Troubles immunitaires

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes, elles reçoivent un agent toxique puis une greffe de cellules humaines, avec des poses d'implants par chirurgie, pour mettre au point un modèle de souris "humanisée" servant à tester des thérapies géniques. Le porteur indique que la greffe peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte, avec anémie progressive et perte de poils au bout de plusieurs mois. Il affirme qu'aucune coculture de cellules ne prédit ces effets à l'échelle de l'organisme et conclut au recours "requis" à la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est de mettre en place un modèle de souris permettant d’ évaluer des thérapies géniques à base de cellules immunitaires génétiquement modifiées, pour traiter des maladies humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra de mettre en place un modèle de souris humanisées à l’aide de cellules hématopoïétiques humaines transduites avec un lentivirus, afin par la suite de pouvoir tester dans ce modèle l’efficacité de l’injection de cellules hématopoïétiques génétiquement modifiées sur des maladies inflammatoires et/ou cancéreuses.

Procédures

Des souris immunodéficientes seront réceptionnées puis acclimatées au moins 5 jours. Elles recevront au maximum 4 administrations intrapéritonéales afin de faciliter la prise de la greffe dans les deux premiers jours suivant l’acclimatation (injection sur animal vigile, moins de 5min). Ensuite, 24-48h après la dernière des ces injections elles recevront une greffe de cellules humaines par voie intraveineuse à la veine de la queue (animal vigile : moins de 5 minutes / Animal anesthésié : maximum 30 minutes). Afin d’évaluer l’efficacité de potentiels traitements sur la prise de la greffe, des composés chimiques ou biologiques pourront être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’au maximum une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie ou en moins de 5 min sur animal vigile; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’au maximum une heure sinon); ou par minipompe ou implant (intraveineux, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Les études dureront au maximum 1 an mais en moyenne 3-6 mois.

Impact sur les animaux

Les administrations de Busulfan pourront générer une toxicité modérée manifestée par une perte de poids transitoire. Les animaux récupèreront leur poids initial en 3 semaines environ. A très long terme (plusieurs mois), une anémie est susceptible d’apparaître. Bien que de la douleur suite à l’injection ne soit pas attendue, son absence sera contrôlée lors des premières administrations. La greffe est susceptible (risque très faible compte tenu du tri des cellules) de générer une maladie du greffon contre l’hôte d’intensité modérée, se manifestant par une anémie progressive et des dépilations. Ces manifestations sont susceptibles d’apparaître après plusieurs mois. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.

Devenir

Après la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.

Remplacement

Les effets d’une greffe de cellules immunitaires génétiquement modifiées se matérialisent à l’échelle de l’organisme dans son ensemble, et bien qu’il existe des systèmes de coculture de cellules, il n’est à ce jour pas possible d’en prévoir les effets sur un organisme dans sa globalité. Il en est de même pour la prédiction de l’efficacité de molécules visant à influencer la prise de la greffe. C’est pour cette raison que l’utilisation de ce modèle murin est requise.

Réduction

Sur la base de la littérature, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure est de 10 animaux par groupe. Cependant, les premières études visant à établir les conditions de la greffe permettront de modifier au besoin ce nombre, s’il est insuffisant, ou au contraire s’il peut être réduit. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps.

Raffinement

Les cellules injectées auront été au préalable triées afin de minimiser le nombre de lymphocytes T qui seraient susceptibles de générer une maladie du greffon conte l’hôte. Lors des premières administrations de Busulfan, les animaux seront observés au moins deux fois lors des 6 premières heures afin d’évaluer les effets indésirables. Si de la douleur est constatée sur les premiers animaux, une analgésie à la buprénorphine sera délivrée a posteriori, et mise en place préventivement (30 minutes avant minimum) pour les animaux suivants. Les animaux seront pesés au minimum deux fois par semaine et leur état clinique sera contrôlé, avec une attention particulière pour l’anémie (couleur des muqueuses, température et niveau d’activité des animaux), et pour l’apparition de lésions dermatologiques (alopécie, irritation des yeux) du fait du risque de développement d’une maladie du greffon contre l’hôte. Le risque principal étant la mise en place d’anémie après plusieurs mois, lors des études de mise en place du modèle, des numération formule sanguine permettant d’évaluer l’anémie seront réalisées (environ toutes les 2 semaines) afin de suivre ce paramètre. L’évolution de l’hématocrite suite à la greffe sera un critère de choix de la souche finale de souris. Les points limites concernant l’état général de l’animal sont listés en détail dans la procédure. De la nourriture sera placée au fond de toutes les cages ainsi que de la nourriture gélifiée lorsque que certains animaux présenteront au moins 10% de perte de poids. En cas de déshydratation constatée sur certains animaux, les animaux concernés seront réhydratés une (déshydratation légère) ou deux fois (déshydratation modérée ou sévère) par jour par voie sous cutanée. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie (implants), une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait d’implant maximum par animal.

