Troubles immunitaires

4 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ingèrent une molécule qui endommage la barrière de l'intestin et reçoivent un agent qui provoque des tumeurs, développant diarrhée, douleur viscérale, saignements et perte de poids, avec prélèvements de sang répétés et traitements deux fois par jour. L'objet est de tester des molécules anti-inflammatoires et anticancéreuses contre les maladies inflammatoires de l'intestin et le cancer du côlon, y compris sur des souris au système immunitaire humanisé. Le porteur qualifie ces modèles d'"indispensables" tout en reconnaissant que la réponse immunitaire de la souris diffère de celle de l'humain.

Objectifs

Les deux principales formes de maladies inflammatoires de l'intestin, la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn, sont des troubles inflammatoires chroniques récidivants du tractus gastro-intestinal. L'étiologie est très probablement une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux favorisant la désintégration de la barrière épithéliale intestinale et la dérégulation de la réponse immunitaire au microbiote intestinal. Rien qu'en France, on dénombre plus de 200 000 patients atteints de MICI. Les cancers de l’intestin, notamment le cancer colorectal, peuvent être associés à la forme chronique des MICI et/ou aux traitements associés. N’ayant pas de traitement efficace pour les maladies inflammatoires de l’intestin ou le cancer colorectal, de modèles pré-cliniques sont nécessaires afin de tester l’efficacité de produits candidats à visée thérapeutique. L'un des modèles les plus utilisés pour étudier les maladies chroniques de l’intestine est le modèle d'inflammation intestinale induite par le DSS (Dextran Sulfate Sodium). Afin de modéliser le cancer du colon, l’injection d’azoxymethane (AOM) associé au modèle chronique de DSS est ainsi un outil indispensable. Les modèles précliniques sont donc indispensables pour tester l'efficacité des médicaments à cet égard. Les modèles murins d’inflammation intestinales sont couramment utilisés pour l’étude de la fonction de la barrière intestinale ainsi que le microbiote. En revanche, on craint de plus en plus que les mécanismes immuno-pathogènes observés dans les ces modèles ne soient pas les mêmes que ceux que l'on pense observer chez l'homme. Nombreuses études ont démontré que la réponse immunitaire murine différencie en structure et en fonction dans des nombreux cas de celles de l’homme, ce qui peut expliquer les taux d’échec dans l’utilisation des données précliniques prometteuses en nouveaux traitements en clinique. Cette réalité inconfortable a incité un certain nombre de chercheurs à entreprendre une série d'études visant à humaniser le système immunitaire murin par le transfert adoptif de cellules progénitrices lymphoïdes ou hématopoïétiques dans une nouvelle génération de receveurs immunodéficients. Ainsi, les souris humanisées au niveau du système immunitaire permettront de comprendre l’interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et également avec les tumeurs.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, le projet validera les doses de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d'AOM (azoxymethane), avant de tester l'efficacité de nouveaux candidats thérapeutiques (anti-inflammatoires et anticancéreux) en utilisant différents modèles/stades de pathologies intestinales. En outre, ce projet évaluera ces maladies intestinales dans un modèle de souris au système immunitaire humanisé. Ces souris recevront des cellules souches humaines capables de se différencier en cellules immunitaires humaines. Il s'agit d'un modèle innovant, car peu étudié à ce jour, et qui répondra à la crainte de plus en plus exprimée vis-à-vis des modèles murins traditionnels : la réponse immunitaire humaine diffère de la réponse murine, donc les souris humanisées au niveau du système immunitaire (NXG-HIS) seront un atout comme modèle préclinique pour l'étude de ces maladies, où la composante inflammatoire et le système immunitaire jouent bien évidemment un rôle primordial. Ce modèle nous permettra également de comprendre l'interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et avec les tumeurs.

