Troubles musculosquelettiques
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- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Gestion du phénotype dommageable d’arthrite lors de l’élevage de lignées murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Élevées pour développer spontanément une arthrite inflammatoire, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est génotypée par poinçonnage de l'oreille sur animal vigile, sans anesthésie mentionnée. Le porteur décrit une inflammation articulaire apparaissant vers huit à dix semaines, avec un gonflement des pattes pouvant affecter la mobilité. Sur les 1 200 animaux, 900 sont expédiés vers un autre établissement pour y être utilisés, 300 servent à l'élevage et sont tués avant vingt semaines pour limiter l'aggravation de la maladie avec l'âge.
Objectifs
Ce projet décrit une procédure de l'élevage avec la prise en charge des animaux d’une lignée de souris développant progressivement une arthrite inflammatoire. Ces souris sont un modèle d’inflammation articulaire qui est causée par un mélange de facteurs génétiques, environnementaux et liés aux microbes présents dans l’intestin. Normalement, le corps produit une molécule inhibant l’interleukine 1 qui va limiter l’inflammation. Mais chez ces souris, cette molécule est absente, ce qui entraîne une inflammation excessive qui va notamment toucher les articulations. De plus, des éléments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques ou les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal peuvent aggraver cette inflammation. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie observée chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans des projets de recherche afin d'étudier l’arthrite inflammatoire et, à terme, aider à la recherche sur cette maladie chez l’homme qui représente 1 million de patients en France.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre à l'équipe de recherche et à leurs partenaires d’avoir les souris nécessaires pour mener leurs études sur l’arthrite inflammatoire. A long terme, ces souris aideront les chercheurs à : mieux comprendre l’arthrite, identifier des marqueurs pour mieux la diagnostiquer, trouver de nouvelles façons de traiter cette maladie, tester de nouveaux médicaments anti-inflammatoires et évaluer leur efficacité par rapport aux traitements déjà disponibles pour les patients atteints d’arthrite.
Procédures
Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 14 jours. Cette méthode consiste à prélever sur animaux vigiles un petit échantillon de tissu (environ 2 mm de diamètre) sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement certains animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.
Impact sur les animaux
Les souris qui n’expriment pas le récepteur inhibant la molécule de l’inflammation interleukine 1 peuvent, pour certaines, développer spontanément une inflammation articulaire à partir de l'âge de 5 semaines. Cependant, les observations récentes de l’équipe de recherche démontrent un âge plus tardif pour l’apparition de l’arthrite, vers 8-10 semaines. Il s’agit de symptômes comme une rougeur ou un gonflement des articulations. Lorsque l’atteinte est sévère, elle peut se manifester par un gonflement des pattes qui peut affecter la mobilité de la souris. Selon les observations antérieures, ces souris ne développent que très peu de signes généraux et leur mobilité est peu affectée. Les souris reproductrices pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage (douleur légère de courte durée).
Devenir
Une partie des animaux sera expédiée en début ou avant l’expression du phénotype dommageable et utilisée dans des projets de l’équipe de recherche dans un autre établissement utilisateur (900 animaux pour l’expérimentation en 5 ans). Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement (300 animaux pour l’élevage en 5 ans). Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 20 semaines, pour limiter l’évolution du phénotype dommageable avec l’âge. Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie l’arthrite, qui est une maladie complexe multifactorielle faisant intervenir différents facteurs (le système immunitaire, les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal, le patrimoine génétique et l’environnement), différents organes et la présence d’une inflammation à la fois chronique locale (articulation) et systémique. Par ailleurs, l’utilisation d’un modèle mammifère vertébré est nécessaire, car les organes impliqués dans la physiopathologie de l’arthrite (notamment le système immunitaire, l’intestin, les articulations et les tissus lymphoïdes associés) présentent des différences anatomiques, physiologiques et immunologiques importantes chez les espèces non mammifères, limitant leur pertinence translationnelle pour l’étude de cette pathologie humaine. Afin d'étudier l'interaction entre l’environnement, le microbiote intestinal et le génome de l'hôte, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (par exemple, modèles cellulaires).
Réduction
Un nombre total de 1200 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour l’élevage et les animaux nécessaires pour l’expérimentation pour les projets scientifiques associés. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, le modèle pourra être cryoarchivé dans notre établissement.
Raffinement
Tous les animaux mutés de manière homozygote pour la modification génétique et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 5 semaines seront suivis à partir de 4 semaines et ce jusqu'à leur envoi avant 8 semaines vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation (ou leur mise à mort) : une évaluation du bien-être animal sera réalisée en prenant en compte l'arthrite, la sensibilité articulaire, l'aspect général, le comportement et la mobilité de l’animal. En fonction de l’état de l’animal, des mesures de raffinement seront mises en place selon les conseils de la vétérinaire et/ou la SBEA (disponibilité de la nourriture directement dans la cage, mise à disposition d’une solution de réhydratation gélifiée, augmentation de la fréquence du suivi, application d'un antiseptique). Les points limites précoces et spécifiques pour les signes cliniques de l’arthrite ont été définis. Si, malgré le raffinement mis en place, un point limite est atteint, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour l’élevage et mis à mort avant 20 semaines (pour limiter les nuisances liées à la progression de l’arthrite avec l’âge).
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilisées pour étudier l’arthrite, car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’articulation elle-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entraînant ainsi une inflammation articulaire ressemblant à une arthrite chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris seront utilisées pour les croisements dès l’âge de 7-8 semaines (maturité sexuelle) et ce jusqu’à 20 semaines, pour limiter l’expression du phénotype dommageable qui progresse avec l’âge. Le phénotype dommageable d’arthrite est susceptible d'apparaître à partir de l'âge de 5 semaines, mais dans l’élevage de l’EU du chercheur ne se manifeste pas avant 8-10 semaines. Les animaux envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 5-8 semaines pour limiter et potentiellement éviter l’expression du phénotype dommageable avant l’envoi.
Etude pilote d’essai pré-clinique de thérapie pharmacologique dans un modèle souris pour une neuropathie fatale chez l’Homme (EU2/3)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Tuées à l'issue pour un prélèvement d'organes, 268 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Ce volet, mené sur un deuxième établissement, teste une molécule déjà commercialisée contre une maladie neuromusculaire humaine incurable. Chaque animal reçoit une injection quotidienne, une série de cinq tests comportementaux et un électromyogramme sous anesthésie. Le modèle a d'abord été exploré chez le poisson-zèbre, dont le porteur juge les résultats insuffisants sans validation chez un mammifère.
Objectifs
Ce projet multisite déployé sur 3 établissements concerne le développement d’une thérapie pharmacologique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie pharmacologique a pour but de prévenir l’avancée de la pathologie, retardant son développement, voire même de restaurer les fonctions sensorimotrices chez des individus traités en post- symptomatique. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. L’objectif de cette étude multi-établissement est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une molécule déjà sur le marché pour d’autres indications sur une durée de traitement de 1 à 4 mois en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (analyses tissulaires et moléculaires).
Bénéfices attendus
La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices d'une molécule chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique.
Procédures
Les souris recevront la molécule quotidiennement par injection sous cutanée (30 secondes) dans l’établissement utilisateur (EU) 2. Les souris réaliseront une fois (à 3 mois) ou deux fois (à 3 et 6 mois) la série de 5 tests comportementaux (durée : entre 30s et 15mn) au sein de l’EU2. A la suite de ces tests, un électromyogramme mesurant la latence et l’amplitude de la réponse musculaire (réalisé sous analgésie et anesthésie, durée : 15-20mn) sera également réalisé dans l’EU2, à 3 mois ou à 3 et 6 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée pour l’identification des géniteurs, leur mise en accouplements et la vérification des gestations causent un stress léger et court, qui s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Nuisances dues au phénotype : les individus homozygotes peuvent présenter une altération de l’état général à partir de 15 mois. Néanmoins, cet âge ne sera pas atteint car trop tardif pour la reproduction en vue de la création de la cohorte et ou de la fenêtre étudiée dans cette étude. L’injection quotidienne sous cutanée de la molécule (durée 1 mn) peut induire un léger stress dû à la manipulation qui s’atténue à mesure que les animaux s’habituent. L’administration de la molécule peut entrainer une douleur et des réactions cutanées. Les tests de comportements peuvent causer un stresse modéré. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.
Devenir
La validation de ce protocole de thérapie pharmacologique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessite leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses).
Remplacement
Le projet a pour but de valider un premier protocole pharmacologique pour cette maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Le modèle poisson-zèbre a permis de mettre en évidence des effets au niveau physiologique et cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyser nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet. Le nombre d’individus inclus dans chaque procédure a été calculé à l’aide d’outils statistiques.
Raffinement
Le bien-être de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (6 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au minimum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation pour valider notre approche pharmacologique. Notre projet sera réalisé sur des femelles, dont les symptômes sont plus marqués que chez les mâles, au stade adulte (2 à 6 mois). Notre modèle souris présente des défauts moteurs et sensoriels décelables uniquement par des tests comportementaux entre 1 et 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce symptomatique. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie.
Rôle du microbiote intestinal au cours de la spondylarthrite du rat transgénique pour le HLA-B27
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
288 rats génétiquement modifiés vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue, pour étudier le rôle du microbiote dans une forme de rhumatisme inflammatoire. Chaque animal reçoit six administrations orales de composés bactériens puis est suivi six mois, développant diarrhée, arthrites des pattes arrière et, spontanément, une inflammation des testicules. Le modèle transgénique est présenté comme le "seul" à reproduire l'ensemble des atteintes de la maladie. Le porteur juge son usage "indispensable" pour disséquer les mécanismes, en vue d'une application chez l'humain.
Objectifs
La Spondylarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent au sein de la population adulte française. Le gène d’intérêt est fortement associé au développement de la maladie et constitue le facteur génétique principal multipliant le risque de développer cette maladie par 40. Malgré une association démontrée il y a plus de 50 ans, les raisons pour lesquelles ce gène confère cette prédisposition sont encore peu connues. L’identification des mécanismes impliqués dans l’association gène/maladie est importante car c’est une maladie fréquente, touchant 0,45% de la population adulte en France. De manière importante, il n’existe aucun traitement curatif, seulement des thérapies ralentissant la progression de l’état inflammatoire et de la maladie. Les modèles in vitro ne permettent pas d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques car ils ne récapitulent pas la complexité d’un organisme. Ainsi, l’étude du rat surexprimant le gène d’intérêt constitue le seul modèle récapitulant toutes les atteintes de la SpA.: une inflammation articulaire chronique, une inflammation intestinale et des atteintes inflammatoires de la peau et des griffes. Le développement de ces symptômes cliniques nécessite une un ensemble normal des microbes (bactéries surtout) vivant naturellement dans un organisme (par exemple dans l’intestin), ainsi ces rats élevés en condition stérile ne développent pas de SpA. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer l’influence des constituants du microbiote intestinal sur l’activation des cellules du système immunitaire du rat conduisant au développement de la SpA et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Une meilleure compréhension du rôle pathogène de ces microbes et de leurs constituants pourra conduire à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos expériences consisteront d’abord à administrer des ces microbes à des rats puis à évaluer l’activation des cellules du système immunitaire et s’ils sont capables d’induire la SpA. L’ensemble de ces approches permettra de révéler les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal et ses composants influencent l’activation des cellules immunitaires au cours de la SpA, dans l’objectif final d’identifier et tester de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La spondylarthrite (SpA) est une maladie complexe qui résulte à la fois de facteurs héréditaires et de l’environnement. Elle provoque une inflammation anormale dans l’organisme, entraînant des douleurs importantes et un handicap, souvent chez de jeunes adultes. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir la maladie, seulement des traitements pour en atténuer les symptômes. Mieux comprendre comment le système immunitaire interagit avec les micro‑organismes vivant naturellement dans l’intestin (le microbiote) pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’utilisation d’un modèle animal chez le rat est indispensable pour étudier ces mécanismes en détail et analyser des tissus touchés par la maladie, comme les articulations, qui ne peuvent pas être prélevés régulièrement chez l’être humain. De plus, les études visant à modifier le microbiote doivent d’abord être réalisées chez l’animal avant toute application chez l’Homme. De telles recherches ont déjà permis, par le passé, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, dont certaines sont aujourd’hui utilisées avec succès en pratique clinique.
