Troubles respiratoires
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Tests de molécules sur un modèle souris du syndrome d’Ondine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Les souris utilisées portent une modification génétique qui reproduit le syndrome d'Ondine et les empêche de respirer normalement, ce qui les expose à des épisodes d'hypoxie dès les premiers jours de vie. 2 028 souris vont être utilisées, 1 008 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 020 un niveau léger. Les nouveau-nés sont anesthésiés sur de la glace, séparés de leur mère, injectés, puis placés deux fois par semaine trente minutes dans une enceinte où l'air est enrichi en dioxyde de carbone, et les femelles gestantes reçoivent une injection. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, au terme de tests portant sur cinq molécules mises au point par une société privée.
Objectifs
Dans le syndrome d’Ondine (encore appelé syndrome d’hypoventilation centrale congénitale), les patients présentent un dysfonctionnement central du contrôle nerveux responsable de la respiration automatique. Cela se traduit notamment par leur incapacité à respirer de façon autonome notamment durant les périodes de sommeil, nécessitant une assistance ventilatoire qui leur est vitale. Nommée en référence à la nymphe d’Ondine de la mythologie grecque, le syndrome d’Ondine est une maladie génétique rare dont l’incidence est de 1 pour 200 000 naissances vivantes en France et la prévalence estimée à 1/550 000. La caractérisation d'un nouveau modèle murin du syndrome d'Ondine a été réalisée sous une précédente autorisation de projet. Sa proximité physiopathologique avec l’Homme nous permet maintenant de l'utiliser comme un modèle préclinique en collaboration avec une société qui développe des traitements novateurs pour des patients souffrant de maladies neurologiques sévères. Notre expérimentation consistera à évaluer l'efficacité de nouvelles molécules candidates mises au point en s’appuyant sur l'analyse de la survie et la comparaison de paramètres respiratoires entre deux lots d'animaux : animaux modèles du syndrome d'Ondine traités ou non
Bénéfices attendus
Les souris modèles du syndrome d’Ondine récaptitulent le phénotype des patients. La stimulation pharmacologique, via les molécules candidates, pourrait potentiellement améliorer la respiration de ces souris nouveau-nés, juvéniles ou adultes en restaurant une réponse à l’hypercapnie. Si une molécule candidate est efficace, nous souhaitons décrypter son mécanisme d’action au niveau de la commande centrale respiratoire. Nous souhaitons également investiguer ce mécanisme selon l’âge car certaines souris modèles du syndrome d’Ondine survivent et récupèrent naturellement une faible réponse à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre la pathologie et son mode d’action. Les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient constituer un socle de connaissances pour aider à la prise en charge de patients atteints du syndrome d’Ondine.
Procédures
Les nouveaux nés seront soumis à une anesthésie sur glace (1 fois, environ 5 min), des injections (une ou plusieurs fois, à déterminer selon l'effet des molécules), - les enregistrements respiratoire en condition normales ou d'air enrichi en CO2 (30 min, 2 fois par semaine), - Les femelles gestantes recevront une injection intra péritonéale ou sous cutanée (une seule fois, moins d'une minute)
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les P0-P5 sont : -hypoxie du au phenotype dommageable - du stress lié à la séparation de la mère, à l'induction de l'anesthésie, aux injections et aux enregistrements pléthysmographiques - de la douleur légère et ponctuelle liée aux injections Les nuisances pour les adultes sont un stress et une douleur légers et ponctuels liés aux injections.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Notre projet consiste en l’étude de traitements pharmacologiques sur une pathologie néonatale qui ne peut être reproduit en culture cellulaire car nous travaillons sur le système respiratoire. L’effet ainsi que la toxicité des molecules a déjà été vérifié au niveau cellulaire et doit maintenant être testé sur un système complexe vivant.
Réduction
Notre projet testera l'efficacité de 5 molécules prometteuses, sélectionnées parmi plusieurs molécules candidates. Nous avons choisi la technique d'analyse de la respiration permettant d’enregistrer les animaux longitudinallement et donc de réduire le nombre d’animaux. Par ailleurs, nous avons utilisé une approche statistique pour définir le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
Raffinement
L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées dans des cagescomprenant 2 enrichissement différents (dôme et bandelettes de cartons), eau et nourriture ad libitum. Après injection, un suivi rigoureux et précis sera réalisé, les nouveau-nés injectés seront mis sur un tapis chauffant et seront séparés le moins de temps possible de leur mère. Les femelles gestantes seront manipulées avec douceur seront prises à l’aide de leur enrichissement et non par prise physique directe. Des points limites précoces avec un arbre décisionnel ont été établis.
Choix des espèces
Les rongeurs sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la commande respiratoire. Les modèles de souris génétiquement modifiés permettent de modéliser les variants rencontrés chez les patients. Le modèle murin est donc actuellement le modèle le plus adapté à l’étude de cette pathologie. Dans la grande majorité des cas, le syndrome d’Ondine se révèle dès la naissance. Le diagnostic est réalisé chez le nouveau-né, dès ses premiers jours de vie. Nous souhaitons donc utiliser les souris modèles du syndrome d'Ondine dès la naissance. En effet, si une molécule candidate est efficace, notre approche sera transférable à l'homme.
Développement d’un système automatisé de surveillance et de régulation du glucose et du pH dans un modèle porcin de poumons perfusés ex-vivo
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système respiratoire
Endormis puis intubés sans jamais être réveillés, 35 cochons de 50 kilos sont ouverts par sternotomie pour que leurs poumons soient prélevés en une heure. Les procédures se déroulent sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Les poumons sont ensuite perfusés hors du corps, pour mettre au point un système automatisé de régulation du pH et du glucose censé prolonger la durée pendant laquelle un greffon reste utilisable. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu puisque l'animal ne se réveille pas, et retient le porc charcutier de 50 kilos parce que ses poumons et ses vaisseaux ont la taille de ceux d'un être humain, ce qui permet d'utiliser la machine de perfusion conçue pour la clinique.
Objectifs
Ce projet vise à améliorer la qualité des poumons destinés à la transplantation. Aujourd’hui, beaucoup de greffons ne peuvent pas être utilisés parce qu’ils sont jugés trop abîmés. Il existe une technique appelée perfusion pulmonaire ex vivo (PPEV), qui consiste à faire circuler un liquide dans les poumons, à l’extérieur du corps, pour les évaluer, les préserver, voire les « réparer » avant la greffe. Notre objectif est de mieux contrôler deux paramètres clés pendant cette perfusion : le pH (reflet du niveau d’acidité) et le niveau de glucose (sucre), essentiels au bon fonctionnement des cellules. Nous voulons développer un système automatisé capable de mesurer et de réguler ces paramètres en temps réel, pour que les poumons soient maintenus dans des conditions proches de celles du corps humain le plus longtemps possible. En effet, plus la durée de la perfusion hors de corps sera longue, plus les poumons auront le temps de se réparer, naturellement ou à l’aide d’intervention humaine (chirurgie, traitement). Ce « temps de réparation bonus » permettra de tester des traitements anti-rejets ou des thérapies rendant les poumons résistants aux infections, afin d’améliorer les résultats de la greffe.
Bénéfices attendus
En contrôlant mieux les niveaux d’acidité et de sucre pendant la perfusion, nous espérons : - Améliorer la qualité des poumons avant transplantation, même s’ils sont initialement jugés « limite » (organes un peu abîmés, dits marginaux) ; - Augmenter le nombre de greffons utilisables, ce qui pourrait sauver plus de vies en réduisant le temps d’attente pour une greffe ; - Réduire les complications après la greffe, en préservant la fonction des poumons et en évitant certains dommages cellulaires ; - Prolonger le temps pendant lequel un greffon peut être conservé, facilitant l’organisation de la transplantation; - Permettre de traiter les greffons avant la greffe, par exemple en réparant certaines lésions ou en apportant des traitements ciblés (avec des cellules ou des gènes) ; - Faciliter et fiabiliser la procédure pour les équipes médicales, grâce à un système automatisé qui limite les erreurs et améliore la reproductibilité. À plus long terme, ce système pourrait aussi être adapté à d’autres organes (comme le foie ou le rein), et contribuer à faire progresser la médecine de la transplantation dans son ensemble.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés profondément à l'aide de 2 injections permettant de les endormir et de supprimer toute douleur ou stress, puis seront intubés et ventilés. Une fois l’animal sous anesthésie générale profonde, nous prélèverons les poumons par voie chirurgicale (sternotomie) selon la méthode de prélèvement pulmonaire de l’Agence de la Biomédecine (60min).
Impact sur les animaux
S'agissant de procédures expérimentales réalisées sous anesthésie générale balancée sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure ou en cas d'échec de l'anesthésie.
Devenir
Pour réaliser notre étude, nous avons besoin de récupérer les poumons des animaux. De ce fait, la procédure consiste en une anesthésie générale suivie d'un prélèvement des poumons, ne permettant pas le réveil de l'animal.
Remplacement
Il n’existe pas, à notre connaissance, de modèle expérimental in silico ou in vitro pouvant servir à la mise au point d’un dispositif médical de perfusion d’organe thoracique. Le matériel dont nous nous servons (machine de perfusion, avec sa connectique) est celui utilisé chez l’homme afin d’assurer une bonne applicabilité future, ce qui impose d’utiliser des poumons similaires anatomiquement et physiologiquement à ceux d’un humain.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé sera strictement limité au nombre nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables, en prenant en compte les éventuels ajustements de protocole et pertes de greffons dûes à l'apparition d'oedèmes avant la fin de la durée de perfusion visée.