Procédures

Pour induire l’inflammation intestinale chez la souris, de l’eau de biberon contenant du DSS (Dextran Sulfate Sodium-une molécule capable d’endommager la barrière intestinale) sera donner aux animaux pendant 7 jours (modèle aigu) ou 5 jours (modèles chroniques) en 3 cycles. Pour l’induction de la tumeur au niveau du côlon, une injection d’azoxymethane (intrapéritonéale) sera donnée avant les cycles de DSS. Les animaux auront des prélèvements de sang en avant l'induction de l'inflammation intestinale ou de la tumorigenèse. Le prélèvement sera fait à la veine maxillaire (en vigile) ou au sinus retro orbitaire (sous anesthésie). D’autres prélèvements au cours de l’étude sont prévus : 1 fois après 15 jours d'intervalle pour le modèle aigu et 3 fois avec un intervalle de 12 jours entre chaque prélèvement pour les modèles chroniques. Le volume à prélever sera de maximum 10% du volume total de sang circulant de l'animal par prélèvement (64mL/kg). Les animaux seront quotidiennement traités par une des voies suivantes : orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, deux fois par jour en respectant le volume journalier à être administré. Pour le DAI (l’indice d’activité de la maladie), les fèces seront récoltées quotidiennement (pendant 12 jours, en modèle aigu et 60 jours, en modèles chroniques) afin de vérifier la présence de sang et sa consistance. La récolte est faite par isolement de l’animal dans une cage propre et sans enrichissement, nourriture et l’eau pendant maximum 30 minutes/jour. A la fin de la phase expérimentale, les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement maximal de sang par ponction cardiaque. Ensuite, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’effet attendu du DSS (Dextran Sulfate Sodium) est l’inflammation intestinale qui perturbe la digestion et l’absorption des nutriments dû à l’altération de la barrière intestinale. Les effets du DSS sur la santé de l’animal seront la diarrhée, la douleur viscérale, le saignement, la perte de poids et l’apathie, principalement. Le score de l’indice d'activité de la maladie qui consiste en évaluer la perte de poids corporel, la diarrhée et le saignement) est mesuré tous les jours pendant la phase expérimentale et permettra rapidement de connaître l’avancement de la maladie et la détérioration de l’état de santé de l’animal. L’objectif du modèle est d’avoir des animaux malades, mais pas dans un état sévère d’inflammation. L’AOM (azoxymethane) est un mutagène qui induit la formation des tumeurs. Il est donc attendu que les souris perdent du poids, aient de la diarrhée, des douleurs abdominales et deviennent apathiques. On attend le développement des tumeurs au niveau intestinal, sans pour autant induire la mort des animaux. Les effets secondaires des candidats thérapeutiques à tester ne sont pas connus, ni leur nature. De ce fait, il nous est impossible de prévoir les nuisances pour les animaux. En ce qui concerne la souris humanisées et son phénotype, celui-ci n’est pas dommageable pour la souris, c’est-à-dire cela n’augmente pas la sévérité des pathologies étudiées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les modèles in vitro, tels que les organoïdes intestinaux ou simplement des lignées cellulaires, ne peuvent pas mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En revanche, ces modèles permettent de sélectionner au préalable des molécules d’intérêt avant de passer dans un modèle pré-clinique in vivo. Ensuite, une fois les pilotes in vivo faites et le screening in vitro réalisés, des tests peuvent être fait en nombre réduit d’animaux à une quantité relevant pour garantir la puissance statistique.

Réduction

L’objectif des études pilotes prévues dans ce projet est de limiter le plus possible le nombre d’animaux dans les modèles qui seront ensuite utilisés. Pour les études pilotes, le suivi quotidien et accru des animaux permettra de sélectionner la dose de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d’AOM (azoxymethane) la plus juste afin d’avoir un phénotype pathologique, sans pour autant induire la mort des animaux. En revanche, dans les modèles pré-cliniques, le fait de ne pas connaître les effets indésirables des molécules à visée thérapeutique in vivo et avec l’objectif de garder la puissance statistique, la quantité d’animaux devra être augmentée de 20% par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et plusieurs types d’enrichissement seront mis dans les cages qui hébergent les animaux (tunnel, Aspen brick, igloo et Sizzle-Nest). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence des points limites à savoir : la prostration ou absence de mouvement, la perte de poids supérieure à 20% du poids d’origine et la diarrhée liquide accompagnée d’un saignement accru. Si un animal présente un des points limites, il serait pris en charge par l'équipe zootechnique. Si son état ne s’améliore pas dans les 24h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieront. Si l’animal présente une plaie, par exemple, des soins de nettoyage et désinfection seront effectués.