Procédures
Lors de la procédure, les rats recevront 6 administrations de composés bactériens par voie orale (durée 15 secondes). Les animaux seront suivis ensuite pendant 6 mois pour le développement de la SpA. Des prélèvements de selles fraîches seront effectuées au cours de l’expérimentation à raison de 1 fois toutes les 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues concernent les rats qui développent de manière spontanée une inflammation testiculaire en conditions stériles. À la suite de la colonisation par des bactéries les rats peuvent développer une SpA. Le premier symptôme est la survenue d’une inflammation intestinale se traduisant par une diarrhée qui sera accompagnée par des arthrites (inflammation au niveau des articulations) aux pattes arrière. Ces arthrites évoluent au cours du temps et certaines se résorbent complètement (environ 20% des cas). Les administrations par voie orale et la collection des selles présenteront un léger inconfort aux animaux le plus souvent associé à la contention de l’animal. En cas de douleur, un traitement antalgique par voie sous-cutanée sera mis en place.
Devenir
Tous les animaux issus de la procédure seront mis à mort à la fin de la procédure. Les organes et tissus seront ensuite collectés pour des analyses biologiques et histologies et ajoutés dès que possible à une biobanque limitant des ajouts futurs d’animaux
Remplacement
Les cultures cellulaires in vitro ne sont pas adaptées pour étudier l’interaction hôte–microbiote dans ce contexte, car la maladie étudiée est complexe et implique plusieurs organes (intestin et articulations). Ces modèles simplifiés risquent de ne pas reproduire les mécanismes biologiques pertinents et ne permettent pas de maintenir les conditions anaérobies nécessaires au microbiote. Il est donc nécessaire de recourir à un organisme vivant. Des tests in vitro sont néanmoins réalisés en amont pour vérifier l’absence de toxicité des substances testées.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est strictement limité tout en garantissant que les conclusions tirées d’une étude sont fiables et peuvent être considérées avec confiance afin de respecter le principe de réduction. Plusieurs tests statistiques préalables nous permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet réel, fiable et peu probable d’être dû au hasard. Des tests pour déterminer l’effet sur le développement et la sévérité de la SpA nécessitent des effectifs plus élevés (6 animaux par groupe) Ce projet s’inscrit dans une thématique importante avec des projets similaires menés dans d’autres établissements. Enfin, les analyses seront faites à la fin de chacune des expériences et permettront le cas échéant de ne pas effectuer une expérience supplémentaire si la significativité est atteinte
Raffinement
Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre pour garantir le bien-être des animaux tout au long du protocole. Pour l’administration par voie orale de composés du microbiote, nous utiliserons une canule en plastique adaptée à l’animal et à son poids, afin de diminuer la douleur liée à la procédure. Les changes des cages seront plus fréquents chez les animaux dont l'inflammation intestinale est présente. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel compétent, permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’inconfort. Ces observations sont effectuées par le personnel de zootechnie, par le vétérinaire lors des contrôles réguliers et par les expérimentateurs. L'administration d'un médicament analgésique est prévue pour limiter les douleurs liées à la SpA. En cas de présence d’arthrites causant une difficulté de la mobilité des rats, l’alimentation humidifiée avec de l’eau sera mise à disposition dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement. Des points limites ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi pour ce projet est le rat, en raison de sa pertinence préclinique et de son adéquation expérimentale mimant la SpA. Les rats surexprimant le gène d’intérêt permettent ainsi d’évaluer l’efficacité des traitements en fonction des atteintes cliniques. Les analyses cellulaires, moléculaires, histologiques et cliniques permettent d’appréhender le bénéfice fonctionnel global, tout en respectant les principes des 3R. Ainsi, l’utilisation des rats surexprimant le gène d’intérêt est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques de la SpA. Par ailleurs, les expérimentations de modulation du microbiote doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Les animaux utilisés dans ce projet seront des rats à différents stades de développement allant de 3 semaines d’âge (correspondant au sevrage chez le rat : période de colonisation bactérienne) à l’adulte. Ce choix permet d’évaluer le rôle des composant du microbiote lors du développement de la SpA du rat.
Etude pilote d’essai pré-clinique de thérapie pharmacologique dans un modèle souris pour une neuropathie fatale chez l’Homme (EU3/3)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
268 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue, pour tester une molécule déjà commercialisée contre une maladie neuromusculaire humaine. Chaque animal reçoit une injection quotidienne, puis passe une série de cinq tests comportementaux et un électromyogramme sous anesthésie, à trois puis six mois. La mise à mort permet un prélèvement d'organes pour analyse tissulaire. Le porteur annonce cinq tests comportementaux sans préciser lesquels.
Objectifs
Ce projet multisite déployé sur 3 établissements concerne le développement d’une thérapie pharmacologique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie pharmacologique a pour but de prévenir l’avancée de la pathologie, retardant son développement, voire même de restaurer les fonctions sensorimotrices chez des individus traités en post- symptomatique. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. L’objectif de cette étude multi-établissement est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une molécule déjà sur le marché pour d’autres indications sur une durée de traitement de 1 à 4 mois en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (analyses tissulaires et moléculaires).
Bénéfices attendus
La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices d'une molécule chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique.
Procédures
Les souris recevront la molécule quotidiennement par injection sous cutanée (30 secondes) dans l’établissement utilisateur (EU) 2. Les souris réaliseront une fois (à 3 mois) ou deux fois (à 3 et 6 mois) la série de 5 tests comportementaux (durée : entre 30s et 15mn) au sein de l’EU2. A la suite de ces tests, un électromyogramme mesurant la latence et l’amplitude de la réponse musculaire (réalisé sous analgésie et anesthésie, durée : 15-20mn) sera également réalisé dans l’EU2, à 3 mois ou à 3 et 6 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée pour l’identification des géniteurs, leur mise en accouplements et la vérification des gestations causent un stress léger et court, qui s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Nuisances dues au phénotype : les individus homozygotes peuvent présenter une altération de l’état général à partir de 15 mois. Néanmoins, cet âge ne sera pas atteint car trop tardif pour la reproduction en vue de la création de la cohorte et ou de la fenêtre étudiée dans cette étude. L’injection quotidienne sous cutanée de la molécule (durée 1 mn) peut induire un léger stress dû à la manipulation qui s’atténue à mesure que les animaux s’habituent. L’administration de la molécule peut entrainer une douleur et des réactions cutanées. Les tests de comportements peuvent causer un stresse modéré. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.
Devenir
La validation de ce protocole de thérapie pharmacologique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessite leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses).
Remplacement
Le projet a pour but de valider un premier protocole pharmacologique pour cette maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Le modèle poisson-zèbre a permis de mettre en évidence des effets au niveau physiologique et cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyser nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet. Le nombre d’individus inclus dans chaque procédure a été calculé à l’aide d’outils statistiques.
Raffinement
Le bien-être de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (6 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au minimum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation pour valider notre approche pharmacologique. Notre projet sera réalisé sur des femelles, dont les symptômes sont plus marqués que chez les mâles, au stade adulte (2 à 6 mois). Notre modèle souris présente des défauts moteurs et sensoriels décelables uniquement par des tests comportementaux entre 1 et 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce symptomatique. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie.
Rôle de la surexpression d’une protéine membranaire dans le déclenchement des neuropathies périphériques héréditaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Génétiquement modifiées pour développer une neuropathie périphérique progressive, 85 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Elles subissent chaque semaine des tests moteurs et sensoriels sur animal vigile et deux enregistrements musculaires sous anesthésie, tandis que la double mutation installe des déficits moteurs chroniques. Le porteur cherche à savoir si une protéine surexprimée déclenche la maladie, pour l'ajouter aux panels génétiques proposés aux patients. Toutes sont tuées pour prélever nerfs et muscles.
Objectifs
Ce projet vise à étudier un modèle murin génétiquement modifié susceptible de reproduire les symptômes d'une neuropathie périphérique héréditaire de type Charcot-Marie-Tooth (CMT). Ces souris feront l'objet d'un suivi longitudinal par des évaluations comportementales et électrophysiologiques régulières, afin d'identifier des marqueurs cliniques et biologiques pouvant contribuer à l'amélioration du diagnostic génétique des patients atteints de CMT non résolus.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet concernent principalement la compréhension et la prise en charge des neuropathies périphériques de type CMT. En testant l’hypothèse qu’une surexpression ciblée d’une protéine de remodelage membranaire peut déclencher ou aggraver un phénotype de neuropathie périphérique dans un modèle prédisposé, le projet permettra de mieux définir le rôle potentiel de cette protéine comme gène de risque ou gène causal dans les formes non résolues de CMT. Sur le plan diagnostique, ces résultats pourraient justifier l’intégration de ce gène au panel d’analyses génétiques proposé aux patients CMT non diagnostiqués, en particulier pour rechercher des mutations à gain de fonction ou des duplications. Sur le plan thérapeutique, l’identification d’un déséquilibre fonctionnel entre deux protéines clés du trafic membranaire pourrait ouvrir la voie au développement de stratégies ciblant cet équilibre (par exemple, ajustement de l’expression ou de l’activité de l’une des protéines) afin de prévenir ou atténuer la neuropathie périphérique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux et fonctionnels non invasifs (animaux vigiles), à une procédure instrumentale sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les tests non invasifs sont réalisés hebdomadairement de 8 à 16 semaines, cependant, un enregistrement anticipé pourra être effectué si l'état clinique de l'animal l'exige, conformément aux points limites définis dans le protocole (1-15 min par animal, par test et par semaine). Un enregistrement de l’activité musculaire est réalisé à deux reprises chez chaque animal (à 8 et 16 semaines), pour une durée maximale de 15 minutes par session, avec une surveillance respiratoire continue.
