanismes de la fibrose pulmonaire chez l’Homme.

Procédures

En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose au niveau de la trachée après incision de la peau et des tissus sous cutanés. Après incision, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées après anesthésie profonde, après quoi des prélèvements serons réalisés.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Dans le modèle de fibrose, il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose à partir du 7ème jour, et jusqu'au 14ème jour après injection. Cette mortalité est en général < 10% des effectifs. Une fréquence respiratoire anormalement élevée ainsi qu’une gêne respiratoire sont des conséquences possibles de la fibrose. Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est également possible. Une altération de l'état général avec perte de poids est possible.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement sanguin et des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes cellulaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules issues d’autres tissus/organes via la circulation sanguine notamment. Ces affirmations se basent sur des discussions avec des confrères, des conférences en pneumologie/immunologie et une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2000-2023. Il faut noter que des méthodes alternatives comme les organoïdes (culture cellulaire en laboratoire) sont déjà utilisées dans notre projet mais ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ce modèle n’intègre qu’un nombre restreint de sous-types cellulaires pulmonaires et ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement des cellules extrapulmonaires (c'est à dire l'arrivée de cellules non pulmonaires dans le poumon).

Réduction

Le nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures expérimentales. Des antalgiques seront donnés en pré et post opératoire. Pour l'ensemble des souris, l'enrichissement consistera en la mise en place de coton et d’un tunnel de change dans les cages, et à partir de J7, d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment de l'euthanasie. Les souris seront euthanasiée. Cette surveillance clinique sera effectuée quotidiennement par l'expérimentateur. Elle se base sur une grille de points limites évaluant l’apparence de l’animal (yeux, poils, oreilles, posture...), son comportement (motricité, apathie (activité réduite), posture de repli, détresse respiratoire, hypothermie...), la diminution du poids et la cicatrisation. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En cas d'atteinte des points limites, une euthanasie sera effectuée par une méthode réglementaire.

Choix des espèces

Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose pulmonaire humaine. Les souris offrent également la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et d’étudier spécifiquement le rôle d’un gène donné dans le poumon. Enfin, le modèle murin permet la mise en place de modèles pré-cliniques incontournable pour le développement précoce de thérapies innovantes. Actuellement, pour la fibrose pulmonaire, il n’existe pas de stratégie alternative pour modéliser la réponse d’un organe dans le contexte d’un organisme entier. La souris est donc un animal incontournable pour apporter des réponses à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 11 et 13 mois (étude du phénotype pulmonaire à l’état basal) et 7 et 16 semaines (modèle « bléomycine »). La fibrose pulmonaire est une pathologie évoluant en fonction de l'age de l'individu nécessitant une fourchette d'age large pour les animaux utilisés au cours de ce projet.

Greffer dans les bronches des cellules souches humaines corrigées génétiquement conduit ici à utiliser 10 mini-porcs, tous tués à l'issue pour analyses histologiques, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie sous anesthésie pouvant durer deux heures trente, deux séances d'imagerie d'une heure trente et huit prélèvements sanguins sous anesthésie de trente minutes. Le porteur liste les risques attendus, bronchite, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aiguë, pneumothorax, pleurésie et signes de sepsis, puis les juge "extrêmement réduits" grâce aux traitements préventifs. Le bénéfice qu'il avance, fournir les données d'un futur essai clinique sur la dyskinésie ciliaire primitive, dépend entièrement de résultats "favorables" encore à obtenir.

Objectifs

La majorité des maladies pulmonaires d’origine génétique, comme certaines formes de mucoviscidose, n’ont pas encore de traitement curatif. Les tentatives de traitement par inhalation de virus modifiés n’ayant pas donné les résultats espérés, une nouvelle approche combinant thérapie cellulaire et thérapie génique a vu le jour. Nous avons mis au point une méthode simplifiée pour créer des cellules souches à partir du sang du patient, les corriger génétiquement, puis les transformer en cellules capables de régénérer les voies respiratoires. Cette technologie ouvre la voie à des traitements innovants pour les maladies pulmonaires génétiques. Pour valider cette approche, nous l’appliquons actuellement à une maladie rare appelée dyskinésie ciliaire primitive (PCD).