Choix des espèces

La greffe de cellules hématopoïétiques humaines chez la souris immunodéficiente est bien décrite dans la littérature. Par la suite, la mise en place de ce modèle chez la souris nous permettra dans le cadre d’autres projets de l’utiliser en combinaison avec d’autres modèles établis chez la souris de maladie pour lesquelles la greffe de cellules hématopoïétiques génétiquement modifiées pourrait présenter un intérêt thérapeutique. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées au polluant PFOS par gavage deux fois par semaine pendant vingt-huit jours, vaccinées contre la grippe, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire. Le porteur les fait tuer pour prélever les organes cibles du système immunitaire. Il affirme que la souris est le "meilleur modèle" et qu'il n'existe "pas encore" de méthode alternative, tout en présentant l'objectif final du programme comme la mise au point de tests sans animaux.

Objectifs

De nombreuses substances chimiques produites par l’activité humaine polluent l’environnement. Ces polluants environnementaux sont multiples et leurs effets néfastes sur la santé humaine sont nombreux. Parmi les polluants environnementaux, certains sont des polluants organiques persistants, c’est-à-dire qu’ils s’accumulent dans l’environnement mais aussi dans les organismes, comme l’organisme humain, du fait d’une très lente élimination. Ils représentent une large famille de plusieurs milliers de composés produits intentionnellement par synthèse chimique pour leurs propriétés diverses. Ces substances se répandent dans l’environnement lors de leur production et de leur utilisation. La population humaine y est donc largement exposée, notamment, par ingestion ce qui peut entraîner de nombreux problèmes de santé comme la perturbation endocrinienne (maladies thyroïdiennes, problèmes de fertilité…), des lésions hépatiques et des cancers. L’agence sanitaire européenne a proposé une réévaluation de la toxicité de ces polluants organiques persistants en incluant leurs effets sur le système immunitaire. L’objectif de cette expérience pilote consiste à mettre au point un protocole adapté visant à analyser, chez la souris, les conséquences d’une exposition par ingestion (gavage) à un polluant organique persistant, sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination anti-grippale. L’administration par ingestion a été choisie afin de mimer le principal mode d’exposition de la population humaine. Le polluant choisi pour cette expérience est l'un des plus connus de sa catégorie.

Bénéfices attendus

Ce programme de recherche en immunotoxicologie englobe de nombreux laboratoires de recherche français et étrangers. Il s’agit d’une démarche de caractérisation des effets de polluants environnementaux sur l’organisme. Ces effets constituent un réel enjeu de santé publique. Ce projet d’immunotoxicologie dont fait parti cette première demande d'autorisation à projet, a pour objectif de développer des biomarqueurs d’exposition et des méthodes de mesures standardisées avec l'objectif à la fin de la réalisation complète du programme de mettre en place des tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.

Procédures

Gavage : 2 fois par semaine pendant 28 jours. Le temps de gavages est de moins d'une minute. Injection intra-musculaire : 2 injections maximun sur 74 jours. Une injection dure environ 30 secondes. Prélèvements sanguins tous les 5 jours pendant 47 jours. Comme ce prélèvement se ferra au niveau sinus retro-orbitaire en tenant compte de la sédation par inhalation, de la contention et de la récupération du sang la durée est estimée à 3 minutes par prélèvement.

Impact sur les animaux

Le gavage peut induire une iritation de l'oesophage. La toxicité du polluant peut provoquer une réaction chez l'animal. La vaccination en intra musculaire peut provoquer une douleur localement. Les prises de sang répétés engendrent des contraintes aux animaux à cause de la contention et du renouvellement de leur volume sanguin induit par les prélèvements et pouvant avoir une influence sur leur état général.

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour étudier dans le détail le système immunitaire.

