Troubles immunitaires

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 120 d'entre elles et sévère pour 120. Elles reçoivent des injections trois fois par semaine pendant trois mois et sept prélèvements sanguins, le RNT évoquant aussi un gavage et une infection par Salmonella non repris dans la description des procédures. Le projet développe un modèle de néphropathie à IgA, une maladie rénale humaine, en étudiant l'effet d'un facteur de croissance sur sa sévérité. Le porteur affirme qu'aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle et présente les effectifs comme le minimum "indispensable".

Objectifs

Le but du projet est le développement d'un modèle de maladie rénale : la néphropathie à immunoglobuline A, chez la souris. Cette maladie rénale humaine est responsable d'une évolution vers l'insuffisance rénale terminale (dialyse ou transplantation rénale) chez 30% des patients qui en sont atteints, alors que la fréquence de la maladie est autour de 0,5% de la population. Il s'agit d'une maladie à plusieurs facteurs, génétique en partie, et faisant également intervenir le système immunitaire des muqueuses (intestin, bronches) via la production d’un type d’anticorps, nommées IgA, au niveau de ces muqueuses. Une des anomalies au cours de cette maladie est le fait que ces anticorps soient déversés anormalement dans le sang. Parmi les facteurs impliqués dans cette anomalie, le rôle d’un facteur de croissance de globules blancs produisant cet anticorps semble être très important. En effet, les patients atteints de cette maladie présentent des concentrations de ce facteur de croissance plus élevées que les volontaires sains et d’autre part une particularité génétique portant sur la production de ce facteur est plus souvent présente chez les patients. Nous disposons d'un modèle de souris produisant des IgA humain dans le sang mais aucune production de cet anticorps dans les muqueuses. Ces souris présentent des dépôts d'IgA humain dans leurs reins avec un début d'inflammation. Il s'agit au cours de ce projet, d’étudier les souris mutantes afin d'évaluer l'impact du facteur de croissance sur l’apparition d’une maladie plus sévère.

Bénéfices attendus

Si le rôle d'APRIL sur la sévérité de la néphropathie à IgA se confirme dans ce modèle, cette cytokine ainsi que ses récepteurs deviendront une cible thérapeutique évidente dans cette maladie. Des molécules visant cette voie sont déjà disponibles (ex: belimumab) pour le traitement d'autres pathologies inflammatoires (lupus). Elle permettra de mieux comprendre le rôle de l'immunité muqueuse au cours de la maladie.

Procédures

Prélèvement d'oreille pour génotypage : 30sec par animal Prélèvement sanguin: 1 mn par animal - 7 fois en 3 mois Injection: 30sec par animal - 3 fois par semaine sur 3 mois

Impact sur les animaux

Possibles douleurs liées aux prélèvements sanguins et prélèvements d'oreille, classe légère, pratique courante en laboratoire. Possible douleur et inconfort lié au gavage. Possible troubles digestifs dont diarrhées et amaigrissements dans la procédure de challenge muqueux par Salmonella, points limites définis.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements de sang et d'organes afin d'analyser les données et obtenir les résultats.

Remplacement

Il s'agit d'un modèle physiopathologique, nécessitant un environnement in vivo, aucun remplacement n'est possible dans cette situation multifactorielle

Réduction

Le nombre d'individus utilisés par génotype est le minimum d’individus indispensable pour effectuer la procédure d’expérimentation et obtenir des résultats pertinents interprétables. Le nombre d'animaux par génotype est le nombre minimal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Afin de minimiser le nombre d’individus nécessaires, un test statistique a permis à partir d’une hypothèse réaliste de prévoir le nombre de souris le plus pertinent.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée qui possède tous les éléments du raffinement. Toutes les mesures de réduction de l’inconfort animal sont prévues, à savoir la mise en place d’une anesthésie générale avant tout geste invasif, une analgésie lors des interventions potentiellement douloureuses et la mise en œuvre de points limite adaptés, conduisant à la mise à mort en cas de souffrance. Des observations quotidiennes seront mises en place tout au long du projet, et adaptées pour chaque individu.