Impact sur les animaux
Les effets prévus sur les animaux résultent à la fois des manipulations expérimentales et des nuisances liées aux mutations. Les tests sur animaux vigiles peuvent induire un stress transitoire, une fatigue musculaire ou une anxiété modérée, mais ces effets sont limités en durée et en intensité, avec des périodes de repos suffisantes entre essais. L’enregistrement de l’activité musculaire , réalisé sous anesthésie générale à l’isoflurane, comporte un risque anesthésique minimal (dépression respiratoire, hypothermie) et une douleur ou irritation locale potentielle au site d’insertion des électrodes, compensée par la surveillance continue. Les mutations génétiques induisent un phénotype dommageable caractérisé par des déficits moteurs progressifs et une hypotrophie musculaire au cours du temps. Globalement, les effets indésirables prévus sont légers à modérés et transitoires pour les manipulations, mais chroniques et progressives pour les animaux porteurs de la double mutation ; ils sont maîtrisés par des protocoles de raffinement, de surveillance clinique quotidienne et de points limites prédéfinis permettant l’intervention ou la mise à mort en cas de détresse importante.
Devenir
Le sort prévu pour tous les animaux consiste en leur mise à mort en fin d’expérience, après la réalisation des tests comportementaux, fonctionnels à 16 semaines maximum. La mise à mort est suivie d’une collecte terminale de tissus (muscles, nerfs périphériques et, le cas échéant, cerveau ou moelle épinière), nécessaire pour corréler le phénotype fonctionnel avec les analyses histologiques, moléculaires et ultrastructurales.
Remplacement
Aucune méthode alternative (in vitro, in silico ou autre modèle non animal) ne permet actuellement de reproduire de manière fiable l’ensemble des interactions entre la protéine de remodelage membranaire et la protéine de trafic intracellulaire dans un organisme intégré, ni d’évaluer simultanément les déficits musculaires et neurologiques, la sensibilité périphérique et la conduction nerveuse. Les modèles cellulaires ou bioinformatiques existants ne suffisent pas à remplacer le modèle murin pour caractériser un phénotype de neuropathie périphérique de type CMT (Charcot Marie Touth) et ses corrélats fonctionnels. L’expérimentation animale est donc justifiée à ce stade, en accord avec le principe de remplacement qui impose de n’utiliser des animaux que lorsqu’aucune autre approche ne peut fournir le même niveau d’information.
Réduction
Le principe de réduction est appliqué en minimisant le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques. Le projet prévoit 80 souris réparties en 4 lots (20 animaux par lot, 10 mâles et 10 femelles), ce qui permet d’atteindre une puissance statistique adaptée aux paramètres fonctionnels et histologiques attendus, sans sur‑échantillonnage. Cette estimation s’appuie également sur nos connaissances sur le modèle murin utilisé et les variabilités attendues dans les paramètres fonctionnels et histologiques. Les prélèvements terminaux de muscles et d’organes sont réalisés sur chaque animal en fin de procédure, ce qui permet de corréler données fonctionnelles et analyses moléculaires/histologiques sans multiplier les cohortes. Les protocoles sont standardisés et optimisés (durée des tests, conditions d’hébergement, conditions d’anesthésie, périodes de repos) pour réduire la variabilité et éviter de devoir répéter des expériences. Un suivi clinique quotidien et des points limites prédéfinis permettent de détecter précocement toute détresse, ce qui contribue également à la réduction en évitant de poursuivre des expériences sur des animaux dont l’état de santé se dégrade.
Raffinement
Le principe de raffinement est appliqué tout au long du projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Les souris sont élevées dans des cages enrichies (tunnels, copeaux épais, nids), avec température et hygrométrie contrôlées, cycle lumière/obscurité standardisé, groupées par 5 maximum, alimentation et eau ad libitum, et sont manipulées régulièrement pour limiter le stress lors des tests. En cas de difficulté à se nourrir ou à boire, une nourriture en gel est proposée afin de faciliter l’hydratation et l’alimentation, et de prévenir la déshydratation ou la malnutrition. Les tests comportementaux non invasifs sont limités en durée, réalisés dans un environnement calme, avec des périodes de repos d’au moins 15 minutes entre essais. L'enregistrement de l’activité musculaire est réalisée sous anesthésie générale, avec surveillance continue de la respiration et de l’état général. Les souris sont utilisées pour plusieurs types d’analyses (tests comportementaux, tests de coordination et de force, tests de sensibilité mécanique et thermique, enregistrement de l’activité musculaire , analyses histologiques et moléculaires), ce qui maximise l’information obtenue par animal et évite de multiplier les expériences redondantes Un suivi clinique quotidien est mis en place pour détecter précocement tout signe de souffrance (perte de poids ≥ 15% sur une semaine à partir du poids maximum, difficulté à se nourrir ou à boire, déficits moteurs sévères, comportement de douleur, altération de l’état général), et tout animal atteignant un point limite prédéfini est mis à mort sans délai. Ces mesures garantissent que les conditions de l’expérience sont optimisées pour le bien être animal, tout en préservant la validité scientifique des données.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce souris (Mus musculus) repose sur sa pertinence comme modèle biologique pour l’étude des myopathies et neuropathies périphériques de type CMT, ainsi que sur l’existence de modèles génétiquement modifiés permettant de reproduire de manière fiable les déficits musculaires et neurologiques étudiés. La souris offre une bonne reproductibilité, un temps de génération court et des outils génétiques et analytiques bien établis, tout en restant suffisamment proche de l’humain pour permettre une translation raisonnable des résultats. Les animaux sont utilisés à partir de 8 semaines (âge adulte jeune) jusqu’à 16 semaines, stade auquel le phénotype musculaire et neurologique lié aux mutations est déjà installé mais encore progressif, ce qui permet d’évaluer l’impact de la surexpression de la protéine de remodelage membranaire sur l’évolution de la maladie. Ce choix de stades de développement évite les périodes néonatales ou très avancées de la vie, où la gestion des animaux et l’interprétation des données seraient plus complexes, tout en couvrant une fenêtre temporelle pertinente pour détecter des effets précoces et durables sur la fonction neuromusculaire.
Caractérisation de deux modèles murins porteurs d’une mutation du gène Stac3
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les souris dont la faiblesse musculaire évolue vers la paralysie ou la détresse respiratoire sont mises à mort. 540 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, porteuses de mutations reproduisant une myopathie humaine sans traitement existant. Le porteur reconnaît un risque de mortalité potentiellement élevé et des défauts respiratoires. Toutes sont tuées pour prélever muscles et organes et corréler les mesures fonctionnelles aux analyses des tissus.
Objectifs
Le projet vise à caractériser in vivo les conséquences fonctionnelles et moléculaires d’une mutation associée à une myopathie tubulaire chez l’Homme, à l’aide de modèles murins génétiquement modifiés. À ce jour, aucun modèle animal spécifique de cette maladie n’existe, ce qui limite la compréhension des mécanismes physiopathologiques et le développement de thérapies ciblées. Cette myopathie est caractérisée, chez l’Homme, par une faiblesse musculaire progressive, une fatigue importante, une difficulté à marcher, une instabilité posturale et, dans les formes plus sévères, une atteinte respiratoire et une limitation majeure des activités de la vie quotidienne, rendant la maladie fortement invalidante. Trois modèles murins sont utilisés dans cette étude. Le premier reproduit fidèlement la mutation génétique la plus fréquemment observée chez les patients, ce qui lui confère une forte pertinence translationnelle. Le deuxième est un modèle dans lequel le gène est modifié soit dans l'ensemble de l'organisme, soit exclusivement dans le muscle, permettant de comparer les effets selon l'étendue de la modification. Le troisième est un modèle inductible dans le muscle squelettique, dans lequel la modification génétique est activée de manière ciblée à 4 semaines d'âge, afin d'évaluer les conséquences d'une perte complète de la fonction du gène sur la fonction musculaire. Les données obtenues devraient contribuer à mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette myopathie et à identifier des biomarqueurs fonctionnels et histologiques utiles pour le développement de stratégies thérapeutiques. Ce modèle animal unique, qui reproduit la forme génétique humaine la plus fréquemment observée, constituerait ainsi un outil essentiel pour la recherche translationnelle et l’évaluation préclinique de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la myopathie tubulaire associée à cette mutation, en identifiant les mécanismes moléculaires et fonctionnels qui sous‑tendent la faiblesse musculaire et l’invalidité. Il conduira à la mise au point d’un premier modèle animal pertinent de cette maladie, reproduisant la forme génétique humaine la plus fréquemment observée et comblant un vide majeur dans la recherche préclinique sur cette pathologie rare. Ce modèle servira également à identifier des biomarqueurs fonctionnels et histologiques utiles pour suivre l’évolution de la maladie et évaluer l’efficacité de traitements potentiels. Il permettra de valider ou d’invalider des cibles thérapeutiques et de tester des approches pharmacologiques ou géniques dans un contexte proche de la situation humaine, avant tout essai clinique. À terme, ce travail ouvrira la voie à de futures stratégies thérapeutiques capables de ralentir la progression de la maladie, d’améliorer la force musculaire et la qualité de vie des patients, et de réduire l’invalidité liée à cette myopathie. Enfin, les connaissances acquises pourront également enrichir la compréhension des myopathies tubulaires et des troubles de la signalisation calcique musculaire, avec un impact potentiel sur d’autres pathologies musculaires rares partageant des mécanismes communs.
Procédures
Le phénotypage comportemental est réalisé chez l'animal vigile, sans anesthésie. L'enregistrement de l'activité locomotrice spontanée est effectué pendant un maximum de 22 h, période au cours de laquelle les animaux sont hébergés individuellement sans isolement sensoriel (ni olfactif ni auditif), toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines. Les tests de coordination motrice (durée maximale de 4 minutes par essai) et d'endurance (durée maximale de 2 minutes par essai) sont réalisés toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines. Les tests de force musculaire sont réalisés toutes les semaines à partir de 4 semaines, avec une durée maximale de 1 minute par essai. Ces tests sont répétés jusqu'à 16 semaines maximum. Les mesures de force musculaire in vivo consistent en l'enregistrement de la production de force des muscles antérieurs sous anesthésie profonde par inhalation d'un mélange gazeux continu. Chaque séance dure au maximum 15 minutes et est réalisée toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines, jusqu'à 16 semaines maximum. Les mesures de force musculaire in situ impliquent une intervention chirurgicale mineure sous anesthésie générale profonde associée à une analgésie, dont l'administration ne dépasse pas 5 secondes. Chaque séance dure au maximum une heure et est réalisée une seule fois par animal, sans réveil, en fin de procédure (8 ou 16 semaines). L'induction génétique consiste en l'administration d'un agent inducteur, une fois par jour pendant 5 jours consécutifs, chez des souris âgées de 4 semaines, avec une durée de manipulation d'environ une minute par jour. Ces interventions sont conçues pour être aussi brèves et peu répétées que possible, tout en permettant la collecte des données nécessaires à la caractérisation complète du phénotype musculaire et à l'analyse moléculaire et histologique.