Remplacement

La souris est le meilleur modèle pour ce genre d’étude d’immunotoxicité sur la réponse vaccinale et il n’existe pas, encore à ce jour, de méthode alternative à ce modèle. Il permet d'étudier la réponse intégrée de l'organisme, cruciale dans la réponse immunitaire. Dans cette DAP nous prévoyons une première partie expérimentale afin de mettre au point nos techniques d'analyse et de valider le design expérimental post mortem prévu. Selon les résultats obtenus grâce à cette étude, un nouveau projet sera mis en oeuvre sur des souris mâles et femelles en testant différentes doses de polluant, probablement plus faibles que la dose utilisée dans cette présente expérience . Ceci permettra d’évaluer l’effet genre ainsi que la relation entre la dose de polluant et son effet sur la réponse vaccinale. Dans l’ensemble notre projet permettra de mieux comprendre l’impact des polluants environnementaux sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination dans un modèle in vivo. Les résultats obtenus in vivo seront comparés à ceux que nous obtiendrons en parallèle sur des modèles in vitro et ex vivo (cellules humaines) afin d’aider à la mise en place de tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.

Réduction

Les procédures ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. De plus, afin d’obtenir le maximum d’informations sans augmenter le nombre d’animaux utilisés, nous élargirons notre étude à d’autres tissus que ceux composant le système immunitaire (rate, sang), notamment le foie, qui joue un rôle crucial dans le métabolisme et la détoxication. Afin de rationaliser le recours aux animaux, le plan expérimental prévoit le prélèvement de plusieurs tissus sur une même souris (rate, foie, sang), la congélation de plusieurs échantillons d’un même tissu pour des analyses a posteriori (par notre laboratoire ou dans le cadre de collaborations), ainsi que l’analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement (ARN, protéines). En particulier, nous travaillons en concertation avec différents laboratoires de recherche impliqués dans le programme et avons établi une procédure de partage des prélèvements biologiques murins afin d'optimiser l'utilisation des souris.

Raffinement

Les procédures ont été pensées afin de limiter la douleur, des points limites nous permettant d’estimer le degré de douleur ou d’inconfort ont été définis et une grille de scoring a été établie. Des actions d'enrichissement du milieu de vie sont proposées pour réduire les nuisances. Les animaux seront hébergés en portoir ventilé par groupe de 5 avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture et à de l’enrichissement comme des maisons type igloo en plastique ou en carton. Pour réaliser les prélévements de sang les animaux seront sédatés par une anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le modèle est couramment utilisé dans le domaine de la toxicologie selon la bibliographie. Les animaux seront expérimentés à partir de 7 à 8 semaines d'âge, qui correspond à la fin de la phase exponentielle de croissance, selon la fiche référence de la souche du fournisseur et cet âge.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à deux injections intra-péritonéales par jour pendant dix jours sur animal vigile, puis un prélèvement de sang intra-cardiaque avant l'euthanasie pour récupérer organes, rate et ganglions. L'objectif est de tester des inhibiteurs d'une protéine, qui font l'objet d'un dépôt de brevet, pour la greffe de poumon. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et "le seul modèle préclinique adapté".

Objectifs

BOB1 est un facteur de transcription exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associée au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. Notre hypothèse est que BOB1 est un déterminant transcriptionnel qui contrôle les réponses immunes allogéniques après greffe de poumons. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de modifier le programme transcriptionnel des lymphocytes activés et fournir un bénéfice thérapeutique pour la prévention et le traitement des dysfonctions chroniques du greffon. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique. Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune spécifique d’un alloantigène, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Ces souris développent une réponse immune complète (humorale et cellulaire) spécifique d’un alloantigène que nous pouvons quantifier. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique et innocuité in vivo chez la souris. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une allogreffe de poumons.

Bénéfices attendus

D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 2 minutes, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intrapéritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, des tests statistiques adequats sont utilisés et le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.