Choix des espèces

L'expérimentation sur animaux de petite taille apporte des éléments de connaissance physiopathologique impossible à atteindre en expérimentation in vitro seule ou en clinique humaine car: - elle permet d'être à l'initiation de la maladie ce qui n'est pas possible chez l'homme (maladie peu symptomatique, souvent diagnostiquée après de longues années d'évolution). La mécanistique pathogénique ne peut donc être appréhendée qu'en expérimentation animale dans le cas de cette maladie. - le développement d'un modèle animal permettra d'identifier des cibles thérapeutiques, de tester des interventions thérapeutiques chez l'animal en vue de dégager des traitements candidats transférables en clinique humaine. - Les souris utilisées dans ce projet auront 3 mois: cet âge choisi est optimal pour l’étude de la réponse de l'anticorps (IgA) car il correspond à la phase de développement du répertoire immunologique muqueux.

6 048 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère (4 320 modéré, 1 728 sévère). Réparties sur neuf protocoles, elles subissent jusqu'à quatorze actes (prélèvements sanguins, injections intrapéritonéales, intramusculaires et intraveineuses), dont une injection hydrodynamique d'un volume proche de 9 % du poids corporel qui provoque dilatation du foie, montée de pression et arythmie. Le porteur estime lui-même que cet acte sévère peut tuer jusqu'à 5 % des animaux concernés. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier le foie in vivo, le diagnostic humain de l'hépatite auto-immune étant trop tardif.

Objectifs

L’hépatite auto-immune (HAI) est une pathologie du foie caractérisée par une attaque immunitaire contre l’organe qui peut entraîner une défaillance hépatique, des cirrhoses ou même des cancers. Les traitements immunosuppresseurs non-spécifiques (combinaison de corticostéroïdes et d’azathioprine) entraînent une rémission complète en 18 mois chez 75% des patients HAI. Cependant, ces traitements présentent de nombreux effets secondaires et 50 à 90% des patients rechutent dans l’année après l’arrêt du traitement. Par ailleurs, l’HAI est une pathologie dont l’origine reste méconnue. Les lymphocytes T CD4+ (LT CD4) constituent la population de cellules immunitaires classiquement considérée comme responsable des lésions hépatiques. Mais l’étude des LT CD4 dits spécifiques d’antigènes hépatiques, c’est-à-dire les LT CD4 qui reconnaissent des molécules présentent spécifiquement dans le foie, reste limitée chez l’Homme. De plus, le diagnostic de l’HAI n’étant que tardif dans l'évolution de la pathologie, l’étude des évènements à l’origine de la maladie n’est pas réalisable chez l’Homme. Notre équipe a mis en place des modèles murins ressemblant à l’HAI et qui permettent d’étudier le rôle des LT CD4 spécifiques d’un antigène hépatique dans les temps précoces de l’atteinte du foie. Dans ce projet, notre objectif est de décrire les signaux immunologiques impliqués dans le contrôle d’une réponse immunitaire contre un antigène hépatique et pouvant favoriser l’attaque immunitaire du foie sur le long terme. Dans cette mesure, nous souhaitons moduler l’environnement hépatique dans : (1) un modèle de tolérance de l’antigène hépatique, (2) un modèle d’hépatite aiguë transitoire et (3) un modèle d’hépatite chronique.

Bénéfices attendus

Nos travaux permettront de mettre en évidence comment l’environnement hépatique joue un rôle dans les réponses inflammatoires locales contre un antigène hépatique, ainsi que des pistes solides concernant l’origine immunologique de l’hépatite auto-immune. Les résultats de nos travaux devraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques plus spécifiques contre la pathologie. Nous espérons également pouvoir mettre en lumière une marque prédictive précoce de la sévérité et de l’évolution de l’hépatite auto-immune.