Raffinement
Avant d’entrer dans le protocole, les animaux auront une semaine minimum d’acclimatation dans l’animalerie et feront l’objet d’un contrôle quotidien par un personnel qualifié (zootechnicien). Lors de ce contrôle, des observations basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales attendues aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite) seront réalisées. Ces contrôles permettront de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. L’environnement sera adapté de façon à réduire l’angoisse des animaux : -Hébergement en groupe pour contact régulier entre congénères -Enrichissement de l’environnement des animaux avec des copeaux (activité de fouissement) -Activités avec plusieurs dispositifs d’enrichissement (medecine ball, planche à gratter ...) -Pesée hebdomadaire réalisée sous forme de jeux, sans contention ni contrainte, avec récompense (portion de fruit).
Choix des espèces
La machine de perfusion que nous utilisons est faite pour des organes humains et impose donc d’utiliser des organes similaires, tant sur le plan des paramètres de perfusion que de la connectique. Le porc charcutier a des poumons proches de ceux d’un humain sur le plan anatomique et physiologique. L’artère et les veines pulmonaires sont du même ordre de taille (ce qui facilite en particulier la cannulation, la pneumoplégie, puis la perfusion isolée). Sa physiologie cardio-pulmonaire est également similaire (fréquence cardiaque 100 battements/mn, débit cardiaque 3-5 L/mn, pression artérielle pulmonaire moyenne < 15mmHg. Le porc permet donc de réaliser une modélisation chirurgicale et expérimentale de haute fidélité pour une meilleure applicabilité des résultats à la pratique clinique. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une physiologie cardio-pulmonaire semblable à l’homme et des poumons du même ordre de grandeur.
Potentiel thérapeutique de l’aérosolisation des nanoparticules d’apolipoprotéine A1 enrichies en alpha-1-antitrypsine chez la souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
La procédure s'arrête si le seuil de douleur mécanique d'une souris descend sous 0,3 gramme, mesuré au filament de von Frey. 246 souris sont utilisées, dont 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Un emphysème pulmonaire leur est installé sur quatorze jours, elles subissent une biopsie de la queue à six jours de vie, puis des aérosolisations pendant lesquelles elles sont suspendues par les incisives à un panneau incliné à 45 degrés. Le bénéfice avancé, une thérapie inhalée qui remplacerait les perfusions hebdomadaires des personnes déficientes en alpha-1-antitrypsine, reste au stade de la preuve de concept.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs : EU1 et EU2. Le déficit en alpha-1-antitrypsine (AAT) est une maladie génétique rare causée par une mutation du gène SERPINA1, responsable de la production de la protéine AAT. L'AAT est principalement synthétisée dans le foie et sécrétée dans la circulation, où son rôle principal est de protéger le tissu pulmonaire contre l'action de différentes enzymes. Ce déficit en AAT est un facteur de risque au développement d'un emphysème pulmonaire, caractérisé par une dégradation progressive et irréversible du tissu alvéolaire, entraînant une diminution de la fonction respiratoire et un risque accru de mortalité. Chez les patients souffrant de cette maladie, l'administration intraveineuse d'AAT réduit la perte annuelle du tissu pulmonaire et ralentit le déclin de la fonction respiratoire. Cela étant, ce traitement n'a aucun effet sur des épisodes d'aggravations des symptôles et donc l'état de santé. Ce projet vise à évaluer un nouveau traitement reposant sur l'aérosolisation de l'AAT, vectorisée dans des nanoparticules lipidiques. Ces nanoparticules ont des propriétés protectrices (anti-inflammatoire, anti-oxydante et anti-infectieuse). Ces effets protecteurs, combinés avec ceux de l'AAT, constituent une thérapie prometteuse pour laquelle l'inhalation permettra une action directe sur les poumons. Ainsi, ce projet qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, a le potentiel de fournir une preuve de concept pour le développement d'une thérapie innovante pour les patients déficients en AAT.
Bénéfices attendus
Recherche médicale : il existe un besoin d'améliorer les normes de soins pour les maladies pulmonaires liées à la déficience en alpha-1-antitrypsine (AATD). L'injection intraveineuse d'AAT a montré une efficacité limitée et les injections hebdomadaires constituent une contrainte sur la qualité de vie des patients. La voie inhalée est une stratégie thérapeutique prometteuse qui améliorera l'observance et l'autonomie des patients. Des études précliniques et cliniques de ces dernières années ont démontré la capacité des nanoparticules lipidiques inhalées à délivrer localement divers médicaments dans les poumons, pour le traitement de maladies pulmonaires telles que les cancers pulmonaires, les maladies pulmonaires obstructives et les infections respiratoires. Les nanoparticules lipidiques ont permis d’atteindre cet objectif tout en améliorant la stabilité des médicaments, en réduisant la toxicité systémique et en permettant une concentration locale plus élevée du médicament dans les poumons. Ici, nos particules ont aussi un intérêt thérapeutique, en potentialisant les effets bénéfiques des nanoparticules à celle de l’AAT. Coûts des soins de santé : des traitements efficaces contre l'emphysème pulmonaire lié à l'AATD et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO ; 3ème cause de décès dans le monde) pourraient réduire les coûts des soins de santé associés aux hospitalisations et à la gestion à long terme de ces maladies chroniques. Les perspectives du projet sont de mener un essai clinique multicentrique avec des médecins du réseau RespiFIL (Filière Maladies Respiratoires Rares) pour évaluer si l'aérosolisation des nanoparticules enrichits en AAT peut améliorer la santé des patients.
Procédures
Dans l'EU1/2 : Les animaux auront une biopsie de queue à 6 jours et seront soumis à des aérosolisations à l'âge adulte. Parmi les animaux exposés, certains recevront des nanoparticules et ou du LPS et certains auront des mesures de leur fonction respiratoire. Les procédures d’aérosolisations et d’injections intraveineuses dure environ 1 minute et la procédure de mesure de fonction respiratoire dure environ 10 minutes. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale. Dans l'EU2/2 : Les animaux seront soumis à des aérosolisations de nanoparticules radiomarquées. La procédure d’aérosolisation dure environ 1 minute puis la mesure de la scintigraphie se déroule à 6h, 24h et 48h. Des prélèvements sanguins (caudales) sont aussi réalisés à ces temps. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
- Nuisance modérée pour la biopsie de queue (douleur légère de courte durée). - Nuisance modérée pour l'instillation intratrachéale. Les souris anesthésiées sont retirées de la chambre d’induction et suspendus par leurs incisives sur un panneau en plexiglas en position couchée, avec une inclinaison d’environ 45 degrés. La durée totale de la procédure d’aérosolisation est d'environ 1 minute. - Nuisance sévère pour la mise en place de l'emphysème pulmonaire. Nous évaluerons le seuil à la douleur dans l’étude pilote en utilisant le test de Von Frey (stimuli mécaniques). Ce test mesure la réponse de retrait à des filaments appliquant une pression mécanique. Chez des souris avec emphysème, on pourrait s'attendre à une hypersensibilité mécanique (réduction du seuil). Une évaluation comportementale sera faite en complément. Si le seuil de douleur est très faible (allodynie mécanique
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d’organes
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de l’emphysème pulmonaire ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de dégradation et de fibrose du tissu pulmonaire impliquent plusieurs types cellulaires : neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales, fibroblastes, pneumocyte de type 1 et 2 entres autres. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de l’emphysème tel que l’inflammation et le stress oxydatif. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Le nombre d’animaux de cette étude se base sur des publications scientifiques ayant décrit des résultats significatifs avec des approches similaires. Chaque expérimentation sera scindée en trois expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont significatifs avec les deux premières expériences (n=8 au lieu de 12 dans l’objectif 2.2 par exemple ; analyses statistiques : two-tailed unpaired t test ou two-way ANOVA). En effet, les résultats, s’ils sont homogènes, peuvent être significatifs avec 8 souris. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le groupe d'animaux suivant.
Raffinement
Pour garantir un environnement optimal, les animaux seront logés dans des cages offrant un espace suffisant, avec un maximum de 5 animaux par cage. Cet aménagement limitera au maximum les contraintes subies et permettra un comportement normal. De plus, l’environnement sera enrichi avec des matériaux pour se nicher et jouer, contribuant ainsi à leur bien-être. Les animaux seront observés de façon continue pendant les 30 premières minutes après l’aérosolisation, puis 3 à 6 fois par jour afin de nous assurer de leur bien-être et de ne pas laisser un animal en souffrance. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté immédiatement au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée, conformément aux protocoles en vigueur pour minimiser la douleur et le stress des animaux. Nous observerons et analyserons divers points limites spécifiques pour évaluer leur bien-être, tels que : 1. Altération du comportement : signes d'apathie, d'agressivité, d'isolement, ou réduction drastique de l'activité normale. 2. Nutrition anormale : incapacité à se nourrir ou à boire normalement. 3. Perte de poids : surveillance régulière du poids pour détecter toute perte significative. 4. Aspect physique : poil ébouriffé, yeux fermés, respiration laborieuse, posture courbée. Si l'un de ces paramètres ou points limites est atteint, cela sera signalé immédiatement au vétérinaire référent. Celui-ci évaluera la situation et pourra décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal pour limiter ses souffrances, conformément aux règles éthiques en vigueur. Pour compléter le raffinement des procédures, une injection d’analgésique sera réalisée avant chaque intervention et chaque fois que la souris démontrera des signes de douleurs. La mise en place d’une étude pilote permettra aussi d’améliorer les manipulations de l’expérimentateur. Concernant le transport des souris de l’EU1/2 vers l’EU2/2, le transporteur agréé s'engage à réunir toutes les conditions pour assurer la sécurité des animaux et leur bien-être (véhicule climatisée avec des cages de transports agrées sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire, ajout de croquettes humidifiées et paille). Le choix d'un transport dédié uniquement à nos souris permet aussi d'assurer un trajet rapide d'environ 1 heure (80km).