Impact sur les animaux
Les effets prévus sur les animaux dans le cadre de ce projet sont principalement liés aux manipulations expérimentales, à l'induction génétique et au phénotypage musculaire, et restent compatibles avec un niveau de souffrance modéré contrôlé. D'une part, les souris porteuses de la mutation ciblée développeront une faiblesse musculaire progressive, une fatigue accrue et une diminution de la force de préhension et de la performance locomotrice, en lien avec la myopathie tubulaire modélisée. D'autre part, dans les cas les plus sévères, des défauts de couplage excitation-contraction avec paralysie et difficultés respiratoires pourraient apparaître. Les risques de mortalité sont potentiellement élevés, justifiant les stratégies alternatives et un suivi clinique strict. Ces signes se traduiront par une mobilité réduite, une difficulté à marcher ou à maintenir l'équilibre lors des tests de coordination motrice et d'endurance, ainsi que par une perte de masse musculaire progressive chez les animaux les plus sévèrement atteints. Les procédures de phénotypage comportemental et locomoteur non invasif induiront un stress temporaire lié à la manipulation et au changement d'environnement, mais sans douleur ni lésion tissulaire. L'activité locomotrice spontanée de l'animal sera mesurée, ce qui impliquera un hébergement individuel pendant une durée maximale de 22 heures, sans isolement sensoriel (maintien du contact olfactif et auditif avec les congénères), afin de limiter au maximum le stress lié à la solitude. L'induction génétique à 4 semaines, ainsi que les procédures d'anesthésie générale à 8 ou 16 semaines, s'accompagneront d'un stress lié à la contention de l'animal (d'une durée de 15 secondes maximum) et au point de ponction, mais ces procédures seront réalisées de manière rapide et standardisée, avec une manipulation douce et une formation du personnel visant à minimiser l'anxiété. Des effets indésirables transitoires tels qu'une baisse d'appétit, une léthargie ou des troubles digestifs mineurs peuvent survenir après l'induction génétique
Devenir
Le sort prévu pour tous les animaux, consiste en leur mise à mort pour la collecte de tissus. La collecte terminale de muscles et d’organes est nécessaire pour corréler phénotype fonctionnel et analyses moléculaires/histologiques. Les prélèvements sont réalisés après la mise à mort, ce qui évite toute douleur supplémentaire.
Remplacement
Aucun modèle non animal ne permet actuellement de reproduire de manière satisfaisante la physiopathologie d’une myopathie tubulaire liée à cette mutation, ni de rendre compte de la complexité de la fonction musculaire in vivo, de la locomotion, de la fatigue et des interactions tissulaires. Les modèles cellulaires (cultures de myoblastes, lignées musculaires) ou les approches in silico ne permettent pas d’étudier l’ensemble du phénotype fonctionnel, ni la dynamique de la maladie au cours du temps dans un organisme entier. L’utilisation de souris génétiquement modifiées reste donc indispensable pour comprendre les mécanismes moléculaires de la pathologie, valider la pertinence de cibles thérapeutiques et tester des approches précliniques. Le modèle animal développé reproduit génétiquement la forme humaine de la maladie la plus fréquemment observée, ce qui renforce sa pertinence translationnelle et limite, à l’avenir, le recours à d’autres modèles animaux moins ciblés ou moins représentatifs. En ce sens, le choix de ce modèle murin répond à une nécessité scientifique forte et constitue une application rigoureuse de la règle de remplacement, dans la mesure où aucun système non animal ne peut aujourd’hui remplacer l’animal dans ce contexte spécifique.
Réduction
Le plan expérimental repose sur une répartition optimisée des lots (un lot par stratégie de recombinaison) avec un effectif par génotype (contrôles, hétérozygotes, homozygotes) calculé pour détecter des différences biologiquement significatives dans la force musculaire, la locomotion et la morphologie, sans surdimensionnement inutile. Les procédures de phénotypage non invasif et les mesures de force musculaire in vivo et in situ sont regroupées autant que possible sur les mêmes animaux, afin d'obtenir un maximum d'informations fonctionnelles par individu. Les prélèvements terminaux de muscles et d'organes sont réalisés sur chaque animal à la fin de la période de traitement ou de survie, ce qui permet de corréler données fonctionnelles et analyses moléculaires/histologiques sans multiplier les cohortes. Enfin, le recours à un modèle animal unique, reproduisant génétiquement la forme humaine la plus fréquemment observée, évite le développement de plusieurs modèles redondants. Cette approche limite, à l'avenir, le besoin d'animaux supplémentaires pour des études précliniques ultérieures.
Raffinement
Le bien être des nouveaux nés est surveillé quotidiennement par observation clinique (état général, activité, présence d'une poche de lait, interaction avec la mère et les congénères) et par pesée régulière afin de détecter précocement tout signe de détresse, de retard de croissance ou de souffrance. Au sevrage vers 4 semaines, les animaux sont pesés 2 à 3 fois par semaine afin de surveiller leur état général ; en cas de perte de poids, la pesée est effectuée quotidiennement pour suivre l'évolution et adapter rapidement la prise en charge. En cas de difficultés de locomotion ou de prise alimentaire, de la nourriture en gel est ajoutée dans les cages pour faciliter l'accès à la nourriture et prévenir la dénutrition. Les procédures de phénotypage comportemental et locomoteur sont non invasives et réalisées chez l'animal vigile, avec une durée de test strictement limitée et une fréquence régulée pour éviter la fatigue et le stress cumulatif. Les mesures de force musculaire in vivo et in situ sont réalisées sous anesthésie générale profonde et anti douleur, avec une durée d'anesthésie minimale, une surveillance respiratoire continue et un maintien de la température corporelle afin de préserver le bien être de l'animal. Les injections sont réalisées avec une contention douce et une manipulation rapide. L'isolement des animaux pour la mesure de l'activité locomotrice spontanée est limité à 22 heures maximum et réalisé sans isolement sensoriel (contact olfactif et auditif maintenu avec les congénères). Enfin, la mise à mort en fin de procédure, suivie de prélèvements terminaux, évite la poursuite de l'expérience au delà d'un stade où la progression de la myopathie pourrait entraîner une détérioration importante de l'état des animaux.
Choix des espèces
Ce projet vise à mieux comprendre une maladie musculaire héréditaire en utilisant des souris comme modèle. Les souris sont choisies car elles permettent de reproduire de façon fiable les anomalies musculaires observées chez l’homme, notamment la forme génétique la plus fréquente de cette maladie, tout en offrant un contrôle génétique précis grâce à des outils modernes de modification du génome. Ce modèle pourrait également servir de base pour évaluer de futures approches thérapeutiques visant à corriger ou atténuer les effets de cette maladie. Les souris seront utilisées uniquement après le sevrage, à partir de 4 semaines d’âge, puis suivies jusqu’à 16 semaines. Ces stades correspondent à des animaux jeunes puis adultes, ce qui permet d’étudier à la fois l’apparition et l’évolution de la maladie dans le temps. Des tests fonctionnels, des analyses musculaires et des examens histologiques seront réalisés pour caractériser précisément les effets de la mutation étudiée sur la force et la structure des muscles.
Rôle du métabolisme des phosphoinositides dans la physiopathologie de la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 217 souris porteuses d'une myopathie qui les tue en moyenne vers treize semaines vont être utilisées, dans des procédures classées légères à sévères. Elles subissent des injections quotidiennes pendant 28 jours, des tests de force et de course, une stimulation électrique de la jonction neuromusculaire et l'injection d'un virus. Le RNT répète que cette maladie "ne provoque pas de douleur", tout en classant 418 de ces souris en souffrance sévère et en décrivant une dégradation musculaire jusqu'à la mort. Toutes sont tuées pour disséquer leurs muscles et tester trois traitements censés prolonger leur survie.
Objectifs
La myopathie centronucléaire liée au chromosome X est une maladie grave, touchant les garçons dès la naissance, qui rend les muscles très faibles et pour laquelle il n’existe malheureusement pas encore de traitement. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine qui contrôle le métabolisme de certains types de lipides. Lorsque la protéine ne fonctionne pas bien, les muscles perdent leur force et deviennent plus petits. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du muscle et dans le développement de la myopathie centronucléaire, nous avons créé une nouvelle lignée de souris dans laquelle cette protéine a perdu sa fonction. Ces souris commencent à montrer des signes de myopathie vers 6 semaines et vivent moins longtemps que les souris normales. Dans leurs cellules musculaires, deux fonctions semblent particulièrement perturbées : la fonction mitochondriale et la fonction lysosomale. L’objectif du projet est de mieux caractériser l’évolution de la fonction musculaire chez ces souris au cours du développement de la myopathie centronucléaire et de comprendre comment les fonctions mitochondriale et lysosomale sont contrôlées par cette protéine. Nous testerons également plusieurs traitements pour restaurer les fonctions mitochondriale et lysosomale lorsque la protéine ne fonctionne plus afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques contre cette maladie. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs : les tests auront lieu dans l’EU 1 et la mise à mort sera effectuée dans l’EU 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la perte de fonction de la protéine perturbe le fonctionnement normal du muscle et provoque la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (XLCNM). Plus précisément, il permettra d’étudier le rôle des fonctions mitochondriale (production d'énergie pour la cellule) et lysosomale (recyclage des déchets cellulaires) dans le développement de la maladie. De plus, il permettra de tester de nouveaux traitements potentiels en vérifiant qu’ils ne sont pas toxiques et qu’ils sont efficaces pour empêcher ou ralentir le développement de la XLCNM. Si les résultats sont positifs, ils pourront être proposés pour de futurs essais chez les patients atteints de myopathie centronucléaire.
Procédures
Sur le 1er groupe d’animaux, 4 fois (semaines 4-7-10-13), sur animal vigile sauf si mention contraire : -mesure de composition corporelle : contention dans l’appareil de mesure de la composition corporelle, 2 minutes -test de force (force d'agrippement des 4 membres à une grille reliée à un dynamomètre): 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais -test de course sur tapis roulant : 10-45 minutes selon la capacité des animaux -test de motricité (temps mis pour franchir un obstacle de type "échelle horizontale" en marchant): 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux -test de la fonction de la jonction neuromusculaire (animal anesthésié) : stimulation électrique 8 x 0,2 millisecondes Sur le 2ème groupe d’animaux, 1 fois : 1 injection sur animal anesthésié, 10 secondes Sur le 3ème groupe d’animaux : -injection intrapéritonéale : 1 / jour pendant 28 jours consécutifs, 28 x 10 secondes -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Sur le 4ème groupe d’animaux : -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Toutes ces interventions seront réalisées dans l’établissement EU 1.