Choix des espèces

Les modèles d’inflammation intestinale par DSS (Dextran Sulfate Sodium) et le modèle de cancer du colon induit par l'AOM (azoxymethane) suivi de l'inflammation chronique induite par DSS sont très bien décrits et caractérisés dans la littérature. Pour les souris normalles, non-humanisées, la maturité sexuelle est atteint pour les mâles à 8 semaines et pour les femelles à 6 semaines. Donc, pour que les animaux soient matures, ils rentreront en étude qu'à partir de l'âge de 8 semaines. En revanche, pour les animaux humanisés, dû au processus d’humanisation, les animaux rentreront en étude à partir de 15 semaines d'âge.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunisées au collagène avec un adjuvant par deux injections intramusculaires dans les cuisses, ce qui déclenche une arthrite auto-immune, avec prises de sang et mesure des chevilles au pied à coulisse deux fois par semaine. Le porteur affirme que les processus de l'arthrite ne peuvent être reproduits in vitro et écarte le modèle d'arthrite spontanée jugé trop aléatoire. Le projet vise à comprendre le rôle des neutrophiles dans le déclenchement de la maladie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un modèle murin d’arthrite qui permettra d’étudier les mécanismes d’induction de l’auto-immunité impliqués dans cette pathologie, notamment le rôle des neutrophiles ainsi que leur diversité dans le déclenchement de cette pathologie. Pour cela, il est indispensable d’avoir un évènement déclencheur (ici le début de l’immunisation) à partir duquel les processus pathologiques amenant à la maladie se développent afin de pouvoir comparer des groupes de souris et établir une cinétique d’étapes clés. Un modèle d’arthrite spontanée ne se prête pas à notre recherche, car le début d’arthrite est trop aléatoire. Un modèle d’arthrite active (induite par une immunisation) a été décrit (collagen-induced arthritis (CIA)), mais ce modèle nécessite l’injection répétée de collagène II en présence d’un adjuvant fort, qui induit des inflammations tissulaires importantes. Pour éviter l’usage de cet adjuvant, nous proposons donc d’administrer du collagène II associé à une protéine porteuse en présence d’un adjuvant alternatif pour induire une arthrite chez la souris. Cet adjuvant est une huile naturelle qui est également utilisée dans certains vaccins humains. Pour établir les meilleures conditions expérimentales, nous réaliserons dans un premier temps, une mise au point du modèle sur des souris sauvages. Ensuite nous appliquerons les conditions établies dans cette première partie à des lignées de souris chez lesquelles l’activité des neutrophiles est altérée et dans un modèle de souris pour lequel les gènes codants pour les différentes classes d’anticorps, pour leurs récepteurs et le complément sont humanisés afin d’étudier les mécanismes impliqués dans la dérégulation de l’immunité, la perte de tolérance contre le soi et le développement de l’auto-immunité. Nous étudierons les cellules sanguines ce qui nécessitera des prises de sang régulières. A la fin de l’expérimentation, les souris seront mises à mort puis autopsiées pour étudier les réponses des neutrophiles et les anticorps dans les articulations, la rate et les ganglions drainants.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier les mécanismes d’auto-immunité et la perte de tolérance au soi impliqués dans l'arthrite, notamment le rôle des neutrophiles ainsi que leur diversité dans le déclenchement de cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront immunisés avec du collagène II complexé en présence d’un adjuvant par voie intramusculaire (50 uL) dans les deux cuisses arrière, par 2 injections espacées d’au minimum 1 semaine. Des prises de sang rétromandibulaires de moins de 100uL seront effectuées à trois occasions espacées d’au moins 1 semaine. Les deux types d’interventions ne prendront que quelques secondes. A partir de la première immunisation les articulations seront évaluées deux fois par semaine et l’épaisseur des chevilles mesurée à l’aide d’un pied à coulisse (caliper) (l’évaluation complète dure moins de 5 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Les animaux seront immunisés avec du collagène II complexé en présence d’un adjuvant par voie intramusculaire (50 uL) dans les deux cuisses arrière, par 2 injections espacées d’au minimum 1 semaine. L’injection intramusculaire dure quelques secondes et provoquera un léger œdème dans le muscle associé à une douleur modérée de courte durée. Des prises de sang rétromandibulaires de moins de 7,5% de leur poids (100uL) seront effectuées à trois occasions espacées d’au moins 1 semaine. La prise de sang dure quelques secondes et causera une douleur légère de très courte durée. L’immunisation induira une réaction immunitaire contre le soi, qui se traduira par le développement d’une arthrite au niveau des articulations des membres. Cette inflammation débutera avec une rougeur au niveau d’une jonction articulaire, accompagnée d’un recrutement localisé de cellules inflammatoires, qui progressivement s’étendra à d’autres articulations du membre et s’accompagnera d’un gonflement. L’inflammation des articulations se traduira par une douleur progressive, qui n’entrainera pas pour autant une réduction de la mobilité des souris. A partir de la première immunisation les articulations seront évaluées deux fois par semaine et l’épaisseur des chevilles mesurée à l’aide d’un pied à coulisse (caliper) (l’évaluation complète dure moins de 5 minutes/souris).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Une autopsie sera réalisée sur tous les animaux afin de prélever différents organes et tissues dont la rate, les ganglions drainants, et les articulations pour étudier les réponses des neutrophiles dans ces différents compartiments.

Remplacement

L’arthrite met en œuvre des processus complexes reposant sur les singularités du système circulatoire et des tissus cibles, processus qui ne peuvent pas être reproduits in vitro.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé avec l’objectif de réduire ce nombre autant que possible tout en minimisant le « bruit de fond » inhérent à la recherche biologique in vivo. Ce nombre inclut le nombre nécessaire de contrôles et la nécessité de reproduire les résultats. De plus, le recours à des lignées consanguines de souris permettra de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental.