Choix des espèces
La structure et la fonction du système respiratoire des souris présentent des similitudes avec celles des humains, bien que les différences existent en termes de taille et de complexité. Les souris possèdent des bronchioles, des alvéoles, et des cellules immunitaires pulmonaires similaires à celles des humains, ce qui permet d'étudier les effets des traitements inhalés. Les souris montrent des réponses inflammatoires et immunitaires comparables à celles des humains lorsqu'elles sont exposées à des agents pathogènes ou à des stimuli nocifs, permettant ainsi d'évaluer les réponses thérapeutiques des nanoparticules. Les modèles murins d'emphysème sont bien établis et peuvent être induits par diverses méthodes telles que l'exposition à la fumée de cigarette, l'administration d'élastase ou d'autres agents chimiques. Ici, les souris AAT KO reproduisent les caractéristiques clés de l'emphysème humain, telles que la destruction des alvéoles et la perte d'élasticité pulmonaire. Animaux adultes entre 8 et 10 semaines. À l'âge de 8 à 10 semaines, les souris ont atteint une maturité physiologique qui leur permet de mieux refléter les caractéristiques pulmonaires des adultes humains. Les structures alvéolaires et les voies respiratoires sont pleinement développées, ce qui est crucial pour étudier les changements pathologiques induits par l'emphysème. Les souris de cet âge possèdent un système immunitaire mature mais encore flexible, permettant une réponse inflammatoire et immunitaire comparable à celle observée chez les adultes humains. Cela est important pour étudier les mécanismes inflammatoires et immunopathologiques de l'emphysème. Enfin, à cet âge, les souris ont un niveau d'activité physique, de métabolisme et de croissance relativement stable, ce qui minimise les facteurs confondants qui pourraient influencer les résultats expérimentaux.
Pré-conditionner le donneur pour améliorer la clinique de la transplantation pulmonaire : évaluation en modèle rat
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Quarante-cinq minutes de chirurgie pour prélever un poumon sur 150 rats donneurs, deux heures pour le greffer sur 150 rats receveurs : 300 rats vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les donneurs sont mis à mort avant le prélèvement du poumon, les receveurs trois jours après la greffe pour mesurer la dysfonction du greffon et la réponse immunitaire. Jusqu'à 90 d'entre eux reçoivent auparavant une injection de corticoïdes dans la veine de la queue quinze heures avant l'opération, et 30 une administration directe dans la trachée. Le porteur écrit que les effets indésirables de cette administration trachéale "ne sont pas bien connus" et qu'une difficulté à respirer au réveil est envisageable.
Objectifs
La transplantation pulmonaire est souvent le dernier espoir pour les personnes atteintes de graves maladies respiratoires. Malheureusement, même si de plus en plus de patients ont besoin de cette opération, les résultats restent décevants : seuls 60 % des patients sont encore en vie cinq ans après la greffe. L’un des grands problèmes est qu’un grand nombre de patients développent, dès les premiers jours après l’opération, un dysfonctionnement du nouveau poumon peut ensuite entraîner des complications à long terme. Les recherches récentes en immunologie montrent que le stress subi par les cellules pendant l’opération joue un rôle important dans l’échec du greffon. Ce stress déclenche une inflammation, la mort de certaines cellules et attire des cellules du système immunitaire qui peuvent endommager le nouveau poumon. Aujourd’hui, pour éviter ces réactions, les médecins injectent des corticoïdes (anti-inflammatoires puissantes) au patient juste après la chirurgie. Notre projet vise à aller plus loin : nous pensons qu’il serait encore plus efficace de traiter le donneur, avant la greffe, avec ces corticoïdes. Pour tester cette hypothèse, nous allons utiliser un modèle bien connu de greffe de poumon chez le rat. Nous allons comparer plusieurs méthodes : traitement du donneur vivant avant le prélèvement, ou traitement du poumon une fois prélevé, pendant une phase où il est maintenu en vie artificiellement grâce à une machine. Cette dernière méthode permet d’utiliser des doses de médicament plus fortes, sans risque pour le reste de l’organisme. Nous testerons aussi plusieurs types de corticoïdes : la forme classique, mais aussi deux nouvelles versions conçues pour cibler plus précisément les cellules responsables de l’inflammation.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de montrer qu’un traitement du poumon du donneur, avant la greffe – soit directement sur le donneur (in vivo), soit sur l’organe une fois prélevé et maintenu en vie par une machine (ex vivo) – peut améliorer nettement les résultats de la transplantation. Le traitement réalisé sur le poumon en dehors du corps (ex vivo) pourrait être encore plus efficace, car il permet d’utiliser des doses plus fortes de médicaments anti-inflammatoires (corticoïdes) sans effets secondaires pour le reste du corps. Les résultats de ce projet pourraient ensuite servir à lancer une étude chez l’homme. Si les résultats sont positifs, cela pourrait changer les méthodes actuelles et grandement améliorer les chances de survie des patients greffés. Ce type de traitement pourrait aussi profiter à d’autres types de greffes, comme celles du rein, du foie ou du cœur. Ce projet permettra également de tester une approche innovante : l’utilisation de microparticules pour transporter les corticoïdes directement vers les cellules du système immunitaire responsables de l’inflammation. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie à un nouveau protocole de traitement des donneurs de poumons chez l’homme, et ainsi améliorer significativement la survie des personnes greffées. Enfin, ce travail représente une première en France : il permettra de mettre en place un modèle de greffe de poumon chez le rat, avec maintien de l’organe en vie en dehors du corps. Ce modèle pourra ensuite être utilisé pour tester d’autres traitements innovants, comme des thérapies cellulaires, géniques ou de nouveaux médicaments, et ainsi faire progresser encore davantage la médecine de la transplantation.
Procédures
Toutes les procédures appliquées aux animaux seront effectuées sous anesthésie générale : -injection une seule fois sur les animaux donneurs sur une durée de 5 minutes, maximum 90 animaux -administration du meilleur traitement, une seule fois, sur une durée de 15 minutes, sur max. 30 animaux donneurs -chirurgie pour récupérer le poumon donneur, 1 seule fois, durée de 45minutes, sur les animaux donneurs, 150 animaux -chirurgie pour transplantation du poumon, 1 seule fois, animaux receveurs, durée de 2h, 150 animaux
Impact sur les animaux
Pour les animaux donneurs : L’injection de médicament dans la veine de la queue est faite sous anesthésie générale 15h avant le prélèvement du poumon. Bien que la piqure n’induit pas une douleur ressentie pendant l’anesthésie, elle pourrait générer une douleur légère et passagère au réveil. Les effets indésirables dus à l’administration dans la trachée ne sont pas bien connus, on pourrait s’attendre a observer une difficulté à respirer après le réveil. Pour les animaux receveurs : Il est fréquent que les animaux aient un peu moins d’appétit pendant un ou deux jours après l’opération. Cela est souvent dû à l’anesthésie plus qu’à la chirurgie. Une cicatrice sur le thorax gauche peut, dans de rares cas, provoquer une gêne temporaire. Cette gêne disparaît généralement en 24 à 48 heures et n’empêche pas l’animal de manger ou de boire. Les problèmes respiratoires sont très rares, car l’autre poumon (le droit) continue de fonctionner normalement. Jusqu’à présent, aucune difficulté respiratoire n’a été observée dans les trois jours suivant la greffe. Enfin, une hémorragie interne pourrait survenir si les vaisseaux sanguins ne sont pas parfaitement refermés pendant l’opération. Des signes comme des saignements, une grande pâleur ou des difficultés à respirer seront surveillés de très près pendant la période de suivi de 3 jours post-transplantation. Une nuisance liée à l’hébergement individuel en post-greffe pourrait être générée, mais elle sera atténuée par le maintien de contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux.
Devenir
Tous les animaux donneurs seront mis à mort avant la récupération du poumon (n=150). Les animaux receveurs seront mis à mort pour évaluer les paramètres biologiques de dysfonction primaire du greffon, l’inflammation, et la réponse immunitaire.
Remplacement
Aucune méthode ne permet d’évaluer l’effet de la transplantation pulmonaire en raison des effets complexe de la chirurgie (sections, sutures), et des réponses au stress de nombreux types cellulaires (cellules de la structure du poumon, cellules des vaisseaux, cellules immunitaires) qui sont issus du donneur et qui rencontrent les cellules étrangères du receveur venues par la circulation sanguine. Cette complexité n’est strictement pas modélisable in vitro. Seule cette méthode permettra d’apprécier l’effet du traitement du poumon donneur (in vivo et/ou ex vivo) sur l’issue clinique de la transplantation.