8 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sensibilisées à un allergène puis soumises à un déclenchement provoquant une réaction allergique pouvant devenir systémique, elles reçoivent des composés dont la voie et la fréquence d'administration sont fixées "selon le choix du sponsor", avec prélèvements de sang et de fèces. Le projet, mené pour des partenaires commerciaux, vise à évaluer des candidats médicaments contre le choc anaphylactique. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne peut se substituer à la souris pour reproduire les mécanismes de l'allergie alimentaire.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement curatif de l'allergie alimentaire, seuls les symptômes sont pris en charge. Cette pathologie peut affecter la qualité́ de vie des patients mais également avoir des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke. Le choc anaphylactique est un réaction immunitaire allergique grave en réponse à l’exposition à un allergène. Cet allergène peut venir des aliments, de certains médicaments, d’une piqûre d’insecte, du contact avec du latex, voire d’un effort physique intense après ingestion d’un aliment légèrement allergène. Si le risque de décès par suite du choc anaphylactique existe, il demeure rare, de l’ordre de 0,3 %. Cette réaction peut atteindre le système cardiaque, respiratoire, cutané, gastro-intestinal, entrainant notamment des difficultés respiratoires, des réactions cutanées, des nausées/diarrhées, une baisse de la tension artérielle et possiblement la mort. La recherche menée ici a pour objectif de tester de futurs candidats médicaments ou substituts alimentaires qui pourront permettre de mieux prendre en charge cette pathologie et de la traiter de façon durable. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles expérimentaux permettant une meilleure compréhension et analyse des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de ces maladies inflammatoires ainsi que l'efficacité́ de nouvelles molécules thérapeutiques visant à̀ améliorer la santé des patients. Pour cela nous proposons plusieurs modèles de sensibilisation présentant comme allergène : l'ovalbumine, la bétalactoglobuline bovine (BLG), des extraits contenant de l’arachide, du gluten, du blé, du sésame, des fruits à coques, du sésame, des coquillages, des crustacés, des poissons (liste non exhaustive). La molécule à tester sera administrée par différentes voies recréant les diverses possibilités d’administration médicamenteuses chez l’Homme et selon la voie d'administration conseillée pour ce composé.

Bénéfices attendus

Les modèles animaux d'allergie alimentaire utilisés dans cette étude sont pertinents pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de l'allergie alimentaire afin de répondre à un besoin important de santé, celui des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke pouvant porter atteinte à la vie des patients souffrants d'allergies alimentaires.

Procédures

Dans le but de réaliser une réaction allergique plus importante un jeûne de 4 heures pourra être réalisé avant chaque sensibilisation et/ou lors du challenge final. La molécule à tester pourra être administrée dans l’eau de boisson, dans l’alimentation, par gavage, inhalation, injection intra péritonéale, intravasculaire, sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire selon le choix du sponsor. La fréquence de l'administration est variable en fonction de la demande de nos partenaires. Les animaux seront pesés quotidiennement. Au cours de l'étude, le sang sera prélevé en respectant un volume maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pour une période de récupération de 7 jours. Les fécès pourront également être prélevés maximum 1 fois par semaine au cours de l’étude. D'autres prélèvements seront possibles en fonction des demandes du sponsor. Des relevés de température rectale ainsi qu'un scoring clinique pourront être effectués quotidiennement pour surveiller l’inconfort des animaux. Les animaux sont ensuite anesthésiés sans réveil et le sang total est prélevé au niveau de l'aorte abdominale ainsi que d'autres organes.

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable est le développement d'une réaction inflammatoire à un niveau local et possiblement systémique en fin d'étude, lors du challenge.

Devenir

Tous les animaux du protocole sont euthanasiés à la fin et des prélèvements sont réalisés pour l'analyse.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude des allergies alimentaires. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - réduire le nombre des animaux utilisés en utilisant un nombre très proche du nombre minimal de 6 animaux nécessaire à une étude statistique. Basé sur la bibliographie et notre précédente expérience du modèle le nombre de 10 animaux permet de répondre à la fois à l’hétérogénéité et la variabilité individuelle tout en respectant la puissance statistique et la nécessité de réduire les animaux.

Raffinement

Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - raffiner en apportant du soin et une observance accrue aux animaux en souffrance ou en angoisse suite à l'induction des maladies. Ces pathologies étant basées sur l'inflammation, un traitement pharmacologique visant à̀ réduire la souffrance de l'animal ne pourra être envisagé sans compromettre les résultats de l'étude. L'état de santé des animaux sera évalué́ quotidiennement selon des critères d'apparence physique et comportementaux selon le tableau détaillé́ dans le paragraphe. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63/UE en unités individuelles ventilées de type III ou IV avec enrichissement de l’environnement (composants de nidification et igloo). L'enrichissement pourra être augmenté si nécessaire.