Impact sur les animaux
La myopathie centronucléaire chez l’Homme se caractérise par une faiblesse musculaire dès la naissance, sans douleur, due à l’absence d’une protéine. La faiblesse musculaire s’aggrave progressivement jusqu’ à ce qu’ils ne puissent plus respirer et meurent vers l’âge de 2,5 ans. La souris que nous avons créée, dont la protéine n’est plus fonctionnelle, développe les premiers symptômes autour de 6 semaines. D’après nos premiers résultats, ces symptômes deviennent sévères rapidement pour aboutir à une perte de mobilité des membres inférieurs et à la mort des animaux autour de 13 semaines en moyenne. Ponctuellement, les souris seront soumises à des stress et de l’inconfort pour des durées très courtes (contention nécessaire aux injections et injections elles-mêmes, mesures de composition corporelle et de force) ou courtes avec fin immédiate du stress et de l’inconfort à l’arrêt de la manipulation (tests d’endurance). Les traitements viseront tous à améliorer le phénotype musculaire et à prolonger la durée de vie. Deux d’entre eux ont déjà été largement utilisés dans des modèles animaux et testés lors d’études cliniques. Concernant le troisième, son absence de toxicité à haute dose à court et moyen termes (4 mois) a déjà été testée et validée sur des souris. Afin de déterminer les conditions de traitement optimales, la présente demande inclut une expérience préliminaire au cours de laquelle des petits groupes de souris seront traités selon différentes modalités, mais à des doses inférieures ou égales à celle déjà testée. Enfin, l’injection par voie intraveineuse d’un virus spécial (utilisé chez l’Homme en thérapie génique), qui permettra de faire briller une protéine dans certaines parties de la cellule, bien que réalisée sous anesthésie, pourrait entraîner un inconfort léger au réveil. Pour éviter cela, nous utiliserons un gel analgésique localement.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort et leurs muscles disséqués pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires ou pour préparer des cultures de cellules musculaires in vitro.
Remplacement
Le but principal de ce projet est d’étudier un nouveau modèle de la myopathie centronucléaire pour mieux comprendre comment les muscles sont touchés. Ensuite, ce modèle servira à tester plusieurs traitements qui pourraient aider les muscles à mieux fonctionner. Pour cela, nous devons mesurer des paramètres importants du fonctionnement du muscle comme la force, l’endurance, la façon dont les souris bougent mais aussi combien de temps elles vivent. Ces paramètres ne peuvent pas être mesurés avec d’autres méthodes. Les autres méthodes disponibles sont des cellules musculaires qui poussent dans une boîte en plastique au laboratoire, mais ces cellules ne deviennent jamais aussi développées, ni aussi fortes, que de vrais muscles dans un corps vivant. Elles ne peuvent même pas vraiment se contracter comme un vrai muscle. Elles ont quand même été utiles pour comprendre ce qui ne marche plus quand la protéine d’intérêt est absente, et pour trouver quelles parties de la cellule sont perturbées (par exemple, les mitochondries et les lysosomes). Ces cellules seront d’ailleurs à nouveau utilisées plus tard pour comprendre comment elles réagissent aux traitements, mais pour bien étudier l’effet des médicaments sur les muscles, il faut utiliser les souris du modèle de myopathie centronucléaire.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes statistiques pour calculer combien de souris utiliser pour chaque expérience afin d’être sûrs d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Tout d’abord, nous comparerons la force des muscles entre les souris saines et les souris malades au cours de l’évolution de la maladie. D’après nos tests précédents, il faut environ 21 souris par groupe pour voir une vraie différence. Nous incluerons 2 souris de plus dans le groupe malade au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Des souris seront également nécessaires pour étudier ce qui se passe à l’intérieur des muscles aux différentes étapes du développement de la maladie, c’est-à-dire aux âges de 4, 7, 10 et 13 semaines. Pour ces analyses, nous aurons besoin de 9 souris par groupe. Ensuite, nous ferons un essai pour vérifier une nouvelle technique qui permet de « marquer » certaines parties des cellules musculaires (mitochondries et lysosomes) avec un virus spécial. Pour ça, nous utiliserons seulement 3 souris saines par groupe. Pour comparer les protéines et les petites molécules dans ces mitochondries et ces lysosomes chez les souris saines et les souris malades, nous utiliserons 6 à 12 souris par groupe selon la variabilité des mesures. Les groupes de souris malades auront une souris de plus au cas où l’une meure plus tôt à cause de la myopathie. Puis nous testerons différents traitements (3 médicaments, donnés à différents moments au cours du développement de la maladie) pour essayer d’améliorer la force des muscles et augmenter la durée de vie des souris. Pour cela, nous aurons besoin de plusieurs groupes de souris pour comparer les effets de ces traitements à des souris saines et à des souris malades non traitées. Nous aurons besoin de 19 souris par groupe pour détecter une différence intéressante, et nous ajouterons 2 souris de plus dans les groupes de souris malades au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Enfin, des souris serviront à préparer des cellules musculaires en laboratoire pour comprendre ce qui se passe à l’intérieur des cellules et comment elles réagissent aux traitements.
Raffinement
La myopathie centronucléaire, chez les souris comme chez les patients, ne provoque pas de douleur au niveau des muscles, ni ailleurs. Nous serons quand-même attentifs à ce que les souris ne souffrent pas durant nos expériences. Pour cela, nous leur permettrons d’avoir un comportement aussi naturel que possible dans leurs cages en leur donnant du matériel leur permettant de ronger et de faire un nid, et elles seront plusieurs par cage afin de ne pas souffrir d’isolement. Lorsque leurs muscles deviendront faibles et qu’elles auront du mal à se déplacer, nous leur fournirons la nourriture et l’eau directement au fond de la cage pour qu’elles n’aient aucun effort à faire pour s’alimenter. Avant de réaliser les tests de la fonction musculaire, nous les habituerons aux systèmes utilisés pour qu’elles ne soient pas stressées au moment de faire les tests. Lorsque des anesthésies seront nécessaires, nous les placerons sur un tapis chauffant pour ne pas qu’elles aient froid durant l’expérience. Suite aux injections intraveineuses de virus, nous utiliserons un analgésique local.
Choix des espèces
La myopathie centronucléaire est une maladie musculaire due à l’absence d’une protéine dans le muscle. Nous avons donc créé une nouvelle lignée de souris chez laquelle cette protéine ne fonctionne pas dans le muscle afin d’étudier comment la protéine provoque la maladie. Ces souris ne présentent initialement pas de symptômes ; à partir de 6 semaines, leur fonction musculaire commence à se dégrader et elles meurent en moyenne vers 13 semaines. Dans les expériences sans traitement, nous utiliserons des souris âgées entre 4 et 13 semaines, c’est-à-dire avant le moment où elles risquent de mourir de la maladie. Dans les expériences avec traitements, ceux-ci auront pour objectif d’améliorer la fonction musculaire, mais également d’augmenter la durée de vie. Si ces traitements fonctionnent, nous serons donc amenés à étudier les souris au-delà de 13 semaines, plus ou moins longtemps en fonction de l’efficacité des traitements pour maintenir la fonction musculaire.
Étude de l’effet d’une molécule visant à protéger le cœur et les muscles dans la dystrophie musculaire de Duchenne chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
119 rats atteints d'une forme de myopathie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, un groupe étant laissé vivre la maladie jusqu'au décès autour de douze mois. Selon les groupes, ils reçoivent une pompe implantée sous la peau renouvelée toutes les quatre semaines, un capteur cardiaque, des échographies sous anesthésie et cinq prélèvements sanguins. Le niveau de souffrance déclaré va de modéré à sévère, 32 animaux étant opérés sous anesthésie et tués sans réveil. Le projet teste un dérivé d'oméga-3 censé protéger le cœur et les muscles, bénéfice renvoyé à d'éventuels essais chez l'humain.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (ou myopathie de Duchenne) est une maladie génétique grave causée par une mutation sur le gène codant pour la dystrophine, une protéine essentielle au bon fonctionnement des muscles. Elle touche uniquement les garçons et entraîne une faiblesse musculaire progressive, affectant à la fois les muscles du corps et le cœur. Avec le temps, ces faiblesses conduisent généralement à un décès prématuré causé par une insuffisance cardiaque et respiratoire. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir la maladie, bien que plusieurs approches thérapeutiques soient en cours de développement. De nombreuses études ont montré que certaines graisses nommé « oméga-3 », issus de l’alimentation, ont des effets bénéfiques sur l’organisme. Ils aident à réduire l’inflammation et à améliorer certains paramètres sanguins, en particulier en diminuant des lipides comme les triglycérides. Ces oméga-3 protègent le cœur et les muscles, notamment en maintenant un bon équilibre du calcium à l’intérieur des cellules. Plus récemment, notre équipe a mis en évidence qu’un dérivé d’un oméga-3, possède des propriétés protectrices. Ce dérivé est capable de réduire les troubles du rythme cardiaque, l’inflammation et certains problèmes musculaires, en particulier au niveau du diaphragme. Dans le cadre de la myopathie de Duchenne, les atteintes musculaires et cardiaques ont, notamment un mécanisme commun les altérations de la régulation du calcium. L’objectif de ce projet est donc de déterminer si les effets d’un traitement avec la molécule peuvent limiter l’évolution d’un modèle de rat atteint de myopathie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Si les améliorations observées chez ces animaux concernant la mobilité, les fonctions respiratoires et cardiaques sont confirmées, ces résultats pourraient potentiellement ouvrir la voie à des études chez l’humain et servir de base au développement de futurs traitements. Au-delà des avancées scientifiques, ce projet pourrait apporter des bénéfices concrets aux patients et à leurs familles, en orientant la recherche vers des stratégies thérapeutiques capables d’améliorer la qualité de vie, ce qui contribuerait à prolonger l’espérance de vie.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront répartis en plusieurs groupes et suivront différentes procédures expérimentales. Un premier groupe de 32 animaux recevra une injection. Un second groupe de 18 animaux sera équipé d’un petit dispositif implanté sous la peau, permettant d’administrer le traitement de manière continue et contrôlée. Deux groupes de 23 animaux chacun recevront à la fois ce dispositif d’administration du traitement (une pompe osmotique) et un petit capteur implanté permettant de suivre à distance l’activité du cœur (un capteur télémétrique). Ces animaux bénéficieront également d’examens d’imagerie du cœur (des échocardiographies) réalisés sous anesthésie, ainsi que de prélèvements sanguins, effectués cinq fois au total, dans le cadre de procédures à court et moyen terme. Un dernier groupe de 23 animaux sera suivi sur une période plus longue. Le dispositif d’administration du traitement sera renouvelé toutes les quatre semaines, jusqu’au décès de l’animal. Les interventions sont brèves : les injections durent moins de 5 minutes, les imageries cardiaques environ 15 minutes, les mesures d’activité respiratoire et de force 30 min, et la mise en place des dispositifs implantés moins de 30 minutes. Toutes les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie. Un suivi régulier est assuré afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long de l’étude.
Impact sur les animaux
Les rats malades qui ne reçoivent pas de traitement vont vivre la maladie, présentant un niveau de stress plus élevé, dont les premières manifestations cliniques apparaissent généralement à partir de 3 semaines. Pour ces animaux, la maladie progressant, leur état devrait se détériorer entre 6 et 10 mois jusqu’au décès autour de 12 mois, au plus tard. Des effets peuvent survenir lors de l’implantation unique du capteur télémétrique et de la pompe osmotique, ainsi qu’au cours des anesthésies gazeuses nécessaires aux échocardiographies. Ces effets incluent principalement un inconfort ou une douleur légère au site d’implantation, une inflammation locale passagère, ainsi qu’un stress lié aux manipulations. Les anesthésies gazeuses peuvent entraîner une fatigue, une désorientation brève au réveil et une baisse de la température corporelle. L’ensemble de ces manifestations est généralement de courte durée et disparaît spontanément, sans séquelles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les échantillons nécessaires aux analyses biochimiques, histologiques et moléculaires.