Raffinement

Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les monitorings effectués (qui selon leurs scores déclenchent des actions à prendre) sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Nous respecterons les conditions d’élevage et de maintien établies par nos vétérinaires. Les animaliers ont la charge de la surveillance du bien-être des animaux, et inspectent les cages régulièrement, en plus de nos visites et de la visite hebdomadaire du vétérinaire. Dès la première immunisation les animaux seront observés au moins 1 fois par semaine et « scorés » selon une grille d’évaluation, prenant en compte l’arthrite, l’apparence de l’animal, les fonctions du corps et leur comportement. Des points limites ont été définis : - Pour l’arthrite : pour chaque patte un score de 4, et un score global (prenant en compte les quatre pattes) de 9. - Une perte de poids supérieur à 20% - Une immobilité persistante pendant plus que 24h - Un score clinique composite plus important que 20 Nous avons également mis en place des actions à prendre en fonction du score clinique composite : Pour un score de : - 0-3 : monitoring classique avec augmentation de la fréquence de surveillance (2 fois par semaine) - 4-7 : nourriture / gel humidifié dans la cage - 8-12 : nourriture / gel humidifié dans la cage et augmentation de la fréquence de surveillance (3 fois par semaine) - 13-20 : nourriture / gel humidifié dans la cage et augmentation de la fréquence de surveillance (tous les jours) et discussion de la conduite à tenir avec un membre de la structure du bien-être animal.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une cavité est creusée dans leurs molaires puis laissée ouverte 24 heures pour déclencher une inflammation de la pulpe dentaire, avant l'application d'un hydrogel expérimental. Le porteur reconnaît une douleur buccale et une gêne pour s'alimenter, et prévoit l'euthanasie de groupes de six animaux à 24 et 72 heures pour récupérer les molaires. Il affirme que les expériences in vitro ne reproduisent pas les interactions cellulaires complexes de l'inflammation et que le recours au rongeur reste "nécessaire" pour valider le biomatériau.

Objectifs

La carie dentaire touche environ 98% de la population en Europe. La dent représente un environnement spécialisé où la pulpe dentaire est un tissu conjonctif mou entouré d'une barrière minérale dure faite de dentine et d'émail. Lors d’une carie, les micro-organismes pénètrent l’émail et la dentine et déclenchent ensuite une réponse inflammatoire/immunitaire dans la pulpe dentaire (pulpite). Cette pulpite peut entraîner des douleurs dentaires très aiguës (la forme la plus répandue de douleur orofaciales). Le traitement des dents en pulpite est encore controversé. Le traitement « classique » canalaire radiculaire présente un bon taux de succès (85%) : il consiste après mise en forme et désinfection à l’aide d’une solution d’hypochlorite de sodium 2,5% à obturer de manière tridimensionnelle l’intégralité de l’endodonte avec un ciment et de la gutta percha (polymère naturel). Cependant, les dents traitées sont plus cassantes que les dents non traitées ; il y a une perte des capacités de cicatrisation, et un risque de dissémination bactérienne dans l'organisme subsiste toujours après traitement radiculaire. Une approche alternative consiste à retirer uniquement la partie enflammée de la pulpe pour maintenir et préserver son potentiel de guérison. Les avantages de ces thérapeutiques sont : le maintien des mécanismes de défense, la perception de la douleur comme système d'alerte, la cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients. Malgré ces avantages évidents, cette approche alternative est encore peu pratiquée notamment parce que le résultat est difficilement prévisible en raison de l'état inflammatoire du tissu pulpaire restant. En effet, l'inflammation pulpaire est souvent trop importante et entraîne une nécrose pulpaire. L'originalité de ce projet est de contrôler la réponse immunitaire qui est le principal facteur de succès.

Bénéfices attendus

Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de ces nouveaux hydrogels d'acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 (LXA4). Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments qui ont des effets immunotoxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites (maintien des mécanismes de défense, perception de la douleur comme système d'alerte, cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients). Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.

Procédures

Le jour de la procédure, les rats seront anesthésiés. L’ouverture buccale sera maintenue par instrument dentaire. Pour induire l’inflammation, nous formerons une cavité à l'aide d'instruments dentaires sur les molaires, la cavité formée sera rincée au sérum physiologique avant d’être laissée à l’air libre durant 24h. Après 24h d’exposition, la cavité sera de nouveau rincée au sérum physiologique pour éliminer tous débris éventuels puis nous viendrons injecter dans la cavité la proposition thérapeutique (ou bien les solutions contrôles) à l’aide d’une seringue, le volume sera adapté à chaque cavité de manière à la remplir. La cavité sera ensuite refermée avec un biomatériau utilisé en dentisterie. Pour chaque groupe, 6 rats seront euthanasiés à 24h et 6 autres à 72h. Nous récupérerons les maxillaires de manière aseptique afin de procéder aux différentes analyses.

Impact sur les animaux

Ce modèle entraine une inflammation « contrôlée » et limitée du tissu pulpaire. Ce protocole de classe modérée pourrait conduire à : - Une douleur au niveau buccal après avoir exposé le tissu pulpaire à l’environnement oral - Une gêne pour s’alimenter (normalement pendant 24h) liée aux dents laissées ouvertes. Le design de l’étude permet de conserver un coté sans atteinte dentaire permettant une alimentation normale. Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer les molaires traitées et controlatérales (qui serviront de témoins).