Réduction
Nous avons pris toutes les mesures possibles pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette expérimentation. Cependant le nombre d'animaux par groupe ne doit pas être inférieur à 10, en raison de la nécessité d'obtenir des résultats fiables en tenant compte des variations inter-individus. Ce nombre est basé sur des expériences précédentes réalisées sur des porcs, sur l’expérience de nos collaborateurs, et des calculs d’estimation statistique.
Raffinement
L’état général des rats est surveillé quotidiennement : une fois par jour avant l'intervention, et trois fois par jour après la transplantation. Les animaux sont pesés avant l'intervention et trois jours après, au moment de l'euthanasie, ou plus fréquemment s’ils n’ont pas commencé à manger normalement. Un complément alimentaire hautement nutritif sera donné en post-transplantation et des hamacs chauffants seront installés dans les cages. Toutes les interventions sont réalisées de manière à réduire au maximum le stress et la douleur des animaux. Cela inclut l'anesthésie, la gestion de la douleur pendant et après l'opération, ainsi que l'utilisation de coussin ou de lampes chauffantes pendant la chirurgie. Un suivi systématique est mis en place pour évaluer la douleur des animaux et leur fournir des traitements appropriés. Des contrôles réguliers sont effectués pour minimiser la douleur, avec des évaluations trois fois par jour après l'opération. . Des points limites sont définis pour évaluer les paramètres de suivi, permettant ainsi de minimiser la douleur animale. Ces évaluations sont consignées sur des fiches de suivi pour chaque animal.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale de référence pour la transplantation pulmonaire. C’est également un modèle animal utilisé pour analyser la réponse biologique du poumon à la perfusion et pour évaluer l’effet du traitement chez le donneur directement. Il permet aussi d’employer des animaux dont la génétique est mieux maitrisée que celle du porc, ainsi que des animaux consanguins (tous les donneurs sont du même type génétique, tous les receveurs sont d’un autre type génétique). Le modèle rat est désormais maîtrisé et a été validé par plusieurs équipes internationales. Les animaux seront utilisés à l'âge de 70 à 85 jours, lorsqu'ils auront atteint un poids minimal de 300 g, suffisant pour garantir un développement adéquat des vaisseaux sanguins permettant la réalisation des sutures vasculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge de 70 à 85 jours, lorsqu'ils auront atteint un poids minimal de 300 g, suffisant pour garantir un développement adéquat des vaisseaux sanguins permettant la réalisation des anastomoses vasculaires.
Evaluation d’agents de transfection synthétiques pour le transfert de gènes par injection systémique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Suivre où se logent des agents de transfection synthétiques grâce à un ADN codant une protéine luminescente : 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le travail est présenté comme une étape vers le traitement de maladies génétiques comme la mucoviscidose, alors que la séquence injectée ne sert qu'à produire de la lumière. Chaque souris reçoit quatre injections, un prélèvement sanguin, trois pesées et quatre anesthésies, les seules atteintes décrites étant un stress de trente secondes et une douleur d'une quinzaine de secondes au point d'injection. Le porteur indique que le pouvoir transfectant de ces agents a déjà été vérifié sur plusieurs lignées cellulaires, et affirme que la biodistribution "nécessite le passage à un modèle souris".
Objectifs
Ce projet a pour but de développer et d’optimiser de nouveaux agents thérapeutiques pour des maladies génétiques comme la mucoviscidose. Ces agents non-viraux permettent le transport d'une séquence d'ADN de grande taille. Des tests in vitro d’efficacité et de toxicité de nos agents thérapeutiques ont été effectués sur des modèles cellulaires complexes et nous souhaitons maintenant tester leur efficacité et leur toxicité chez la souris. L'objectif de ce projet est de pouvoir évaluer la biodistribution de nos formulations pour en déterminer les organes cibles, pour ce faire, nous utiliserons une séquence d'ADN codant un gène permettant de générer de la lumière chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer la biodistribution et l'efficacité de transfection de nos nouveaux agents synthétiques grâce à l'introduction d'un gène de bioluminescence. Ce gène nous permet de suivre la diffusion de nos agents dans l'organisme de la souris et de valider le transfert de gènes. Les résultats obtenus nous permettront d'optimiser nos formulations actuelles afin d'obtenir les meilleurs résultats et d'en déterminer les organes cibles. De plus, ces tests nous permettrons de détecter d'éventuels effets toxiques jusqu'à 48h après injection par le dosage des enzymes du foie.
Procédures
Chaque animal sera pesé 3 fois en vigile lors de la procédure (~30 secondes par pesée). Au total, chaque animal recevra : -1 injection sous anesthésie de nos agents de transfection (~30 secondes) -2 injections sous anesthésie de notre solution de marquage (~30 secondes) -1 injection de solution de réhydratation en vigile (~30 secondes) -1 prélèvement de sang en vigile (~1 minute) -1 injection d'anesthésie et d'antidouleur (~30 secondes).
Impact sur les animaux
Un stress d’intensité légère peut être induit lors de la préhension des animaux pour la pesée par exemple (~30 secondes) et lors de l’induction de l’anesthésie (~1 minute). Les différentes injections peuvent engendrer aussi un stress ainsi qu'une légère douleur d'environ 15 secondes au niveau du site d'injection.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus.
Remplacement
Des études préliminaires afin de déterminer le pouvoir transfectant de nos agents synthétiques ont préalablement été réalisées sur différentes lignées cellulaires. Cependant, la complexité du vivant et la biodistribution ne peuvent pas être obtenu in vitro et nécessitent le passage à un modèle souris.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au maximum pour réaliser cette étude sans nuire aux objectifs initiaux et à l'obtention de tests statistiques robustes. Le nombre d'animaux par lot est un effectif nécessaire et suffisant, permettant d'utiliser des tests statistiques non paramétriques afin de pouvoir mettre en évidence, le cas échéant, des différences d'efficacité entre les agents de transfections utilisés.
Raffinement
Les animaux seront anesthésiés le temps de réaliser l'injection systémique ou d'acquérir l'image (soit environ 20 minutes) puis remis dans leur cage afin qu'ils puissent récupérer. Sur l'ensemble du projet, les animaux sont anesthésiés 4 fois. Les animaux seront surveillés tout le long de la procédure à l'aide d'une grille de soin adaptée. Durant la phase d'acclimatation, les souris seront habituées à la présence des manipulateurs pour diminuer les stress engendrés lors de la procédure. Des analgésies seront réalisés sur les animaux et ils seront suivis en appliquant des points limites strictes et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Il s’agit d'une espèce de référence au sein du laboratoire pour ce type d'étude. Lors des études précédentes, ces dernières étaient agées de 7 semaines, afin de pouvoir comparer les études entre elles, nous préfeérons garder le même âge pour les animaux.
Exploration de nouveaux agents radiopharmaceutiques couplant le diagnostic et la thérapie pour contourner la résistance des cancers aux traitements.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
Rats : 256
Pour tester des médicaments radioactifs censés à la fois repérer et détruire des tumeurs, 1 536 souris et 256 rats reçoivent deux injections de cellules cancéreuses, puis jusqu'à quatre injections de traceurs ou de traitements. Tous vont être tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, leurs organes étant prélevés pour vérifier au microscope ce que l'imagerie a montré. Ils passent jusqu'à huit sessions d'imagerie sous anesthésie, de 15 à 70 minutes chacune, subissent des prélèvements sanguins et parfois une ablation chirurgicale de la tumeur de vingt minutes, avec radiothérapie, chimiothérapie ou immunothérapie associées. Le protocole se déroule sur deux sites, ce qui impose à ces animaux porteurs de tumeurs un transport d'une heure au maximum, suivi d'une journée de récupération.
