Troubles immunitaires

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur applique un produit allergisant et irritant sur le ventre rasé puis sur les oreilles pour déclencher un eczéma, et jusqu'à huit injections d'anticorps sur trois semaines. Le porteur analyse les mécanismes immunitaires de l'eczéma et sa récidive, maladie qu'il dit toucher plus de 15% de la population. Il affirme qu'aucun test in vitro ne récapitule la complexité de la réaction immunitaire de la peau et que les cellules primaires doivent être prélevées post-mortem sur des souris.

Objectifs

Les eczémas allergiques tels que l’eczéma de contact (colorants, produits chimiques, nickel…) ou l’eczéma atopique (acariens, moisissures, poils de chien/chat…) se caractérisent par des lésions cutanées et sont dues à une réaction allergique. Ces eczémas touchent plus de 15% de la population. La cause des eczémas est complexe et reste mal comprise à ce jour. Ces dernières années, une population de cellules immunitaires, ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans les tissus, a été mise en évidence. Ces cellules particulières ne re-circulent pas dans l’organisme et patrouillent dans la peau à l’interface entre l’organisme et l’environnement. Il a été montré que ces cellules sont impliquées dans la récidive et la sévérité de l’eczéma. En effet, une des caractéristiques cliniques de l’eczéma est qu’il se développe sous forme de poussées, entrecoupées de périodes de rémission. Lors des poussées, dont la sévérité augmente généralement au cours du temps, les lésions reviennent préférentiellement sur les sites antérieurement atteints. Les traitements actuels préconisés pour ces eczémas consistent notamment en l'application cutanée d'anti-inflammatoires (corticoïdes). Toutefois, ce type de traitement, bien que permettant de soulager les symptômes de l’eczéma, ne permet pas d’empêcher les récidives. Ce projet a donc pour but de tester une nouvelle stratégie thérapeutique pour lutter contre les eczémas et d'évaluer son effet sur la formation, la survie, la prolifération et la réactivation des cellules immunitaires mémoires résidant dans la peau. Ainsi, 6 anticorps, dont l'efficacité et la sureté ont déjà été démontrées dans d'autres modèles, seront testés dans ce projet. Grâce à cette stratégie, une nouvelle solution thérapeutique permettant d’éliminer les cellules responsables de l'eczéma et donc de traiter cette pathologie à sa source, pourrait voir le jour.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension de la biologie des cellules immunitaires mémoires résidant dans la peau. Il pourra servir en outre de preuve de concept de l’intérêt de cibler les cellules immunitaires mémoires résidants dans la peau pour traiter l'eczéma ou d'autres maladies inflammatoires chroniques. Enfin, l'objectif final de ce projet serait de pouvoir proposer une stratégie thérapeutique innovante, permettant de stopper la récurrence des poussées d’eczémas, grâce aux résultats de ce travail.

Procédures

Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 40 minutes. Les animaux seront également être traités (8 injections de traitement au maximum) avec un anticorps (ou anticorps contôle) sur une durée maximale de 3 semaines. En effet, dans certaines procédures, 7 injections de traitement sont nécessaires pour observer un effet de l'anticorps, comme démontré dans la littérature. Ce traitement sera réalisé sur animal vigile par injection du produit (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines, afin de suivre de manière quantitative l'inflammation (l'augmentation de l'épaisseur des oreilles étant un des signes de l'inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes) afin d'éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Ce modèle d'eczéma induit chez la souris est parfaitemenent maitrisé dans l'équipe ; nous savons donc que l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'eczéma peut conduire les souris à se gratter, mais dans notre expérience, nous n'avons jamais observé de signe excessif de grattage.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs oreilles, leurs ganglions (et éventuellement leur rate et leur sang). Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire.