Remplacement
Les dystrophies musculaires notamment de Duchenne touchent plusieurs organes (les muscles, le cœur, le cerveau ...). Avant toute expérimentation animale, ce traitement a fait l’objet d’études approfondies sur des cellules, assurant une compréhension des mécanismes biologiques impliqués. L’administration de la molécule a déjà montré des effets bénéfiques sur le muscle et le cœur validés dans des modèles expérimentaux rigoureux, chez la souris ensuite chez le cochon, pour des applications proches (une altération du diaphragme). Cette démarche progressive garantit que l’utilisation d’animaux est strictement limitée aux questions scientifiques qui ne peuvent être résolues autrement, tout en respectant les principes éthiques.
Réduction
L’équipe de recherche possède une solide expérience sur cette lignée animale. Des analyses statistiques ont été réalisées pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires grâce aux essais déjà obtenus, tout en garantissant la robustesse des résultats. Pour ce projet, nous avons conçu une série de procédures complémentaires, chacune optimisée pour limiter l’utilisation d’animaux. En effet, les expériences sont planifiées pour combiner plusieurs mesures sur un même animal. Chaque animal est suivi précisément, ce qui réduit le risque de perte et donc le besoin d’en utiliser plus. Les procédures sont répétées uniquement si nécessaire. Certaines procédures reposent sur un suivi au long terme permettant que chaque animal soit observé à plusieurs moments et puisse être comparé, ce qui augmente la précision statistique sans avoir besoin d’en utiliser davantage.
Raffinement
Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à un contact doux et régulier afin de limiter le stress lié aux manipulations. Chaque jour, un temps d’interaction est prévu pour maintenir une relation calme et positive avec les intervenants. De plus, des séances de jeux dans des espaces plus larges seront ponctuellement effectuées. Ils sont hébergés en groupe dans un environnement confortable favorisant leur bien-être La prise en charge de la douleur est assurée tout au long des procédures, de façon préventive et curative si nécessaire, grâce à l’administration de médicaments destinés à l’anesthésie et au soulagement de la douleur. Pour détecter rapidement tout signe de souffrance, des critères de suivi du bien-être ont été établis et évalués quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Ces critères concernent l’apparence générale des animaux (pelage, yeux), leur comportement (mobilité, interactions) et leur état physique (masse corporelle). En cas de signe de douleur ou de gêne, des mesures adaptées sont mises en place immédiatement : surveillance renforcée et traitement médicamenteux pour réduire ou éliminer la douleur.
Choix des espèces
Le rat est un mammifère proche de l’être humain sur le plan biologique, ce qui en fait un bon modèle d’étude. Il partage de nombreux aspects avec l’humain, concernant la structure et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Grâce aux avancées récentes en génétique, il est aujourd’hui possible de reproduire chez le rat certaines maladies humaines, notamment les troubles musculaires, de manière très fidèle. Ce modèle conserve par ailleurs les avantages propres aux rongeurs : une courte durée de gestation, une taille adaptée aux études expérimentales et une durée de vie compatible avec l'observation dans un temps raisonnable d'effets à long terme des médicaments testés sur des individus âgés. Il est un excellent complément aux autres modèles. Les animaux seront suivis dès 5 semaines afin d’évaluer l’effet du traitement sur la durée, en observant les signes cliniques de la maladie, notamment la motricité, la respiration et le fonctionnement cardiaque.
Identification de virus adéno-associé pour édition du génome des cellules satellites du muscle squelettique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Une partie des 224 rats utilisés porte une mutation du gène Dmd qui reproduit la dystrophie musculaire de Duchenne. Tous sont tués, dans des procédures classées en souffrance légère, après une injection unique de virus adéno-associé sous anesthésie et, pour 48 d'entre eux, des tests de force répétés. Les rats malades sont mis à mort entre 1 et 3 mois, avant l'apparition des atteintes les plus lourdes du phénotype. La mise à mort sert à prélever les muscles pour repérer quelles capsides virales atteignent le mieux les cellules souches, en vue d'une future thérapie génique.
Objectifs
Les cellules satellites du muscle squelettique sont essentielles pour la régénération, et peut-être la population cellulaire clé pour les thérapies géniques pour lutter contre des myopathies, comme la dystrophie de Duchenne (DMD). Les cellules satellites sont entourées par plusieurs types de cellules. Les thérapies pour certaines maladies musculaires pourraient être améliorées en ciblant ces cellules souches, et en évitant l’expression du transgène (gène thérapeutique qui remplace le gène défectueux causant la maladie) dans d’autres cellules, qui pourraient déclencher des réponses immunitaires. Aujourd’hui la thérapie génique repose fortement sur l’utilisation de virus adéno-associé (AAV). Les différents variants du virus ont des capacités différentes d’infecter des organes et populations cellulaires spécifiques. En modifiant les protéines de surface des virus, les capsides, des équipes autour du monde cherchent à trouver des variants d’AAV encore plus spécifiques que ceux trouvés dans la nature. Nous allons utiliser des AAV avec des capsides variées pour identifier les meilleurs variants qui peuvent cibler les cellules satellites du muscle squelettique. Des rats d'une souche type sauvage ou avec une dystrophie provoquée par mutation du gène Dmd recevront une injection du virus par traitement qui circule dans tout le corps. On vérifiera que les cellules satellites sont bien ciblées en les isolants du tissu, en les examinant individuellement et en analysant leur ADN et ARN. Quelques virus seront également testés pour leur capacité de guérir la dystrophie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier des capsides qui permettent une expression de transgène spécifique pour les cellules souches du muscle squelettique. Une telle capside n’est pas connue à ce jour, donc l’identification sera une avancée importante pour la thérapie génique du muscle. Du point de vue clinique, ces capsides seraient essentielles pour des thérapies géniques ciblées pour les cellules souches, pour éviter des effets hors-cible et des réponses immunitaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection qui dure environ 30 minutes avec anesthésie. 48 animaux seront soumis à des tests de force, qui durent également environ 30 minutes. Cinq mesures successives seront effectuées, avec un temps de repos minimum de cinq minutes entre chaque essai.
Impact sur les animaux
Nous attendons une douleur légère liée avec les injections systémiques et intramusculaires, qui ne nécessite pas de traitement analgésique. Les rats DMD ne présentent pas des effets délétères majeurs du phénotype avant l’âge de 10 mois, et dans ce projet, ils seront mis à mort entre 1 et 3 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Les variants d’AAV ont déjà été testés dans d’autres modèles, dont la souris. Plusieurs expériences seront avec des bibliothèques de variants, ce qui permet de tester des millions de variants dans un seul animal. La complexité de la niche des cellules souches du muscle ne peut pas être reconstitué in vitro, et c'est donc essentiel que ces expériences soient faites dans des rats, pour examiner la spécificité des capsides.
Réduction
Le nombre d’animaux soumis aux expérimentations avec AAV est nécessaire pour la cytométrie en flux, l’extraction d’ADN, et les coupes histologiques. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Le calcul de puissance statistique nous recommande d’utiliser 8 rats par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés. Les données seront analysées avec des tests ANOVA.
Raffinement
Les animaux sont élevés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la règlementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, avec un nombre par cages adapté à leur taille. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites pour cette lignée a été établie. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice précisée sur la grille. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat pour des raisons multiples. Le rat est un mammifère et la conservation des fonctions et protéines entre mammifères suggère qu'un AAV qui peut infecter les cellules satellites du muscle de rat aura une capacité similaire d'infecter les cellules satellites du muscle humain. Les AAVs seront injectés à 4 semaines d’âge, quand le muscle se forme toujours, parce que les cellules satellites sont plus accessibles au virus à ce stade.
Gestion de la production d’animaux qui présentent une myopathie à agrégats tubulaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les souris qui deviennent rachitiques, sous 18 à 20 grammes, sont mises à mort, comme celles dont la perte de poids persiste ou qui développent des malocclusions. 3 600 souris sont utilisées, toutes dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, toutes tuées à l'issue. Le projet gère la production d'une lignée modifiée pour reproduire une myopathie rare qui provoque faiblesse musculaire, maigreur et déformation du dos. Les surnuméraires à "phénotype dommageable" sont tués avant l'apparition des symptômes.
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare congénitale caractérisée par de la faiblesse musculaire, des crampes et de la myalgie. Elle est associé à un syndrome multisystémique appelée le syndrome de Stormorken (STRMK) qui englobe de nombreux symptômes tels qu'une plus petite taille, une thrombocytopénie, de l'hyposplenie ou de l'ichtyose. Le modèle murin TAM/STRMK mimique fidèlement le phénotype musculaire mais également le phénotype multisystémique trouvés chez les patients. Ce modèle nous a déjà permis de valider différentes approches thérapeutiques géniques et pharmacologiques translationnelles, et d'évaluer leur effet systémique sur le phénotype global. Néanmoins, certains aspects de la maladie sont encore mal compris, notamment la thrombocytopénie qui n'a pas pu être amélioré par les traitements testés pour l'instant.
Bénéfices attendus
Ce projet permet la production et le suivi d'animaux à phénotype dommageable afin d'assurer le maintien de la lignée, envoi à des collaborateurs, mais également à l’utilisation continue vers des des projets experimentaux. Ils participent à la meilleur compréhension de la maladie et de ses symptômes multisystémiques, mais également à la mise en place et à la validation d'approches thérapeutiques translationnelles.
Procédures
Ce projet permet la gestion et le suivi de la production d'animaux qui présentent un phénotype dommageable caractérisé notamment par une petite taille et une maigreur. En adéquation avec ce phénotype, les animaux sont régulièrement surveillés et pesés pour limiter et suivre la perte de poids, le nourriture en gel disposée dans la cage permet également de faciliter leur alimentation et s'assurer d'une hydratation normale.
Impact sur les animaux
La souris a un phénotype clair qui s'aggrave avec le temps. Visuellement, elle est plus petite, plus maigre et présente une cyphose claire à partir de 4 mois. La faiblesse musculaire est surtout visible lorsqu'elle est mésurée directement dans le muscle. Les animaux malades peuvent vivre au-delà de 1 ans, mais certains meurent de causes inconnus avant cet âge.
Devenir
Tous les animaux sont mis à morts afin de permettre: le prélèvement post-mortem (dans le cas de fins d'études experimentales), le renouvellement des reproducteurs (s'ils ne sont pas réutilisés par une étude en cours), de limiter la souffrance en euthanasiant les animaux à phénotype dommageable surnuméraires avant l'apparition des symptômes, mais également d'euthanasier les animaux ayant atteint les points limites de cette étude.
Remplacement
La majorité de nos thérapies sont d'abord validé in vitro dans des cellules murines et humaines. Cependant, la nature multisystémique de notre maladie, ainsi que le muscle qui est une structure complexe encore mal modélisée par les modèles cellulaires, nous oblige pour le moment à utiliser un modèle murin.