Choix des espèces

Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'allergie alimentaire sont complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces évènements par une approche substitutive de culture cellulaire. La souris est largement décrite dans la littérature pour être une espèce de choix dans ce modèle. Les allergies alimentaires pouvant survenir à tout moment de la vie d'un individu, les souris seront préférentiellement utilisées à l'âge adulte (8-12 semaines) au début des investigations, car elles présentent un système immunitaire mature. Cependant selon la population ciblée, l’âge pourra être laissé à l’appréciation du sponsor, les animaux pourront être plus jeune ou plus âgés. L'âge minimal étant de 3 semaines et l'âge maximal sera déterminé par l'âge de la population ciblé et peut être de 3 ans.

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur soumet une partie des souris à une irradiation du corps entier suivie d'une greffe de cellules, et l'ensemble à des injections intrapéritonéales répétées et à des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les quinze jours pendant trois mois, qu'il reconnaît pouvoir altérer leur vision. Ce travail vise à comprendre le rôle d'une molécule dans une forme agressive de mastocytose, un cancer du sang. Il cite un "dépôt de brevet" et des financements parmi les retombées attendues et affirme le modèle animal "indispensable", la complexité des interactions cellulaires n'étant selon lui pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les mastocytoses systémiques (MS) sont des formes incurables de maladies du sang particulièrement difficiles à traiter. Ces maladies très hétérogènes allant de formes indolentes à des leucémies fatales, sont caractérisées par l’accumulation et l’activation incontrôlée des cellules immunitaires appelées mastocytes dans la moelle osseuse. Plus de 30% des patients atteints de MS agressives ne répondent pas aux traitements administrés en clinique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le métabolisme des cellules est fortement perturbé dans les cellules cancéreuses afin de répondre à leur besoin en énergie pour proliférer de façon aberrante. Nous avons donc identifié les altérations métaboliques dans les mastocytes de patients afin de tester le potentiel clinique de leur inhibition. Nous avons mesuré une forte concentration de kynurénine (L-Kyn), une petite molécule chimique, dans le plasma des patients atteints de formes agressives comparé aux indolentes et confirmé l’activité de la voie dont elle fait partie dans des mastocytes issus de la moelle osseuse de patients.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment la L-Kyn dont la concentration est élevée de façon physiologique dans le plasma des patients atteints de MS agressive, exacerbe les fonctions mastocytaires en régulant directement les fonctions des mastocytes ou leur microenvironnement (adipocytes médullaires). Ces analyses nous permettront d'une part de tester le potentiel de la voie de la kynurénine comme cible thérapeutique dans les MS agressives dans un contexte physiologique mais également d'identifier de nouvelles cibles en aval de la L-Kyn qui pourraient également être pertinentes. Cette étude est la première étape vers le développement de nouveaux médicaments ciblant ces régulations en combinaison ou non avec les traitements utilisés pour cette pathologie en routine clinique. Elle permettra également le dépôt de brevet et de financements indispensables pour la poursuite de ce projet. Ces pathologies agressives sont particulièrement invalidantes ; la médiane de survie des patients au diagnostic est de moins de 3 ans et de moins de 6 mois pour les formes les plus agressives. Cette étude est donc indispensable pour améliorer le devenir des patients et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de prévenir ou freiner le développement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux (procédures 1-2) recevront une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 3 fois par semaine pendant une semaine puis 5 fois par semaine pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins seront réalisés en rétro-orbital sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à l’atteinte des points limites. Les animaux (procédures 3-5) recevront une irradiation sous-létale sur corps entier sur animaux vigiles. Une greffe intraveineuse en rétro-orbital unique sera réalisée. Une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 5 fois par semaine sera réalisée pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins en rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à atteinte des points limites.

Impact sur les animaux

La manipulation et la pesée pourraient entraîner du stress chez les animaux. Une mauvaise tolérance à l’irradiation sous-létale pourrait entraîner une inactivité et une mobilité réduite pendant quelques heures après l’irradiation (rare). Le même phénotype pourrait être observé après une greffe partielle des cellules injectées quelques jours après la transplantation. Une perte de poids pourra être observée et sera monitorée. Les prises de sang répétées dans le sinus rétro-orbital pourraient causer des problèmes de vision aux souris.