Procédures

Les animaux subiront entre 3 et 14 actes sur une période allant de 10 à 60 jours en fonction de la procédure : Procédure 1 = Les animaux recevront, sur une période de dix jours, 1 prélèvement sanguin (durée : 1 minute, animal anesthésié), 1 injection intrapéritonéale (i.p., durée : 30 secondes, animal vigile) et 3 injections intraveineuses (i.v., durée : 1 minute, animal anesthésié) à 3 jours d’intervalle. Procédure 2 = Les animaux recevront, sur une période d’un mois, 2 prélèvements sanguins, 1 injection intramusculaire (i.m., durée : 30 secondes, animal anesthésié), 1 injection i.p. et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 3 = Les animaux recevront, sur une période de cinq semaines, 3 prélèvements sanguins, 1 injection i.p., 2 injections i.m. et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 4 = Les animaux recevront, sur une période de dix jours, 1 prélèvement sanguin, 1 injection i.p. et 1 injection intraveineuse hydrodynamique (HTVi, durée : 10 secondes, animal vigile). Procédure 5 = Les animaux recevront, sur une période d’un mois, 2 prélèvements sanguins, 1 injection i.m., 1 injection i.p. et 1 injection HTVi. Procédure 6 = Les animaux recevront, sur une période de cinq semaines, 3 prélèvements sanguins, 1 injection i.p., 2 injections i.m. et 1 injection HTVi. Procédure 7 = Les animaux recevront, sur une période de douze jours, 1 prélèvement sanguin, 6 injections i.p. et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 8 = Les animaux recevront, sur une période d’un mois, 2 prélèvements sanguins, 1 injection i.m., 6 injections i.p. en douze jours et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 9 = Les animaux recevront, sur une période de cinq semaines, 3 prélèvements sanguins, 2 injections i.m., 6 injections i.p. en douze jours et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Les procédures 1, 2, 3, 4, 5 et 6 se terminent à un temps précoce ou tardif. Dans le cas d’une fin de procédure à un temps tardif, les animaux recevront un prélèvement sanguin une semaine après le dernier acte subi.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des gestes plus ou moins douloureux au cours des différentes procédures. Durant les injections intrapéritonéales, les animaux pourront ressentir un inconfort local et limité dans le temps. En fonction de la procédure, ce geste sera reproduit jusqu’à 6 fois sur une période de deux semaines. Pour les actes subis tels que l’injection intraveineuse, l’injection intramusculaire ou le prélèvement sanguin, les animaux seront anesthésiés par un anesthésique gazeux ce qui pourrait engendrer un stress chez l’animal. Du fait de l’injection intraveineuse par la veine caudale d’un grand volume de solution dans la circulation systémique, une analgésie locale sera appliquée au site d’injection. L’injection hydrodynamique d’environ 9% du poids corporel en volume, conduit à une dilatation massive mais transitoire (inférieure à 30 minutes) du tissu hépatique, une augmentation de la volémie globale, une forte augmentation de la pression sanguine et une arythmie cardiaque courte (durant 30 à 60 secondes). Du fait de la sévérité de cet acte, une perte maximale de 5% des animaux impliqués dans ces procédures est estimée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de récupérer différents tissus (sang, foie et rate) indispensables pour mener diverses analyses d’histologie, de biologie cellulaire, de biologie moléculaire, de biochimie et d’immunologie.

Remplacement

Dans ce projet, nous interrogeons l’origine immunologique de l’auto-immunité dans le foie. Cet aspect ne peut être étudié chez le patient humain car le diagnostic de l’hépatite auto-immune est très tardif et les échantillons (biopsies) sont rares. Par ailleurs, l’étude des mécanismes immunologiques dictant le développement de la pathologie n’est pas réalisable à l’échelle cellulaire et, à nos connaissances, il n’existe pas de système pertinent de remplacement. Ainsi, dans notre projet l’étude in vivo chez l’animal est indispensable car cela permet d’avoir accès à des échantillons de l’organe cible de la pathologie, le foie. Cela nous permet d’une part de mesurer les dommages hépatiques et d’autre part d’étudier l’environnement immunologique dans l’organe.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 6048 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Pour cela, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Durant le projet une réduction du nombre d’animaux pourra être envisagée en fonction des résultats expérimentaux obtenus. Nous pourrons être amenés à manipuler moins d’animaux si l’effet de certains composés s’avère significatif au cours des premières expériences. À l’inverse, si l’effet d’un composé rejette l’hypothèse émise dès les premières expériences, le composé sera exclu des prochaines expérimentations afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Dans le but d’extraire le maximum de données de chaque animal, plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les utilisateurs passeront régulièrement du temps avec les animaux avant les procédures et en dehors des jours d’expérimentation pour limiter leur stress et les habituer à être manipulés. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un symptôme réversible sera signalé, l’animal recevra les soins nécessaires. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

L’étude chez l’animal étant indispensable dans notre projet, nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. À nos connaissances, il n’existe pas de modèle pertinent pour étudier le développement de l’auto-immunité dans le foie utilisant une autre espèce animale. De plus, au cours de ce projet, nous bénéficions de souches génétiquement modifiées déjà en place au laboratoire. Nous travaillerons avec des souris adultes de 8 à 12 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. À des âges plus avancés, le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité au cours des expérimentations.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles expriment une protéine mutée qui provoque une neuroinflammation avec douleurs, fièvre, baisse de mobilité et perte de poids, et reçoivent des injections quotidiennes pendant plus de deux semaines ainsi que des prélèvements de sang par incision de la queue. L'objectif est de vérifier si le blocage d'un canal potassique réduit la neuroinflammation d'un syndrome auto-inflammatoire rare, le CAPS. Le porteur affirme que l'effet ne peut être validé que sur un modèle vivant et administre des antalgiques toutes les huit heures aux animaux les plus atteints.

Objectifs

L’inflammation est un phénomène normal de défense lorsqu’elle est bien régulée. La mutation d'une protéine peut entrainer une réaction inflammatoire exacerbée qui n'a pas lieu d'être. Ce mécanisme est à l'origine de maladies autoinflammatoires appelées Syndrôme Périodique Associé au Froid (CAPS) dont certains symptômes sont un grave déficit intellectuel et un retard de croissance dû à une réaction inflammatoire provoquée par les cellules immunitaires du cerveau (neuroinflammation). Dans notre laboratoire, au cours d'études in vitro, nous avons découvert de nouvelles protéines impliquées dans le déclenchement de l'inflammation. Dans un modèle de souris dans lesquelles on peut induire le CAPS, nous voulons confirmer que le ciblage de ces protéines par des molécules peut réduire la neuroinflammation. Les molécules que nous allons tester font déjà l'objet d'études cliniques dans le cadre d'autres maladies comme l'anémie et la sclérose en plaque.

Bénéfices attendus

L'industrie pharmaceutique réalise beaucoup d'effort pour soigner les maladies autoinflammatoires. A l’heure actuelle, aucun traitement n’existe pour traiter la neuroinflammation des patients atteints de CAPS. La neuroinflammation due au CAPS est responsable de graves déficits intellectuels et de retards de croissance importants. Si nous validons in vivo un effet des molécules testées sur la neuroinflammation, alors de nouvelles perspectives thérapeutiques s'ouvriraient non seulement pour le traitement de la neuroinflammation dans le CAPS, mais également dans les maladies neurodégénératives liées au vieillissement, y compris la maladie d'Alzheimer.

Procédures

1) 360 souris test subiront 1 injection intrapéritonéales quotidienne pendant 4j, puis une injection intrapéritonéale et 3 injections sous cutanées par jour pendant 14 j.Sur ces 360 animaux, 216 subiront en plus 1 prélèvement de 100 µl de sang tous les 6j. 2) 90 souris contrôles subiront 1 injection intrapéritonéales quotidienne pendant 4j, puis une injection intrapéritonéale par jour pendant 14 j. Sur ces 90 animaux, 54 subiront en plus 1 prélèvement de 100 µl de sang tous les 6j Chaque injection prend environ 10 secondes. Les prélèvements sanguins durent environ 1 minute: une légère incision est pratiquée sur la queue en moins d'1 seconde puis le sang qui perle est prélevé à l'aide d'un tube capillaire. Il faut environ 1 minute pour récupérer les 100 µl de sang nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

Les souris que nous testerons vont exprimer une protéine mutée dans les cellules immunitaires du cerveau. En conséquence, ces souris présenteront une neuroinflammation qui va altérer leur état général en impactant plusieurs organes et provoquer des douleurs, de la fièvre, une réduction de la mobilité et une perte de poids. Les souris pourront ressentir une légère douleur de piqure lors des injections. Les souris pourront également ressentir une légère douleur lors des prélèvements sanguins réalisés en pratiquant une incision superficielle sur la queue.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas être réutilisés, ils seront tous mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Nous avons observé sur des cellules immunitaires en culture qu'en inhibant des protéines particulières nous pouvons affecter l'activation de l'inflammasome qui constitue la première étape de la réaction inflammatoire. Cette observation a été réalisée dans un système simple (cellules en culture) dont le paramètre quantifiable est la production de molécules pro inflammatoires. Dans un contexte physiologique, ces molécules pro inflammatoires constituent en fait un relais car elles vont à leur tour activer d'autres effecteurs de l'inflammation et de la réponse immunitaire innée. Afin de vérifier le potentiel thérapeutique de cette observation, nous devons maintenant la valider dans un modèle in vivo en montrant que le blocage d'une des premières étapes de l'inflammation suffit à exercer un effet sur la réaction inflammatoire exacerbée mimant celle présentée par les patients atteints de maladies autoinflammatoires et qui met en jeu des interactions entre différents organes et différents types cellulaires.

Réduction

Ce projet nécessitera 450 souris. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour une comparaison statistique fiable de la mortalité et des niveaux sanguins des différents marqueurs de l'inflammation. Des groupes de 18 animaux seront nécessaires pour comparer les niveaux sanguins des marqueurs de l'inflammation. Pour les mesures de survie après induction de la mutation, les groupes seront comparés statistiquement sur des échantillons de 18 souris par groupe. Nous allons aussi étudier les dommages tissulaires par histologie au jours 8 et 14 après l'induction de la neuroinflammation. Le paramètre mesuré sera le nombre de cellules immuntaires infiltrés dans les tissus qui sera comparé statistiquement entre les groupes sur des échantillons de 18 souris.

Raffinement

Dans ce projet, les animaux développeront une inflammation induite par l’expression d'une protéine mutée. Cette inflammation est sévère. Afin de limiter autant que possible leur souffrance, des traitements antalgiques puissants seront administrés toutes les 8h aux animaux testés. Après l'induction de la neuroinflammation les animaux seront surveillés 3 fois par jour et leur état état général sera scoré. Nous avons défini un point limite qui est un score au dela duquel l'état de l'animal est considéré irréversible et entrainera sa mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal déjà validé dans le domaine de l’inflammation. Par ailleurs, une lignée génétiquement modifiée, porteuses d’une mutation conditionnelle d'un gène, analogue à celle retrouvée chez les patients atteints de CAPS est disponible. Pour ce modèle d’inflammation induite par les souris seront utilisées au stade adulte (à partir de 8 semaines). À ce stade, le système immunitaire est complètement développé. Si les souris sont trop jeunes, le système immunitaire ne sera pas mature. Si les souris sont trop âgées, le système immunitaire ne sera plus assez efficace.

3 000 rongeurs, 2 500 souris et 500 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur injecte des anticorps puis une toxine bactérienne pour déclencher une arthrite, avec gavages, injections répétées et prises de sang par voie rétro-orbitaire, afin de tester des composés à potentiel thérapeutique répartis sur cinquante études. Le porteur décrit une maladie qui provoque des œdèmes des pattes, des ankyloses et des douleurs spontanées, une ankylose ou une nécrose sévère entraînant une mise à mort immédiate. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la complexité des maladies inflammatoires des articulations.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de solutions thérapeutiques innovantes pour l’arthrite rhumatoïde qui est une maladie chronique auto-immune systémique qui touche principalement les articulations. Elle induit des lésions causées par des cytokines, des chimiokines et des métalloprotéases. Les articulations périphériques sont symétriquement enflammées, provoquant une destruction progressive des structures articulaires et des désordres généraux entrainant douleurs et handicaps qui empêchent d'effectuer les gestes quotidiens et activités professionnelles. Les traitements médicamenteux disponibles ont pour objectif de réduire l'inflammation pour prévenir les érosions articulaires mais les effets sont en général insuffisants. Par ailleurs leurs utilisations sont limitées à cause d’effets indésirables. Ces traitements incluent les antirhumatismaux modificateurs de la maladie, des agents biologiques (anti-TNF, anti-IL-1, anti-IL-6), des dépléteurs des lymphocytes B, des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et des corticostéroïdes. Tous les traitements biologiques présentent des risques d’infections sérieux (tuberculose, septicémie), et peuvent induire la production d’anticorps neutralisants. Les AINS induisent des effets cardiovasculaires et gastrointestinaux qui peuvent être très sévères. Par conséquent l’arthrite rhumatoïde est une maladie dont les besoins médicaux ne sont toujours pas satisfaits. Il est donc urgent de développer de nouvelles solutions thérapeutiques pour les patients souffrant de cette maladie, qui soient plus efficaces et mieux tolérées. La recherche visant à la mise au point de nouveau traitement contre la polyarthrite rhumatoïde est très active grâce à l’identification de nombreuses cibles potentielles en partie grâce au développement des technologies de séquençage génétique : molécules d’activation des macrophages, des polynucléaires, cytokines de l’inflammation ou de l’angiogenèse, cibles intracellulaires et autres molécules de signalisation. Des anomalies du microbiote intestinal associées à la maladie ont aussi été mises en évidence. Des thérapies cellulaires sont elles aussi en développement. Le projet permettra d’évaluer l’efficacité de nouvelles substances à potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les traitements médicamenteux pour l’arthrite rhumatoïde, souvent prescrits en association, ont pour objectif de réduire l'inflammation pour prévenir les érosions mais les effets sont en général insuffisants et leurs utilisations sont limitées par des effets indésirables. Ces traitements incluent les antirhumatismaux modificateurs de la maladie, des agents biologiques (antagonistes du TNF-alpha, inhibiteurs des récepteurs de l'interleukine-1 (IL-1), inhibiteurs de l'interleukine-6 (IL-6), des dépléteurs des lymphocytes B, des molécules modulatrices des lymphocytes T, des inhibiteurs de la Janus kinase, des AINS contre la douleur, des corticostéroïdes par voie systémique ou en intra-articulaire. Tous les traitements biologiques présentent des risques d’infections sérieux (tuberculose, septicémie), et peuvent induire la production d’anticorps neutralisants. Les AINS induisent des effets cardiovasculaires et gastrointestinaux qui peuvent être très sévères. L’arthrite rhumatoïde est une maladie dont les besoins médicaux ne sont toujours pas satisfaits. Il est donc urgent de développer de nouvelles solutions thérapeutiques pour les patients souffrant de cette maladie, qui soient plus efficaces et mieux tolérées. A long terme, ce projet pourrait satisfaire ce besoin. A court terme les données générées permettront de faire avancer les programmes de recherche : Par exemple, un composé peu efficace sur l’une des deux procédures peut indiquer le besoin de développer des dérivés structuraux plus actifs, ou bien invalider la cible d’intérêt ce qui conduit à l’arrêt du programme. Un composé efficace peut faire progresser le projet vers la phase de développement clinique.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées : Durée de 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Mesure de la température corporelle : Durée de 1min, sur animal vigile ou sous anesthésie générale via une sonde rectale pour rongeur. • Prise de photographies des pattes en les posant sur une plateforme en verre (animal vigile) Durée de 15 secondes • Prélèvement de sang par voie retro orbitale au cours des procédures : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. • Prélèvements de sang via la veine caudale ou à la submandibulaire : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 μl chez la souris et de 20 à 200 μl chez le rat. Le volume total prélevé n’excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l’animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu’à une semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques par voir orale (gavage à l’aide d’une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée ou via la veine caudale : Sur animaux vigiles, durée de 30 secondes. • Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. • Immunisation par voie intradermique ou sous-cutanée, au niveau de la queue : Durée 30 secondes, une seule injection, sur animal vigile • Induction de l’arthrite par injection intrapéritonéal d’anticorps : Durée de 30 secondes, sur animal vigile, une seule injection • Boost de LPS par voie intrapéritonéale : Durée de 30 secondes sur animal vigile, une seule injection.

Impact sur les animaux

Ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal. L’induction de l’arthrite peut engendrer une hypothermie et un état de fatigue passagere (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car l’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différent tissues dont les articulations et les tissus lymphatiques.

Remplacement

A notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui reproduisent l’extrême complexité des maladies inflammatoires articulaires. Celle-ci intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’intéraction du composé avec la cible d’intéret (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux. 50 études seront réalisées dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin de satisfaire la manifestation de leurs comportements naturels (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture, etc.). Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique journalière sur la durée des procédures. Les locaux d'hébergement et les systèmes d’hébergement suivront un programme d’hygiène et sanitaires (programme sanitaires) afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adapté sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet tels que l’ajout d’eau gélifiée ou de nourriture au sein de la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux ainsi que l’utilisation de litière adéquate si nécessaire, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Le stress lié à la manipulation peut avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire, c’est pourquoi une habituation sera réalisée avant l’induction de l’arthrite. Des critères d'arrêt anticipés seront mis en place, suivant la grille de score établie, pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris qui sont communément utilisées en pharmacologie. De nombreuses données sur les modèles d’inflammation chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de l’agent arthritogène, effets de molécules de références etc.). Adulte: Les données de la littérature indique clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine de l’arthrite car ils doivent disposer d'une système immunitaire mature.