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. D'une part, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal. Malheureusement, les techniques actuelles d'étude in vitro ne permettent pas de mimer cette étape de pénétration dans le tissu. D'autre part, l'utilisation de modèles de peau reconstruite à partir de cellules murines n'est pas envisageable. En effet, ces modèles sont loin d'être fonctionnels puisqu'il n'existe à ce jour aucune lignée de cellules de peau immortalisées. Cela nécessite donc l'utilisation de cellules primaires (récupérées post-mortem sur des souris) qui ne peuvent pas être congelées et qui résistent mal ex vivo. Enfin, les modèles de peau reconstruites à partir de tissu humain en sont à un stade de développement plus avancé que chez la souris mais ils restent malgré tout inutilisables après 2 semaines de culture. Etant donnée que nos expériences durent toutes 3 semaines ou plus, l'utilisation de ces modèles de peau reconstruites ne peut être envisagée dans ce projet. Dès lors, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable à la réalisation de notre étude.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra diminuer en fonction des résultats obtenus. En effet, des statistiques intermédiaires pourront être réalisées afin de déterminer la puissance de nos tests et de revoir à la baisse nos effectifs d’animaux si possible.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux. Nous attacherons ainsi une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. Lors des injections par voie intrapéritonéale, nous veillerons consciencieusement à ne pas toucher les mammelles des souris afin de ne pas blesser les animaux. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie (ex: anticorps, kits de dosage de cytokines), ne sont disponibles que chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de molécules inflammatoires ou l’induction de différentes populations de cellules mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules étudiées dans ce projet sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter nos résultats à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable à notre étude. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à six injections intraveineuses sous anesthésie et trois à quatre prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut léser l'œil, pour évaluer l'immunogénicité d'une protéase modifiée destinée à éliminer des anticorps chez l'humain. À l'issue, elles sont tuées pour prélever le sérum et les organes lymphoïdes. Le porteur annonce peu d'effets indésirables au motif que la protéase agit peu sur les anticorps de souris, et renvoie le bénéfice clinique à de futurs médicaments.

Objectifs

Une protéase nommée IgG-degrading enzyme ou IdeS est produite par la bactérie Streptococcus pyogenes afin d'échapper au système immunitaire de l’hôte. Cette protéase digère les anticorps de type Immunoglobulines G chez l’homme, le lapin ou les primates non-humains, mais n’a pas ou peu d’actions sur les Immunoglobulines G de souris. Plusieurs groupes de recherche ont montré que la protéase IdeS peut être utilisée dans des modèles précliniques de maladies autoimmunes ou chez certains patients, pour éliminer, de manière transitoire, les anticorps de type IgG pathologiques. Cependant, l’utilisation de cette protéase chez l’homme se heurte à deux problèmes: sa courte durée de vie dans l’organisme avec une demi-vie de 3-5 heures et son immunogénicité, c’est-à-dire sa capacité à induire des anticorps neutralisant. Pour cette raison, l’utilisation de la protéase IdeS comme traitement chronique n’est actuellement pas possible chez l’homme. Les objectifs de ce projet sont de générer des protéases IdeS ayant une durée de vie prolongée dans l’organisme, et d’évaluer l’immunogénicité de ces protéases à demi-vie augmentée chez la souris. L’avantage d’une étude d’immunogénicité chez la souris réside dans le fait que les Immunoglobulines G murines sont peu ou pas digérées par l’IdeS ; Ceci devrait donc permettre d’étudier en détail le mécanisme d’action des IgG murines anti-IdeS, et notamment leur capacité à neutraliser l’activité de la protéase IdeS, sans que l’étude ne soit biaisée par leur dégradation par IdeS.

Bénéfices attendus

L'intérêt de l'utilisation de la protéase IgG-degrading enzyme a été démontré afin de lutter contre certaines maladies auto-immunes (Purpura thrombocytopénique, arthrite rhumatoïde), contre le rejet de greffe ou encore afin d'améliorer l'efficacité de la thérapie génique utilisant des vecteurs rétroviraux. L'utilisation de cette enzyme en clinique se heurte toutefois à sa courte demi-vie et à son immunogénicité. La validation préclinique de nouvelles protéases IgG-degrading enzyme recombinantes à durée d’action optimisée ouvrira la voie à la préparation de nouveaux médicaments plus efficaces. Ceci devrait ainsi permettre de réduire les fréquences d’injection de la molécule aux patients et de réduire les doses de molécules injectées, ce qui devrait diminuer la probabilité de développer des réponses immunitaires neutralisantes.

Procédures

Les animaux subiront 1 à 6 injections intraveineuse. Ces interventions (injection) seront réalisées sous anesthésie gazeuse et ne durent que 10 à 20 secondes. Ils subiront également 3 à 4 prélèvements sanguins maximum. Ces prélèvements seront également réalisés sous anesthésie gazeuse et ne nécessitent que 20 secondes d'immobilisation maximum de l'animal anesthésié. Dans certaines conditions expérimentales, les animaux subiront en plus des gestes cités précedemment 1 injection intrapéritonéale en tout début de procédure. Cette injection nécessite 10 à 20 secondes d'immobilisation de l'animal.