Devenir

La totalité des individus impliqués seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation de plusieurs modèles cellulaires in vitro seuls ne permet pas de rendre compte de la complexité des interactions cellulaires impliquées dans la maladie. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal afin de valider notre hypothèse. A cette étape du projet, il n’existe aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Le calcul d’effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul d'effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul statistique approprié. Cette approche nous permet de conserver une méthode scientifique rigoureuse tout en réduisant au minimum le nombre d'animaux nécessaires. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes contrôles. Afin de réduire à son minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes contrôles seront commun à plusieurs tests d'efficacité. Enfin, afin de réduire le nombre d'animaux issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos expériences.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les expérimentateurs et le personnel qualifié de l'animalerie sont formés pour limiter au maximum le stress des animaux lors de leur manipulation. Les animaux utilisés dans ces expériences seront soumis à une surveillance quotidienne. Les objectifs de toute procédure étant de donner à l’animal la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute souffrance due aux procédures soit détectée et réduite. Pour ce faire, le suivi de la maladie se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs. Dès l’apparition des points limites, que nous avons choisis le plus précoce possible pour que l’animal reste asymptomatique, l’animal sera mis à mort. Par conséquent, cette mise à mort intervient avant l’apparition de symptômes et de nuisances dues à la pathologie. Nous optimiserons les conditions d'hébergement des animaux par la présence d'enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactes et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 4 ou 5 afin d'éviter le stress de l'isolement. Pour limiter au maximum la souffrance des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie, et une analgésie sera mise en place si nécessaire (voir points limites).

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici l'hématopoïèse). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. En effet, bien que des formes ancestrales de systèmes hématopoïétiques aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers parmi lesquels, le poisson zèbre et la souris, sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, les outils développés chez cette espèce et l’absence d’expertise sur le poisson zèbre au sein de l’institut satisfait aux exigences d’utilisation de la souris comme espèce la moins susceptible de ressentir de la souffrance ou de la douleur pour les expérimentations proposées. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ces types de modèle de MS et ce type d'injection de cellules néoplasiques mastocytaires en intraveineux, c'est à dire des souris "jeunes adultes" âgées de 6 à 10 semaines au moment de la transplantation et/ou des injections intra-péritonéale prévues.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'inhibiteurs et de molécules inflammatoires, dont une instillation intra-rectale par cathéter provoquant une inflammation intestinale, et un prélèvement de sang, pour tester des inhibiteurs des NADPH oxydases dans des modèles d'inflammation chronique. Le porteur annonce une douleur modérée, une perte de poids et des selles molles. Il évoque des systèmes de co-cultures capables d'imiter certaines fonctions d'organes, tout en les jugeant limités par l'absence de flux sanguin.

Objectifs

Les maladies inflammatoires sont des causes majeures de mortalité dans le monde développé. Au cours de la réponse inflammatoire pathologique, c’est-à-dire lorsque la réponse inflammatoire est non résolue, devient prolongée et chronique, les cellules du microenvironnement produisent de manière accrue des dérivés toxiques de l’oxygène. Ces dérivés sont des substances chimiques qui sont formées à partir de l’interaction de l’oxygène avec d’autres composés et peuvent endommager les cellules car ils sont toxiques. La production excessive de ces dérivés peut donc entraîner des lésions tissulaires contribuant à la progression des maladies inflammatoires chroniques. Dans l’organisme, les dérivés toxiques de l’oxygène sont produits principalement par une famille de protéines spécialisées appelées NADPH oxydases (NOXs). Le dysfonctionnement ou l’expression anormale de ces protéines pourrait donc contribuer aux maladies inflammatoires. Pour de nombreuses maladies inflammatoires chroniques, les solutions thérapeutiques restent insuffisantes. C’est dans ce contexte de santé publique que se tient notre projet d’étude qui visera à valider in vivo, c’est-à-dire dans un organisme vivant, les NOXs comme cibles thérapeutiques clés pour le traitement des maladies inflammatoires, et à évaluer in vivo, dans des modèles murins d’inflammation chronique l’action anti-inflammatoire de nouvelles molécules qui inhibent les NOXs ou leurs voies d'activation que nous avons récemment identifiées in vitro.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra d’identifier de nouvelles molécules capables d’inhiber in vivo la progression des maladies inflammatoires chroniques apportant ainsi la preuve du concept. Elle permettra d’envisager des essais cliniques chez des patients atteints de maladie inflammatoires chroniques.