Bénéfices attendus

Les bénéfices concernent le traitement de la dyskinésie ciliaire primitive (PCD). Si les résultats sont favorables, notre travail pourrait permettre à conduire un futur essai clinique, en fournissant des données qui seront nécessaires à la mise en place d'un essai clinique.

Procédures

Les animaux sont soumis à : -Procédures chirurgicales : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 2h30, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux; - Imagerie (2 fois) : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 1h30; - Prélèvements sanguins (8 fois) : sous anesthésie rapide de 30 minutes maximum.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la greffe des cellules, plus précisément au conditionnement excessif (risque de dommage des bronches) ou bien insuffisant, lesquelles pourront induire la mort des cellules greffées. Une mort cellulaire excessive pourrait être la conséquence d'une dissociation unicellulaire des progéniteurs bronchiques humains dérivés des iPSC dans le contexte d'une stase intra bronchique, d'un piégeage du mucus ou, à l'inverse, d'une toux et d'expectorations après administration. Les risques principaux sont également : bronchites, pneumonie, saignement, détresse respiratoire aigue, pneumothorax, pleurésie, signes de sepsis. Ces risques à priori paraissent extrêmement réduits étant donnés les prémédications prophylactiques périprocédures (antibiothérapies, corticothérapie, anti tussifs). La simple mesure des constantes, et la réalisation d’une tomodensitométrie visant à évaluer ces risques sont ainsi prévues. Entre autres, des complications liées à la chirurgie ou à l'anesthésie ou les effets indésirables du traitement immunosuppression peut être également observées. De plus, une adaptation du protocole en termes de médicament anesthésique, de choix de traitement, etc. sera éventuellement proposée pour la deuxième série d'animaux (8 mini-pigs).

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative de remplacement, car l’objectif de cette étude est d’évaluer la toxicité ainsi que l’efficacité sur un modèle animal avant passage chez l’homme.

Réduction

Au total, 10 animaux seront utilisés (2 et 8). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables, la toxicité et efficacité de xénogreffe de progéniteurs d'épithélium bronchique dérivés d'iPSC en "conditions réelles".

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée après chaque anesthésie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des porcs. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés : anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et/ou morphiniques. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. Des examens d'imagerie (une bronchoscopie et le scanner) et sanguins viendront compléter cette évaluation.Concernant l'immunosuppression, le traitement par ciclosporine sera administré avec l’alimentation, afin de limiter le stress et de ne pas perturber les animaux. De plus, compte tenu de l’immunosuppression, des mesures de biosécurité seront renforcées : un équipement de protection individuelle propre sera utilisé pour réduire le risque infectieux. Enfin, un suivi biologique régulier (formule sanguine complète et biochimie) permettra d’adapter rapidement la posologie en fonction des effets observés, limitant ainsi les effets secondaires.

Choix des espèces

Nous utiliserons des mini-porcs qui ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain et peuvent facilement être immunosupprimés pendant plusieurs semaines grâce à la ciclosporine permettant une xénogreffe. De plus, seul un grand modèle comme le porc peut fournir une situation clinique similaire à celle rencontrée chez l'homme, notamment en ce qui concerne l'accès par fibroscopie lobaire et la grande surface à traiter. Les mini-pigs à l'âge adulte (8 à 10 mois) ont une anatomie pulmonaire proche de celle de l'humain (5 lobes, accès facile à l'endoscope humain).

Trois vaccinations par injection et deux injections de sensibilisation sous anesthésie, trois prélèvements sanguins, puis trente minutes de mesure des capacités respiratoires : 7 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie terminale pour prélever leurs organes. Elles sont rendues allergiques puis traitées, afin de tester avant tout essai chez l'humain des vaccins d'immunothérapie contre l'asthme allergique. Le porteur ne détaille pas comment il arrive à 7 200 animaux et se borne à dire que l'effectif tient compte des paramètres analysés, des effets attendus et de la variabilité du modèle. Il décrit les nuisances au conditionnel, des douleurs locales de moins de cinq minutes et une gêne respiratoire qui pourrait durer moins d'une demi-heure, sans préciser ce que produit chez une souris une réaction asthmatique provoquée.