Remplacement

Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire. L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, et bioactivité. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Le nombre de 6 animaux par groupe est calculé à partir d’un test de puissance statistique pour une différence significative de 20%, un écart-type de 10% et un risque consenti de 5%.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi par alpha dri. Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage. Nous raffinerons également en réduisant les douleurs via : - 1. Une anesthésie réalisée localement avant toute procédure sur la dent. - 2. Des antalgiques en post opératoire. Les rats seront observés et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en oeuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. De plus, pour faciliter la prise alimentaire, l’alimentation des rats sera posée sur le sol de manière à être plus accessible. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes. Les molaires traitées et les molaires controlatérales seront prélevées pour effectuer des analyses complètes afin d'exploiter le tissu extrait dans sa totalité.

Choix des espèces

Notre choix se base donc sur l’étude de la bibliographie. Notre projet fondé sur une approche translationnelle est un préalable nécessaire à un développement préclinique sur d'autres espèces plus proches de l'Homme. Ce modèle est bien maitrisé dans notre laboratoire. Le modèle de carie induite sur la molaire de rat est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude des biomatériaux et/ou la réponse immunitaire de la pulpe dentaire tout particulièrement pour l’approche moléculaire, histologique et imagerie 3D. Nous avons choisi d’utiliser uniquement des mâles. Il existe des différences liées au sexe dans la prévalence des lésions carieuses chez l’Homme. Ces différences sont dépendantes d’un grand nombre de variables (milieu socio-économique, accès à l’éducation, accès aux soins). En revanche ces différences n’ont jamais été démontré dans des modèles animaux de caries dentaires. La réponse immunitaire est capitale dans la cicatrisation et il peut y avoir des différences de réponse entre mâles et femelles. Nous prévoyons d’utiliser que des mâles pour justement éliminer ce biais et cela correspond de plus à des publications qui nous ont servi de références pour l’élaboration du protocole. Les animaux reçus auront 7 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les rats auront donc 8 semaines au début du protocole et presque 9 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation de la pulpe dentaire.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis une injection de lymphocytes T par voie rétro-orbitale, avant le prélèvement de leurs tumeurs, rate et ganglions, pour étudier le rôle d'une protéine dans l'efficacité de l'immunothérapie du cancer. Le porteur fixe un point limite à un volume tumoral de 2 500 mm3, seuil au-delà duquel les souris qui l'atteignent sont mises à mort. Il indique avoir mené des expériences in vitro au préalable mais conclut que les interactions entre cellules tumorales et microenvironnement immunitaire "ne peuvent actuellement pas être remplacées" par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

La progression du cancer est grandement influencée par un équilibre délicat entre l'immunité et la tolérance aux tumeurs. En particulier, les lymphocytes T (LT) CD8 ont pour fonction de détruire les cellules tumorales. Leur étude a conduit au développement de deux types d’immunothérapies du cancer, qui ont révolutionné la prise en charge des patients : l’administration d’anticorps anti- PD-1 qui ciblent la fonction défectueuse des LT CD8, ainsi que l’injection de LT spécifiques d’un antigène tumoral et capables d’éliminer directement la tumeur. La combinaison de ces deux traitements est testée actuellement en clinique mais les mécanismes moléculaires régissant la réponse ou la résistance à ces thérapies sont mal connus. La protéine X joue un rôle critique dans la tolérance immunitaire dans le cancer et nos données préliminaires suggèrent qu’il pourrait également être un régulateur majeur de l’activité des LT CD8+. Dans ce contexte, nous émettons l’hypothèse que l’élimination des tumeurs par l’injection de LT spécifiques, en combinaison ou non avec une thérapie par anti-PD-1, requiert l’activation de X.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier un mécanisme moléculaire impliqué dans l’effet curatif des thérapies du cancer par injection de LT. D’autre part, ces études pourraient révéler des activités spécifiques de la protéine X qui peuvent être ciblées par de nouveaux agents thérapeutiques pour améliorer la fonction des LT, seule ou de concert avec des immunothérapies existantes.

Procédures

- Rasage du flanc des souris après désinfection a l’alcool 70% sous anesthésie isofluorane (1x 2 minutes/souris) -Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie isofluorane, de cellules tumorales resuspendues dans du PBS1X stérile, dans un volume total de 100uL (1x 2 minute/souris) -Injection intraveineuse par voie rétro-orbitale, sous anesthésie isofluorane, de cellules LT resuspendues dans du PBS1X stérile, (ou du PBS1X comme témoin) dans un volume total de 100uL. (1x 2 minute/souris)