Impact sur les animaux

Les risques de lésions au niveau de l'œil existent du fait des cycles d’injections/ prélèvements au niveau du sinus rétro-orbital, mais ce risque est limité. Par ailleurs, les lots d’animaux seront divisés en 2 afin de limiter le nombre de prélèvements par animaux. Il n'y a pas d'effets indésirables particuliers attendus suite à l'injection d'IdeS car celle ci est peu active sur les IgG murines (pas de risque d'infection) et nous validerons l'absence d'endotoxine avant injection (pas de risque d'inflammation). L'injection unique d'IVIg par voie intra-péritonale ne présente pas non plus d'effet indésirables attendus.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés. Le sérum et les organes lymphoïdes secondaires seront collectés pour l'évaluation de la réponse immunitaire anti IdeS ou pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le projet fera appel à différents modèles expérimentaux chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment le catabolisme de l’IdeS et l’induction d’une réponse immunitaire anti-IdeS). Toutefois, toute information obtenue par l’expérimentation animale sera immédiatement transposée à des systèmes in vitro pour analyses ultérieures.

Réduction

Le nombre de répétition des expériences sera défini de manière rationnelle : si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs, elle ne sera pas répétée, sinon elle sera répétée une à deux fois maximum. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés; ainsi, aucune expérience supplémentaire ne doit-elle être faite si des questions nouvelles surviennent. Nous prévoyons d'utiliser pour ce projet un nombre maximum de 345 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Les lésions au niveau de l'œil sont possibles du fait des cycles d’injections/ prélèvements au niveau du sinus rétro-orbital, mais ce risque est limité car nous maîtrisons ce geste et nous alternerons l'œil concerné. Différents groupes seront par ailleurs constitués afin de réduire le nombre de prélèvements par animal. Des points limites ont été définis, les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce qui permette d’avoir un nombre suffisant d’individus de même âge et de génotype homogène, qui permette l’obtention de résultats statistiquement fiables. Par ailleurs, les IgG de souris étant peu sensibles à l’action protéolytique d’IdeS, cela nous permettra d’étudier plus aisément l'immunogénicité des variants de l'IdeS et la capacité des IgG murines anti-Ides (si présentes) à neutraliser l’activité d’IdeS sans que l’étude ne soit biaisée par leur dégradation par IdeS. Des souris adultes, âgées de 7-12 semaines en début d’expérimentation (système immunitaire mature) seront utilisées.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Elles sont sensibilisées puis exposées à un allergène d'acarien par voie intranasale, ce qui peut provoquer inflammation pulmonaire et difficultés respiratoires, avant une ponction cardiaque terminale sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine PCSK9 dans l'asthme allergique. Le porteur décrit une grille de points limites déclenchant l'injection de buprénorphine ou la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'évaluer ce traitement et que seul un modèle murin asthmatique le rend possible.

Objectifs

Ayant déjà débuté un projet sur l’étude de PCSK9 dans l’allergie alimentaire, nous souhaitons continuer cette approche et vérifier l’impact de celle-ci dans un contexte d’asthme allergique. De plus, il n'existe pas de méthodes alternatives d'étude des mécanismes appondis de PCSK9 et de l'allergie respiratoire. Le modèle PCSK9 KO associé à l’allergie respiratoire n'est que peu ou pas décrit dans la littérature. C'est pourquoi un modèle d’allergie respiratoire à l’acarien permettra de se rapprocher de la physiopathologie présente chez l'homme tout en évaluant les effets de l'absence ou non de PCSK9 sur l'inflammation.

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement ne permet soigner la cause de l’asthme allergique, de plus, les effets secondaires liés aux corticoïdes sont notables et la désensibilisation n’est pas efficace chez tous les patients. PCSK9 devient une cible de plus en plus privilégiée dans le cadre de maladies inflammatoires, de plus, notre première étude sur le traitement anti-PCSK9 soigne les symptômes de l’allergie alimentaire chez la souris. Étant donné les fortes similitudes entre l’asthme allergique et l’allergie alimentaire, nous pensons que le traitement anti-PCSK9 chez des souris asthmatiques sera bénéfique.

Procédures

Les souris sont soumises à des sensibilisations par voie percutanée ( 4 sensibilisations de 45 minutes), et à des déclenchements par voie intranasale (2 déclanchements de 45 minutes). A la fin du protocole, un prélèvement du sang terminal sera effectué par ponction intracardiaque après anesthésie sous isoflurane.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une perte de poids, une inflammation pulmonaire ou difficultés respiratoires au moment des challenges intranasaux.

Devenir

A la fin du protocole d'allergie au jour 35 post sensibilisation, toutes le souris seront mises à mort pour analyses. Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane et un maximum de sang sera prélevé.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant d’évaluer le bénéfice du traitement anti-PCSK9 dans le cadre de l’asthme allergique. Seul un modèle murin asthmatique nous permettra de mesurer l’amélioration des symptômes via ce traitement et comprendre les effets de PCSK9 dans la physiopathologie de l’asthme. Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le projet étudiera l’allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire.