Procédures

Les principaux types d’interventions auxquels les animaux seront soumis sont : des injections intra-péritonéales (administration directement dans la cavité abdominale) et sous-cutanées à l’aide d’une aiguille fine, une instillation (administration lente goutte à goutte) de molécules inflammatoires à l’aide d’un cathéter fin par voie intra-rectale, et un prélèvement de sang par ponction au niveau de la queue avec une aiguille fine. Excepté le prélèvement de sang qui sera effectué une seule fois sur tous les animaux à la fin de l’expérience, le nombre des interventions variera selon les modèles expérimentaux (3 modèles expérimentaux). Dans le 1er modèle expérimental, d’une durée de 3 jours, les souris vont subir: 1 injection en sous-cutanée pour l’anesthésie, 2 en intrapéritonéales pour l’administration de l’inhibiteur (substance qui a la capacité de bloquer un processus biologique spécifique, ici l’inflammation), 1 en intra-rectale pour l’administration de la molécule inflammatoire. Dans le 2ème modèle expérimental d’une durée de 11 jours les souris vont subir uniquement 4 injections en intrapéritonéales pour l’administration de l’inhibiteur, la molécule inflammatoire est ajoutée dans la boisson. Finalement dans le 3éme modèle expérimental d’une durée de 8 jours, les souris vont subir 2 injections en intrapéritonéales pour l’administration des molécules inflammatoires et 4 injections en intrapéritonéales pour l’administration de l’inhibiteur.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation utilisés dans cette étude sont des modèles de sévérité modérée. L’animal sera susceptible d’éprouver une douleur modérée de courte durée et son bien être pourra être impacté de façon modérée. Les animaux pourront présenter une perte de poids, les fèces pourront apparaître inconsistantes. Ils pourront également présenter une mobilité réduite. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés (état général, poids, consistance des fèces, mobilité). Un analgésique sera administré si nécessaire toutes les 12 heures. Si l’animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les tissus seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude in vivo ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire qui fait intervenir plusieurs types cellulaires, ce qui nous oblige à travailler à l'échelle d'un organisme. Il sera cependant possible d’envisager des systèmes de co-cultures entre les cellules immunitaires et des structures tridimensionnelles cultivées en laboratoire pouvant imiter certaines caractéristiques et fonctions d'organes humains ou animaux tel que l’intestin. Ces co-cultures pourront reproduire les interactions entre les différents types cellulaires au cours de la réponse inflammatoire de la même manière que dans un organisme vivant. Cependant ce modèle reste limité par le fait de l’absence de flux sanguin ou de déformations mécaniques (modification de la structure d’un organe en réponse à des forces mécaniques) qui sont essentiels pour la modélisation des maladies.

Réduction

Dans ces différents modèles le taux de mortalité est faible (moins de 10%), nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaires et suffisants dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats statistiquement exploitables à 6 par sous-groupe. Cette démarche a été validée lors de la demande d’autorisation de projet utilisant des animaux à des fins scientifiques précédente.. Les organes (intestins, pattes, plasma) seront conservés de façon adéquate pour des études ultérieures en cas de besoin sans avoir à recourir à de nouvelles expérimentations animales.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes et le stress imposées aux animaux : hébergement en groupe, portoirs ventilés, période d’acclimatation d’au moins 5 jours dans les mêmes conditions environnementales que celles qui prévaudront lors du protocole expérimental afin de stabiliser les animaux au point de vue physiologique et comportemental et de diminuer leur stress. Un enrichissement sera proposé aux animaux tout au long de l’expérience (coton et lanières cartonnées pour la confection de nids). Des critères comportementaux, physiologiques et cliniques seront observés pour définir le point limite précoce adapté. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés (état général, poids, consistance des fèces, mobilité). Un analgésique sera administré si nécessaire toutes les 12 heures. Si l’animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie de l’inflammation intestinale et de l’arthrite induite dans cette espèce animale est proche de celle de l’homme. De plus la taille et le poids limité de l’animal permet de restreindre les traitements à administrer et de nombreux outils biologiques sont disponibles pour caractériser l’inflammation chez la souris. L’espèce souris est donc la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants. Les souris âgés de 8 à 12 semaines seront utilisés car les publications ayant validé les différents modèles utilisés, ont montré que ces stades sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (souris adultes de poids suffisant).

510 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections répétées, intratumorales, intramusculaires ou intrapéritonéales, et des gavages sur animal vigile, pour tester des immunothérapies contre des tumeurs rhabdoïdes de l'enfant. Les retombées annoncées pour les patients restent formulées comme des perspectives de soins cliniques. Le porteur affirme que l'étape chez la souris est "indispensable" pour évaluer l'efficacité de ces traitements avant une application humaine.