Objectifs
Aujourd'hui, de nombreuses résistances aux traitements conventionnels contre le cancer surviennent. La radiothérapie interne, qui utilise un atome radioactive pour cibler et détruire les cellules tumorales, a récemment montré des résultats impressionnants pour certains types de cancers, comme ceux de la prostate et les cancers neuroendocriniens. Néanmoins, cette nouvelle voie prometteuse est limitée par des phénomènes de résistances et l’apparition d’effets secondaires. Ces défis justifient l'exploration de nouvelles générations de médicaments radiomarqués plus attractifs, capables d’être utilisés en thérapie mais aussi en diagnostic. En combinant ces deux aspects , le radiopharmaceutique a ainsi le potentiel pour : - améliorer le ciblage des cellules tumorales et ainsi limiter les effets indésirables ; - suivre en temps réel les effets de la thérapie pour l’ajuster et ainsi diminuer les phénomènes de résistance . Notre projet vise à développer une nouvelle génération de médicaments radiomarqués qui se lieront spécifiquement à des marqueurs tumoraux via des ligands à base d’anticorps et de peptides. Nous testerons nos ligands sur des modèles tumoraux chez des rongeurs. Nous tirerons partie de l’utilisation combinée de plusieurs types d’imagerie pour affiner la sélection des ligands les plus intéressants pour cette stratégie. Nous souhaitons également étudier l’effet de la combinaison de notre approche de radiothérapie interne avec d’autres modalités thérapeutiques susceptibles de renforcer son action et/ou de minimiser les effets secondaires. Ainsi, nous combinerons l’utilisation de nos radioligands à : - des ultrasons thérapeutiques, permettant de minimiser les effets indésirables sur les tissus sains ; - des nanoparticules radioamplificatrices, pour augmenter l'efficacité de la radiothérapie, tout en minimisant les effets secondaires ; - des immunostimulateurs, pour renforcer la réponse immunitaire contre les tumeurs ; - de la chirurgie, afin de retirer un maximum de tissus tumoraux et d’éliminer les cellules tumorales infiltrantes ne pouvant difficilement être réséquées. Le projet sera réalisé sur deux sites, avec un site pour la radiothérapie interne (Site Imagerie) et l’imagerie et un site pour la radiothérapie externe (site IR).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider de nouvelles approches thérapeutiques en utilisant des biomarqueurs prédictifs de l’efficacité des traitements, essentiels pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés avec des thérapies comme l’immunothérapie, la radiothérapie et les thérapies ciblées (qui bloquent des mécanismes spécifiques des tumeurs), seuls certains patients en bénéficient pleinement. Plusieurs facteurs influencent l’efficacité des traitements, notamment le type de tumeur, le stade de la maladie, le système immunitaire du patient et des facteurs génétiques. Pour traiter efficacement le plus grand nombre de patients, il est crucial de les regrouper en sous-groupes homogènes afin de prédire quelle thérapie leur conviendra le mieux. Cette stratification améliorée des patients repose sur l’utilisation de biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique. Actuellement, la détection de ces biomarqueurs se fait principalement par des techniques invasives comme l’immunohistochimie sur des biopsies. L’imagerie offre une alternative moins invasive, permettant une évaluation dynamique et quantitative à l'échelle du corps entier. L'objectif de notre projet est de valider des couples biomarqueurs-radioligands (basés sur des anticorps ou des peptides) pour l’imagerie. Cette approche vise à prédire l’efficacité thérapeutique et de proposer un traitement adapté, fournissant ainsi aux oncologues un outil complémentaire aux biopsies pour personnaliser davantage les traitements. Ainsi, ce projet aspire à offrir un outil décisionnel puissant. Cela permettra une meilleure personnalisation des traitements en fonction des caractéristiques spécifiques de chaque patient, améliorant ainsi les résultats et la qualité de vie des patients atteints de cancer.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o La mise en place d'un modèle tumoral dans ce projet est essentielle pour reproduire les caractéristiques de la maladie et évaluer l'efficacité des nouveaux traitements dans un environnement contrôlé. Pour la mise en place de ce modèle tumoral, des cellules tumorales seront injectées (5 minutes d’intervention, deux injections par animaux). (Site Imagerie) o L’injection des traitements et d’agents d’imagerie radioactifs (pour l’imagerie ), fluorescents (imagerie optique) et/ou IRM pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre d’injection total par souris : maximum 4). (Site Imagerie) o Une anesthésie lors des différentes sessions imageries et de l’application des traitements (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 8 sessions d’imagerie au cours de l’étude pour un suivi dynamique du traceur dans le cas de l’imagerie par tomographie). (Site Imagerie et site IR) o Un prélèvement sanguin sous anesthésie (maximum 5 minutes, 2 fois maximum par session d’imagerie). (Site Imagerie) o La chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésiant (maximum 20 minutes de chirurgie). (Site Imagerie)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Le développement de la tumeur peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur. Un suivi régulier des animaux sera réalisé. • L’injection des radioligands ou de médicaments peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Lors du réveil en fin de session d’imagerie, les souris peuvent être désorientées et stressées. • Les traitements (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie et thérapie ciblée) peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines et sera limitée par l’utilisation de doses thérapeutiques décrites et validées dans la littérature. • La résection tumorale peut induire une inflammation.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Ceci permettra de prélever les organes afin de pouvoir effectuer les analyses ex-vivo sur ceux-ci. Cela permet tout d'abord de valider, à un niveau microscopique, des éléments observés par imagerie à une échelle plus large, tout en approfondissant notre compréhension des mécanismes impliqués, notamment le rôle du système immunitaire et l'identification de différentes populations cellulaires, dont certaines ne peuvent pas être visualisées par imagerie.
Remplacement
Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont testées sur des cultures cellulaires 3D impliquant les lignées testées ensuite comme modèle tumoral chez l’animal afin de déterminer la pertinence des stratégies thérapeutiques et pour certains biomarqueurs, leur surexpression au niveau des tumeurs. Les tests in vitro permettent d’éviter l’utilisation d’animaux en validant des paramètres qui ne seront plus nécessaires de valider dans le modèle animal. Cependant, le microenvironnement tumoral global avec la complexité immunitaire est difficilement reproductible in vitro et la pharmacocinétique des traitements injectés ne peut être déterminée qu’in vivo.
Réduction
Différentes utilisations de systèmes d’imagerie seront mises en place pour réduire de manière conséquente le nombre d’animaux nécessaires pour l’évaluation thérapeutique en suivant de manière individuelle des paramètres cliniques tels que la taille de la tumeur, l’apparition de métastases mais également l’apparition d’inflammation telle que les colites. Les données obtenues permettront de manière individuelle de définir une biodistribution des biomarqueurs dans une continuité temporelle. Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte nos résultats préliminaires et des données publiées concernant l’efficacité thérapeutique attendue (écarts-types et variations observés).
Raffinement
Les injections de cellules tumorales et de produits d’imagerie seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Les souris seront hébergées en groupe de 4 ou 5 par cage avec un milieu enrichi. Leur suivi régulier assurera de mettre en place des réponses adaptées devant tout signe de souffrance. Des points limites ont été mis en place afin d’éviter toute souffrance. Le suivi régulier du poids des animaux favorise leurs interactions régulières avec le personnel et limite ainsi le stress durant les sessions d’imagerie. Pour le transport des animaux entre les deux sites, d’une durée maximale d’une heure, il sera réalisé suite à l’accord vétérinaire donné en fonction des statuts sanitaires et réalisé dans des cages de transport avec de l’eau en gelée et la nourriture en gelée dans un véhicule climatisé. Une journée de récupération entre chaque lieu de transport est prévue.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont des animaux de choix pour la mise en place de modèles tumoraux, pour les lignées cellulaires tumorales qui sont utilisées dans ce projet. Leur taille est adaptée pour la manipulation et l’imagerie de tout le corps. Les études seront menées soit sur des rongeurs immunodéficients afin d’évaluer l’impact du traitement sur des cellules humaines, soit sur des modèles de rongeurs immunocompétents pour analyser son effet sur des cellules tumorales de rongeurs dans un contexte immunitaire préservé. Les souris et les rats utilisés dans ce projet auront atteint un stade de jeune adulte (5 semaines) à adulte (8 semaines), une tranche d’âge représentative des cancers chez les patients adultes. Cela nous permettra de mieux simuler les conditions cliniques et de développer des thérapies qui pourront être rapidement appliquées en clinique pour offrir de meilleures options de soins aux patients.
Potentiel thérapeutique de l’aérosolisation des nanoparticules d’apolipoprotéine A1 enrichies en alpha-1- antitrypsine chez la souris (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Anesthésiées, suspendues par leurs incisives sur un panneau de plexiglas incliné à 45 degrés le temps d'une aérosolisation d'une minute : 246 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. L'installation de l'emphysème pulmonaire et la mesure des fonctions respiratoires sont classées en nuisance sévère, avec une évaluation du seuil de douleur au filament de von Frey et un arrêt de la procédure si une allodynie mécanique sous 0,3 g apparaît. Les nanoparticules lipidiques enrichies en alpha-1-antitrypsine sont inhalées pour établir une preuve de concept avant un éventuel essai clinique, une partie des souris étant transportée sur 80 kilomètres entre deux établissements. Le choix de l'espèce repose sur des souris privées du gène de l'alpha-1-antitrypsine, chez qui le porteur attend une destruction des alvéoles et une perte d'élasticité pulmonaire proches de l'emphysème humain.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs : EU1 et EU2. Le déficit en alpha-1-antitrypsine (AAT) est une maladie génétique rare causée par une mutation du gène SERPINA1, responsable de la production de la protéine AAT. L'AAT est principalement synthétisée dans le foie et sécrétée dans la circulation, où son rôle principal est de protéger le tissu pulmonaire contre l'action de différentes enzymes. Ce déficit en AAT est un facteur de risque au développement d'un emphysème pulmonaire, caractérisé par une dégradation progressive et irréversible du tissu alvéolaire, entraînant une diminution de la fonction respiratoire et un risque accru de mortalité. Chez les patients souffrant de cette maladie, l'administration intraveineuse d'AAT réduit la perte annuelle du tissu pulmonaire et ralentit le déclin de la fonction respiratoire. Cela étant, ce traitement n'a aucun effet sur des épisodes d'aggravations des symptôles et donc l'état de santé. Ce projet vise à évaluer un nouveau traitement reposant sur l'aérosolisation de l'AAT, vectorisée dans des nanoparticules lipidiques. Ces nanoparticules ont des propriétés protectrices (antiinflammatoire, anti-oxydante et anti-infectieuse). Ces effets protecteurs, combinés avec ceux de l'AAT, constituent une thérapie prometteuse pour laquelle l'inhalation permettra une action directe sur les poumons. Ainsi, ce projet qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, a le potentiel de fournir une preuve de concept pour le développement d'une thérapie innovante pour les patients déficients en AAT.