Impact sur les animaux

Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs. Chez la souris, l’injection d’anti-PD-1 ne provoque pas d’effets secondaires délétères détectables. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, effectuées sous anesthésie isofluorane, mais susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites et la manipulation des animaux sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux 2 fois par semaine. Un enrichissement (morceau de coton) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort lorsqu’un des points limite (volume tumoral de 2500 mm3, nécrose de la tumeur ou altération de l'état général de la souris) sera en passe d’être atteint, par dislocation cervicale ; les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous allons tout d’abord effectuer un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer la fonction de la protéine X dans l’immunothérapie par transfert de LT. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Dans des études antérieures décrivant les lignées cellulaires utilisées ici, il a été démontré un écart-type de 150 mm3 au point final (1250 mm3). L'effet minimal souhaité de l’ablation de X serait une augmentation > 50% de la croissance tumorale, donc une taille de 2500 mm3 au point final. En prenant en compte une puissance de 90% et un alpha de 0.05, nous calculons une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Un test ANOVA à 2 voies suivi du post-test Bonferroni sera utilisé pour analyser la significativité des résultats. L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin du protocole (au plus tard à J21) ou dès l’atteinte d’un point limite par un individu pour réduire la variabilité expérimentale. Pour assurer la reproductibilité des résultats, nous répéterons l'expérience une fois. Il n’y a pas de double emploi des souris.

Raffinement

Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer le rôle de NF-kB dans les réponses immunitaires anti-tumorales. D’autre part il existe un certain nombre de modèles de tumeurs transplantables chez la souris, largement décrits et utilisés par le passé. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 10 semaines.

250 souris "humanisées" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur une centaine de jours, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des cellules sanguines humaines et des anticorps monoclonaux, pour tester lesquels renforcent la réaction du greffon contre la tumeur. Le porteur prévoit une mise à mort dès qu'une tumeur atteint 2 000 mm³ ou qu'une souris perd 20 % de son poids, et décrit des tumeurs pouvant s'ulcérer et se nécroser. Il justifie le recours à ces souris immunodéficientes, seules à accepter des cellules humaines, comme une alternative aux primates en recherche préclinique.

Objectifs

En transplantation, l'effet greffon contre la tumeur a été observé après une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Le greffon contient des cellules lymphocyte T du donneur qui peuvent être bénéfiques pour le receveur en éliminant les cellules malignes résiduelles. Dans le but d'évaluer le potentiel thérapeutique d'anticorps monoclonaux sur l'effet greffon contre la tumeur nous testons in vivo plusieurs candidats médicamenteux dans un modèle de greffe contre la tumeur chez la souris immunodifficiente. Ces anticorps monoclonaux ont été générés et validés in vitro mais les études in vivo sont indispensables pour pouvoir envisager des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à l’issue de cette étude, permettront de : - Comparer les résultats in vivo aux data in vitro - Déterminer le potentiel thérapeutique des anticorps testés sur les réponses immunes dans le contexte de cette maladie - Comprendre les différents mécanismes d’action mis en place - Valider et sélectionner pré-cliniquement la meilleure molécule avant d’envisager les tests cliniques

Procédures

- Rasage des souris la veille de l’injection des cellules tumorales, cette action s’effectuera sur animal vigile (2min/animal)- Injection des cellules tumorales en sous-cutanée (sur toute les souris) sous anesthésie gazeuse (10min/animal), 8 jours avant le début de protocole - une fois que les tumeurs sont détectables par palpation injection des cellules sanguine humaines en intraveineuse sur animal vigile (hormis le groupe de tumeur seul) 5min/animal - Injection des traitements en intra-péritonéal sur animal vigile (1min/animal) en fonction des groupes, deux fois par semaine - Prélèvement sanguin (100µl de sang,) tous les deux semaines sur toutes les souris (10min/souris)sous anesthésie gazeuse - Euthanasie sous anesthésie général et dislocation cervical de toutes les souris. A préciser que la durée totale de l'expérience est de 100 jours, chaque intervention sera réalisées à part dans un instant t. A noter que l’utilisatrice est une personne expérimentée en procédure animale, ce qui réduira les temps d’intervention et par conséquence moins de stress et d’angoisse animal