Objectifs

Les tumeurs rhabdoïdes (RT) sont des cancers rares mais très agressifs, qui touchent les nourrissons et les jeunes enfants, et se développent dans une grande variété d'organes, tels que le rein, le foie et le cerveau. L'agressivité de ces tumeurs nécessite aujourd'hui des traitements chirurgicaux, de chimiothérapie et de radiothérapie très intenses, qui ne sont efficaces que pour une minorité de patients et sont associés à des effets secondaires très graves. Ce scénario démontre un besoin urgent de développer des thérapies innovantes. Il a été récemment démontré que l'immunothérapie, un traitement qui renforce les défenses immunitaires naturelles de l'organisme, peut améliorer le contrôle tumoral d'un grand nombre de cancers. Cependant, elle n'a pas été testée sur les RT car, jusqu'à récemment, on pensait que ces tumeurs étaient invisibles pour les cellules immunitaires. Nos résultats préliminaires suggèrent que les RT peuvent être reconnues par les cellules immunitaires et que certaines stratégies d'immunothérapie pourraient être efficaces dans le contrôle de ces tumeurs. Ce projet a pour but d'explorer quelles molécules de la tumeur sont reconnues par les cellules qui défendent notre corps et ainsi, de développer des immunothérapies combinatoires pour renforcer les réponses anti-tumorales sans générer des effets secondaires graves. Ce projet sera développé par une équipe multidisciplinaire qui implique des pédiatres, des bioinformaticiens, des experts en chimie et en immunologie, ce qui nous permet de disposer des meilleurs outils pour mener à bien cet objectif.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier les mécanismes d’action de certains traitements par immunothérapie ciblant différentes populations de cellules immunitaires et de plus, les résultats obtenus seront importants pour des applications en soins cliniques des patients atteints de ce cancer rare. Ils pourraient également ouvrir de nouveaux champs de recherche pour d'autres cancers pédiatriques partageant des caractéristiques similaires.

Procédures

L’ensemble des procédures vise à évaluer l’effet de traitement sur la progression tumorale, donc l’ensemble des animaux seront greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée intervention inférieure à 10 min). Puis, dans une première procédure, les animaux seront traités tous les 2 jours avec 3 injections au total par voie intratumorale ou intra-musculaire sur animaux vigiles (durée du geste inférieur à 10 sec). Dans une seconde procédure, les animaux seront traités avec un produit tous les 2 jours pour 3 injections au total par voie intratumorale (durée du geste inférieur à 10 sec), et avec un autre produit chaque jour pendant 7 jours par voie intrapéritonéale, sur animaux vigiles (durée du geste inférieur à 10 sec). Dans une dernière procédure, les animaux seront traités avec un produit tous les 2 jours pour 3 injections au total par voie intratumorale (durée du geste inférieur à 10 sec). En parallèle ils seront traités avec un autre produit 2 fois par semaine tout au long de l’expérience par voie intrapéritonéale, ou chaque jour pendant 21 jours par voie intrapéritonéale (durée du geste inférieur à 10 sec), sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les animaux sont greffés avec des tumeurs par voie sous-cutanée dont la croissance sera suivie par des mesures régulières. Les nuisances seront associées à celles d’une petite ouverture du plan cutané (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet découle de résultats préliminaires déjà obtenus d’une part in vivo démontrant l’efficacité d’une immunothérapie sur ce type de tumeur et d’autre part de l’analyse bioinformatique de gènes exprimés par les tumeurs et des gènes exprimés par les cellules immunitaires infiltrant la tumeur. Après ces étapes ayant permis de démontrer l’intérêt de moduler le système immunitaire pour traiter ces tumeurs, et étant donné que la tumeur interagit avec l'ensemble de son environnement in situ (plusieurs types de cellules immunitaires avec des activités parfois contraires, vascularisation, stroma…) pour se développer, l'évaluation pré-clinique des traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours grâce à la culture et aux tests fonctionnels in vitro, l’étape chez la souris est indispensable pour évaluer l'efficacité et le mécanisme d'action de ces types de traitements combinés avant d'envisager une application clinique chez l'Homme en thérapie anti-cancéreuse.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans les conditions réglementaires et sont surveillées régulièrement dont 2 fois par semaine pour mesurer la taille des tumeurs. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux Les animaux sont mis à mort lorsque les points limites énoncés dans la grille de score sont atteints. La greffe des tumeurs est réalisée sous anesthésie accompagnée de l’administration d’un anti-douleur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies anti-tumorales, notamment car la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés. Les souris seront utilisées à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire adulte.