Bénéfices attendus
Recherche médicale : il existe un besoin d'améliorer les normes de soins pour les maladies pulmonaires liées à la déficience en alpha-1-antitrypsine (AATD). L'injection intraveineuse d'AAT a montré une efficacité limitée et les injections hebdomadaires constituent une contrainte sur la qualité de vie des patients. La voie inhalée est une stratégie thérapeutique prometteuse qui améliorera l'observance et l'autonomie des patients. Des études précliniques et cliniques de ces dernières années ont démontré la capacité des nanoparticules lipidiques inhalées à délivrer localement divers médicaments dans les poumons, pour le traitement de maladies pulmonaires telles que les cancers pulmonaires, les maladies pulmonaires obstructives et les infections respiratoires. Les nanoparticulesn lipidiques ont permis d’atteindre cet objectif tout en améliorant la stabilité des médicaments, en réduisant la toxicité systémique et en permettant une concentration locale plus élevée du médicament dans les poumons. Ici, nos particules ont aussi un intérêt thérapeutique, en potentialisant les effets bénéfiques des nanoparticules à celle de l’AAT. Coûts des soins de santé : des traitements efficaces contre l'emphysème pulmonaire lié à l'AATD et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO ; 3ème cause de décès dans le monde) pourraient réduire les coûts des soins de santé associés aux hospitalisations et à la gestion à long terme de ces maladies chroniques. Les perspectives du projet sont de mener un essai clinique multicentrique avec des médecins du réseau RespiFIL (Filière Maladies Respiratoires Rares) pour évaluer si l'aérosolisation des nanoparticules enrichits en AAT peut améliorer la santé des patients.
Procédures
Dans l'EU1/2 : Les animaux auront une biopsie de queue à 6 jours et seront soumis à des aérosolisations à l'âge adulte. Parmi les animaux exposés, certains recevront des nanoparticules et ou du LPS et certains auront des mesures de leur fonction respiratoire. Les procédures d’aérosolisations et d’injections intraveineuses dure environ 1 minute et la procédure de mesure de fonction respiratoire dure environ 10 minutes. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale. Dans l'EU2/2 : Les animaux seront soumis à des aérosolisations de nanoparticules radiomarquées. La procédure d’aérosolisation dure environ 1 minute puis la mesure de la scintigraphie se déroule à 6h, 24h et 48h. Des prélèvements sanguins (caudales) sont aussi réalisés à ces temps. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
- Nuisance modérée pour la biopsie de queue (douleur légère de courte durée). - Nuisance modérée pour l'instillation intratrachéale. Les souris anesthésiées sont retirées de la chambre d’induction et suspendus par leurs incisives sur un panneau en plexiglas en position couchée, avec une inclinaison d’environ 45 degrés. La durée totale de la procédure d’aérosolisation est d'environ 1 minute. - Nuisance sévère pour la mise en place de l'emphysème pulmonaire. Nous évaluerons le seuil à la douleur dans l’étude pilote en utilisant le test de Von Frey (stimuli mécaniques). Ce test mesure la réponse de retrait à des filaments appliquant une pression mécanique. Chez des souris avec emphysème, on pourrait s'attendre à une hypersensibilité mécanique (réduction du seuil). Une évaluation comportementale sera faite en complément. Si le seuil de douleur est très faible (allodynie mécanique
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d’organes
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de l’emphysème pulmonaire ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de dégradation et de fibrose du tissu pulmonaire impliquent plusieurs types cellulaires : neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales, fibroblastes, pneumocyte de type 1 et 2 entres autres. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de l’emphysème tel que l’inflammation et le stress oxydatif. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Le nombre d’animaux de cette étude se base sur des publications scientifiques ayant décrit des résultats significatifs avec des approches similaires. Chaque expérimentation sera scindée en trois expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont significatifs avec les deux premières expériences (n=8 au lieu de 12 dans l’objectif 3.2 par exemple ; analyses statistiques : two-tailed unpaired t test ou two-way ANOVA). En effet, les résultats, s’ils sont homogènes, peuvent être significatifs avec 8 souris. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le groupe d'animaux suivant. Enfin, si l’objectif 1 n’est pas validé, alors le projet s’arrêtera.
Raffinement
Pour garantir un environnement optimal, les animaux seront logés dans des cages offrant un espace suffisant, avec un maximum de 5 animaux par cage. Cet aménagement limitera au maximum les contraintes subies et permettra un comportement normal. De plus, l’environnement sera enrichi avec des matériaux pour se nicher et jouer, contribuant ainsi à leur bien-être. Les animaux seront observés de façon continue pendant les 30 premières minutes après l’aérosolisation, puis 3 à 6 fois par jour afin de nous assurer de leur bien-être et de ne pas laisser un animal en souffrance. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté immédiatement au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée, conformément aux protocoles en vigueur pour minimiser la douleur et le stress des animaux. Nous observerons et analyserons divers points limites spécifiques pour évaluer leur bien-être, tels que : 1. Altération du comportement : signes d'apathie, d'agressivité, d'isolement, ou réduction drastique de l'activité normale. 2. Nutrition anormale : incapacité à se nourrir ou à boire normalement. 3. Perte de poids : surveillance régulière du poids pour détecter toute perte significative. 4. Aspect physique : poil ébouriffé, yeux fermés, respiration laborieuse, posture courbée. Si l'un de ces paramètres ou points limites est atteint, cela sera signalé immédiatement au vétérinaire référent. Celui-ci évaluera la situation et pourra décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal pour limiter ses souffrances, conformément aux règles éthiques en vigueur. Pour compléter le raffinement des procédures, une injection d’analgésique sera réalisée avant chaque intervention et chaque fois que la souris démontrera des signes de douleurs. La mise en place d’une étude pilote permettra aussi d’améliorer les manipulations de l’expérimentateur. Concernant le transport des souris de l’EU1/2 vers l’EU2/2, le transporteur agréé s'engage à réunir toutes les conditions pour assurer la sécurité des animaux et leur bien-être (véhicule climatisée avec des cages de transports agrées sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire, ajout de croquettes humidifiées et paille). Le choix d'un transport dédié uniquement à nos souris permet aussi d'assurer un trajet rapide d'environ 1 heure (80km).
Choix des espèces
La structure et la fonction du système respiratoire des souris présentent des similitudes avec celles des humains, bien que les différences existent en termes de taille et de complexité. Les souris possèdent des bronchioles, des alvéoles,et des cellules immunitaires pulmonaires similaires à celles des humains, ce qui permet d'étudier les effets des traitements inhalés. Les souris montrent des réponses inflammatoires et immunitaires comparables à celles des humains lorsqu'elles sont exposées à des agents pathogènes ou à des stimuli nocifs, permettant ainsi d'évaluer les réponses thérapeutiques des nanoparticules. Les modèles murins d'emphysème sont bien établis et peuvent être induits par diverses méthodes telles que l'exposition à la fumée de cigarette, l'administration d'élastase ou d'autres agents chimiques. Ici, les souris AAT KO reproduisent les caractéristiques clés de l'emphysème humain, telles que la destruction des alvéoles et la perte d'élasticité pulmonaire. Animaux adultes entre 8 et 10 semaines. À l'âge de 8 à 10 semaines, les souris ont atteint une maturité physiologique qui leur permet de mieux refléter les caractéristiques pulmonaires des adultes humains. Les structures alvéolaires et les voies respiratoires sont pleinement développées, ce qui est crucial pour étudier les changements pathologiques induits par l'emphysème. Les souris de cet âge possèdent un système immunitaire mature mais encore flexible, permettant une réponse inflammatoire et immunitaire comparable à celle observée chez les adultes humains. Cela est important pour étudier les mécanismes inflammatoires et immunopathologiques de l'emphysème. Enfin, à cet âge, les souris ont un niveau d'activité physique, de métabolisme et de croissance relativement stable, ce qui minimise les facteurs confondants qui pourraient influencer les résultats expérimentaux.
Rôle d’HSPB5 dans la sécrétion de vésicules extracellulaires : étude dans un modèle murin de fibrose pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Un inhibiteur de la protéine HSPB5 développé par le laboratoire comme candidat médicament contre la fibrose pulmonaire motive l'utilisation de 1 040 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dose de bléomycine leur est administrée en trente secondes par aspiration au fond de la gorge sous anesthésie, ce qui déclenche entre le deuxième et le septième jour une inflammation des poumons, une perte de poids et des troubles respiratoires, puis une fibrose progressive. Le porteur justifie un effectif supérieur aux usages du domaine par la quantité de vésicules extracellulaires qu'il doit obtenir des animaux pour les injecter à d'autres souris. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle in vitro ne peut se substituer à l'étude d'un "animal entier", le poumon comptant plus de quarante types cellulaires.
Objectifs
Les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique ont une accumulation de vésicules, appelées vésicules extracellulaires (EVs). . Ces vésicules aggravent la maladie de ces patients en transportant des molécules actives (protéines, ADN etc). .Si on inhibe la machine des cellules pour incorporer ces molécules actives dans ces EVs, on réduit la progression de la fibrose dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition de la protéine de stress HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Les objectifs de ce projet sont de : 1) Confirmer que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion des EVs 2) Tester si l’absence d’HSPB5 réduit l’activité des EVs pour aggraver la fibrose.
Bénéfices attendus
Notre laboratoire développe des inhibiteurs de la protéine de stress HSPB5 comme un médicament dans la fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Nous devons mieux comprendre les rôles d’HSPB5 pour développer notre médicament et permettre une meilleure prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire.