Réduction

Le modèle animal utilise a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera realisé. Une p-value inferieur a 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Au cours de la procédure d’induction de l’asthme allergique, les souris sont anesthésiées sous isoflurane. Elles sont surveillées jusqu’à leur réveil. Durant la phase de réveil les souris elles sont placées sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et sont hébergées en groupe dans des cages enrichies par des frisottis ou une petite maison en carton. Une observation quotidienne des souris sera effectuée, et les souris seront pesées 3 fois par semaine ce qui permettra de détecter tout changement de comportement. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délai. Les signes spécifiques et notables sont les suivants : - Notables : Aspects extérieur : Pelage sale, Position recroquevillée à la manipulation Réticent à se déplacer, Zone urogénitale souillée, respiration difficile Évolution pondérale : Perte de poids10% En présence d'un signe notable: administration de buprénorphine à 0,1 mg/kg en sous-cutanée 2 fois/jour.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche C57/Bl6 et Balb/c. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire et du métabolisme lipidique du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires et métaboliques seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages ainsi qu'à de nombreux outils de biochimie (ELISA, dosage colorimétrique...). Souris C57/B6 et Balb/c femelles âgées de 5 semaines au début du protocole ce qui correspond à des souris sevrées donc adultes ayant un système immunitaire mature ou quasi-mature.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques Townes développent une drépanocytose avec anémie et atteintes du foie, des reins et de la rate, et reçoivent des candidats médicaments ainsi que des prélèvements de sang répétés au sinus de l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que la complexité de la maladie impose d'en faire la preuve dans un "organisme intégré" et que le remplacement total par la culture cellulaire est impossible.

Objectifs

Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose, une forme grave d’hémoglobinopathie à transmission autosomique récessive touchant le gène codant pour l’hémoglobine. La drépanocytose se caractérise par une altération de la forme native du globule rouge suite à la formation de polymères d’hémoglobine S mutée. Elle se manifeste des crises vaso-occlusives récurrentes et douloureuses ainsi que par une anémie hémolytique notamment dues à une inflammation vasculaire et un stress oxydant chroniques. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères et multifocaux subséquents rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. Il est donc nécessaire de continuer de développer des médicaments ciblant mieux les mécanismes d'action de la pathologie. Pour cela nous devons évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques pour mieux traiter la drépanocytose. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules sur la physiopathologie de la drépanocytose dans un modèle murin transgénique développant la maladie. Dans ce contexte, nous évaluerons l'impact des molécules à tester sur l'érythropoièse, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'hématocrite, la falciformation des globules rouges, ou encore le dosage de l'hémoglobine. L’utilisation de la souris se fera en accord avec la règle des 3R (réduire, raffiner, remplacer). Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des souris seront mis en place dans chaque procédure afin de veiller à leur bien-être. Une étude préliminaire pilote permettra de s’assurer de la faisabilité des mesures des paramètres listés ci-dessus et sera suivie d’études principales dont l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de futurs candidats médicaments, seuls ou en combinaison avec l’hydroxyurée. Ce projet de recherche nécessitera au total 380 souris sur 3 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, l’hydroxyurée. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression de la drépanocytose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au sinus rétro-orbital, sous anesthésie isoflurane 3% et suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Dans l'étude principale, les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration dépendra de la demande du sponsor (détails dans le rubrique Procédure 2). Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, un prélevement en point final de sang sera effectué au sinus rétro-orbital. Puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.

Impact sur les animaux

Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique ainsi qu'une augmentation de l'érythropoïèse. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester, en les comparant et ou les combinant au traitement de référence, l’hydroxyurée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet du composé testé sur la physiopathologie de la drépanocytose.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire pilote permettra de valider les paramètres à évaluer avant d'administrer les composés à tester dans l'étude principale et de confirmer la robustesse du modèle, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité du modèle transgénique Townes.

Raffinement

Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement. et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur la physiopathologie de la drépanocytose. La souris a été choisie car le modèle Townes a été développé afin de reproduire au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront 7-8 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

2444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux et des adultes reçoivent des vaccins, des injections d’anticorps et une infection nasale par un grand nombre de bactéries de la coqueluche, avant le prélèvement de leur nez, de leurs poumons et de leurs organes lymphoïdes, pour identifier des anticorps maternels protecteurs. Le porteur indique que l’infection peut tuer l’animal, souiller son pelage et gêner sa respiration, la perte de poids survenant juste avant la mort. Il précise que les mères sont tuées au sevrage et affirme qu’aucun modèle in vitro ne peut remplacer cette étude.