Impact sur les animaux

Ce modèle murin de GvT consistera à injecter des cellules tumorales en sous-cutanée, ce qui engendre quelques paramètres à surveiller régulièrement qui concerne la masse tumorale et l’animal lui-même. *La masse tumorale : les cellules seront injectées localement en sous-cutanée, la tumeur prendra de volume au fur à mesure, une surveillance quotidienne sera appliquée pour vérifier si la tumeur pousse ou pas en mesurant la longueur et la hauteur pour calculer le volume ? ; si elle envahie les tissus voisins en palpant la masse tout en cherchant les contours et des éventuelles adhérences avec le tissu cutané ? si elle s’ulcère, une ulcération de la tumeur sera visible l’œil nu, la tumeur sera rouge et présente un point de nécrose, à noter que le flanc de l’animal sera toujours rasé pour faciliter l’observation. *Le poids : une perte de poids est un signe d’un mal-être, souffrance ou douleur ; le poids sera suivi 2-3 fois par semaine, une perte supérieure ou égale à 20% est considéré comme point limite qui oblige l’euthanasie de l’animale. *Comportement : le comportement d’un animal souffrant d’un mal-être sera modifié, une baisse d’activité, une voussure de dos, pelage ébouriffé, froidure et pâleur des extrémités… tous ces critères indiquent une douleur. L’animale sera soulagé par une l’administration de l’anti-douleur adéquat et disponible dans notre laboratoire. A savoir que les animaux qui souffrent de manière chronique vont être suivis avec une attention particulière non seulement pour soulager leur souffrance, mais aussi parce qu’ils nécessitent une gestion et un mode de vie particuliers (manipulation délicate, accès facile à l’eau et à la nourriture, réduire le nombre de souris dans la cage, administration d’anti-douleur Ci-dessous une liste des points limites qui déterminera l’euthanasie de l’animal La masse tumorale : • L’évolution de la croissance tumorale est un des paramètres clés de cette étude, mais la masse tumorale ne doit pas interférer les fonctions normales de l’animale ni induire une souffrance pour son déplacement. Un volume tumoral supérieur ou égal à 2000mm3 est un point limite. • Une ulcération/infection à l’emplacement de la tumeur • Un envahissement des tissus voisin par la tumeur localisée La perte de poids • Une perte supérieure ou égale 20 % du poids du corps d’un animal normal (en tenant compte de la masse tumorale) Comportement anormale • Une détresse, un mal-être

Devenir

Mise à mort

Remplacement

Des études fonctionnelles ont été réalisées in vitro à partir de cellules humaines, les résultats sont prometteurs mais sont limités par l’absence du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire et ne peuvent remplacer les études in vivo. Il est donc nécessaire de tester l’efficacité immuno-régulatrice des molécules d’intérêt dans un modèle in vivo proche de l’Homme. Une alternative solide à l’utilisation de primates en recherche préclinique est le modèle de souris dites « humanisées ».

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit à 25, nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Les souris seront divisées en 10 groupes (25 souris/groupe). Le groupe témoin recevra un isotype contrôle ou PBS, les autres groupes seront traités avec les différents anticorps test. Le nombre de groupes a été réfléchi afin d’avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Le nombre total des animaux est de 250.

Raffinement

Afin de respecter le bien-être animal, au début de protocole les souris seront réparties par groupe de 3-5 souris par cage, avec des moyens d’enrichissement (frisottis, dôme et tunnel). Une surveillance quotidienne des animaux en protocole, pour déceler une douleurs, souffrance ou mal-être. Les animaux souffrants d’une douleur seront séparés des autres (étant donné qu’il existe toujours un animal dominant dans une cage, qui empêche l’animale faible d’accéder à la nourriture ou l’eau. En séparant les animaux faibles dans des cages offre une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Une administration d’analgésique buprénorphine 0.05mg/kg en sous cutané deux fois par jour pour tout animale souffrant, à noter que en cas de point limite (souffrance qui ne sera pas gérable par anti-douleur) l’animale sera euthanasié. Les différents points limites, une perte de poids de 20%, un volume tumoral de 2000mm3 ou montrant des signes physiques caractéristiques d’un mal-être seront euthanasiés (inhalation d'isoflurane suivie par une dislocation cervicale).

Choix des espèces

Les propriétés immuno-régulatrices de l’anticorps ne peuvent être testées que dans un modèle primate ou humanisé. Nous avons choisi les souris NOD/SCID/Il2R gamma-/- déficientes en cellules immunes car elles permettent l'acceptation de cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire. Ces souris sont issues de l'animalerie Charles River et sont reproduites au sein notre animalerie. A noter également que cette espèce animale présente une facilité de reproduction, d'hébergement et de manipulation.

600 rongeurs, 480 souris et 120 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 420 tués à l'issue et 180 réutilisés. Ils reçoivent plusieurs injections d'un immunogène émulsionné avec l'adjuvant de Freund, puis un rappel sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever leur rate et récupérer les anticorps. Le porteur indique que les bons répondeurs sont tués tandis que les mauvais répondeurs sont tués ou versés à un programme de formation. Il affirme le recours aux rongeurs "indispensable" et le prélèvement d'organes possible seulement sur un "organisme entier".