Objectifs

L'organisation mondiale de la santé a classé les maladies allergiques au quatrième rang mondial des affections, considérant que ces pathologies représentent un problème majeur de santé publique en termes de qualité de vie, de perte de jours de travail, de coût médicamenteux, voire de mortalité. Parmi les approches thérapeutiques proposées pour traiter les allergies respiratoires de type I, l’immunothérapie allergique est le seul traitement qui permet de réorienter la réponse du système immunitaire vers un état de tolérance spécifique de l’allergène. Le but du projet proposé est de permettre une évaluation préclinique de l’efficacité des vaccins thérapeutiques et de réaliser des tests de sécurité des produits en développement.

Bénéfices attendus

Ce projet, d'une durée de 5 ans va contribuer, avant toute étude clinique chez l’homme, à la sélection des principes actifs, et des modes d’administration qui composeront les vaccins du futur afin d’induire la tolérance vis-à-vis des allergènes responsables de la maladie chez les patients allergiques.

Procédures

Le projet comporte des gestes ou techniques expérimentales complémentaires. Des vaccinations par injection au nombre de 3 sous anesthésie flash d’une durée de moins de 5 minutes chacune sont réalisées. Une sensibilisation est obtenue par deux injections d’une durée de moins de cinq minutes chacune. Trois prélèvements de sang sous anesthésie sont aussi réalisés, la durée de chaque prélèvement ne dépasse pas quelques minutes. Des mesures des capacités respiratoires des animaux par des méthodes non invasives d’une durée de 30 minutes par protocole sont aussi effectuées pour vérifier l’efficacité des traitements utilisés

Impact sur les animaux

le projet comporte des gestes ou techniques expérimentales comme des traitements par injections dans les muscles et peuvent possiblement causer des douleurs locales d’une durée inférieur à 5 minutes, la mesure des capacités respiratoire des animaux peut possiblement engendrer du stress et une gêne respiratoire de courte durée (moins de 30 minutes). La contention des animaux pour traitement peut possiblement, aussi engendrer du stress de courte durée.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés sous anesthesie terminale en fin de protocole pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Il est indispensable de recourir à un modèle animal car il est impossible de reconstruire un processus de sensibilisation/désensibilisation dans des cultures de cellules Seules les études in vivo permettent d'obtenir des résultats sur l'efficacité. Toutes les molécules étudiées ont été présélectionnées en amont avec des méthodes, biochimiques et des tests cellulaires in vitro

Réduction

Des pré-études de caractérisation et des tests in vitro de présélection sont réalisés en amont afin de ne tester sur les animaux que les formulations/traitements validés par ces pré-études. Si un principe actif ou une formulation ne satisfait pas aux exigences du cahier des charges, l’évaluation s’arrête ce qui aura pour conséquence de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’expérimentation. Les études publiées et les directives éthiques recommandent également de réduire au minimum le nombre d'animaux tout en garantissant la validité statistique. Le nombre d’animaux pour le projet a été déterminé en tenant compte des paramètres à analyser, des effets des traitements attendus et de la variabilités liée au modèles animaux, cela permet de s’assurer que l’on ne manque pas de puissance et de fiabilité pour ne pas à refaire les experiences.

Raffinement

Si au cours des experiences, des signes d’alerte, la surveillance sera accrue, les animaux seront pesés et des mesures correctives seront apportées : antalgiques s'il y a des signes de douleurs, séparation et soin local s’il y a des blessures entre congénères. Des anesthésies spécifiques sont utilisées pour limiter le stress et la douleur lors des injections et des prélèvements et des analgiques sont appliqués. Une grille de points limites, spécifique et suffisamment alerte et précoce est aussi élaborée, afin de limiter au minimum la douleur chez l’animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ce type d’expérimentation parce que son système immunitaire, très bien décrit est très proche de celui de l’Homme en termes de composition et fonctionnement. Aussi, Il existe une bibliographie très riche sur les modèles d’étude de l’allergie et de son traitement sur laquelle nos protocoles, analyses et interprétations peuvent s’appuyer ; ces études sont reconnus par la communauté scientifique internationale. Nous traillons avec des animaux adulte afin d’étudier les réponses immunologiques sur un système immunitaire mature.