Objectifs

Prévenir les maladies infectieuses chez l’enfant par l’immunisation maternelle et l’immunisation de l’enfant s’avère être une nécessité pour les maladies à taux infectieux (R0) élevé. Le nombre de maladies que l’on peut prévenir par la vaccination a considérablement chuté ces dix dernières années. Néanmoins, les maladies infectieuses constituent la première cause de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans, en particulier dans les pays en voie de développement. Le développement de nouveaux vaccins fondés sur l’identification d’anticorps protecteurs est nécessaire pour parvenir à réduire la mortalité infantile. La coqueluche figure parmi les maladies avec un R0 très élevé et pour lesquelles le taux de mortalité infantile est élevé. Les formes graves de la coqueluche touchant les nouveau-nés sont associées à une augmentation du nombre de globules blancs dans le sang (hyperleucocytose) entraînant une hypertension artérielle pulmonaire, conditionnant le pronostic vital notamment lorsqu’une défaillance cardiovasculaire apparaît. Par le passé la mise en place d’un modèle d’hyperleucocytose chez le souriceau a permis de montrer le rôle de la toxine pertussique (PT) dans ce phénomène. Les objectifs de ce projet sont les suivant : - Objectif 1 : Identification d’anticorps anti-PT conférant une immunité contre la coqueluche. - Objectif 2 : Etude du passage sélectif des anticorps de la mère à la progéniture et de la contribution des anticorps à la clairance du pathogène chez la progéniture infectée. - Objectif 3 : Immuno-modulation de la réponse immune de la progéniture par les anticorps maternels.

Bénéfices attendus

Les bénéfices apportés par ce projet seront multiples. Nous caractériseront les anticorps anti-PT protecteurs contre la coqueluche et contribuant à la clairance du pathogène. Nous déterminerons l’impact du transfert d’anticorps anti-PT sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination contre la coqueluche ou à un challenge infectieux. Dans cette optique, nous étudierons l’effet de différents vaccins anticoquelucheux dans le but d’identifier la meilleure stratégie vaccinale et de concevoir des vaccins plus performants.

Procédures

Les vaccinations seront réalisées sur animaux vigiles, par injection sous-cutanée, qui est l'injection la plus indolore ayant prouvée son efficacité. L'injection en sous-cutané dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection). Deux séries de vaccinations à 4 semaines d'interval sont réalisées. Cela concerne 174 animaux. Les injections d'anticorps sont réalisées sur des souriceaux vigiles, en intrapéritonéal et dans un volume minimal de 50 uL ou bien à des souris adultes endormies, en retroorbital, dans un volume minimal de 100 uL de façon à limiter la douleur de l'animal. L'injection dure 1 à 2 minutes/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection) Une seule injection par animal est réalisée. Cela concerne 1860 animaux. Les infections en intranasal sont réalisées sur des souris endormies et dans des volumes minimaux pour éviter que l'animal se noie. L'injection en intranasal des bactéries prend 2 minutes/animal (temps de la contension et du maintien de l'animal après inoculation pour éviter qu'il se noie et vérifier son rythme cardiaque). Un animal est infecté une seule fois au cours des expériences. Cela concerne 2444 animaux. Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sur des animaux euthanasiés à l'issu des expériences. L'euthanasie dure 1 à 2 min/animal (en comptant la contension nécessaire à l'injection et le temps que le produit fasse effet). Cela engage la totalité des animaux inclus dans les expériences (2444).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, seule l'infection est susceptible d'induire de fortes nuisssances aux animaux. En effet, pour induire une hyperleucocytose chez les souris nous devrons inoculer un nombre élevé de bactéries virulentes ce qui peut causer la mort de l’animal. Les souris malades ont le pelage souillé et des difficultés à respirer et elles perdent du poids.

Devenir

Pour évaluer la protection des anticorps glycosylés anti-PT contre la coqueluche dans le modèle murin nous devons euthanasier l'animal et prélever son sang afin de mesurer l'augmentation du nombre de leucocytes circulants, symptôme le plus précoce associé à la maladie dans le modèle murin. La perte de poids apparaît tardivement et quasi de façon concommitente avec la mort de l'animal. De plus, nous récolterons le nez et les poumons des animaux euthanasiés pour mesurer la charge bactérienne ou la réponse immune locale. Des organes lymphoides primaires ou secondaires tels que la rate et le thymus seront également prélevés pour étudier la réponse immune en périphérie. Les mères sont euthanasiées au moment du sevrage (4 semaines) et leur sang est collecté pour mesurer le taux d'anticorps circulant et les caractériser.

