Troubles immunitaires

1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe d'îlots pancréatiques sous anesthésie, des injections de lymphocytes, des dosages de glycémie trois fois par semaine pendant quatre mois et une biopsie de la queue, pour étudier le rôle d'une protéine dans le diabète de type 1 sur la souris NOD, qui développe spontanément un diabète. Le porteur indique que le diabète provoque soif, déshydratation et perte de poids, et que la greffe d'îlots peut entraîner douleurs et mobilité réduite. La retombée annoncée, une nouvelle cible thérapeutique, reste conditionnelle, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace la souris, qu'il décrit comme un "outil incontournable".

Objectifs

Le diabète représente un enjeu majeur de santé publique dont l’importance ne cesse de s’accroitre Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune complexe qui résulte de la destruction spécifique des cellules pancréatiques qui produisent l'insuline et de la perte de la capacité́ à contrôler le niveau de glucose dans le sang. La maladie survient suite à une réaction anormale du système immunitaire. Des cellules du système immunitaire, les lymphocytes T, identifient les cellules du pancréas comme des cellules étrangères à l’organisme du patient, et les éliminent. Au cours d’une réponse immune ces cellules jouent un rôle crucial dans la reconnaissance et élimination des cellules qui présentent des fragments des protéines appelés peptides, issues de pathogènes ou des protéines de notre organisme. Ce projet vise à examiner le rôle d’une protéine responsable de la réduction des peptides à la taille optimale pour l’activation du système immunitaire dans la physiopathologie du diabète auto-immun et à étudier les mécanismes qui contribuent à déclencher la réponse auto-immune. Le modèle de la souris non-obèse diabétique, qui développe un diabète auto-immun spontané partageant de nombreuses caractéristiques avec le diabète de type I humain sera utilisé dans ce projet. Ce travail pourrait, à terme, permettre l’identification et l’utilisation de cette protéine comme une nouvelle cible thérapeutique dans le diabète auto-immun.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination du rôle de la protéine étudiée dans la pathogenèse du diabète auto-immun. Si cette protéine est impliquée dans l’apparition du diabète elle pourrait faire l’objet d’un ciblage thérapeutique.

Procédures

Le dosage glycémique avec un lecteur de glycémie capillaire, pour suivre l’évolution du diabète sera effectué par prélèvements d’une goutte de sang lorsque la glycosurie mesurée avec une bandelette urinaire s’avère positive. Le temps estimé pour effectuer le dosage de glycosurie ou de glycémie est environ 10 secondes par souris. La frequence sera de 3 fois par semaine sur un periode de 4 mois. L'administration des produits par voie intrapéritonéale se fera une seule fois et le temps necessaire est de 5 secondes par souris. L’injection des lymphocytes par voie intraveineuse se fera une seule fois, après induction de l’anesthésie, le temps necessaire est de 5 secondes par souris. La greffe d'îlot sera effectuée une seule fois sous anesthésie generale et la durée de l'intervention est de 15 minutes. La biopsie de la queue avant sevrage entre 2 et 4 semaines se fera une seule fois, ce prélèvement s'ajoutera au marquage des animaux par tatouage réalisé par le personnel de l'animalerie. Le temps necessaire est de 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Le diabète est responsable d’une augmentation de la soif et d’une déshydratation et tardivement une perte de poids. Ces manifestations sont précédées d’une augmentation du taux de sucre dans le sang et les urines. Les injections intrapéritonéales et les prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire ou de la veine caudale induisent un douleur de courte durée. L’animal peut subir un stress au cours de l’anesthésie. Les greffes d’îlots peuvent induire chez les animaux des douleurs les jours suivant la chirurgie accompagnées d’une perte de poids et d'une mobilité́ réduite.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que l'incidence du diabete sera determinée et la reponse immune alors caractérisés.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle alternatif in vitro n’est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun, alors que la souris NOD représente un modèle très performant et hautement informatif. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle de la souris est incontournable.

Réduction

Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. L’incidence du diabète et les différences entre les populations lymphocytaires au cours des différents traitements seront analysées par un test statistique adapté. Le protocole expérimental prévoit l’analyse du système immunitaire des animaux pour limiter la répétition des expériences. La stratégie d’accouplement qui a été choisie permet de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, 3-5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs. Les injections intraveineuses sont effectuées sous anesthésie générale. Les animaux qui ont subi une greffe d’ilots seront suivis quotidiennement la première semaine puis 3 fois par semaine par la suite. Du dietgel sera ajouté dans les cages la première semaine pour faciliter l’alimentation.

Choix des espèces

La souris NOD est considérée comme le meilleur modèle du diabète spontané insulino-dépendant auto-immun et permet d’étudier la maladie et la réponse immunitaire diabétogène. La souris NOD développe un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines d'âge. Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l'étude de cette maladie, en effet les mécanismes immunopathologiques décrits à l'aide des modèles murins se sont avérés très similaires aux mécanismes de la maladie chez l'homme. Aucun modèle alternatif in vitro n'est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun. Les souris NOD femelles adultes développent un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines d'âge. Notre étude d’incidence se concentre sur des animaux déclarant un diabète entre 13 et 22 semaines d’âge.