Procédures
Les souris seront soumises à une administration unique de bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale (isoflurane). Cette intervention dure 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Le modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine est le modèle le plus utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose. Les souris sont exposées à la bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale. Le modèle est composé d’une étape inflammatoire puis d’une fibrose pulmonaire progressive. Entre 2 et 7 jours après bléomycine, un phénomène inflammatoire se met en place. Il est associé à une perte de poids des animaux, ce qui peut entrainer des troubles respiratoires plus ou moins importants suivant la dose injectée. Pour ce projet, une faible dose de bléomycine sera utilisée. Cette dose permettra de réduire au maximum l’apparition potentielle d’effets indésirables induits chez l’animal, et entrainera une fibrose pulmonaire détectable.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour des études biochimiques et histologiques.
Remplacement
Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.
Réduction
Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Pour la procédure 2, une analyse de puissance a été réalisée pour établir les effectifs. Pour la procédure 1, les effectifs décrits sont supérieurs au nombre d’animaux utilisés classiquement. Ceci est expliqué par le nombre d’EVs que nous devons produire pour les injections décrites en partie 2 et par les contraintes statistiques associées aux études biochimiques et histologiques (méthodes indispensables à notre projet). Des tests statistiques d’analyse de variance seront réalisés pour toutes les données d’analyses (histologie, dosage de collagène etc). Après avoir déterminé la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit) au centre de zootechnie de l’université de Bourgogne. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). Ils bénéficieront d’un environnement enrichi avec accès ad libitum à des suppléments alimentaires (aliments gélifiés, morceaux de pommes), afin de limiter la perte de poids. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Les administrations oro-pharyngées seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal (isoflurane). Après l’injection, les souris seront placées sous lampe chauffante pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale de l’animal à son réveil de l’anesthésie.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. De plus, l’utilisation de souris offre l’avantage de pouvoir travailler sur des modèles génétiquement modifiés. Dans ce projet nous utiliserons des souris délétées pour le gène Hspb5. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience du modèle, la toxicité de la bléomycine est d’autant plus importante et rapide que les souris sont petites. Pour minimiser les signes de toxicité aigüe de la bléomycine, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g.
Efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses d’origine adipocytaire sur des modèles murins de sclérodermie systémique
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
174 souris vont être utilisées, chacune recevant une injection sous la peau cinq jours par semaine pendant quatre à six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La bléomycine ou l'acide hypochloreux injectés leur font développer une fibrose de la peau et des poumons, et quarante d'entre elles subissent en plus une biopsie cutanée au punch dans le bas du dos. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et peau. Le bénéfice avancé reste conditionnel, valider un jour une thérapie cellulaire chez les personnes atteintes de sclérodermie systémique, quand la fibrose infligée aux souris est immédiate et le porteur affirme qu'observer l'"animal entier" est "indispensable".
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.
Procédures
Toutes les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines ou pendant 6 semaines et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs). 40 souris auront en plus une biopsie cutanée qui sera réalisé en bas du dos à l'aide d'un punch.
Impact sur les animaux
L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires. Il n'est pas attendu d'effets négatifs pour les souris suite à la réalisation de la biopsie cutanée ; en effet, comme le diamètre du punch est réduit au minimum (4 mm) et que nous faisons un pont de suture, la cicatrisation est rapide.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)
Remplacement
Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades. Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, les effets thérapeutiques précoces (préventifs) et tardifs (curatifs) des d'ASCs dans le modèle de souris sclérodermiques induit par injection d'HOCl seront évaluées dans la même procédure (N°4).
Raffinement
Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.
Choix des espèces
Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes
Etude en modèle murin du rôle d’un métabolite majeur de Streptococcus mitis, le lactate, sur la réponse à une pneumonie.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
6 354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une ou plusieurs injections, certaines sous anesthésie générale, pour installer dans leurs poumons une bactérie ou du lactate et provoquer une pneumonie. Le porteur indique une perte de poids transitoire de deux à trois jours après l'infection et prévoit des injections de morphinique selon le score clinique atteint. Les retombées annoncées pour les patients en réanimation restent au conditionnel, et il conclut que les modèles animaux sont "indispensables" à la compréhension des interactions entre microbiote respiratoire et immunité pulmonaire.
Objectifs
Les infections pulmonaires contractées à l’hôpital sont les plus fréquentes parmi les infections liées aux soins médicaux et représentent une des principales raisons de l’utilisation d’antibiotiques. Cependant, la résistance croissante des bactéries aux antibiotiques complique leur traitement, avec des échecs thérapeutiques observés dans environ 30 % des cas. Cette situation souligne l’urgence de développer de nouveaux traitements pour prévenir ou soigner ces infections. Des recherches récentes suggèrent que certaines bactéries naturellement présentes dans les poumons, pourraient jouer un rôle protecteur contre ces infections pulmonaires. Cependant, les interactions entre ces bactéries bénéfiques et celles responsables des infections sont encore peu connues, et leur influence sur les défenses immunitaires des poumons reste à approfondir. Notre projet de recherche explore, à l’aide d’un modèle animal, comment le lactate – une substance produite par une bactérie naturellement présente dans les poumons – agit sur la muqueuse pulmonaire et les cellules immunitaires, ainsi que son impact sur la réponse à une pneumonie.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à identifier les substances produites par les bactéries naturellement présentes dans les poumons qui aident à maintenir leur bon fonctionnement. Cela permettra de combler un manque de connaissances essentiel pour développer des traitements basés sur le microbiome pulmonaire. Ce travail pourrait avoir un impact majeur pour les patients souffrant de pneumonie. En effet, des études récentes montrent que l'administration de probiotiques, comme les bactéries lactiques, à des patients en réanimation pourrait réduire le risque de pneumopathie. Cependant, les preuves actuelles sont encore insuffisantes pour justifier des recommandations médicales.
Procédures
Tous les animaux recevront une ou plusieurs injections. Certaines injections seront réalisées sous anesthésie générale et ne dureront au maximum qu’1 minute, avec un réveil presque instantané. Les autres injections seront réalisées sur animaux vigiles et ne dureront que quelques secondes. En fonction de l’état général des animaux (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections de morphinique pourraient être réalisées.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection : Les modèles d’inflammation respiratoires aigües sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les animaux reprennent une courbe de poids normale. Pour les autres parties du projet, suite à la colonisation bactérienne, les animaux pourraient présenter, au cours des 24 premières heures du protocole, une légère perte de poids. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendrent pas de douleurs résiduelles ainsi que de stress supplémentaire. Suite à l’injection de bactérie ou de molécules en fonction des voies d’administration choisies et dans le cas d’injections multiples sur une durée maximum de 14 jours, les animaux pourraient ressentir un stress et une gêne.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre le microbiote respiratoire et le système immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=8) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Pour les tests pour lesquels une analyse statistique n’est pas prévue ainsi que pour certains groupes témoins, le nombre d’animaux sera réduit à 3 ou 5 animaux par groupe. Le nombre indiqué est un nombre maximum de souris et toutes ne seront pas forcément utilisées. Une partie des analyses sera conditionnelle aux résultats obtenus sur l’étape d’avant.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections d’analgésiques seront réalisées. Afin de limiter la gêne potentielle consécutive à certaines administrations, la zone d’injection sera anesthésiée localement.
Choix des espèces
Le modèle murin de pneumonie est un modèle bien caractérisé, reproductible, et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature.
Evaluation de la biodisponibilité d’un composé (candidat médicament) après administration unique par voie intravasculaire et par voie extravasculaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique du composé, puis jusqu'à six prélèvements sanguins en une semaine, sous anesthésie gazeuse. L'objectif est de mesurer comment un candidat médicament se répartit dans l'organisme, pour choisir la molécule et la dose qui passeront ensuite en clinique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour ce type d'étude et que les modélisations in silico ne sont "pas encore abouties".
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer la biodisponibilité de composés afin de sélectionner le meilleur candidat médicament, de définir les doses à administrer chez l’homme et la pharmaceutique optimale. Il fait suite à une première sélection de candidats médicament qui ont montrés leur efficacité sur des modèles vitro ou vivo
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’étudier la biodisponibilité des candidats médicaments dans l’organisme vivant. Les données ainsi recueillies dans un contexte pré-clinique permettent de sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses (selon leur profil pharmacocinétique et leur biodisponibilité) et d’identifier la forme pharmaceitique optimale avant de poursuivre vers les études cliniques. Les molécules étudiées sont à visée thérapeutique humaine ou vétérinaire (maladie d’Alzheimer, maladies cardiaques, diabète, ...).
Procédures
Les administrations sront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la voie utilisée. Les administrations sont réalisées en bolus (administration en une seule fois et inférieure à 30 secondes). Les animaux sont également soumis à des prélèvements sanguins répétés après application d’un analgésique si besoin et sous anesthésie. 6 prélèvements maximum sont réalisés par animal sur une semaine (la durée totale de l’intervention pour chaque prélèvement est d’environ 5 min : anesthésie + prélèvement) et sur un période allant de15 min à généralement 24h mais pouvant s’étendre jusqu’à 1 mois maximum
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus aux gestes expérimentaux, c’est à dire à l’administration du composé ou aux prélèvements sanguins. Pour les administrations on peut observer de l’inconfort ou une douleur locale au point d’injection. Pour les prélèvements répétés on peut observer un stress lié à la manipulation répétée des animaux, un inconfort, une douleur locale ou un hématome au point de prélèvement. Dans tous les cas l'inconfort ou le stress, si observé, sera de très courte durée, inférieur à 1 min. Les nuisances en lien avec les effets possibles des molécules testées sont rares. Néanmoins on pourrait observer les effets indésirables suivants : Signes de douleur sur la face, constrictions abdominales, posture modifiée, présence de sang dans les urines, modification de la consistance des selles, perte de poids, hypothermie, modification de la respiration. Si ces signes devaient néanmoins survenir ils seront de courte durée, inférieur à 1h.