Remplacement

L’étude des effets de la vaccination maternelle sur la réponse immune de la progéniture ne peut être substituée par des modèles in vitro.

Réduction

Différentes mises au point seront réalisées afin d’identifier les conditions optimales pour répondre aux problématiques posées; ce qui permettra de réaliser les expériences de grande échelle (telle que le criblage d’une banque d’anticorps glycosylés) sur un nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Des points limites ont été définis, qui seront surveillés quotidiennement tels que le comportement apathique des souris, leur pelage souillé, leur difficulté à respirer et la perte de poids. Les souris gestantes ne seront pas transportées pour limiter le stress à l’animal. Les souris gestantes auront un régime alimentaire adapté (croquettes enrichies). Du coton sera mis dans les cages pour permettre aux souris de faire un nid.

Choix des espèces

Dans un but d'étude de potentialité vaccinale et d'immunorégulation induite par les anticorps, il n'existe pas d'autres possibilités que le recours à l'In vivo, et donc aux souris dans notre cas puisqu'elles représentent un bon modèle adapté à nos études. Il est connu que la coqueluche touche tous les âges de la population et elle est mortelle chez les nourrissons non encore correctement protégés par la vaccination. Pour faire le parallèle avec le modèle murin, nous travaillerons sur des souriceaux de 7 à 9 jours, âges auquels le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un nouveau-né. Nous emploierons des souris de 4 semaines, âge auquel le système immunitaire des souris est comparable à celui d'un enfant pour étudier l'effet des anticorps maternels sur la réponse immune des souriceaux à une vaccination. Des souris adultes de 7 semaines, au système immunitaire mature, seront également employées comme outil de criblage, la reproductibilité et la faisabilité des expériences étant meilleure comparé au modèle d'infection néonatale.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un transfert de cellules d’une souris donneuse puis des injections et des prélèvements de sang répétés, souvent par voie rétro-orbitaire, avant le prélèvement de leur sang et de leur rate, pour tester deux immunosuppresseurs contre un rejet de greffe médié par les lymphocytes NK. Le porteur fixe un point limite de mise à mort à 20 % de perte de poids et mentionne un risque rare d’embolie lors des injections. Il affirme que l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme ne peut être appréhendé par des modèles in vitro seuls.

Objectifs

La meilleure option thérapeutique pour les patients au stade terminal d'une défaillance d'organe vital est la transplantation, qui consiste à substituer chirurgicalement l'organe défectueux par un greffon fonctionnel prélevé chez un donneur. La principale complication de la greffe d’organe est le phénomène de « rejet » qui demeure la cause majeure d’échec en transplantation. En effet, bien que de la même espèce, les individus sont génétiquement différents. Le système immunitaire du receveur va alors reconnaître des antigènes présents à la surface du greffon comme étrangers, au même titre qu’il reconnaît un agent infectieux. On distingue différents mécanismes conduisant au rejet de greffe, en particulier l’un d’eux découvert récemment fait intervenir des cellules de l’immunité du receveur appelé « lymphocytes NK ». C’est donc autour de la compréhension des mécanismes immunologiques de ce nouveau type de rejet, appelé « rejet NK » que ce projet s’articule, grâce à l’utilisation d’un modèle murin de transplantation simplifié. Dans ce modèle la transplantation sera modélisée par le transfert de cellules de souris dites « donneuses » à des souris « receveuses » issues d’un fond génétique différent, permettant de recréer un rejet NK de manière moins invasive qu’une transplantation chirurgicale. Les patients transplantés sont contraints de prendre toute leur vie un traitement immunosuppresseur qui permet de diminuer la réactivité de leur système immunitaire vis-à-vis du greffon, afin de limiter le phénomène de rejet. Ces traitements, actuellement validés pour d’autres types de rejets, n’ont à ce jour jamais été testés sur le rejet NK. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de 2 familles d’immunosuppresseurs sur ce rejet NK in vivo chez la souris, afin de pouvoir proposer ces traitements aux patients qui en sont atteints. Tout au long du projet, les conditions d'élevage, d'hébergement et de soins seront adaptées aux besoins des animaux. Les procédures utilisées dans ce projet n’occasionnent qu’une douleur et une angoisse minimes pour les animaux. Des points limites précis ont cependant été définis afin d’intervenir si besoin. Les prélèvements sanguins et injections seront réalisés sous anesthésie afin de limiter toute souffrance ou stress chez les animaux. Ce projet nécessite le recours à 116 souris, nombre calculé à visée de réduction par des méthodes biostatistiques nécessaire pour répondre à la problématique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider un nouveau modèle murin de rejet NK grâce à une technique de transfert de cellules, beaucoup moins invasif que le modèle chirurgical par transplantation cardiaque. Grâce à ce modèle murin, l’efficacité de 2 familles de traitement immunosuppresseurs (déjà disponibles en clinique) pourra être évaluer spécifiquement dans ce nouveau type de rejet NK. De manière plus concrète, la validation de l’efficacité de ces traitements chez la souris pourra permettre aux patients atteints de ce rejet particulier de bénéficier de ces médicaments pour limiter la perte de leur greffon