42 macaques à longue queue vont être utilisé·es, 5 tués pour prélèvement d'organes et 37 réutilisés ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des injections intradermiques, une immunisation, l'injection intraveineuse d'une molécule anti-inflammatoire, jusqu'à 16 prélèvements de sang sur 48 jours dont une anesthésie prolongée de deux heures, ainsi que des ponctions de moelle osseuse et de ganglions. Le porteur décrit le protocole d'anesthésies répétées sur 24 heures comme "inconfortable" et affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer un "système immunitaire complet", ce qui rendrait l'animal "indispensable". Il justifie le macaque par sa "proximité phylogénétique" avec l'Homme.

Objectifs

Les traitements anti-inflammatoires actuels visent à éteindre une inflammation chronique préexistante mais cette atténuation de la réponse du système immunitaire n’est souvent que transitoire et s’accompagne très souvent de rechutes. Les études scientifiques visant à déterminer les mécanismes associés à l’inflammation ont mis en lumière un processus actif de l’extinction de l’inflammation s’appelant résolution de l’inflammation Nous avons déjà démontré dans notre laboratoire que le traitement prorésolutif constitué par notre molécule d'intérêt (anticorps monoclonal ciblant un des récepteurs de la résolution exprimé par les neutrophiles et les macrophages) est cliniquement actif chez la souris dans de nombreux modèles inflammatoires. En effet, dans des modèles de colite induite ou spontanée, nous avons pu apprécier un retour plus rapide ou une stabilisation/amélioration de la colite lorsque les animaux ont été injectés avec ce traitement prorésolutif. Par ailleurs nous avons chez l’Homme, observé in vitro un effet de cette même molécule sur les neutrophiles et les macrophages. En outre, dans une précédente étude chez le primate non humain, nous avons pu apprécier la pharmacocinétique ainsi qu’un effet biologique du produit sur un modèle d’inflammation réalisée par l’injection intradermique de bactéries inactivées aux UV. Ce projet sera dans la continuité du précédent pour évaluer les doses minimales et maximales requises pour observer un effet biologique et évaluer la toxicité du produit ainsi qu’identifier des biomarqueurs d’activité permettant de suivre la pharmacodynamique du produit et orienter les analyses chez l’Homme lors d’essai clinique. En outre, l’étude de biodistribution du traitement n’a pas été réalisée et pourra être évaluée dans cette étude, paramètre indispensable pour l’évolution du produit vers la clinique. Enfin, de manière complémentaire, un modèle de vaccination et rechallenge sera évalué pour répondre à la question d’un éventuel impact du traitement sur la vaccination, notamment la réponse humorale liée aux anticorps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. En outre, la réalisation en parallèle d’un modèle inflammatoire intradermique permettra d’apprécier un effet biologique de la molécule sur un modèle déjà utilisé dans une phase I lors d’essais cliniques et pour lequel nous avons obtenu des résultats préliminaires encourageants nécessitant d’être confirmés. Enfin, l’étude sur la capacité vaccinale après injection de la molécule permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament et s’assurer que l’administration d’une telle drogue de manière concomitante à une vaccination de trouble pas la réponse immunitaire primaire et/ou secondaire.

Procédures

Certains animaux seront soumis sous anesthésie à l’induction d’une inflammation suite à des injections intradermiques (sur 5 min) sur une seule journée. D’autres animaux seront soumis sous anesthésie à une injection intramusculaire ou sous-cutanée (5 min) d’une protéine immunogène de mollusque puis une injection sous-cutanée de cette même protéine (5 min) à 8 jours d’intervalle. Les animaux seront soumis également, sous anesthésie, après injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt (30 min), à plusieurs prélèvements sanguins (au maximum 6 dans une même journée, 16 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 48 jours), notamment lors d’une anesthésie prolongée de 2h, quelques prélèvements de moelle osseuse (N=3, avant traitement, j10 et j21) et de ganglions (N=3, avant traitement, j7 et j21).

Impact sur les animaux

Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Les modèle d’inflammation pourrait créer une démangeaison locale qui sera alors protégée si tel est le cas.

Devenir

Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet après accord du vétérinaire pour une nouvelle procédure légère ou modérée exceptés ceux utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule qui nécessite un prélèvement de différents organes après euthanasie (N=5 animaux).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.

Réduction

Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum, à savoir 3 animaux par groupe, ce qui rend impossible tout test statistique. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, le nombre de 3 animaux/groupe est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude cinétique dans le sérum de la molécule. De plus, si le modèle d’inflammation cutanée (injection bactéries inactivées) n’a pas d’impact sur la cinétique, l’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux, il s’agit de réutilisation d’animaux dans le cadre strict de la loi après avis vétérinaire.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées chez le macaques sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique qui devra toutefois ne pas être dans la catégorie des anti-inflammatoires pour ne pas perturber ou annihiler l’effet de la molécule thérapeutique injectée et évaluée. Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Il est en effet fondamental pour ne pas stresser davantage aussi bien l’animal traité que les autres animaux, de pouvoir lui faire facilement (sous anesthésie légère) des injections ou prélèvements qui seraient impossibles dans un environnement commun. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. Différents modèles chez le macaque peuvent être ainsi développés pour mimer des situations cliniques connues, voire des protocoles similaires déjà existants chez l’Homme comme c’est le cas pour cette étude tout en étant moins douloureux, et tester différents protocoles thérapeutiques innovants en conditions précliniques. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes (3 à 4 kg) dont le système immunitaire est alors mature.