Réduction
Nous adapterons le nombre de croisement et donc le nombre de naissances à nos projets en cours afin de limiter la production d'animaux surnuméraires.
Raffinement
Chaque cage est enrichie avec des nids de chanvre pour réduire l’anxiété des animaux. Nos animaux étant plus maigres et plus petits, ils sont régulièrement pesés et observés (au moins une fois par semaine) afin de prévenir toute pertes de poids sévères. Nous déposons également de la nourriture au fond de la cage afin de s'assurer que les animaux puissent se nourrir ad libitum. Les souris malades n'ont pas de phéntoype visible à part leur petite taille et leur poids réduit. Il arrive qu'au-delà de 4 mois d'âge, certaines souris soient rachitiques (avec un poid inférieur à 18-20g), cet état est considéré comme un point limite et les souris seront mises à morts. Additionnellement, les souris ayant perdu au-delà de 10% du poids maximal atteints seront surveillées de près avec ajout de nourriture en gélée (Dietgel)et pesée journalière. Si la perte de poids est maintenue dans le temps, les animaux seront également mis à mort. Enfin, nous avons récemment eu des cas chroniques de malocclusions, si un tel phénotype se produit à répétition, les animaux seront mis à morts. Les animaux à phénotype dommageable surnuméraires sont mises à morts avant l'apparition des symptômes pour limiter la souffrance. Bien que le modèle animal ne présente pas de signes évidents de douleur ou de détresse nécessitant une prise en charge systématique, une analgésie sera mise en place de manière préventive ou curative dès lors qu’un animal présente des signes cliniques évocateurs de douleur (altération du comportement, posture anormale, perte de mobilité, amaigrissement marqué ou tout autre signe jugé pertinent par le personnel formé). Le choix de l’analgésique, sa posologie et sa durée d’administration seront adaptés en concertation avec le vétérinaire référent, conformément aux recommandations en vigueur et aux procédures de l’établissement. Une surveillance renforcée sera assurée après toute intervention susceptible d’induire une douleur.
Choix des espèces
La TAM/STRMK est une myopathie progressive qui s'aggrave dans le temps, notamment chez le modèle murin, avec une apparition tardive des symptômes multisystémiques qui sont marqués à partir de 4 mois (les symptômes commencent à apparaître à partir de 1 mois). Nos études utilisent ces animaux à plusieurs stades entre 1 mois et jusqu'à au-delà d'un an.
Thérapie génique expérimentale pour le traitement de la myopathie congénitale liée à la myopalladine MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Pour mettre au point une thérapie génique contre une myopathie congénitale très rare, 116 souris porteuses de la mutation sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des tests d'effort répétés jusqu'à l'âge de douze mois, des prélèvements de sang et une injection de vecteur viral ou de solution saline. Les muscles et les organes sont prélevés après la mise à mort pour mesurer l'effet du traitement. Le porteur situe le bénéfice pour les patients après la fin du projet, avec un passage attendu vers l'essai clinique, quand les atteintes portées aux souris sont immédiates.
Objectifs
Les myopathies congénitales constituent un groupe hétérogène de troubles neuromusculaires héréditaires dont les symptômes sont une faiblesse musculaire et des déformations squelettiques, ayant pour certaines un fort impact sur la survie et la qualité de vie des patients. Ce projet vise à combler une lacune majeure dans le traitement d'une myopathie congénitale très rare liée à des mutations du gène mypn engendrant un défaut de production de la protéine myopalladine (MYPN-CM, MYPN-associated congenital myopathy). Les mutations dans ce gène mypn entraînent une absence totale ou une diminution de la quantité de protéine MYPN fonctionnelle specifiquement dans les muscles, altérant l’intégrité du tissu musculaire cardiaque et squelettique, à l’origine de myopathies congénitales rares diagnostiquées généralement dès la naissance ou durant l’enfance. Le but du projet présenté pour une durée de 5 ans vise à caractériser plus précisément l'une de ces myopathies congénitales et de mettre au point une thérapie génique pour traiter cette maladie encore incurable, en rétablissant l’expression de la myopalladine manquante. Dans ce but, un modèle de souris déficient pour cette protéine MYPN (souris MKO) sera utilisé, reproduisant les caractéristiques de la maladie humaine du point de vue clinique. Un premier objectif de l'étude est de caractériser les souris MKO à différents âges afin de mieux comprendre l'évolution de la maladie dans ce modèle. Cette première étude permettra également d'établir les paramètres à évaluer lors de la thérapie génique expérimentale qui constitue le deuxième objectif. Les différents paramètres seront analysés avant et après administration d'un traitement permettant une expression de la protéine MYPN chez les souris MKO, afin de déterminer les bénéfices thérapeutiques de ce traitement, mais également d’écarter tout potentiel effet indésirable sur les autres organes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à répondre à un besoin médical non satisfait en fournissant une approche de traitement novatrice pour la MYPN-CM qui consiste en une approche de thérapie génique. Ce projet devrait produire un bénéfice à court terme avec la caractérisation en profondeur du modèle de souris déficient pour la proteine MYPN (modèle MKO) qui pourra ensuite être comparé à la trajectoire de la maladie chez l’humain. Cela permettra de caractériser la maladie et de mieux comprendre son évolution au fil du temps. Le bénéfice à long terme sera obtenu après l’achèvement du projet grâce auquel il est attendu une rapide évolution vers une phase pré-clinique puis clinique pour la thérapie génique de la MYPN-CM.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une étude de leur force/résistance musculaire par 4 tests non invasifs de courte durée. Chaque test sera réalisé à différents âges des souris 1.5, 3, 6, 9 et 12 mois. Certaines souris seront également soumises à deux prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue et une unique injection intraveineuse de vecteur viral ou solution saline sous anesthésie générale + anesthésie locale, ne dépassant pas 10 min afin d'éviter stress et douleur. Certaines souris ne recevront que deux injections intramusculaires (une dans chaque patte arrière, solution saline ou traitement).
Impact sur les animaux
Dans les conditions de vie courante en cage, les souris MKO sont de plus petites tailles mais ont une longevité comparable aux souris sauvages et du fait d'une activité réduite elles ne semblent pas génées par l'absence de myopalladine. La réalisation des tests fonctionnels d'effort peut engendrer un léger stress, un essoufflement et une faiblesse musculaire. L’injection des vecteurs viraux par voie intramusculaire ou systémique peut engendrer une légère douleur jusqu’à quelques heures après l’injection qui sera prise en charge par un traitement antalgique.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de pouvoir procéder à une caractérisation moléculaire et histologique de différents tissus. Selon les procédures, les muscles et/ou plusieurs organes d’intérêt seront prélevés afin de vérifier les bénéfices et éventuels effets indésirables sur d'autres organes (foie, cœur, rate, etc…) que ceux ciblés par la thérapie (les muscles).
Remplacement
En amont de l'étude expérimentale chez les souris MKO déficientes en myopalladine, le traitement développé sera d’abord testés sur des cellules musculaires in vitro, ce qui permettra de valider leur efficacité avant l’injection chez l’animal, et ainsi réduira le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Du fait de la visée thérapeutique de ce projet, il est cependant essentiel de réaliser des tests pré-cliniques dans le modèle animal afin de vérifier l'expression de la myopalladine in vivo suite à l'injection du traitement, et ceci sans effets secondaires tels qu'une réaction inflammlatoire violente ou toxique pour l'organisme, toutes deux malheureusment déjà observées dans d'autres thérapies géniques. A ce titre, il est nécessaire de tester l'efficacité de la thérapie génique in vivo, dans un organisme entier dont l’ensemble des organes est en interrelation constante afin de vérifier le tropisme et l'innocuité du traitement.
Réduction
Pour la caractérisation clinique (force et endurance), les mêmes animaux seront utilisés à différents âges (1.5, 3, 6, 9 et 12 mois), ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Ces souris seront ensuite mises à mort afin de prélever tous les muscles qui serviront pour plusieurs analyses. Pour les analyses histologiques et moléculaires à 1.5, 3, 6, 9 et 12 mois d’autres souris, seront mises à mort hors procédure pour prélèvement d'organes uniquement. Le modèle MKO n’a fait l’objet que d’une seule publication et les auteurs se sont principalement concentrés sur les défauts cardiaques du modèle et n’ont pas caractérisé en profondeur le phénotype musculaire, ce que nous souhaitons faire. Cette myopathie est extrêmement rare chez l’homme et n’est donc que très mal caractérisée également. La faiblesse musculaire est par ailleurs légère comparée à d’autres myopathies telle que la dystrophie musculaire de Duchenne ou même celle de Becker. Les marqueurs conventionnels utilisés comme la phosphocréatine kinase ne sont pas appropriés pour comparer les animaux sauvages et les MKO, c’est pourquoi nous souhaitons conduire cette étude. Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes donc basés sur notre expérience avec d’autres modèles de myopathie notamment les rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Dans ce modèle, il a été calculé par une approche statistique que 8 rats seraient nécessaires afin d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution de la maladie. Il se trouve que ce nombre est également celui utilisé dans la première étude de ce modèle, c'est pourquoi nous avons choisi ce même nombre de souris par condition pour cette étude. Enfin, en travaillant par étape, cela nous permettra d’appréhender et d’optimiser les expérimentations au fur et à mesure afin de réduire au mieux le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont dans des cages ventilées dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères et sont uniquement séparées par sexe afin d’éviter les accouplements non contrôlés. Les souris sont dans un environnement avec un cycle d’éclairage de 12h par jour. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de papier et d’abris en carton dans les cages. Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de s’habituer à l’homme et éviter tout stress lors des procédures animales. Les méthodes expérimentales ont été choisies pour éviter au maximum les douleurs lors des interventions sur les animaux. Les tests cliniques ne sont pas douloureux et ne correspondent qu’à des exercices physiques, et les injections des vecteurs dans le muscle ou dans les veines se feront sous anesthésie et n'entraîneront qu’une très légère douleur. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleurs chez les animaux.
Choix des espèces
La souris MKO présente des similarités cliniques et histologiques avec les patients MYPN-CM que nous souhaitons caractériser plus en profondeur. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée des expériences proposées, particulièrement pour la caractérisation des souris à 12 mois. Les approches de thérapie génique expérimentale sont facilement réalisables sur ce petit modèle, et sont essentielles avant de passer à une étude pré-clinique chez un modèle animal plus gros comme le chien, puis à une étude clinique chez l’homme. Les caractérisations phénotypiques se feront à partir de 1.5 mois, âge qui correspond au début de la puberté chez l’homme. En effet, nous savons que les phénotypes apparaissent à la naissance ou durant l’enfance. Ensuite, la maladie est progressive et à 3 mois, les souris MKO commencent à montrer une faiblesse musculaire. La caractérisation phénotypique se poursuivra entre 3 mois, âge correspondant au jeune adulte dont les muscles sont complètement formés, et 12 mois, âge adulte avancé chez l’homme. Cette stratégie permettra d’établir une trajectoire précise de la maladie au fil du temps, ce qui aidera à mieux comprendre l’évolution de la maladie chez l’homme. Puis ce modèle servira à évaluer les effets bénéfiques du traitement lorsque celui-ci est administré (1) avant l'apparition des symptômes (6 semaines) pour voir s’il est possible d’empêcher ou retarder l’apparition de la maladie ; et (2) après l'apparition des symptômes de la maladie (6 mois), pour voir s’il est possible de ralentir voir d’arrêter la progression de la maladie ou d’en promouvoir le décours.