Devenir
Les animaux utilisés étant des jeunes adultes entre 6 et 12 semaines, l’application d’une seconde procédure expérimentale ne peut pas être envisagée. A la suite du dernier prélèvement, l’animal est donc mis à mort.
Remplacement
L’étude de la biodisponibilité d’un candidat médicament est une étape importante et nécessaire dans le développement d’un médicament et il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce type d’étude. Des méthodologies de modélisation in silico sont en cours de recherche mais ne sont pas encore abouties et fiables pour apporter le même niveau d’information.
Réduction
Afin de calculer un minimum de statistiques descriptives (moyenne, écart-type et coefficient de variation) sur les données obtenues, un minimum de 3 animaux par conditions (molécule, voie d’administration, dose, formulation, temps de prélèvement) est nécessaire. L’expérimentation est définie pour prélever sur un même animal le volume minimum de sang nécessaire aux analyses tout en respectant les volumes de sang définis dans les textes règlementaires . Le nombre de prélèvement par animal est ainsi optimisé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux
Raffinement
Tout au long des expériences une observation de l’état clinique des souris est assurée. Les mesures de raffinement suivantes sont prises. Les animaux sont maintenus en groupe stable durant toute la période d’acclimatation et si possible pendant la procédure expérimentale. Afin de réduire le stress et la souffrance animale les administrations sont réalisées sous anesthésie gazeuse lorsque le geste technique ou le type d’administration le nécessite et les prélèvements sont réalisés sous analgésie et anesthésie gazeuse. Les souris à euthanasier sont placés dans une salle isolée du reste des animaux. Pour ce projet les études sont réalisées sur animaux sains. Aucune toxicité particulière n'est attendue sur les molécules testées. Des points limites adaptés sont définis et un arbre décisionnel basé sur ces points limites est établi. Des critères de diminution ou d’arrêt des souffrances sont mis en place.
Choix des espèces
Le modèle (rongeur) dans les études pré-cliniques précoces est le même modèle qui sera ensuite utilisé et requis dans le cadre d’études réglementaires de toxicocinétique. Le choix de la souris dépendra des données déjà disponibles dans la littérature et du modèle qui a été utilisé dans les précédentes études pré-cliniques et/ou qui sera requis selon les études réglementaires visées. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes d’environ 6-12 semaines basé sur les recommandations des textes règlementaires et leur robustesse par rapport à des animaux plus âgés ou juvéniles. De plus l'utilisation d'animaux spécifiques de cette tranche d'âge permet la comparaison d'études différentes mais avec des molécules chimiquement proches en limitant le biais expérimental lié à l’âge.
Mise au point d’un modèle pour la préparation des bronches avant l’administration d’une thérapie cellulaire.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
L'épithélium de leurs bronches est éraflé par brossage mécanique ou par une solution chimique, au cours d'une endoscopie d'une heure trente sous anesthésie générale, suivie de deux autres endoscopies de quarante-cinq minutes à un jour et à sept jours pour des biopsies. 12 cochons juvéniles de 30 à 40 kg vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tués au septième jour pour le prélèvement des poumons. Il s'agit de choisir la méthode d'érosion qui permettra ensuite de greffer des cellules bronchiques chez des patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive. Le porteur écrit qu'aucune sensation désagréable n'est attendue, les bronches et les poumons ne contenant pas de nerfs sensibles à la douleur, et annonce dans la même rubrique deux anesthésies générales en vingt-quatre heures et un risque de détresse respiratoire après l'érosion.
Objectifs
Le projet vise à développer une thérapie cellulaire et génique pour soigner la dyskinésie ciliaire primitive, une maladie génétique qui empêche les cils des cellules des voies respiratoires d’éliminer le mucus. Des recherches sur des tissus pulmonaires créés à partir de cellules souches ont montré que des cellules immatures (progéniteurs bronchiques) peuvent s’implanter, se multiplier et se transformer en cellules ciliées fonctionnelles, rétablissant ainsi le battement des cils. Cependant, pour que ces cellules s’intègrent bien, il est nécessaire de préparer les bronches en retirant une partie de la couche cellulaire existante. Des tests préalables en laboratoire ont évalué différentes méthodes (mécaniques, enzymatiques et chimiques), et les plus prometteuses sont le brossage mécanique et une solution chimique. L’étape suivante consiste donc à tester ces méthodes sur des modèles vivants pour identifier la meilleure technique permettant une bonne intégration des cellules greffées.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de transposition de la greffe de progéniteurs bronchiques vers un essai clinique chez l’homme, et concerne une étape indispensable sur l'animal pour la translation de cette thérapie au niveau clinique chez l’homme. Les patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive (incidence de 1/15000 naissances) restent aujourd’hui encore sans aucun traitement curatif. Le développement de cette thérapie au niveau clinique représente donc un espoir pour ces patients, mais ouvre aussi la voie au développement de thérapies pour d’autre pathologies pulmonaires tel que certaines formes de la mucoviscidose.
Procédures
Trois endoscopies bronchiques seront réalisées sous anesthésie générale, à J0 pour le geste d'érosion tissulaire (1h30 h), à J1 pour réaliser les biopsies (45 min), à J7 pour réaliser des biopsies (45 min) juste avant mise à mort. Au cours de l'anesthésie, deux prélèvements sanguins (quelques secondes) de 7 ml à chaque fois seront réalisés à J1 et J7.
Impact sur les animaux
À part le stress et la piqûre ressentie lors de l’injection pour l’anesthésie, aucune sensation désagréable n’est attendue car les bronches et les poumons ne contiennent pas de nerfs sensibles à la douleur. Cependant, les animaux subiront deux anesthésies générales en 24 heures. Même si elles seront courtes, elles pourraient ralentir leur récupération et réduire leur activité pendant deux jours. De plus, des difficultés respiratoires pourraient survenir après l’application du traitement érosif.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en prévision du prélèvement des poumons pour analyse.
Remplacement
Pour que la greffe de cellules réussisse et répare correctement les bronches, il est nécessaire d'effectuer une préparation au préalable. En effet, la barrière naturelle de l’épithélium bronchique empêche l’intégration des cellules greffées, ce qui limiterait l'efficacité du traitement. Des tests préliminaires en laboratoire ont permis de trouver des méthodes efficaces pour éroder cette barrière. Cependant, à ce stade, il est essentiel de tester ces méthodes sur des modèles plus complexes, proches de la réalité du vivant, afin de vérifier qu’elles ne sont pas toxiques et qu’elles fonctionnent dans des conditions normales. Il est donc nécessaire de passer à un modèle animal, car il n’existe pas d’autres alternatives pour tester ces solutions dans des conditions aussi proches que possible de la clinique.
Réduction
L'objectif est de comparer la quantité de cellules de base dans les biopsies des bronches, entre les zones traitées (ou érodées) et non traitées (contrôles), et de calculer le pourcentage de cellules éliminées en fonction du traitement appliqué. Suite à une évaluation statistique et pour tenir compte des variations entre les animaux, le nombre d'animaux a été estimé à 12 animaux (4 traitements testés donc 4 groupes de 3 animaux), avec 10 prélèvements par bronche. Chaque animal donnera donc 60 prélèvements (3 bronches par animal, sur 2 lobes). Ce nombre inclut aussi le risque 15% des prélèvements qui ne soient pas exploitables, ce qui est cohérent avec ce qui est généralement observé dans la littérature scientifique.
Raffinement
Pendant la période d'acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiennes par les soigneurs, hébergement en groupe, environnement adapté et enrichi. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale avec l’utilisation de médicaments analgésiques et anesthésiques adaptés. Une attention particulière sera portée au suivi post-opératoire des animaux entre J1 et J7. En effet, le risque de développement d’une détresse respiratoire nécessitera une surveillance accrue de l’état clinique des animaux au niveau de la fonction respiratoire. Certains paramètres seront des alertes pour la mise en place de points limites associés à des actions et des traitements.
Choix des espèces
Le porc apparaît comme le meilleur modèle pour étudier la thérapie cellulaire bronchique humaine pour deux raisons principales : son poumon a une anatomie proche de celle du poumon humain, notamment au niveau de la structure pulmonaire, et en particulier du nombre de ramifications des voies respiratoires et du diamètre des bronches ; ces similitudes permettent de s’approcher des conditions cliniques humaines. De plus, seul un grand modèle comme le porc peut fournir une situation clinique similaire à celle trouvée chez l'homme, notamment en ce qui concerne l'accès à la bronchoscopie lobaire par fibre optique avec un endoscope humain. Les animaux utilisés seront des juvéniles dont la taille (30-40 kg) et les caractéristiques anatomiques permettront la réalisation de la procédure dans des conditions proches de celles rencontrées chez l’humain.