Procédures

Deux à 3 prélèvements sanguins (chaque prélèvement sanguin dure environ 30 secondes), et 2 à 10 injections (la durée d’une injection est inférieure à une minute) seront réalisés au cours de l’expérimentation. Ces gestes seront réalisés après anesthésie gazeuse et de manière alternée gauche/droite pour les prélèvements, afin de limiter le stress des animaux. Les procédures dureront entre 5 et 18 jours. L’ensemble de gestes seront réalisés par un opérateur expérimenté de manière à veiller à engendrer le moins de stress possible sur les animaux.

Impact sur les animaux

Au vu de la durée des procédures (maximum 18 jours) et de la dose d’immunosuppresseurs administrée (concentrations thérapeutiques déjà testées dans un précédent projet et évaluées dans la littérature comme inférieures aux concentrations toxiques), il n'y a pas d'effets indésirables attendus imputables aux substances injectées. Les principales nuisances attendues sont le stress et la douleur liés aux prélèvements et injections répétées de façon rapprochée. Les animaux seront anesthésiés par inhalation avant de procéder aux injections, ou aux prélèvements sanguins. Un collyre anesthésiant, sera administré aux souris avant de procéder à une injection intra veineuse par voie rétro-orbitaire ou à un prélèvement sanguin rétro-orbitaire pour limiter au maximum le stress et la douleur liés à ces gestes. L’ensemble des manipulations et gestes seront réalisées par un opérateur expérimenté afin de limiter les nuisances pour les animaux. Les souris seront surveillées dans les minutes suivants leur réveil après anesthésie afin de contrôler leur état et comportement.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort après anesthésie gazeuse afin de prélever le sang et les rates des animaux, et procéder à l’analyse des cellules d’intérêt

Remplacement

Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité de 2 traitements immunosuppresseurs dans le traitement du rejet de greffe induit par les lymphocytes NK du receveur. Nous avons précédemment mis en évidence l'effet bénéfique de ces traitements in vitro grâce à un modèle de coculture cellulaire entre des lymphocytes NK de volontaires sains et une lignée de cellules endothéliales. Néanmoins, la complexité des mécanismes immunologiques en jeu, de même que l'effet des traitements immunosuppresseurs à l'échelle de l'organisme entier ne peuvent être appréhendés par des modèles in vitro seuls. C'est pourquoi ce projet nécessite l'emploi d'un modèle in vivo de rejet NK, permettant de confirmer les données que nous avons obtenu in vitro. Par ailleurs ce modèle de rejet NK utilise une méthode simplifiée par transfert de cellules d’une souris donneuse à une souris receveuse, beaucoup moins invasif pour les animaux que la chirurgie pour transplantation d’organe solide.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupes dans chaque procédure expérimentale a été calculé à minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables, basée sur notre expérience passée. Les paramètres de réponse immunitaire étant relativement homogène chez les souris contrôles, nous avons pris le parti de diminuer le nombre d'animaux contrôles à 5 plutôt que 8. En cas d'échec de l'une des expérimentations dû à problème technique, nous gardons la possibilité de renouveler une fois les procédures.