Rôle du métabolisme des phosphoinositides dans la physiopathologie de la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 217 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Modifiées pour perdre une protéine musculaire, elles développent une myopathie qui les affaiblit jusqu'à la perte de mobilité et la mort vers treize semaines, et subissent des tests répétés de force, de course sur tapis et de motricité. Le porteur affirme que la maladie ne provoque pas de douleur, tout en décrivant une dégradation musculaire qui mène à la mort. Les bénéfices thérapeutiques restent suspendus à de futurs essais, quand la dissection des muscles après mise à mort, elle, est programmée.
Objectifs
La myopathie centronucléaire liée au chromosome X est une maladie grave, touchant les garçons dès la naissance, qui rend les muscles très faibles et pour laquelle il n’existe malheureusement pas encore de traitement. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine qui contrôle le métabolisme de certains types de lipides. Lorsque la protéine ne fonctionne pas bien, les muscles perdent leur force et deviennent plus petits. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du muscle et dans le développement de la myopathie centronucléaire, nous avons créé une nouvelle lignée de souris dans laquelle cette protéine a perdu sa fonction. Ces souris commencent à montrer des signes de myopathie vers 6 semaines et vivent moins longtemps que les souris normales. Dans leurs cellules musculaires, deux fonctions semblent particulièrement perturbées : la fonction mitochondriale et la fonction lysosomale. L’objectif du projet est de mieux caractériser l’évolution de la fonction musculaire chez ces souris au cours du développement de la myopathie centronucléaire et de comprendre comment les fonctions mitochondriale et lysosomale sont contrôlées par cette protéine. Nous testerons également plusieurs traitements pour restaurer les fonctions mitochondriale et lysosomale lorsque la protéine ne fonctionne plus afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques contre cette maladie. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs : les tests auront lieu dans l’EU 1 et la mise à mort sera effectuée dans l’EU 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la perte de fonction de la protéine perturbe le fonctionnement normal du muscle et provoque la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (XLCNM). Plus précisément, il permettra d’étudier le rôle des fonctions mitochondriale (production d'énergie pour la cellule) et lysosomale (recyclage des déchets cellulaires) dans le développement de la maladie. De plus, il permettra de tester de nouveaux traitements potentiels en vérifiant qu’ils ne sont pas toxiques et qu’ils sont efficaces pour empêcher ou ralentir le développement de la XLCNM. Si les résultats sont positifs, ils pourront être proposés pour de futurs essais chez les patients atteints de myopathie centronucléaire.
Procédures
Sur le 1er groupe d’animaux, 4 fois (semaines 4-7-10-13), sur animal vigile sauf si mention contraire : -mesure de composition corporelle : contention dans l’appareil de mesure de la composition corporelle, 2 minutes -test de force (force d'agrippement des 4 membres à une grille reliée à un dynamomètre): 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais -test de course sur tapis roulant : 10-45 minutes selon la capacité des animaux -test de motricité (temps mis pour franchir un obstacle de type "échelle horizontale" en marchant): 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux -test de la fonction de la jonction neuromusculaire (animal anesthésié) : stimulation électrique 8 x 0,2 millisecondes Sur le 2ème groupe d’animaux, 1 fois : 1 injection sur animal anesthésié, 10 secondes Sur le 3ème groupe d’animaux : -injection intrapéritonéale : 1 / jour pendant 28 jours consécutifs, 28 x 10 secondes -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Sur le 4ème groupe d’animaux : -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Toutes ces interventions seront réalisées dans l’établissement EU 1.
Impact sur les animaux
La myopathie centronucléaire chez l’Homme se caractérise par une faiblesse musculaire dès la naissance, sans douleur, due à l’absence d’une protéine. La faiblesse musculaire s’aggrave progressivement jusqu’ à ce qu’ils ne puissent plus respirer et meurent vers l’âge de 2,5 ans. La souris que nous avons créée, dont la protéine n’est plus fonctionnelle, développe les premiers symptômes autour de 6 semaines. D’après nos premiers résultats, ces symptômes deviennent sévères rapidement pour aboutir à une perte de mobilité des membres inférieurs et à la mort des animaux autour de 13 semaines en moyenne. Ponctuellement, les souris seront soumises à des stress et de l’inconfort pour des durées très courtes (contention nécessaire aux injections et injections elles-mêmes, mesures de composition corporelle et de force) ou courtes avec fin immédiate du stress et de l’inconfort à l’arrêt de la manipulation (tests d’endurance). Les traitements viseront tous à améliorer le phénotype musculaire et à prolonger la durée de vie. Deux d’entre eux ont déjà été largement utilisés dans des modèles animaux et testés lors d’études cliniques. Concernant le troisième, son absence de toxicité à haute dose à court et moyen termes (4 mois) a déjà été testée et validée sur des souris. Afin de déterminer les conditions de traitement optimales, la présente demande inclut une expérience préliminaire au cours de laquelle des petits groupes de souris seront traités selon différentes modalités, mais à des doses inférieures ou égales à celle déjà testée. Enfin, l’injection par voie intraveineuse d’un virus spécial (utilisé chez l’Homme en thérapie génique), qui permettra de faire briller une protéine dans certaines parties de la cellule, bien que réalisée sous anesthésie, pourrait entraîner un inconfort léger au réveil. Pour éviter cela, nous utiliserons un gel analgésique localement.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort et leurs muscles disséqués pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires ou pour préparer des cultures de cellules musculaires in vitro.
Remplacement
Le but principal de ce projet est d’étudier un nouveau modèle de la myopathie centronucléaire pour mieux comprendre comment les muscles sont touchés. Ensuite, ce modèle servira à tester plusieurs traitements qui pourraient aider les muscles à mieux fonctionner. Pour cela, nous devons mesurer des paramètres importants du fonctionnement du muscle comme la force, l’endurance, la façon dont les souris bougent mais aussi combien de temps elles vivent. Ces paramètres ne peuvent pas être mesurés avec d’autres méthodes. Les autres méthodes disponibles sont des cellules musculaires qui poussent dans une boîte en plastique au laboratoire, mais ces cellules ne deviennent jamais aussi développées, ni aussi fortes, que de vrais muscles dans un corps vivant. Elles ne peuvent même pas vraiment se contracter comme un vrai muscle. Elles ont quand même été utiles pour comprendre ce qui ne marche plus quand la protéine d’intérêt est absente, et pour trouver quelles parties de la cellule sont perturbées (par exemple, les mitochondries et les lysosomes). Ces cellules seront d’ailleurs à nouveau utilisées plus tard pour comprendre comment elles réagissent aux traitements, mais pour bien étudier l’effet des médicaments sur les muscles, il faut utiliser les souris du modèle de myopathie centronucléaire.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes statistiques pour calculer combien de souris utiliser pour chaque expérience afin d’être sûrs d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Tout d’abord, nous comparerons la force des muscles entre les souris saines et les souris malades au cours de l’évolution de la maladie. D’après nos tests précédents, il faut environ 21 souris par groupe pour voir une vraie différence. Nous incluerons 2 souris de plus dans le groupe malade au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Des souris seront également nécessaires pour étudier ce qui se passe à l’intérieur des muscles aux différentes étapes du développement de la maladie, c’est-à-dire aux âges de 4, 7, 10 et 13 semaines. Pour ces analyses, nous aurons besoin de 9 souris par groupe. Ensuite, nous ferons un essai pour vérifier une nouvelle technique qui permet de « marquer » certaines parties des cellules musculaires (mitochondries et lysosomes) avec un virus spécial. Pour ça, nous utiliserons seulement 3 souris saines par groupe. Pour comparer les protéines et les petites molécules dans ces mitochondries et ces lysosomes chez les souris saines et les souris malades, nous utiliserons 6 à 12 souris par groupe selon la variabilité des mesures. Les groupes de souris malades auront une souris de plus au cas où l’une meure plus tôt à cause de la myopathie. Puis nous testerons différents traitements (3 médicaments, donnés à différents moments au cours du développement de la maladie) pour essayer d’améliorer la force des muscles et augmenter la durée de vie des souris. Pour cela, nous aurons besoin de plusieurs groupes de souris pour comparer les effets de ces traitements à des souris saines et à des souris malades non traitées. Nous aurons besoin de 19 souris par groupe pour détecter une différence intéressante, et nous ajouterons 2 souris de plus dans les groupes de souris malades au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Enfin, des souris serviront à préparer des cellules musculaires en laboratoire pour comprendre ce qui se passe à l’intérieur des cellules et comment elles réagissent aux traitements.
Raffinement
La myopathie centronucléaire, chez les souris comme chez les patients, ne provoque pas de douleur au niveau des muscles, ni ailleurs. Nous serons quand-même attentifs à ce que les souris ne souffrent pas durant nos expériences. Pour cela, nous leur permettrons d’avoir un comportement aussi naturel que possible dans leurs cages en leur donnant du matériel leur permettant de ronger et de faire un nid, et elles seront plusieurs par cage afin de ne pas souffrir d’isolement. Lorsque leurs muscles deviendront faibles et qu’elles auront du mal à se déplacer, nous leur fournirons la nourriture et l’eau directement au fond de la cage pour qu’elles n’aient aucun effort à faire pour s’alimenter. Avant de réaliser les tests de la fonction musculaire, nous les habituerons aux systèmes utilisés pour qu’elles ne soient pas stressées au moment de faire les tests. Lorsque des anesthésies seront nécessaires, nous les placerons sur un tapis chauffant pour ne pas qu’elles aient froid durant l’expérience. Suite aux injections intraveineuses de virus, nous utiliserons un analgésique local.
Choix des espèces
La myopathie centronucléaire est une maladie musculaire due à l’absence d’une protéine dans le muscle. Nous avons donc créé une nouvelle lignée de souris chez laquelle cette protéine ne fonctionne pas dans le muscle afin d’étudier comment la protéine provoque la maladie. Ces souris ne présentent initialement pas de symptômes ; à partir de 6 semaines, leur fonction musculaire commence à se dégrader et elles meurent en moyenne vers 13 semaines. Dans les expériences sans traitement, nous utiliserons des souris âgées entre 4 et 13 semaines, c’est-à-dire avant le moment où elles risquent de mourir de la maladie. Dans les expériences avec traitements, ceux-ci auront pour objectif d’améliorer la fonction musculaire, mais également d’augmenter la durée de vie. Si ces traitements fonctionnent, nous serons donc amenés à étudier les souris au-delà de 13 semaines, plus ou moins longtemps en fonction de l’efficacité des traitements pour maintenir la fonction musculaire.