12 480 souris et 3 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur induit une fibrose de la peau et des poumons, avec pose chirurgicale de pompes, injections intradermiques et administrations intranasales ou oropharyngées, pour cribler l'efficacité de nouvelles molécules contre la sclérodermie. Le porteur indique que la fibrose se développe sans autre effet indésirable attendu et fixe la mise à mort à un score de souffrance déterminé. Sur le remplacement, il affirme qu'il est "indispensable" d'examiner l'"animal entier" et que ces essais ne peuvent être reproduits sur cellules, pour un total de 15 600 animaux.

Objectifs

La sclérodermie systémique (SSc, systemic sclerosis) est une maladie systémique du tissu conjonctif. Elle est caractérisée par des lésions de fibrose cutanée et/ou viscérale, une atteinte microvasculaire et une réponse immunitaire activée et dérégulée. La SSc est une pathologie rare, sa prévalence varie de 30 à 240 cas par million d’habitants. Cette maladie touche essentiellement les femmes (4 femmes pour 1 homme environ), et se déclare généralement entre 45 et 60 ans. La SSc est associée à une surmortalité significative. Le pronostic dépend essentiellement de la survenue d’atteintes viscérales et plus particulièrement d’une pneumopathie infiltrante diffuse (PID) parfois sévère, d’une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) ou d’une atteinte cardiaque primitive, qui représentent les 3 premières causes de mortalité au cours de la SSc. C’est une maladie multifactorielle qui implique des facteurs environnementaux et un fond génétique de susceptibilité. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché mais une prise en charge adaptée permet seulement d’atténuer les symptômes. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules efficaces. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet, le but étant d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels contre la sclérodermie. Le projet inclus un screening de nouvelles molécules, une étude si besoin de leur mécanisme d’action et évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique. Ainsi, ces études permettront de trouver potentiellement un médicament contre la sclérodermie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de l’sclérodermie avec la mise en place de différents modèles animaux de fibrose cutanée et pulmonaire chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la fibrose et l’inflammation dans des modèles animaux mimant les symptômes de la sclérodermie diffusée chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans des maladie chronique fibrotiques. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui soulageraient à la fois les symptômes de la fibrose et l’inflammation.

Procédures

Tous les animaux de la procédure 6 (sauf le groupe 1, opéré à blanc) subiront une chirurgie pour incorporer les pompes osmotiques. La chirurgie de 20-45minutes aura lieu au jour 0 sur animal anesthésié et analgésié. Tous les animaux de la procédure 1et 2 subiront des injections intradermiques, les animaux de la procédure 3 et 4 subiront des administrations intranasale et oropharyngée (sauf le groupe 1, sérum physiologique) et les animaux de la procédure 5 sauf le groupe 1, avec du véhicule) subiront des injections sous-cutanées et intramusculaires. Les traitements pourront être administrés avant, pendant ou après l'induction du modèle. Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale (sur animal vigile). Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer de la fibrose cutanée et pulmonaire, et l’inflammation sans autre effet indésirable attendu. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie pour récupérer différents organes, dont les articulations, pour analyses histologiques ou autre.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur la fibrose et l’inflammation implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie de fibrose humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur la réponse à la fibrose et l’inflammation et structure des organes viscéraux, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (Mann Whitney test) ou une analyse de variance (ANOVA).

Raffinement

Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, administrations oropharyngée) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Toutefois, pour les modèles d’induction de fibrose pulmonaire par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique sera administré en phase pré- et post-opératoire. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces et la réponse respiratoire. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >6 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de fibrose cutanée et pulmonaire en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de souris C57Bl/6 est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Cependant, il est envisageable d’utiliser d’autres souches de souris comme les BALB/C ou des rats comme la souche de rat Sprague Dawley qui est également un modèle de laboratoire bien connus. Chez la souris, la souche C57Bl/6 représente la souche de choix pour ces études mais d’autres souches pourront également être utilisées dépendant de leurs susceptibilités à l’induction de la pathologie en fonction du modèle Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier des objectifs et besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés de 6-19 semaines au début de l’étude selon le type ou le stade de progression de la maladie sur des patients atteints de sclérodermie (Sclérodermie juvénile ou sclérodermie sur des patients adultes).