Raffinement

Au vu de la durée des procédures et de la dose d’immunosuppresseurs administrée (concentrations thérapeutiques déjà testées dans un précédent projet et évaluées dans la littérature comme inférieures aux concentrations toxiques), il n'y a pas d'effets indésirables attendus imputables aux substances injectées. Un collyre anesthésiant, sera administré aux souris anesthésiées par inhalation avant de procéder à une injection ou un prélèvement sanguin. Les gestes d'injection et les prélèvements seront réalisés par un opérateur expérimenté afin de limiter les nuisances liées au geste. Les côtés seront alternés afin de limiter les conséquences de ces prélèvements et dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera rincé quotidiennement par sérum physiologique. Un point de compression sera réalisé au site de ponction après chaque prélèvement. Une hémorragie non contrôlée conduira à la mise à mort de l’animal. Les animaux seront surveillés dans les 15 minutes suivants leur réveil après anesthésie, afin de contrôler leur état et comportement. De plus une surveillance du comportement des animaux sera observée de manière très régulière, avant chaque geste et le lendemain des transferts de cellules. Dans de très rares cas, l’injection intraveineuse peut se compliquer d’une embolie. Les points limites suivants conduiront à la mise à mort de l’animal : coma, convulsions. Si des signes de souffrance ou des modifications de comportement tels qu’une prostration, des yeux mi-clos, un pelage hérissé, un dos vouté ou encore une absence d’interaction avec ses congénères sont observés, cela conduira à une nouvelle surveillance de l’animal le lendemain. En cas de persistance de ces signes de souffrance un antalgique de palier 1 (paracétamol) pourra être administré à l’animal. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera sorti du protocole et sera mis à mort. La perte de poids étant un indicateur clé de l’état de souffrance ressentie par les souris, ces dernières seront pesées 2 fois par semaine durant le déroulé de la procédure. Une perte de poids supérieure à 10% du poids maximum atteint par l’animal conduira à sa réhydratation avec de l’eau gélifiée durant 48h ainsi que la mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage pour favoriser l’alimentation. Une perte de poids supérieur à 20% du poids maximum de l’animal, constitue un point limite à cette procédure. L’animal sera alors mis à mort.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude du rejet de greffe. Afin de reproduire la différence génétique entre un donneur et un receveur d’organe conduisant au rejet, deux lignées de souris de fonds génétiques différents seront utilisées. Les cellules de souris donneuses, qui expriment à leur surface des antigènes différents de celles des souris receveuses, seront reconnues comme « étrangères » par les lymphocytes NK des receveuses, conduisant ainsi à leur destruction. Des souris adultes entre 8 et 15 semaines seront utilisées dans ce projet. Nous avons choisi cette fenêtre afin de laisser le temps au système immunitaire de se développer et d’atteindre sa maturité afin de répondre aux antigènes administrés.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une polyarthrite leur est provoquée par une injection de collagène, puis ils reçoivent un anticorps trois fois par semaine pendant deux semaines, avant d'être tués pour prélever sang, rate, ganglions et une patte, afin de tester une immunothérapie contre la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que ce modèle entraîne une inflammation des articulations puis une atteinte du cartilage et des os. Il affirme que le produit n'a jamais provoqué d'effet dommageable chez le rat et que la phase préclinique sur l'animal est nécessaire avant un essai clinique.

Objectifs

L'objectif du projet est, dans un premier temps, d'identifier une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ; puis de tester l'efficacité d'un traitement par injection d'anticorps anti-CD45RC et enfin d'optimiser ce protocle de traitement dans l'objectif finale de réaliser une étude pré-clinique chez le rat pouvant aboutir sur un essai clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence le potentiel d'un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde et découler sur un essai clinique dont un grand nombre de patients pourrait bénéficier.

Procédures

Les animaux vont d'abord subir sous anesthésie une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue pour induire l'arthrite (10min de procédure de l'endormissement au réveil). Par la suite, les rats (vigiles) receveront un traitement par injection intrapéritonéale 3 fois par semaines pendant 2 semaines (pour chaque injection, 2min de procédure de la prise en contention à la fin de l'injection) . Deux fois au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés pour effectuer le prélèvement d'une petite quantité de sang dans la veine caudale après anesthésie locale (10min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat est déjà utilisé depuis plusieurs années. Celui-ci se caractérise par une inflammation des articulations avec, sur le long terme, une atteinte du cartilage, des os et l'installation d'une fibrose.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvement (sang, rate, ganglions et patte) et réaliser une analyse immunologique et anatomopathologique.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsque le modèle expérimental existe. Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. L'utilisation de celui-ci est nécessaire pour évaluer de manière exhaustive les effets ciblés, et potentiellement systémiques, du traitement sur les différents organes et fonctions de l'organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement. Par ailleurs, la réalisation d'une première étude pilote sur un faible nombre d'animaux permettra de s'assurer de l'intérêt et de la bio-sécurité du projet avant de faire entrer un plus grand nombre d'individus dans la procédure.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections répétés de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et les symptômes seront évalués 3 fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batôn de bois,...).

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est utilisé dans le modèle d'arthrite induite par injection de collagène depuis de nombreuses années. Ce modèle animal s'avère pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. De plus, nous avons déjà testé notre traitement dans d'autres modèles expérimentaux chez le rat, ainsi nous savons que notre produit n'a jamais induit d'effets dommageable chez cette espèce. Les rats seront utilisés au stade adulte (environ 8 semaines) qui est le stade le plus couramment utilisé pour le modèle d'arthrite induite par injection de collagène.