1340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes carencés ou enrichis en gras et sucre pendant seize semaines, des injections répétées, des gavages, et 90 d'entre elles une chirurgie d'accès aux ganglions et au tissu adipeux, avant prélèvement des organes. Le porteur répertorie une gêne à l'administration, des variations de poids et une douleur modérée liée à la chirurgie soulagée par antalgiques. Il affirme que les expériences in vivo sont "absolument essentielles" faute de système in vitro assez complexe.

Objectifs

Ce projet s'intéresse au rôle du microenvironnement immunitaire des organes périphériques comme le foie et l’intestin en conditions physiologiques et au cours de l’inflammation. L’inflammation s'accompagne de modifications des cellules immunitaires au voisinage du site d’inflammation et même jusqu’aux organes plus centraux producteurs de nouvelles cellules effectrices. Pour comprendre la régulation cellulaire et moléculaire de la réponse des cellules immunitaires dans l’intestin et le foie lors de stimuli inflammatoires, les souris sont mises dans des contextes de régimes alimentaire inflammatoires (MCD) et un régime gras et sucré (High-fat High glucose Diet, HFHG). Globalement, les désordres tissulaires engendrés par ces stimulations vont modifier le comportement des cellules immunitaires en agissant à différents niveaux (métabolisme, survie, prolifération, activation...). Ainsi, les cellules immunitaires seront étudiées pour leur propriété de prolifération, différenciation, de motilité et de circulation au niveau des organes primaires du système immunitaire (thymus et moelle osseuse), des organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate, plaques de Peyer) ainsi qu’au niveau des organes périphériques (poumons, l’intestin, le foie et le tissu adipeux). L’étude de la réponse immunitaire des différentes populations impliquées dans l’inflammation tissulaire, permettra de cibler les processus cellulaires et moléculaires mis en place par le système immunitaire en parallèle des modifications globales corporelles et systémiques (infiltration tissulaire, réponse systémique pathophysiologique avec l’analyse des caractéristiques hématologiques, biochimiques, cytologiques et histologiques). L’étape suivante consistera en l’analyse de molécules permettant de moduler la réponse inflammatoire et d’évaluer leur potentiel thérapeutique et leur mode d’action sur les cellules immunitaires et la répercussion sur l’état inflammatoire tissulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors d’inflammation tissulaire au cours de pathologies de type stéatose non alcoolique. A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit l’accumulation de certaines populations immunitaires dans le foie et l’intestin à la suite des inflammations causées par des régimes alimentaires spécifiques. Cela devrait renseigner sur les mécanismes moléculaires mis en jeu dans les tissus en inflammation pour réparer ou amplifier la stéato-hépatite et l’implication des modifications métaboliques associées comme l’insulinorésistance. Le rôle des différentes populations immunitaires sur l’évolution de la pathologie du foie et la perméabilité intestinale associée est encore mal compris. Cependant, des études indiquent que ces populations immunitaires seraient cruciales pour lutter contre une mise en place de modifications irréversibles, comme la fibrose. De plus, nous étudierons si ces processus relancent une hématopoïèse et quels en sont les mécanismes moléculaires associés. A long terme, ces données moléculaires sur l’inflammation pourraient représenter une source importante de moyens thérapeutiques avec des actions supplémentaires pour lutter contre l’évolution de la pathologie de type stéato-hépatite. Le nombre de cas est en constante progression au vu de l’augmentation mondiale de l’obésité qui y est associée.

Procédures

Les interventions sont: Un régime riche en gras et en sucre donné sur une période de 16 semaines à un grand nombre des souris en parallèle de leur contrôle sous régime alimentaire « normal ». Des injections intra-péritonéales (ip) (quelques secondes) tous les 5 jours pendant un maximum de 8 semaines. Des injections ip (quelques secondes) réalisées quotidiennement pendant 7 jours sur d’autres lots de souris. Une seule injection en ip (quelques secondes) sera réalisée soit 10H ou 24H avant la mise à mort. Un gavage de 2 minutes en 1 seule fois par animal sera suivi d’un dosage sanguin de quelques secondes sur une cinétique de 1, 3 et 5 heures pour certains animaux ou de 5, 15, 30, 60, 90, et 120 min pour les autres (quelques gouttes sur bandelettes). 90 animaux subiront une procédure chirurgicale (avec un maximum de 10min) permettant d’accéder aux ganglions et tissu adipeux. Des antalgiques sont administrés en pré et post opératoire et la chirurgie se fait sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Nous avons répertorié 4 points de nuisances qui sont les suivants : 1- Une gêne légère liée à l’administration et/ou les prélèvements effectués. 2- Une perte de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire déficient en Methionine et choline (MCD). 3- Une prise de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire enrichi en gras et en sucre (High-fat High glucose Diet, HFHG). 4- Une douleur modérée liée à la chirurgie et améliorée par la prise d’antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés pour prélèvement de leurs organes et l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.

Remplacement

La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Pour les études dans une seconde étape, toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront entreprises en culture afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, notre étude ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique car les effets du régime sont déjà décrits dans la littérature et nous avons aussi le recul nécessaire avec notre précédent projets sur les mêmes régimes alimentaires. Par exemple, nous savons que l’insulinorésistance et la résistance au glucose ne sont à tester qu’à partir de la 12ème semaine de régime pour des souris sauvages. Les mécanismes cellulaires et leurs modulations ne seront analysés qu’aux stades précis de la cinétique correspondant aux points de temps avec des différences significatives des populations immunitaires détectées lors de la première procédure du projet. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire (sur animal non manipulé), ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. De plus, nous aurons des résultats des procédures qui s’enchainent qui permettront d’éliminer des hypothèses concernant l’implications de certaines populations et/ou molécules. Ainsi, le nombre d’analyse à faire sera réduit par rapport à ce qui a été anticipé en prenant en compte toutes les lignées utilisées à la procédure précédente sans tenir compte de la significativité des résultats. Pour les tests statistiques, nous avons évalué nos nombres finaux à analyser selon les comparaisons à faire entre les variables et selon un niveau de risque fixé à 0.01 et une puissance fixée à 0.66. Quand cela était nécessaire, nous avons appliqué un possible effet cage et donc pondéré par le facteur correspondant. Seulement dans les conditions adéquates (point de cinétique précis) où l'augmentation du taux circulant des cellules immunes est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations bloquées avaient plutôt un effet pro-inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences car ils sont souvent pesés et cela limite leurs stress de suivre cette habitude d’interactions. Une fiche d’observation tout au long des régimes permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Pour la plupart des procédures, les animaux sont mis à mort très peu de temps après le geste invasif. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.

Choix des espèces

La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. De plus, il existe un grand nombre de lignées de souris mutantes et transgéniques, qui permettent des études mécanistiques approfondies. Le recours à ces souris génétiquement modifiées va nous permettre d’identifier et de caractériser les processus sous-tendant la stéato-hépatite. Le détail du nombre d'animaux par procédure est mentionné dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte et les régimes débutés chez le jeune adulte âgé de 6 semaines. Cette date a été retenue comme la plus significative pour observer la mise en place et le suivi de la stéatose chez la souris. C’est le stade le plus précoce auquel les souris ont un poids assez stable et assez important pour en perdre suite au régime . De plus, comme le régime se pratique sur au moins 16 semaines, les souris doivent être prises à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après le régime et que l’on ne soit pas sur l’interprétation d’un facteur vieillissement.

159 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales, un traitement oral quotidien pendant 93 jours et deux prises de sang, après administration d'un composé oncogène et d'un produit chimique reproduisant une rectocolite hémorragique, avec perte de poids et diarrhées pouvant contenir du sang. Le porteur teste une molécule déjà passée en essai clinique de phase 2 pour réduire le risque de cancer colorectal, la mise sur le marché restant l'objectif affiché. Sur le remplacement, il affirme que seul le modèle murin convient, une tumeur liée à l'inflammation ne pouvant selon lui être reproduite sur cellules en culture.

Objectifs

La Rectocolite hémorragique est une maladie inflammatoire chronique de l'intestin affectant 1 personne sur 1000 dans le monde. Elle se manifeste généralement par poussées plus ou moins sévères caractérisées par des diarrhées, des douleurs abdominales et un amaigrissement pouvant amener à des complications comme une péritonite. Sur le long terme, les patients sont exposés à un risque plus élevé de cancer colorectal. Des traitements existent et permettent de réduire cette inflammation mais ne fonctionnent pas chez un grand nombre de patients. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, nous voulons étudier la possibilité de diminuer le risque d’apparition de cancer colorectal chez les patients atteints de rectocolite hémorragique traités par notre molécule.

Bénéfices attendus

La mise sur le marché de ce composé permettra d'améliorer la prise en charge des patients pour qui les traitements actuels ne fonctionnent pas et de limiter leur risque de développer un cancer colorectal.

Procédures

Les animaux recevront une injection par voie intrapéritonéale au début de l'étude puis une deuxième au jour 21, ce geste dure environ une dizaine de secondes. Nous administrerons également aux animaux un traitement par voie orale de façon quotidienne sur une durée de 93 jours. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte de très courte durée (10 secondes en moyenne). Deux prises de sang seront realisées, une avant le début de l'expérience et une seconde après 62 jours, d’une durée de 5 secondes en moyenne afin d'analyser différents paramètres biologiques. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de l’administration d’un composé oncogène induisant l’apparition de tumeurs cancéreuses et de la prise du produit chimique qui mime une rectocolite hémorragique chez l’homme. Ce produit chimique induit une altération de l’épithélium du colon qui provoque une perte de poids de l’ordre de 5% à 10% chez les souris malgré une alimentation et une hydratation normale et des diarrhées qui peuvent ou non contenir du sang.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.

Remplacement

Nous voulons étudier la prévention de l’apparition de tumeurs associée à une rectocolite hémorragique et pour cela seule l’utilisation d’un modèle murin est adaptée car il n’est pas possible de reproduire le développement d’une tumeur suite à une inflammation sur des cellules en culture.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en se garantissant l’obtention de résultats statistiquement représentatifs. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats précédemment obtenus dans un modèle de colite murine et d’après les résultats obtenus par des équipes travaillant sur le modèle.

Raffinement

La surveillance des animaux se fera régulièrement avec une évaluation du stress et de la douleur. L'administration répétée des composés par voie orale sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide. Ceci afin de limiter le stress de l'animal. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux. Lors des périodes de récupération des animaux, de la pâtée alimentaire sera également distribuée dans les cages pour favoriser l’hydratation des souris.

Choix des espèces

Le modèle murin de cancer colorectal associé à une colite est très documenté et permet de reproduire les symptômes, les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique ainsi que le développement de tumeurs observés chez le patient. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets de la molécule.

270 souris, 270 rats et 270 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestations teste pour ses clients des molécules dont elle indique ignorer la nature et les effets, administrées par des voies multiples, avec des prélèvements sanguins par ponction rétro-orbitale, sublinguale ou intracardiaque et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme qui isolent chaque animal. Le porteur reconnaît qu'il lui est difficile d'anticiper les nuisances puisqu'il ne connaît pas les composés testés. Il conclut que l'absence de modèle in vitro rend le recours à l'animal "incontournable" et fixe six animaux par groupe d'après quinze ans d'expérience, sans test statistique.

Objectifs

Ce projet approuvé par la direction de la société permettra d’évaluer l’absorption, la distribution et le métabolisme de candidats médicaments dans l’organisme après administration afin d’obtenir des données de pharmacocinétiques et pharmacodynamie. Etant une société de prestations de service, nous testons les molécules de nos clients dont nous n’avons aucune connaissance sur le type/famille de molécule. Cependant, ces molécules seront testées dans le cadre de la recherche de pathologies rénales, urologiques, oncologiques, gastro-entérologiques…nos principales thématiques de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de récolter du matériel biologique (sang, organes, urines, fecès, salive….) afin d’avoir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de candidats médicaments. Ces différentes données, obtenues au tout début des études pré-cliniques, permettront par la suite d’adapter les doses et la fréquence d’administration des composés dans des études plus complexes (pouvant mimer une pathologie).

Procédures

Les animaux seront traités par des molécules par différentes voies possible (per os, intrapéritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée, intradermique, intra-vésicale…). Ces gestes sont en général rapides et durent moins d’une minute/animal. Les animaux pourront être anesthésiés pour certains gestes ou prélèvements (gazeuse : isoflurane ou fixe : xylazine/kétamine). Ces anesthésies devraient être rapides et ne pas durer plus de 1 heure (pour les administrations intra-vésicales). Des prélèvements sanguins sur animal vigil ou anesthésié au niveau des veines caudales, saphènes, de la veine abdominale, en sublinguale, submandibulaire, rétro-orbital ou intracardiaque pourront être réalisés. Ces gestes sont rapides et durent moins de 5 min. Les animaux pourront être mis dans les cages à métabolisme et seront donc isolés de leurs congénères quelque temps (24H maximum).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés et vont recevoir des administrations de produits, pouvant engendrer un stress et une légère douleur. Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme, et donc être isolés temporairement de leurs congénères (24 heures maximum), avoir des prélèvements sanguins, être anesthésiés…tout cela peut provoquer une nuisance.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent fournir du matériel biologique afin de réaliser différents tests de pharmacocinétique ou pharmacodynamie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. En général, ces études préliminaires de pharmacocinétique et pharmacodynamie ne sont pas réalisées sur un grand nombre d’animaux car ce sont des études préliminaires aux tests pré-cliniques. Aucun test statistique n’est utilisé pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Cependant, de par notre expérience de plus de 15 ans, nous savons qu’un nombre de 6 animaux par groupe est suffisant pour avoir des données fiables et statistiquement significatives. Dans une même étude, il sera rare que différentes espèces soient utilisées. Nous prévoyons de réaliser 3 études par an par espèce avec 18 animaux par étude.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Différents types d’enrichissement seront ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois), igloo en polycarbonate, tunnel, carré de coton…). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal. Les méthodes utilisées pour récolter tout ce matériel biologique (par exemple les cages métaboliques avec une phase d’acclimatation pour réduire le stress) sont peu invasives et ne devraient pas provoquer chez l’animal un grand stress, ni de souffrance particulière et ne nécessitent donc pas l’utilisation d’antalgique. Tous les gestes techniques seront réalisés par du personnel compétent et qualifié diminuant ainsi les temps de contention et la souffrance ou le stress possible. Le personnel, sensibilisé au raffinement et à l’éthique animal, pourra modifier quelques protocoles, enrichissement des cages…. en fonction des nouvelles techniques mises au point et nouvelles obligations dans le but d’améliorer les conditions des animaux de laboratoire. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids supérieure à 20%, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Si un animal présentait un signe de douleur, de mal-être, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Dans notre laboratoire, nous utilisons ces 3 espèces (rat, souris et cobaye) selon les modèles et aires thérapeutiques employés. Ces trois espèces seront donc utilisées pour réaliser des études de pharmacocinétique et pharmacodynamie. Les animaux utilisés seront très dépendants des demandes de nos clients et de la thématique étudiée. Nous essayerons le plus possible d’utiliser des animaux âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines. Cependant, l’utilisation d’animaux plus jeunes ou plus âgés sera possible.

844 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 Gy puis greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes, pour développer une maladie du greffon contre l'hôte et chercher des cibles contre la leucémie. Le porteur décrit une perte de poids, un pelage terne et des atteintes cutanées, les souris atteignant 20 % de perte de poids ou un score clinique de 5 étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients restent générales, et les souris qui n'atteignent pas les points limites sont tuées deux à trois mois après l'irradiation faute d'évolution attendue.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles dans le traitement des rechutes de leucémie aigue myéloblastique ainsi que dans la maladie du greffon contre l'hôte (maladie induite par la greffe de cellules souches hématopoïétiques lors de traitement des hémopathie malignes). Tout d'abord dans la mise en place du modèle murin de leucémie aigue myéloblastique. Ensuite dans l'identification de nouvelles cibles avec des outils technologiques innovants. Par la suite, nous tenterons de traiter les animaux avec des traitements visant les nouvelles cibles identifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider une ou plusieurs molécules thérapeutiques qui auront été identifiés via différents processus autant chez la souris que chez l'homme.

Procédures

Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Le temps total d'irradiation est de 10 minutes par souris. L'irradiation s'effectue dans une pièce adjacente à l'animalerie. Les animaux sont installés par 11 dans une cage à irradiation avec couvercle filtant. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seule ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses (+ ou - cellules leucémiques) pour un total de 100µl par souris. Le temps d'injection des cellules en comptant l'anesthésie est d'environ 1 minute par animal. Dans un second temps, les souris seront traitées selon le schéma adapté à la molécule avec des injections de 100µL de solution diluée dans une solution saline administrée par voie intrapéritonéale. Le temps d'injection des traitements est d'environ 30 secondes par animal. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois par expérience. Le temps de prélèvement est d'environ 1 minute par animal. Le volume maximale prélevé sera de 100µL. Le nombre d'intervention par souris est de minimum 2 à maximum 6.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pelage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi t. Ce score a été évalué par nos pairs spécialistes de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale. Concernant les souris simplement irradiées qui servent de validation de l'expérience, elles meurent d'aplasie. Elles auront de l'anémie et de la perte de poids. Lorsque le poids de ses souris atteint moins 20% du poids initial, ces souris seront mises à mort.

Devenir

Les animaux dont la perte de poids aura atteint 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront mis à mort ainsi que les animaux qui n'auront pas atteint les points limites deux à trois mois après l'irradiation. Pour les procédures 1, 2 et 3, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus. Pour la procédure 4, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 3 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier l’effet de molécules thérapeutiques sur le développement de la maladie du greffon contre l’hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l’utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l’hypothèse émise. Toutefois, toutes les expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo seront réalisées sur des cellules in vitro.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupées le plus possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience. Le nombre d'animaux pour chaque procédure a été calculé par une approche statistique à l'aide du document « Estimation du nombre d’animaux nécessaires » de Hugues Jacobs.

Raffinement

Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 4 ou une perte de poids de 20% seront mises à mort. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établir le score clinique associé à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute souffrance. L'enrichissement et l'hébergement des animaux dépend entièrement des conditions imposées par l'animalerie. Ce qui consiste à déposer 3 enrichissements différents dans les cages comme les Nestlets, un smart home, ainsi que des Bed-r’nest. Le nettoyage des cages a lieu une fois toutes les deux semaines par les zootechniciens, mais les souris étant contrôlées tous les 2 jours par l'expérimentateur, les cages souillées sont changées rapidement.Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront mis à mort quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane et un anesthésique local type collyre d'oxybuprocaïne sera utilisé.

Choix des espèces

La maladie du greffon contre l'hôte a été étudiée depuis des décennies dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, ils possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doses d'irradiations auxquelles ils seront soumis.

904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs pulmonaires sous la peau ou en suspension, puis on leur administre de une à quatre injections d'un vaccin et des prélèvements sanguins, pour tester une immunothérapie combinée contre le cancer du poumon. Le porteur décrit une douleur légère, une perte de poids modérée et une gêne à la mobilité liée aux tumeurs sur le flanc. Il affirme que l'effet d'un vaccin combiné à des anticorps ne peut être vérifié que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

L'objectif du projet est de développer et d'optimiser un vaccin thérapeutique contre le cancer du poumon puis de le combiner avec les immunothérapies anti-PD-1 existantes dans les cancers pulmonaires.

Bénéfices attendus

Le vaccin thérapeutique seul a demontré un effet bénefique, in vitro et in vivo, sur certains lymphocytes en les activant. La combinaison que nous proposons est d'ajouter des anticorps de type anti points de blcage immunitaire qui viseront à maintenir l'état d'activation des de ces lymphocytes, specifiquement induits par le vaccin, plus longtemps. Cette combinaison thérapeutique dévrait demontrer un bénéfice anti-tumoral et à terme pourrait améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

En fonction de la procédure expérimentale appliquée, les souris seront soumises à des greffes de lignées cellulaires en suspension: durée 5 minutes, sous anesthésie locale ou des greffes sous-cutanées de tumeurs solides: durée 10 minutes sous anesthésie locale et générale - Chaque souris sera greffée qu'une seule fois durant toute la procédure expérimentale - Selon les porcédures, les animaux auront entre 1 et 4 injections de vaccin, sous aensthésie locale, durée 3 minutes. Certains animaux pourront avoir 1 prélèvement sanguin par semaine durant 3 semaines: durée 3 minutes, sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les animaux qui seront utilisés subiront des injections (dont des greffes de tumeurs sous la peau), ainsi que des prélèvements de sang. Parmi les nuisances possibles : stress léger et douleur légère et transitoire lors des administrations et des prélèvements, perte de poids modérée posible, gêne légère à la mobilité des souris à cause des tumeurs pouvant pousser sur le flanc.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de conduire des analyses post-mortem sur les tumeurs et les rates.

Remplacement

L’étude de l’effet thérapeutique d’un vaccin peptidique en combinaison avec les inhibiteurs de checkpoints immunitaires relève d’une grande complexité où les modéles in vitro seuls n’apporteraient que des réponses partielles et ne permettraient pas de vérifier nos hypothèses. Un des effets majeurs attendus est le recrutement et l’activation prolongée des cellules immunitaires au sein des tumeurs pulmonaires. L'utilisation d'un organisme vivant entier est donc incontournable.

Réduction

Afin de calculer le nombre d’animaux minimum pour répondre à nos hypothèses,, un logiciel de statistique a été utilisé. Les calculs de puissance ont pris en compte la réalisation d'expériences uniques, l'effet attendu, et le taux de prise de greffe. Les résultats seront étudiés par analyse de variance à une voie. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisé, les doses de vaccins seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. Des procédures pourront être annulées en cas d'hypothèse non vérifiée.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux. Chaque cage contiendra en plus de l’eau et de la nourriture, des éléments d’enrichissements : Une maison par cage ou 2 tunnels en cartons, avec du sizzlenest pour leur nid. Le comportement social des souris sera suivi, en observant des comportements tels que le grooming, leurs mouvements dans la cage ou encore le temps de toilettage des souris. Des examens cliniques seront faits quotidiennement par l'équipe de recherche. En cas de perte de poids, un aliment plus riche, plus appétent et plus facile à consommer sera donné. Toutes les interventions lors des procédures seront faites avec anesthésie locale ou générale (ou en combinaison). Des antalgiques seront utilisés.Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour tester des vaccins sur animaux à système immunitaire normal (greffes de tumeurs murines) ou déficient (greffes de tumeurs humaines). Les souris seront greffées jeune adultes (6 semaines) et seront traitées à 8-9 semaines. Ce choix d’âge est justifié par une réponse immunitaire robuste et une prise de greffe plus efficace.

382 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées, jusqu'à 33 injections intrapéritonéales et plusieurs prélèvements de sang, une infection par le cytomégalovirus murin et un traitement anti-rejet pouvant provoquer une toxicité rénale, pour étudier la réponse immunitaire au virus dans un contexte de greffe. Le porteur indique que l'infection peut causer perte de poids, prostration, hépatite ou colite chez les souris sous traitement anti-rejet. Il affirme que ce projet "ne peut être mené sans" animaux, la réponse immunitaire ne pouvant selon lui se reproduire in vitro.

Objectifs

Suite à une transplantation d'organe, les patients sont à risque de faire un rejet de l’organe transplanté. Pour prévenir le rejet, ils doivent prendre un traitement anti-rejet pendant toute la durée de leur transplantation. Ce traitement affaiblit l’ensemble de leur système immunitaire, les exposant à faire des infections plus nombreuses et plus graves. L’infection virale la plus fréquente après une transplantation est l’infection au cytomégalovirus. Le cytomégalovirus est un virus très commun dans la population générale. Lorsque l’on s’infecte pour la première fois avec ce virus quand on est en bonne santé, on a peu ou pas de symptômes car une réponse immunitaire anti-virale efficace se développe rapidement pour limiter la multiplication du virus. Le virus devient alors dormant (c’est-à-dire à l’état de latence) pendant toute notre vie dans différents organes comme les reins, le foie, le cœur, les poumons. Quand un patient n’ayant jamais rencontré le cytomégalovirus est transplanté avec un organe d’un donneur chez qui le virus est présent, le patient n’est pas toujours capable de monter une réponse immunitaire efficace contre le virus du fait des traitements anti-rejet. L’infection au cytomégalovirus peut alors conduire à des complications graves et peut avoir des répercussions sur le fonctionnement et la survie du greffon. L’objectif de ce projet est d’étudier la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus dans un contexte similaire à la transplantation. Nous nous interesserons en particulier à l’impact des différents traitements anti-rejet sur cette réponse ainsi que des différences génétiques entre donneur et receveur. Pour atteindre ces objectifs, il est prévu de développer un modèle dans lequel des cellules provenant d’organes de souris "donneuses" infectées de manière latente par le cytomégalovirus murin seront injectées à des souris "receveuses", traitées ou non par un traitement anti-rejet et n’ayant jamais été en contact avec le virus. Nous utiliserons des souris donneuses génétiquement différentes des souris receveuses afin de mimer au mieux ce qui se passe après une transplantation d’organe lorsque le receveur reçoit un organe infecté par le cytomégalovirus provenant d’un donneur génétiquement différent. La réactivation et la dissémination du virus seront étudiées dans les différents organes de la souris receveuse. Nous monitorerons aussi la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus dans ce contexte particulier.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre comment le cytomégalovirus est transmis au receveur lors d’une transplantation d’organes et le rôle des différents acteurs immunitaires et leur importance respective dans la résolution de l’infection à cytomégalovirus chez les patients transplantés. Ces données nous aideront à savoir comment moduler cette réponse afin de la rendre efficace sans surrisque de rejet. Nous pourrions ainsi limiter la morbi-mortalité du cytomégalovirus et ainsi certainement prolonger la durée de vie des greffons.

Procédures

Sur les 382 animaux maximum prévus dans ce projet : - 46 animaux au maximum seront soumis à 1 seule injection intrapéritonéale sur animal virgile. - 129 animaux au maximum seront sourmis à 1 injection intrapéritonéale sur animal vigile en début de procédure, et 1 prélèvement sanguin total sous anesthésie générale profonde (suite à une injection intrapéritonéale d'anesthésiant) en fin de procédure suivie d’une mise à mort. - 27 animaux seront soumis à 1 injection intraveineuse sous anesthésie générale gazeuse, des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie locale (soit 4 prélèvements sur une durée de 28 jours pour 1/3 de ces animaux, ou 8 prélèvements au total sur 60 jours pour 2/3 d'entre eux), et enfin 1 prélèvement sanguin total sous anesthésie générale profonde (suite à une injection intrapéritonéale d'anesthésiant) en fin de procédure suivie d’une mise à mort. - 180 animaux au maximum seront soumis à 1 injection intraveineuse sous anesthésie générale gazeuse, des injections intrapéritonéales répétées tous les 2 jours sur animal vigile (soit au maximum 33 injections intrapéritonéales sur une durée de 67 jours maximum), des prélèvements sanguins hebdomadaires effectués sous anesthésie locale (soit jusqu'à 8 prélèvements sanguins maximum sur une durée de 60 jours maximum), puis enfin 1 prélèvement sanguin total sous anesthésie générale profonde (suite à une injection intrapéritonéale d'anesthésiant) en fin de procédure suivie d’une mise à mort. Les injections intrapéritonéales ou intraveineuses durent moins d’1 minute, un prélèvement de l’ordre de 30 secondes (contention comprise). Les anesthésies durent environ 1 heure.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales, intraveineuses, et les prélèvements sanguins répétés sont susceptibles de générer une nuisance, une douleur légère lors de l'injection/prélèvement, ainsi que de générer du stress chez l'animal. L’un des traitements anti-rejet que nous utiliserons peut engendrer une toxicité rénale chez les patients ; chez la souris, une toxicité rénale est généralement associée à une perte de poids. Ce traitement durera 2 mois au maximum. L'infection au cytomégalovirus, aux doses utilisées ici, n'engendre pas de symptômes chez les animaux immunocompétents (c'est-à-dire non traités avec les traitements anti-rejet). Néanmoins, pour les souris traitées sous traitement anti-rejet, l'infection peut causer l'apparition de signes généraux telles qu'une perte de poids ou une prostration, ou encore une hépatite (inflammation du foie non douloureuse) ou une colite (associée à des diarrhées). Cette infection au cytomégalovirus durera 2 mois maximum.

Devenir

Les souris seront mises à mort avec une méthode réglementaire en fin de procédure afin de récupérer différents organes (poumons, foie, coeur, reins, organes lymphoïdes et glandes salivaires). La mise à mort des animaux est donc nécessaire pour toutes les analyses biologiques et biochimiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite avant la fin de la procédure seront également mises à mort avec une méthode réglementaire.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent à la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus ne peuvent avoir lieu qu’au sein d’un organisme vivant complet, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Dans certains cas, la génération du stock de virus pourrait être remplacée par amplification sur lignées de cellules in vitro. Cependant, ceci a pour effet de diminuer la virulence du virus, contrairement au virus amplifié in vivo et isolé à partir des glandes salivaires. Etant donné que, dans notre cas, nous souhaitons utiliser une souche de virus non modifée et peu virulente afin d'étudier la réponse physiologique de certaines cellules immunitaires en particulier (ce qui n'est pas possible avec les autres souches de virus modifiée plus virulentes) et que ce virus doit être suffisamment virulent pour infecter des hôtes immuno-compétent et obtenir une infection latente (virus en état de dormance), une amplification initiale du virus in vivo (au niveau des glandes salivaires de la souris) est donc une étape nécessaire et non remplaçable par une amplification in vitro.

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs. Les procédures dites « pilotes » permettront d’établir les conditions/protocoles optimaux pour les procédures suivantes, afin de réduire également le nombre de groupe. Pour certaines expériences, les groupes contrôles seront réduits à 3 animaux alors que les groupes expérimentaux seront au nombre de 5.Pour une des expérences qui a pour but de vérifier la possibilité de transmettre l'infection au cytomégalovirus via des cellules isolées d'un organe infecté de manière latente, nous avons choisi de réduire autant que possible le nombre d'animaux (n=3 pour tous les groupes, contrôles et expérimentaux), de limiter le nombre de groupes contrôles et de ne réaliser qu'une seule fois cette procédure (pas de duplicat prévu pour cette procédure). Pour les autres expériences, nous prévoyons des duplicats expérimentaux qui seront réalisés si besoin pour re-générer un nouveau stock de virus si ce dernier se retrouve insuffisant pour refaire certaines expériences, pour approfondir certaines analyses par des techniques plus poussées, ou pour valider la reproductibilité des résultats.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances et douleurs liées aux injections intrapéritonéales et aux prélèvements sanguins réguliers, nous alternerons régulièrement des sites d’injection intrapéritonéale et les sites de prélèvement (voie rétro-orbitale en alternant les deux yeux et voie submandibulaire). Un analgésique local sera utilisé pour les prélèvements sanguins au niveau rétro-orbital pour limiter la douleur. De même, une anesthésie générale sera réalisée avant l’injection intraveineuse (anesthésie gazeuse) et avant la mise à mort des souris (anesthésie gazeuse ou profonde par injection intrapéritonéale d'anesthésiants). L'infection au cytomégalivirus des animaux traités sous traitement anti-rejet étant susceptible de causer des symptômes spécifiques comme une inflammation du foie ou du colon, un monitoring spécifique sera réalisé afin de doser des enzymes du foie de façon habdomadaire, et nous surveillerons la survenue de diarrhées. Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général). Les animaux seront pesés une fois par semaine et cette fréquence sera augmentée à 2 fois par semaine en cas de perte de poids supérieure à 10%. Des points limites ont été définis pour les différentes procédures afin d'intervenir en cas de nécessité afin de limiter la souffrance de l'animal. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Du fait de sa similarité avec l’Homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire anti-virale dans le contexte allogénique. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées afin qu’elles aient un système immunitaire mature capable de répondre à l’infection.