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps monoclonaux ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps monoclonaux soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après immunisation de l’animal, l’objectif est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’ajout d’une drogue immunosuppressive. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Les immunisations seront réalisées par voie intrapéritonéale dans un premier temps et par voie intrapéritonéale chez la souris ou intraveineuse chez le rat (stimulation forte des lymphocytes, qualifié de boost final). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris et le rat. Des prélèvements de sang pourront être réalisés à la veine sub-mandibulaire afin de suivre le niveau d’immunisation des souris ou la veine jugulaire chez le rat. A la fin du protocole, les prélèvements de rate et de ganglions lymphatiques seront réalisés afin de récupérer les cellules B productrices d’anticorps à la vue de la fabrication d’hybridome.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique de l’immunogène injecté à l’animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

Pour la génération d’anticorps monoclonaux chez la souris BALB/c ou le rat Wistar, nous effectuerons deux à trois injections par voie intrapéritonéale (i.p.) à quinze jours d’intervalle puis un rappel par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse, trois jours avant la mise à mort. Les administrations i.p. (5-10 ml/kg) sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Lors de la première i.p., le liquide injecté contient l’immunogène émulsionné volume à volume avec (ou sans) de l’adjuvant complet de Freund. Les injections suivantes se déroulent de la même façon mais en présence (ou non selon la nature de l’immunogène) d’adjuvant incomplet de Freund. Quinze jours plus tard, le « boost » final est réalisé par voie intrapéritonéale (ou intraveineuse chez le rat). Ce dernier est réalisé via la veine pénienne sous anesthésie gazeuse. Pour ce rappel, l’immunogène est repris uniquement dans du tampon PBS dans un volume final de 0,1mL/animal. Trois jours plus tard, les animaux seront mis à mort et la rate sera prélevée stérilement. Les ganglions lymphatiques pourront également être récupérés. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’administration d’une drogue immunosuppressive. Deux à quatre injections ip seraient réalisées à 14 jours d'intervalle (soit 4 injections sur 42 jours au maximum), trois jours avant le début du protocole de l'immunisation décrit ci-dessus. Chez la souris, des prélèvements de sang via la veine mandibulaire permettront de tester la présence d’anticorps spécifiques dans le sérum. Le prélèvement sera réalisé sur souris vigiles. Un prélèvement sera réalisé un jour avant l’immunisation (basal) puis 7 jours après la deuxième immunisation et 7 jours après la troisième immunisation s’il y en a une. Le volume maximal prélevé est de 0,5 mL de sang total. Chez le rat, les prélèvements se feront au même timing par ponction de la veine jugulaire au travers du muscle pectoral sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4% pour l’induction puis maintien à 2% avec un mélange 50% air / 50% O2). Le volume maximal prélevé est de 1 ml. Un prélèvement terminal de sang pourrait être demandé par le sponsor. Dans ce cas, l’animal sera anesthésié comme indiqué ci-dessus, et un volume de 1 ml pour la souris et 4ml pour le rat serait prélevé. L’animal serait ensuite mis à mort.

Impact sur les animaux

Les points limites ont été fixés sur la base de l’évaluation de signes caractéristiques de la douleur mais aucune mortalité et souffrance n’est attendue dans ce projet (Raffinement). Une grille d’évaluation clinique avec établissement d’un score sera utilisée et des mesures adaptées seront prises pour réduire ou supprimer la douleur des animaux en fonction de ce score.

Devenir

Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une bonne réponse immunitaire seront sélectionnés. Ces animaux seront mis à mort afin de pélever leur rate pour récupérer les anticorps monoclonaux. Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une mauvaise réponse immunitaire ne seront pas sélectionnés. Ces animaux seront soit mis à mort ou gardés en vie pour être réhabilité dans un programme de formation.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules excrétrices d’anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été déterminé par un calcul de N = 10 animaux par série expérimentale. Ce nombre est suffisant pour générer les anticorps par la technique d’hybridomes.

Raffinement

L'acclimatation des animaux durera au minimum 5 jours. À réception, les souris seront collectivement hébergées (au minimum 3 souris par cage selon le poids) dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. Les rats seront hébergés par deux dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. L'eau et la nourriture (RM1, SDS Dietex, ou équivalent) seront données ad libitum. Les animaux auront accès à différents types d’enrichissements, changés de manière hebdomadaire afin d’éviter une éventuelle lassitude ou habituation (maison, coton, cubes de bois, rouleaux de carton, papier kraft). Les conditions d’hébergement et le bon état de santé́ des animaux seront contrôlés quotidiennement. Bien que aucune douleur ne soit attendue si les animaux venaient à présenter des signes de souffrance, des administrations de buprénophine seront réalisées jusqu'aux prélèvements terminaux. La buprénorphine serait administrée par voie sous cutanée, BID, à 0,01 mg/kg pour le rat et 0,05 mg/kg pour la souris. Pour les injections i.v., une anesthésie gazeuse à l'isoflurane sera utilisée.

Choix des espèces

Pour de nouvelles cibles antigéniques, l’utilisation d’animaux pour l’immunisation et la génération d’hybridomes reste nécessaire car aucun modèle in silico (modèle mathématique, analyse bio-informatique) ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d’un antigène. Les nouveaux modèles de génération d’anticorps monoclonaux (utilisation de souris transgéniques « xenomouse » produisant des anticorps humains ou immunisation in vitro de lymphocytes B de souris) ne permettent pas de s’affranchir également de l’utilisation des animaux. La maturité sexuelle des souris et des rats se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris BALB/c ou les rats Wistar seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation.