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Evaluation de l’effet de molécules à visée thérapeutique sur la néphropathie lupique dans un modèle de lupus érythémateux disséminé chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un lupus, elles subissent pendant vingt semaines des administrations répétées de molécules, un gavage quotidien possible, des passages en cage à métabolisme et des mesures de filtration rénale sous anesthésie, pour tester les candidats médicaments d'un client. Le porteur indique ne connaître ni la nature ni les effets des molécules testées, et signale des effets possibles comme des infections, des lésions de l'œsophage ou des hématomes aux points d'injection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la maladie et conclut que le recours à l'animal est "incontournable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur l’atteinte rénale dans un modèle de lupus érythémateux disséminé.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de lupus érythémateux disséminé.
Procédures
Dans ce projet, les animaux ne subiront aucune procédure chirurgicale. Les animaux pourront subir toutes les procédures expérimentales pendant 20 semaines. Ils pourront avoir des administrations de candidats médicaments ou réactifs de traitement de façon quotidienne pour les voies per os et sous-cutanées, 1 fois par semaine pour les voies intra-péritonéales, intraveineuse et 2 fois par semaine pour la voie intramusculaire. Les animaux pourront être placés en cage à métabolisme par groupe de souris ou de façon individuelle pendant 24H 1 fois par semaine. Les animaux pourront avoir une mesure de filtration glomérulaire qui consiste à une anesthésie légère pour scotcher le capteur d’enregistrement et une administration intra-veineuse. Selon la demande du client, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin plus important terminal pourra être réalisé sous anesthésie avant l’euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés sont génétiquement modifiés pour qu’ils développent spontanément une néphropathie lupique. Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. La procédure expérimentale est longue (20 semaines) et les animaux peuvent avoir des traitements répétitifs pouvant engendrer des effets indésirables comme des infections, des lésions de l’œsophage par exemple, des hématomes aux points d’injection… Une attention particulière sera apportée lors des administrations.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie lupique dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
L’évaluation de l’effet de candidats médicaments sur le lupus érythémateux disséminé et sur la néphropathie lupique se fera au cours du temps (jusqu’à 20 semaines) par des techniques non-invasives : évolution dans le temps du phénotype (scores des lésions cutanées de 0 à 6), mesure de la protéinurie par bandelette urinaire et récolte urinaire par cage à métabolisme, ce qui réduit fortement le stress de l'animal. De plus, une évaluation en basal (avant traitement) ainsi que des évaluations à différents temps pendant le traitement permettront pour chaque animal d'être son propre contrôle et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
L’état général des animaux sera observé tous les jours par du personnel qualifié. . Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, différents types d’enrichissement pourront être ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois) ou igloo en polycarbonate). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal.
Choix des espèces
Le modèle choisi pour cette étude est un modèle murin génétiquement modifié (souris MRL/MpJ-Faslpr/J, communément appelées souris MRL-lpr). Ces souris développent une maladie auto-immune ressemblant au lupus érythémateux disséminé en raison d'une mutation (Faslpr) qui favorise la survie des lymphocytes auto-réactifs, et d'un fond de souche (MRL/MpJ) prédisposé à l'auto-immunité. Elles vont développer de manière spontanée une néphropathie cliniquement similaire à ce qui est observé dans la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Evaluation de l’effet de candidats médicaments sur l’enregistrement des contractions utérines induites par l’administration d’ocytocine chez la rate anesthésiée
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
600 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une ovariectomie, puis toutes reçoivent, sous anesthésie sans réveil, des molécules clientes dont le porteur reconnaît ignorer la nature et les effets secondaires, pendant l'enregistrement des contractions utérines induites par l'ocytocine. L'anesthésiant final étant irréversible, les rates sont mises à mort sans reprise de conscience. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie et juge le recours à l'animal "incontournable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de candidats médicaments sur la diminution ou l’inhibition des contractions utérines induites par l’ocytocine en mesurant la pression intra utérine chez la rate anesthésiée.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patientes atteintes de pathologies gynécologiques impliquant le muscle utérin.
Procédures
Dans ce projet, les animaux pourront subir une procédure chirurgicale courte (environ 30 minutes maximum) afin de réaliser une ovariectomie (procédure 2). Cette procédure se fera sur animal anesthésié avec utilisation de plaque chauffante thermorégulée et utilisation d’antalgiques post-opératoires pour diminuer la douleur. La procédure majeure de ce projet (procédure 1) se fait sur animal anesthésié sans réveil (utilisation de plaque thermorégulée lors de l’expérimentation, pose de cathéter intraveineux, intra-utérin et autre selon le mode d’administration des molécules à tester (intragastrique par exemple)). Selon la demande du client, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale (1 ou 2 prélèvements de sang rapides (environ 2 min et faible volume) maximum entre les procédures 2 et 1). La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Les volumes et fréquences des prélèvements seront déterminés selon la publication internationale faisant référence (Diehl KH. et al., 2001). Un volume inférieur à 7.5% du volume sanguin circulant sera prélevé 1 fois par semaine ou un volume inférieur à 10% sera prélevé 1 fois tous les 15 jours. Un prélèvement sanguin plus important terminal pourra être réalisé sous anesthésie avant le sacrifice de l’animal.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Toutefois, les animaux subiront au maximum une ovariectomie (procédure 2) classée comme une procédure modérée et un enregistrement des contractions utérines induites par l’administration d’ocytocine avec l’évaluation de l’effet d’un candidat médicament, procédure classée sans réveil et étant réalisée sous anesthésie générale.
Devenir
L’anesthésiant utilisé pour les enregistrements finaux des contractions utérines est irréversible, les animaux sont donc mis à mort sans réveil à la fin des enregistrements
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des pathologies impliquant le muscle utérin (dysménorrhées, accouchement prématuré). Actuellement, aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal.
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
L’utilisation de rats pour l’étude des contractions utérines est déjà décrite dans la littérature. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Endometriose : validation de modèles souris et évaluation de l’efficacité de candidats médicaments
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Des souris donneuses reçoivent trois injections d'œstradiol puis sont tuées pour récupérer leur tissu utérin, dont les fragments sont injectés dans l'abdomen de souris receveuses, porteuses d'une mini-pompe implantée sous anesthésie qui diffuse de la substance P, censée entretenir l'inflammation, ou du sérum physiologique. 2 400 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang. Il s'agit de provoquer une forme profonde d'endométriose puis d'y tester des candidats médicaments, par voie veineuse, vaginale, abdominale, sous-cutanée ou par gavage, et le porteur s'attend à une douleur "persistante modérée ou sévère transitoire" et à une perte de poids d'environ 15 %. Avec 8 à 16 receveuses par groupe et une donneuse pour deux receveuses, il ne dit pas combien de molécules ni de groupes justifient un effectif de 2 400 souris.
Objectifs
L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Les lésions peuvent se situer au niveau de la paroi musculaire de l’utérus (myomètre), des ovaires, ou dans la paroi abdominale sur le péritoine. Ces lésions sont associées à de la fibrose. Cette maladie entraîne des douleurs cataméniales importantes (dysménorrhée), des douleurs pelviennes, abdominales, ombilicales, lombaires chroniques, et une infertilité. Il n’existe pas à ce jour de traitement de l’endométriose, d’où l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour but de développer un modèle murin (souris) d’endométriose profonde, la forme la plus grave d’endométriose. L’objectif est donc d’obtenir des lésions d’origine endométriale, encapsulées dans les tissus et/ou organes abdominaux environnants, et présentant des signes de métaplasie en muscles lisses, et des signes de fibrose importants. Une étude pilote sera réalisée afin de vérifier l’induction d’endométriose et que ces lésions remplissent les critères de l’endométriose profonde. Dans un second temps, des candidats de traitement de l’endométriose seront administrés aux animaux afin de tester leur efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouveaux agents chimiques ou biologiques candidats pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’endométriose profonde. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées voire absentes.
Procédures
Ce projet vise à tester des molécules chimiques ou biologiques dans un modèle d’endométriose chez la souris. Pour mettre en place l’endométriose, un groupe de souris donneuses recevra trois injections de benzoate d’estradiol à D-7, D-5, D-3 qui développeront l’endomètre, puis ce groupe sera euthanasié pour récupération du tissu utérin. Plusieurs groupes de souris receveuses seront implantés avec une mini-pompe osmotique délivrant de la substance P ou du sérum physiologique à D-1,. La pose sera réalisée sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques : dérivé morphinique (Buprénorphine) et alpha2. La plaie sera ensuite désinfectée régulièrement et un cicatrisant (Dermaflon crème) pourra être appliqué. Si besoin, la suture sera reprise sous anesthésie à l’isoflurane. Ces souris recevront ensuite à D0 une injection intrapéritonéale de fragments utérins issus des souris donneuses. La substance P participera à la mise en place de l’inflammation caractéristique de l’endométriose. Les souris receveuses pourront recevoir un composé chimique ou biologique à tester, ou un placebo : Administrations intra veineuses, intra vaginales, intrapéritonéales, sous cutanées sous anesthésie générale si nécessaire ; intra musculaires, intra dermiques sous anesthésie générale avec analgésie systématique (buprénorphine) Administration per os : gavage sous contention Des prélèvements de sang et de tissu (après la mort) pourront être réalisés in vivo afin de doser des paramètres d’intérêt de la maladie et donc d’évaluer l’efficacité des composés administrés sur le développement de l’endométriose. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de protocole.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous suspectons une douleur persistante modérée ou sévère transitoire, et des pertes de poids transitoires, c’est pourquoi il sera classé en sévère. Ce degré sera revu suite à l’étude pilote. Nous nous attendons à observer une perte de poids transitoire chez les animaux du fait de l’inflammation générée, environ 15%, au début de l’induction de la maladie (pendant la première semaine), avec ensuite une reprise de poids. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. En début d’étude, les animaux seront randomisés pour créer des groupes homogènes en poids, ce qui sera à l’origine de remaniements des groupes. La pose de mini pompe osmotique nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur la maladie d’intérêt.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront dans la mesure du possible été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez la femme.
Réduction
Un nombre minimum de 8 souris receveuses adultes par groupe sera nécessaire pour pouvoir observer une réduction significative de l’étendue des lésions et de leur fibrose suite à un traitement. Ce nombre pourra monter jusqu’à 16 en cas d’ajout d’autres paramètres devant être mesurés comme le dosage des cytokines, d’autres colorations en histologie et/ou l’expression de gènes dans les lésions, certaines analyses étant incompatibles les unes avec les autres. Par ailleurs, on comptera une souris donneuse pour deux souris receveuses.
Raffinement
Le poids des animaux sera suivi au moins deux fois par semaine, et quotidiennement en cas de perte de poids >10%. Des mesures adaptées seront mises en place pour les animaux perdant du poids. En cas de perte de poids constatée supérieure à 10% sur certains animaux, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Une grille de scoring de douleur a été mise en place et sera raffinée après la première étude sur ce modèle. Elle sert à évaluer la douleur et le comportement des animaux.
Choix des espèces
- Les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées a minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Des femelles sevrées (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés, le modèle d’endométriose profonde étant bien décrit chez les animaux adultes.
Système rénal
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 1000
1000 souris et 1000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un millier d'entre eux réutilisés et les autres tués à l'issue. Ils subissent selon les cas une ligature d'un uretère, l'ablation des deux tiers puis de la totalité d'un rein ou des protocoles de diurèse, avec des prélèvements sanguins et une insuffisance rénale attendue, pour tester des candidats médicaments de firmes pharmaceutiques. Le porteur indique que les animaux des procédures chirurgicales sont euthanasiés pour prélever les reins, ceux d'une procédure pouvant être gardés vivants sauf si un prélèvement incompatible avec la survie est requis. Il reconnaît que des cultures cellulaires apportent des données préliminaires mais affirme qu'elles ne peuvent "entièrement suppléer" le modèle animal, faute d'environnement immunologique intact.
Objectifs
Le vieillissement de la population et l’augmentation du nombre de patients atteints de diabète ou d’hypertension artérielle entraînent une forte accélération de l’incidence des néphropathies menant à l’insuffisance rénale chronique. L’insuffisance rénale aiguë, qu’elle soit par exemple d’origine obstructive (obstruction des voies urinaires dont la cause peut-être la présence de calculs ou d’un adénome prostatique) ou toxique (intoxication médicamenteuse), est également une situation clinique fréquente. Si elle n’est pas prise en charge, une insuffisance aiguë peut rapidement évaluer en insuffisance chronique. Quelle qu’en soit l’origine, la majorité des atteintes rénales chroniques, aboutissent au développement d’une fibrose tubulo-interstitielle dont la présence signe l’évolution vers la perte de la fonction rénale. L’insuffisance rénale chronique est un enjeu majeur en santé publique. La fibrose rénale représente le trait histologique commun des néphropathies associées à une insuffisance rénale chronique évolutive. Elle se caractérise par une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire conduisant à la destruction progressive du parenchyme rénal. L’insuffisance rénale peut rapidement détériorer l’état de santé des patients (exemples : anémie, fatigue, confusion mentale, troubles psychiques, hypertension, troubles du rythme cardiaque) ou mettre en jeu le pronostic vital (exemples : œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral, les infarctus du myocarde). Comprendre et lutter contre le développement de l’insuffisance rénale et de l’apparition de la fibrose représente ainsi un enjeu scientifique et médical de la plus grande importance. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments, ou de s'assurer qu'ils ne modifient pas la fonction rénale ou n'induisent pas eux-mêmes une insuffisance rénale.
Bénéfices attendus
Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter l'insuffisance renale aiguë ou chronique. Par exemple, il n’existe pas, pour l’instant, de traitements médicamenteux établis pour traiter la fibrose rénale. Jusqu’à présent, la dialyse ou la greffe restent les seules stratégies appropriées.
Procédures
Dans les procédures chez la souris (fibrose par ligature d’un uretère, diurèse), un prélèvement sanguin terminal (sans réveil) sous anesthésie gazeuse (isoflurane) peut être réalisé. Dans les procédures chez le rat, un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (isoflurane) est réalisé juste avant l'euthanasie. Selon les besoins de l'étude (rat/souris), des prélèvements sanguins supplémentaires (fréquence selon les besoins de l'étude) peuvent être réalisés (sous anesthésie avec retour à l'état conscient). Dans ce cas, le volume prélevé sera inférieur ou égal à 15% de la volémie sanguine et ne sera répété que toutes les 2 semaines au minimum. Dans la procédure de ligature d’un uretère, une phase de chirurgie est nécessaire. Les animaux sont anesthésiés (isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une laparotomie médiane est pratiquée en condition d'asepsie. Un uretère est ligaturé. Les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Pendant la phase de récupération post-chirurgicale, les animaux reçoivent un antalgique. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la ligature de l’uretère. Dans la procédure de 5/6 néphrectomie, deux phases de chirurgie sont nécessaires. Pour chaque phase (espacée d’une semaine), les animaux sont anesthésiés (anesthésie gazeuse isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une petite laparotomie latérale est pratiquée en condition d'asepsie. Dans la première phase, le rein gauche est exposé et les 2/3 du rein sont excisés. Dans la seconde phase, le rein droit est entièrement excisé. Après chaque phase de chirurgie, les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la 5/6 néphrectomie. Dans les 3 procédures, les animaux sont traités avec la substance d’essai en une plusieurs occasions, la voie et la durée du traitement étant adaptés aux besoins de l’étude. Le traitement est généralement effectué en une occasion (procédure de diurèse) ou pendant plusieurs semaines (4 ou 12 semaines maximum après la ligature d’un uretère ou la 5/6 néphrectomie).
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédures, il est attendu une insuffisance rénale. Dans les modèles nécessitant une intervention chirurgicale (réduction de la masse rénale, ligature unilatérale d'un uretère), les animaux doivent être hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (quelques jours). Pendant les périodes de récolte de l'urine (24 heures maximum), l'isolement des animaux est nécessaire et peut aller jusqu'à 24 heures (pour la détermination de la filtration glomérulaire, les urines doivent impérativement être collectées individuellement pendant 24 heures). Après la procédure de ligature d'un l'uretère, la rétention de l'urine ou hydronéphrose peut être accompagnée de douleurs lombaires. Les stades d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde, observés chez l'homme à un stade avancé de l'insuffisance rénale nécessitant le plus souvent une greffe (d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde) ne sont pas atteints dans les procédures décrites dans ce projet (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées.
Devenir
Dans la procédure 1, les animaux peuvent être gardés en vie et réutilisés, sauf si, pour les besoins de l’étude, un volume de sang (et/ou un prélèvement d'organe) non-compatible avec la survie est nécessaire. Dans les procédures 2 et 3, les animaux sont euthanasiés, le prélèvement des reins (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.
Remplacement
En amont des tests in vivo sur des modèles d’insuffisance rénale, des tests in vitro (exemple: culture cellulaire 3D de fibroblastes) peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (mort cellulaire, prolifération des fibroblastes, modification de la matrice extracellulaire), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 6-12 animaux par groupe selon la procédure (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à tester) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général et un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le système renal du rat et de la souris dans les modèles décrits, sont prédictifs de leur efficacité en clinique. Rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et et 6 mois, conformément aux données historiques.
Génération de modèles de souris transgéniques la technologie par CRISPR / Cas9 combinée ou pas à un transgène
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
1366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1128 femelles reçoivent un traitement hormonal par deux injections pour produire des embryons, 178 autres subissent une chirurgie de réimplantation au niveau de l'oviducte et 60 mâles une vasectomie, l'ensemble servant à fabriquer de nouvelles lignées génétiquement modifiées à la demande d'équipes de recherche. Les mâles vasectomisés sont tués six à douze mois après l'opération, les femelles au moment du sevrage des portées. Le porteur affirme que seul un "organisme intégré" permet d'étudier les interactions entre cellules et tissus et présente ces souris transgéniques comme des "modèles indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste à développer de nouvelles lignées de souris transgéniques pour permettre aux chercheurs d’avoir les outils les plus adaptés à leurs études. La première étape de ce projet est de vérifier que cette lignée de souris transgéniques n’est pas disponible dans une banque internationale ou dans un laboratoire académique. En cas d’indisponibilité, le modèle de souris transgénique est alors créé dans notre service par transgénèse aléatoire ou par la technologie CRISPR/Cas9.
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes (Bradley et al., 2012, Meehan et al., 2017).
Procédures
Pour obtenir un grand nombre d’embryons, les 1128 femelles donneuses reçoivent un traitement hormonal qui consiste en 2 injections intra-péritonéales à 48h d’intervalle. Ces injections sont réalisées sur animal vigile. Les embryons sont ensuite manipulés génétiquement puis réimplantés dans 178 femelles receveuses (=mères porteuses) au niveau de l’oviducte qui est un conduit reliant l'ovaire à l’utérus, Ces femelles receveuses sont produites en accouplant des femelles avec des males vasectomisés c’est-à-dire rendus stériles. Pour obtenir ces mâles vasectomisés, 60 males subissent une chirurgie qui consiste à couper les canaux qui permettent aux spermatozoïdes de sortir du testicule. La réimplantation et la vasectomie requièrent une chirurgie qui est réalisée sous une anesthésie générale induite par une injection intra-péritonéale d’un complexe anesthésique. L’anesthésie de ces 238 animaux (178 femelles receveuses + 60 mâles vasectomisés) dure en moyenne 20 minutes. Une prise en charge de la douleur est systématiquement effectuée par une injection intra-péritonéale d’un anti-inflammatoire non stéroïdien Pour une récupération de meilleure qualité après l’anesthésie et la chirurgie, une injection sous cutanée d’une solution de réhydratation est réalisée sur les animaux opérés. Pour éviter l’hypothermie, le réveil se fait sur un tapis chauffant. Un apport de graines de tournesol et d’une nourriture enrichie en matières grasses permet d’augmenter les bien-être des femelles opérées. Il favorise ainsi un meilleur développement des gestations et une lactation de meilleure qualité pour la prise en charge des nouveaux nés L’ensemble de ces approches technologiques permettent de générer des modèles de souris transgéniques pour l’étude de mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire, le cancer ou dans des maladies immunitaires, par les équipes de recherche.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : 1- ceux liés à l’injection intrapéritonéale d’hormone. La durée des effets indésirables est limitée au moment de l’injection. 2- ceux liés à des petites chirurgies abdominales. La durée des effets n’excédera pas 24 heures.
Devenir
Vasectomie : Les mâles sont conservés pendant la période de leur plus forte activité sexuelle et seront euthanasiés 6-12 mois après leur vasectomie (selon leur aptitude d’accouplement scorée). Après 8 accouplements sans bouchon vaginal, le mâle est euthanasié. Superovulation des femelles donneuses Les femelles superovulées qui présentent un bouchon vaginal sont euthanasiées pour la récupération des embryons Toutes les femelles sans bouchon vaginal sont réutilisées pour une deuxième injection d’hormones, 2-3 semaines plus tard. Réimplantation d’embryons L’ensemble des femelles réimplantées sont euthanasiées au moment du sevrage des naissances.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de des bases de données (études in silico ) et des modèles in-vitro ( culture de cellules , organoïdes…) . En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Les nouveaux outils technologiques tel que l’électroporation combinée à des nucléases toujours plus performantes et des ARN guides commerciaux plus stables (IDT ; Synthego) ont permis de diminuer par un facteur 2 le nombre de séances nécessaires à l’obtention de modèles Knock-Out et de petits Knock-In. Le nombre de naissance a été augmenté en changeant notre approche pour la réimplantation. Une réimplantation bilatérale sur une femelle unique est désormais effectuée en routine (Mahabir E et al 2018) Pour les grands Knock-In, un test d’efficacité de coupure des ARN guides est effectué sur un test in-vitro. Une analyse sur blastocyste unique est réalisée et permet d’éviter d’avoir recours à des femelles réimplantées et des naissances. À la suite de ces tests, une séquence d’ARN guide est choisie. Le plasmide donneur sera alors élaboré en fonction des résultats de ce test. L’expérimentation in-vivo (Injection des embryons avec mélange contenant le plasmide donneur / ARN guides / Cas9) sera alors réalisée avec réimplantation des femelles pseudogestantes.
Raffinement
L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale. Injection IP d’un mélange Xylazine (7.5mg/kg), kétamine (40 mg/kg) et flunitrazépam (0.5 mg/kg) dans du NaCl 0.9%, à raison de 50 μL pour 10g. Ce mélange permet une anesthésie assez longue et profonde ce qui permet de réaliser l’opération dans de bonnes conditions pour l’animal. L’effet analgésique de la Xylazine est utilisé pour soulager la douleur. En complément à la Xylazine, une injection de Rimadyl est effectuée pour une meilleure prise en charge de la douleur. A la fin de l’intervention avant de refermer la paroi musculaire, du Carprofène (Rimadyl) est administré dans la cavité abdominale à raison de 1mg/ml dans NaCl 0.9% à raison de 100µl pour 20g de souris.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée (superovulation efficace et embryons faciles à injecter) Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. En fond mixte B6D2 (C57BL6 x DBA/2), les femelles donneuses ont 8 semaines ce qui permet une quantité et une qualité optimale des embryons. En revanche pour un fond pur C57BL6/J ou N, les femelles ont 4 semaines pour l’obtention d’un plus grand nombre d’embryons avec une qualité correcte. Nous utilisons femelles pseudogestantes NMRI entre 8 et 24 semaines. Les mâles stériles NMRI (vasectomisés) utilisés pour les accouplements ont entre 2 mois et 12 mois.
Une thérapie pharmacologique pour une maladie rénale génétique chez l’embryon de souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
35 souris femelles gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue avec leurs embryons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque femelle reçoit quatre gavages en contention vigile pour tester des médicaments sur une maladie rénale génétique, puis est tuée pour prélever les embryons, eux-mêmes tués pour en prélever les reins. Le porteur affirme qu'aucune souffrance n'est attendue et que les composés ont déjà été testés sur cultures cellulaires. Il conclut qu'il est "indispensable" de tester l'effet des composés à la période de développement rénal de l'embryon.
Objectifs
Chez l’homme, la déficience génétique dans un gène qui code pour un facteur de transcription mène à une insuffisance rénale. A l’heure actuelle, pour cette maladie rare il n’y a pas de thérapie en dehors de la transplantation et la dialyse. Les patients qui souffrent de cette maladie génétique ont sont caractérisés par une activité insuffisante de la protéine codé par ce gène. Suite à nos études, nous avons identifié plusieurs médicaments (normalement utilisés pour d’autres pathologies) qui ont la capacité d’augmenter l’activité de ce gène dans des lignées cellulaires in vitro. L’objectif de notre projet de recherche est de vérifier l’efficacité de nos 3 meilleurs composés qui se sont caractérisés par une importante stimulation de l’activité de ce gène pour vérifier si ces médicaments améliorent les défauts rénaux liés à sa déficience dans un modèle murin de la maladie.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons de pouvoir mesurer l’effet du traitement de ces médicaments sur le degré d’avancement du développement rénal sure des tissus prélevés. Ces mesures seront effectuées par 1) analyse d’image 2) Quantification du niveau d’expression des ARN messagers codants pour les gènes cibles principales de qui sont normalement réprimés 10 fois dans le rein entier en développement d’un embryons par rapport à un embryon contrôle.
Procédures
Nous allons traiter 35 femelles mères porteuse. Chaque souris sera soumise à 4 procédures de gavage (en état vigile en contention) d'un médicament (ou du placebo). Chaque procedure de gavage va durer moins de 3 minutes.
Impact sur les animaux
En dépit du retard développemental observé avant la naissance, la grande partie des souris muntants dans leurs vies post natale arrivent à développer une fonction rénale normale et par conséquence ne développent pas de souffrances. D’autre part, pour ce qui concerne les médicaments qu'on doit tester, des études récentes ont montré que ces composés, administrés par gavage à ces doses, ne provoquent pas de conséquences visible sur le bienêtre des animaux.
Devenir
Tous les animaux utilisé dans ce protocol seront mis à mort a la fin des procédures. En effet, le prelevement des embryons pendant leur développpemnt nécessite la mise à mort des mères porteuses. Le prelevement des reins embryonnaires pendant leur développpemnt nécessite la mise à mort des embryons.
Remplacement
Remplacement : La complexité du rein et de la maladie rénale nécessite l’utilisation d’un modèle animal. Mais les molécules à l'étude de ce protiocole ont préalablement été testées sur des cultures cellulaires ce qui nous permet d’envisager une gamme d’efficacité sans toxicité pour les animaux.
Réduction
Réduction : nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet.
Raffinement
Comme chez l’homme, les maladies rénales restent longtemps silencieuses et le modèle murin qu'on va adopter ne comporte pas de souffrance spécifiquement liée à la déficience rénale. En tout cas, les animaux seront mis à mort avant l’apparition de symptômes douloureux. Une surveillance quotidienne sera effectuée auprès des animaux afin de s’assurer de leur bien-être constant en se référant à une grille de points limites. Pour compléter cette surveillance les souris seront pesée chaque jour pendant le traitement. Si les souris depassent un niveau de score 1 pour l'évaluation de leur apparence physique ou de leur comportement (comme indiqué dans la description de la procédure expérimentale de l'état du bien-être des souris), on mettra en place l’administration d’un antalgique. En cas de dépassement du point limite, on choisira la mise à mort de l’animal. Les animaux bénéficieront d’un programme d’enrichissement, comme des carrés de cellulose, des bâtonnets de bois ou une maisonnette, défini par la cellule de l’établissement chargée de leur bien-être. Les animaux bénéficieront d’un programme d’enrichissement, comme des carrés de cellulose, des bâtonnets de bois ou une maisonnette, défini par la cellule de l’établissement chargée de leur bien-être.
Choix des espèces
Le developpement rénal chez la souris est un excellent modèle experimentale qui se rapproche à celui de l'homme. Le modèle murin étudié developpe spécifiquement un retard de developpement rénal à 14 jours après conception. Il est donc indispensable tester l'effet de nos composés à cette période.
Evolution de la menstruation chez les primates
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Babouins : 6
Singes écureuils : 6
Capturées à la main deux à trois fois par semaine et anesthésiées à chaque fois pour une prise de sang et un frottis vaginal, 6 femelles ouistitis et 6 femelles singes écureuils subissent ensuite l'ablation de l'utérus, avec un risque d'hémorragie interne, d'abcès ou d'éventration. Au total, 18 femelles primates, dont 6 femelles babouins soumises sous anesthésie à une biopsie par raclage, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes restent en vie dans leur groupe social d'origine. Le projet doit retracer l'évolution de la menstruation chez les primates, et le porteur écrit qu'il servira aussi à évaluer si l'utilisation de primates non-humains comme "modèles de recherche" pour l'endométriose "est pertinente". Les ouistitis et les singes écureuils ont été retenus, explique-t-il, parce qu'ils n'ont pas de menstruation, comme point de comparaison avec les babouins.
Objectifs
Les objectifs du projet sont la caractérisation au niveau cellulaire, génétique et fonctionnel de l’évolution de la menstruation chez les primates. Ce projet répond à une question cruciale mais sous-étudiée liée à l’évolution de l’espèce humaine, ayant des conséquences sérieuses au niveau médical.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser les réseaux moléculaires mis en jeu lors du cycle hormonal et de la menstruation à l'état sain chez les primates, et d'évaluer leur conservation entre espèces. La caractérisation de cet état sain est une base indispensable à la compréhension des mécanismes pathologiques, et pour évaluer si l'utilisation actuelle de primates non-humains comme modèles de recherche pour les maladies telles que l'endométriose est pertinente.
Procédures
Babouins : Le suivi des cycles des 6 femelles babouins se fait par observation (non-invasive) pendant 3 mois. Le jour de la biopsie par raclage les animaux seront capturés dans leurs enclos respectives à l’aide des tunnels de capture et transférés dans des cages à fond amovible pour être anesthésiés avant de suivre la biopsie. La durée de la capture peut prendre 30 minutes. La durée de la biopsie, 1 heure. Ouistitis et Singes écureuils : Le suivi des cycles des 6 femelles ouistitis et 6 femelles singes écureuils se fait par dosage sanguin de la progestérone et suivi de l’indice caryopyknotique de l’épithélium vaginal. Les animaux doivent être capturés entre 2 et 3 fois par semaine(les prélèvements pourront être plus espacés lors du suivi du 2ème et 3ème cycle selon la concordance aux valeurs de références) pour faire un prélèvement sanguin à faible volume et un frottis vaginal. Les animaux seront capturés manuellement. L’ensemble des prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. La durée normale de l’intervention est de 10 minutes (maximum 30 minutes). Les 6 ouistitis et singes 6 écureuils subiront une hystérectomie. Le temps d’anesthésie générale requis pour une hystérectomie chez une petite espèce comme le Singe écureuil ou le Ouistiti est de une heure maximum. (avec un temps de préparation de l’animal d’environ 30 minutes et environ 30 minutes d’acte chirurgical pur).
Impact sur les animaux
Babouins : Le suivi des cycles des femelles babouins se fait par observation (non-invasive). La biopsie par raclage est un acte bien maîtrisé et peu invasif et n’induira pas de douleur importante apparente. Dans ce genre d’intervention le risque d’hémorragie est minime. Cependant en cas d’hémorragie la manipulation sera directement arrêtée. L’animal sera pris en charge directement par l’équipe vétérinaire de l’établissement. Ouistitis et Singes écureuils : Le suivi des cycles des femelles ouistitis et singes écureuils se fait par dosage sanguin de la progestérone et suivi de l’indice caryopyknotique de l’épithélium vaginal. Les animaux doivent être capturés dans leurs enclos entre 2 et 3 fois par semaine (les prélèvements pourront être plus espacés lors du suivi du 2ème et 3ème cycle selon la concordance aux valeurs de références) pour faire un prélèvement sanguin à faible volume et un frottis vaginal. Les animaux seront capturés manuellement. Ce geste est très bien maîtrisé par l’établissement. À part de le stress lié à ce type de manipulation, aucun effet indésirable cumulatif n’est attendu sur ces animaux. L’ensemble des prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Le protocole anesthésique est un protocole fiable et sûr car il est réalisé en routine dans l’établissement. Les prélèvements se feront sur la veine fémorale principalement mais d’autres veines pourraient être utilisées telles que les veines saphènes, jugulaire et céphalique pour éviter l’apparition d’hématomes importants. Les ouistitis et singes écureuils subiront une hystérectomie. Plusieurs complications post-chirurgicales peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (hématomes, infections urinaires, surinfections de la plaie chirurgicale (abcès), hémorragies internes ou encore éventration). Les actes pré-opératoires, opératoires et post-opératoires sont réalisés de sorte à minimiser les risques de survenue de ces complications. Toutefois, en cas de complications septiques de plaies une antibiothérapie à large spectre sera initiée (Amoxicilline/Acide clavulanique 15 mg/kg BID PO ou 15 mg/kg IM tous les 2 jours). Dans le cas d’autre complications, l’animal sera immédiatement pris en charge par l’équipe vétérinaire de l’établissement. Dans tous les cas l’animal sera isolé et surveillé par l’équipe vétérinaire de l’établissement jusqu’à récupération complète.
Devenir
Tous les femelles seront gardées en vie et dans leurs groupes sociaux d’origine après chacune des procédures.
Remplacement
La menstruation est un phénomène tissulaire complexe qui ne peut pas être étudié fonctionnellement sur des cellules en culture. L’étude du transcriptome et des régions de régulation de la transcription nécessite l’utilisation d’échantillons de tissus prélevés directement sur les animaux avec un suivi strict du cycle hormonal. Il n’existe pas de banque de tissu pour cet organe en ces conditions.
Réduction
Pour chaque espèce nous utiliserons 6 individus (soit 18 animaux au total). 3 femelles seront prélevées dans la phase lutéale et 3 femelles en fin de cycle (menstruation ou phase équivalente pour les espèces non menstruantes). Ce nombre correspond au nombre minimum de réplications par espèce nécessaire à l'interprétation des résultats de l'étude.
Raffinement
Tous les prélèvements de tissu se feront sous anesthésie générale et couverture antalgique. Pour les babouins, la biopsie se fera par raclage en minimisant au maximum le stress pour l’animal et l’invasivité du prélèvement. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par notre responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal.
Choix des espèces
La menstruation est présente seulement chez certains primates. Nous avons sélectionné pour l’étude cinq primates non-humains et l’Homme. Chez les Cercopithecinae, un clade proche phylogénétiquement de l’Homme, nous trouvons des espèces avec menstruation (e.g. babouin olive, macaque rhésus). Dans la super-famille Ceboidae, incluant des espèces plus éloignées phylogénétiquement, nous trouvons des espèces sans menstruation comme le Singe écureuil et le Ouistiti commun. Cette configuration nous permettra de mettre en évidence les différences fonctionnelles qui sous-tendent l’apparition des menstruations chez les primates en tenant compte de la structure de l’arbre phylogénétique. L'étude nécessitant des échantillons de tissu utérin à la fin du cycle menstruel, tous les animaux utilisés sont des adultes en âge de procréer.
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle d’endométriose induite par administration de LPS chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 450
Une chirurgie abdominale de dix minutes sous anesthésie, puis, selon les études, jusqu'à quatorze injections ou vingt-huit administrations par la bouche des molécules testées, enfin un prélèvement de 500 µL de sang derrière l'œil juste avant la mise à mort : 1 800 rongeurs, 1 350 souris et 450 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le projet teste des molécules anti-inflammatoires sur une endométriose induite par administration de LPS, dont la mise en place provoque, selon le porteur, des "douleurs inflammatoires" liées à la maladie et à la chirurgie, repérées aux expressions faciales des souris et des rats. En cas de signes de souffrance, la buprénorphine "pourra être administrée" à partir d'un score cumulé de 2, et la mise à mort intervient à 4, ou dès que l'un des scores atteint 2. Les souris et les rats qui n'atteignent aucun point limite sont tués entre 24 heures et 14 jours après l'induction de la maladie, selon la molécule, pour prélever organes et tissus.
Objectifs
L’endométriose est une maladie caractérisée par la présence anormale de tissu utérin en dehors de la cavité utérine pour laquelle il n'existe aucun traitement aujourd'hui. Cette anomalie engendre des lésions composées de cellules qui possèdent les mêmes caractéristiques que celles de la muqueuse utérine (l’endomètre) et se comportent comme elles sous l’influence des hormones ovariennes. Il s’agit d’une maladie gynécologique fréquente, retrouvée chez 10% des femmes. Les symptômes induits par l’endométriose sont le plus souvent des douleurs et une infertilité. Un examen clinique et échographique, voire par IRM, permet de détecter une endométriose, même si le diagnostic définitif doit passer par l’analyse du tissu endométrial prélevé au cours d’une chirurgie. Une endométriose asymptomatique, non douloureuse et qui ne pose pas de problèmes de fertilité n’est en général pas détectée et donc pas traitée. Dans un cas d’une endométriose douloureuse, un traitement hormonal sera proposé en première intention destiné à supprimer les règles (contraceptifs œstroprogestatifs monophasiques en continu, progestatifs, danazol ou analogues de la GnRH (gonadotropin releasing hormone)). Ce traitement réduit les douleurs liées à la réponse hormonale des lésions d’endométriose et peut permettre de stabiliser les lésions, voire de diminuer légèrement leur volume. Dans certains cas où le traitement hormonal n’est pas suffisant, un traitement qui provoque une ménopause artificielle peut-être mis en place (injection d’analogue de la LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone); hormone destinée à stopper la production d’oestrogènes). Lorsqu’il y a échec du traitement médical (persistance des lésions et/ou nombreux effets indésirables), la chirurgie reste le seul traitement permettant l’élimination des lésions associées à l’endométriose de façon ponctuelle permettant ainsi à la patiente d'envisager une grossesse. Aucun traitement (hormonal ou chirurgical) ne permet à ce jour de guérir de l’endométriose. Il est donc urgent d’identifier des candidats médicaments efficaces et avec peu d’effets indésirables. Ce projet a pour but de tester des nouvelles molécules à visées thérapeutiques (à caractère anti-inflammatoire) dans un modèle in vivo d'endométriose induite par administration de LPS (lipopolysaccharides) (Xiaofei Ma ,et al. 2021). Le projet pourra comporter jusqu'à 20 études (5 études rat + 15 études souris), inculant au maximum 90 animaux, soit 1800 animaux au total.
Bénéfices attendus
L’inflammation joue un rôle prépondérant dans la progression de l’endométriose. Une augmentation de la production de prostaglandines, de certaines cytokines pro-inflammatoires et de facteurs de croissance susceptibles d’induire inflammation, néo-angiogenèse et prolifération d’implants endométriosiques dans la cavité péritonéale, a été observée chez des femmes présentant une endométriose. Ces processus inflammatoires sont largement responsables de l’apparition des douleurs. A ce jour, aucune molécule anti – inflammatoire spécifiquement indiquée dans le traitement de l'endométriose n’est proposée. Les traitements actuellement proposés sont destinés à soulager les douleurs incluant notamment, des antalgiques, des antispasmodiques, des AINS, des traitements hormonaux (progestatifs et œstroprogestatifs) qui vont interrompre le cycle ovulatoire responsable des poussées douloureuses. Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules à caractère anti-inflammatoire dans un modèle d'endométriose induit par administration de LPS. Afin de déterminer si une molécule candidat a un potentiel dans ce modèle, plusieurs prélèvements d'organes/tissus seront ensuite effectués pour des dosages immunologiques, analyses histologiques, extraction d'ARN. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées.
Procédures
Une seule chirurgie abdominale sous anesthésie générale (par injection intrapéritonéale de xylazine/kétamine + une injection sous cutanée de lidocaine) ou sous isoflurane (+ une injection sous-cutanée de buprénorphine + une injection sous cutanée de lidocaine). Le temps des injections est de 3 secondes/injection. La chirurgie dure 10 minutes par animaux. Les animaux se réveillent 45 minutes après la chirurgie dans le cas d'une anesthésie générale par injection de xylasine/kétamine ou dans le cas d'une chirurgie sous isoflurane, les animaux se réveillent environ 5 minutes après avoir retiré l'isoflurane. Un prélèvement de sang rétro orbital (500μL, durée du prélèvement 30 secondes) sous isoflurane (2-3%) sera effectuée une seule fois juste avant la mise à mort. En ce qui concerne les traitements (voie d'administration variable en fonction des études): -Administration Intra-péritonéale: 1 fois par jour maximum, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 14 administrations, durée : 3 secondes/injection -Administration intra -veineuse: Nombre d’administration: 2/semaine espacé de 2 jours, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 4 administration, durée : 3 secondes/injection -Administration orale: 1 à 2 fois par jour maximum, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 28 administrations, durée : 3 secondes/administration -Administration sous-cutanée: 1 fois par jour maximum, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 14 administrations, durée : 3 secondes/injection -Administration Intra-nasale ou intra-trachéale: 1 fois par jour maximum, nombre maximal d’injection durant l’étude: entre 1 et 14 administrations, durée : 3 secondes/administration
Impact sur les animaux
L'animal utilisé est la souris (C57BL/6 ou BALB/c) ou le rat (WISTAR ou SPRAGUE DAWLEY). Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie ainsi qu'à la chirurgie. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation. La douleur utilise les expressions faciales chez la souris (Langford, 2010): - Rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, - Renflement du nez - Renflement des joues - Positionnement des oreilles vers l'arrière - Changement de position des vibrisses qui peuvent être regroupées vers l’arrière ou hérissées en avant. Chez le rat, les quatre expressions faciales caractérisant la douleur ayant été retenues sont : - Rétrécissement des orbites oculaires avec paupières mi-closes à fermées, - Aplanissement du nez et des joues avec éventuellement disparition de la ridule entre le nez et les joues, - Changement de position des oreilles qui s’orientent vers les côtés ou en arrière ce qui peut entraîner une augmentation de l’espace entre les oreilles, - Changement de position des vibrisses qui ont tendance à se regrouper. Outre ces expressions faciales, la douleur pourra générer une perte de poids qui sera suivi quotidiennement et retranscrite par un score défini dans la grille de scores du suivi journalier. Ces études permettront d'étudier l'efficacité in vivo des molécules testées sur le développement de la maladie (signes cliniques) et l'inflammation de l'utérus.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation.
Remplacement
Remplacement : Les études in vitro ne permettent pas l’étude des interactions systémiques (hormonales, inflammatoires ou immunitaires) intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans l’endométriose demande l’étude d’un organisme complet. De plus, il est observé chez les femmes de nombreuses variabilités individuelles. Il n’existe pas une mais des endométrioses, et travailler sur un organisme vivant permet d’introduire un peu de variabilité individuelle (dans la limite génétique) qui serait complètement inexistante dans les études in vitro.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Le test statistique utilisé sera un test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post test de Dunns de comparaison multiple et un Two-way ANOVA suivi par un post-test de Dunnett de comparaison multiple pour les suivis de poids. Les analyses statistiques sont réalisées avec Graphpad Prism, V7.
Raffinement
La partie chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale xylazine/kétamine et de la lidocaine sera administrée quelques minutes avant l'ouverture du plan cutané. Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer du bien-être des animaux et détecter la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux montrent des signes de souffrance (point limite décrit dans la Procédure), de la buprénorphine pourra être administrée (si score cumulé de 2 atteint) ou ils seront mis à mort (si score cumulé atteint 4 ou si un des scores atteint 2). Si aucun point limite n'est atteint, les animaux seront mis à mort entre 24h à 14 jours après induction de la maladie selon les études (Ce temps dépendra de la pharmacocinétique des molécules candidats). Les souris/rats seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du Celuron. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Des capsules de gel hydratant seront déposées dans les cages 24h avant la chirurgie afin de palier à la légère déshydratation des animaux (miction accrue car myorelaxation, pertes liées à la chirurgie, diminution de la prise hydrique) suite à la chirurgie. Elles seront retirées 24h après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris (C57BL/6 ou BALB/c) ou le rat WISTAR est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Au sein d’un même étude les animaux proviendront du même fournisseur afin de réduire les variabilités. L’utilisation de lignées consanguines permet de supprimer l’hétérogénéité génétique entre les individus étudiés, de réduire les fluctuations phénotypiques incontrôlées qui caractérisent les études effectuées sur des populations naturelles. Nous utiliserons des souches (C57BL/6 ou BALB/c pour la souris WISTAR pour le rat) mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 8 semaines) afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
Evaluation de l’effet de l’administration vaginale de probiotiques ou de post-biotiques sur les infections vaginales bactériennes
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles urogénitaux
6 912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit une infection vaginale expérimentale par des bactéries pathogènes, jusqu'à vingt administrations intra-vaginales et huit lavages par animal, des prélèvements sanguins et des injections d'œstradiol. Il indique que l'infection provoque une inflammation locale, une gêne et des démangeaisons, et que les administrations répétées peuvent l'aggraver. Il affirme que la complexité de l'écosystème vaginal rend le modèle animal "indispensable" pour prolonger des résultats déjà obtenus in vitro.
Objectifs
La sphère vulvo-vaginale est un écosystème fragile dont la bonne santé dépend de plusieurs composantes, notamment son microbiote, l'immunité et l'état de santé de son hôte et de nombreux paramètres externes (pollution, médicaments, hygiène de vie, etc.). La rupture de cet équilibre peut entrainer la survenue d'épisodes infectieux, souvent récurrents, qui ont un impact négatif sur la qualité de vie et peuvent également constituer des facteurs de risque pour d'autres problèmes de santé plus graves (difficultés à la procréation, cancers gynécologiques). Si l'antibiothérapie est une approche thérapeutique efficace, les effets secondaires de ces médicaments, tant sur l'hote que sur l'environnement (antibiorésistance) rendent pertinent l'usage de thérapies complémentaires. Parmi elles, l'utilisation de probiotiques per os ou localement est déjà documentée comme étant efficace pour prévenir la survenue de ces infections ou faciliter le retour de la flore vaginale à un équilibre physiologique après un traitement. Le projet consiste donc à déterminer et à quantifier l'effet de l'administration vaginale de probiotiques ou de post-biotiques (i.e., produits actifs dérivés de probiotiques ou de parties de probiotiques dépourvus de vitalité) sur la sévérité et la cinétique d'infections vaginales bactériennes par des pathogènes bactériens représentatifs de ceux les plus souvent identifiés dans les vaginites bactériennes chez la femme. Pour cela, une infection vaginale avec un de ces pathogènes sera réalisée expérimentalement chez la souris, classiquement utilisée pour ces approches exérimentales en raison de l'existences de données scientifiques sur des modèles similaires. L'effet de l'administration locale de différentes préparations de probiotiques ou post-biotiques, préventive ou curative, sera évalué en mesurant l'évolution de paramètres physiopathologiques pertinents, notamment la charge bactérienne au cours de l'infection, sa durée, la sévérité de l'inflammation développée par l'hôte (paramètres sanguins ou locaux), et l'évolution de la flore vaginale.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de collecter et de comparer les données décrivant l'efficacité de différentes modalités de traitement (cinétique, présentation galénique et formulation) sur les infections vaginales bactériennes. Ces données permettront de supporter le développement et/ou l'usage de produits ou futurs produits de santé à usage gynécologique chez la femme et contribuer à limiter l'usage des antibiotiques et/où à limiter leurs effets secondaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations intra-vaginales et à des lavages vaginaux. Chaque animal sera soumis à un maximum de 20 administrations (absence de manipulation pendant le week-end) et 8 lavages vaginaux. Des prélèvements sanguins caudaux pourront être réalisés tous les 7 à 14 jours en adaptant le volume prélevé à la fréquence de prélèvement. Les injections hebdomadaires d'oestradiol sous-cutanées seront répétées au maximum 4 fois. Chaque acte a une durée ne dépassant pas 1 minute et l'ensemble des procédures est réalisé sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les bactéries pathogènes administrées aux animaux sont susceptibles de provoquer une inflammation locale modérée pouvant entrainer une sensation de gêne et des démangeaisons. Les différents traitements à évaluer ainsi que leurs véhicules (solution saline ou matrice lipidique) sont connus pour être bien tolérés y compris au niveau des muqueuses. L'administration répétée peut éventuellement entrainer/aggraver une inflammation locale. Ces effets indésirables seront surveillés et évalués selon les critères présentés dans la section ad hoc.
Devenir
Les animaux étant hébergés dans une animalerie de confinement A2 et/ou étant exposés à des pathogènes de classe 2, ils seront euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
Des expériences sur modèles in vitro ont déjà prouvé la pertinence de l'approche scientifique et donné des résultats positifs. Cependant, la physiologie de l'écosystème vulvo-vaginal et sa physiopathologie sont l'expression de nombreux facteurs et mécanismes tels que l'immunité de l'hôte, son microbiote vaginal, leurs influences mutuelles réciproques ainsi que les intéractions de ces deux composantes avec les agents pathogènes étudiés. Une telle complexité ne saurait être reconstituée avec pertinence dans des modèles non-in vivo. L'utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour transférer les concepts déjà établis in vitro à la physiopathologie animale puis humaine.
Réduction
La variabilité des réponses à l'infection et au traitement, notamment au niveau de l'évolution du microbiote vaginal, justifie une taille de goupe expérimental de 12 animaux par condition. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus. Cependant, une partie des variables expérimentales (temps de traitement, doses, formulations, etc.) sont déjà définies par l'expérience interne du laboratoire ainsi que par les données de la litterature, limitant le recours à des ajustements des protocoles et à des mises au point.
Raffinement
Le regroupement des actes quotidiens (administrations, pesées), et l'observation attentive de critères précis permettent de réduire le stress et la souffrance des animaux à leur minimum. Les administrations et lavages vaginauxs ainsi que les injections sous-cutanées sont des actes rapides qui seront réalisés sur animaux vigiles par du personnel expérimenté à ces procédures.
Choix des espèces
Sur les critères de la facilité d'hébergement et de manipulation, et de la pertinence scientifique du modèle basée sur les travaux publiés dans la littérature scientifique, la souris est l'espèce la plus adaptée au développement de ce projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes sexuellement mâtures (début des procédures à l'âge de 6-7 semaines).
Evaluation in vivo d’un nouvel agent immunothérapeutique dans les cancers de la vessie
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent chaque semaine, jusqu'à six semaines, une injection intra-uréthrale sous anesthésie et des prélèvements d'urine, pour tester un agent immunothérapeutique contre le cancer de la vessie. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer une inflammation urinaire et un affaiblissement de l'état général. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", aucun autre modèle n'évaluant les effets à l'échelle de l'organisme.
Objectifs
Le cancer de la vessie se classe au 10e rang des cancers les plus courants selon le Centre international de recherche sur le cancer. Les malades sont traités via une approche multidisciplinaire (chirurgie avec radiothérapie, chimiothérapie ou immunothérapie). En particulier, l’immunothérapie par instillation intravésicale du Bacillus Calmette-Guerin (BCG), initiallement utilisée pour la vaccination contre la tuberculose, est fréquente. Elle a des effets prouvés sur la réduction des récurrences et de progression de la tumeur. Ces effets du BCG résultent d'une interaction entre les effets directs sur les cellules tumorales du BCG et de la réponse immunitaire de l'hôte conduisant à la production de cytokines et à la destruction des cellules tumorales. Néanmoins, ce traitement a encore des effets cliniques insatisfaisants, justifiant le développement de nouvelles thérapies. Ainsi, ce projet de recherche vise à établir une preuve de concept pour une stratégie immunothérapeutique anticancéreuse à partir de vésicules de membranes externes (ou VME en abrégé) naturellement produites par des souches d’E. coli. Des expériences ont été menées dans des lignées cellulaires modèles humaines de cancer de la vessie et dans une lignée cellulaire contrôle de vessie peu transformée afin de mesurer l'impact du traitement par les VME sur la prolifération et la survie cellulaire. Il est maintenant indispensable de vérifier l'innocuité et l'efficacité des VME par des expériences in vivo dans un modèle murin car les expériences sur cultures cellulaires ne prennent pas en compte toute la complexité d’un organisme intégré. Nous évaluerons l’innocuité du traitement en instillant des VME dans la vessie de souris saines (même protocole que pour le BCG, cette technique est maitrisée par notre équipe). Si ce traitement s’avérait toxique (ce qui est peu probable au vu des résultats obtenus avec le BCG et étant donné que le traitement est purement local), nous pourrions alors utiliser une souche bactérienne beaucoup moins toxique et disponible au laboratoire. Cette dernière souche est à réserver en dernier recours, car étant moins toxique, elle est aussi bien moins immunostimulante et est donc moins susceptible d'être efficace contre les tumeurs. Puis, en utilisant deux modèles de cancer de la vessie (induits soit par l'ingestion d'un agent carcinogène soit par une infection par un agent uropathogène), nous évaluerons l'impact d'un traitement par les VME sur les cancers de la vessie.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre d'établir une preuve de concept concernant l’efficacité d’un traitement par des VME sur les cancers de la vessie en évaluant d'une part leur inocuité sur l'animal sain et d'autre part leur(s) effet(s) sur le développement de lésions cancéreuses peu évoluées et sur la régression de tumeurs établies.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés une fois par semaine par anesthésie injectable (Ketamine-100mg/kg/Xylazine- 10mg/kg, i.p., 10ml/kg) ou anesthésie gazeuse (4% isoflurane), pendant au maximum 6 semaines, afin de réaliser l'injection de VME ou de produits contrôles (liquide physiologique, etc...) par voie intra-uréthrale via un catheter adapté. Chaque injection durera 1 à 2 minutes. Des prélèvements d’urine par miction spontanée (quelques gouttes recueillies dans un tube eppendorf) seront réalisés une fois par semaine pendant au maximum 6 semaines.
Impact sur les animaux
Certaines procédures expérimentales prévues génèrent chez la souris un développement tumoral pouvant entraîner une souffrance chez l'animal avec des effets locaux (inflammation au niveau de l'appareil urinaire par exemple) et des effets systémiques (affaiblissement de l'état général par exemple).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer les lésions éventuelles, notamment au niveau de la vessie (réalisation de scores macro- et microscopiques)
Remplacement
Nous avons déjà réalisé de nombreuses validations in vitro et in cellulo de manière à garantir la qualité des VME utilisées à des fins de stratégie anti-cancéreuses. Nous allons continuer à étudier leur effet sur des lignées cellulaires modèles. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ne permet d’évaluer les répercussions d’un tel traitement à l’échelle d’un organisme (évaluation de l’éventuelle toxicité systémique – non attendue-, et de l’efficacité sur la régression tumorale). Une veille scientifique sera mise en oeuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Des expériences préalablement réalisées avec ce modèle permettent d'estimer de manière optimale le nombre d'animaux requis. Ce projet nécessite l’utilisation de 610 souris âgées de 6 semaines car il est indispensable de réiterer les expériences 3 fois de manière indépendante pour garantir la robustesse des résultats. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) et une méthode non invasive d'échographie sera appliquée pour suivre la progression tumorale au cours du temps et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les cages possèdent des cabanes dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées de manière à apaiser les animaux. Le change de la litière sera effectué toutes les semaines. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable et le modèle plus décrit pour l’étude du cancer de la vessie. En particulier, les lésions néoplasiques liées aux cancers de la vessis développées dans cette espèce animale sont très similaires à celles développées chez l'homme, ce qui rend ce modèle particulièrement intéressant pour l'étude de cette maladie. Nous utilierons des souris de 7 à 8 semaines. Dans la littérature, les souris soumises au carcinogène (BNN) sont classiquement âgées de 5 à 6 semaines, âge auquel elles sont considérées adultes. Nous prenons une marge de deux semaines pour permettre l’acclimatation.
Evaluation de l’efficacité de produits à visée antiadhérente dans un modèle de chirurgie des cornes utérines chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
96 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque ratte subit une laparotomie et une chirurgie des cornes utérines pour tester des produits anti-adhérence, l'opération abdominale pouvant provoquer des douleurs post-opératoires, avant d'être tuée pour prélever ses cornes utérines. Le porteur indique utiliser les deux cornes de chaque animal pour tester deux produits et réduire ainsi le nombre de rattes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou sur une autre espèce ne convient et que les produits ont été présélectionnés par méthode alternative.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer l'efficacité de produits anti-adhérence, destinés à la prévention de la formation d’adhésions intra-utérines post chirurgie. L’efficacité au niveau des cornes utérines sera réalisée en ex-vivo par imagerie médicale (scanner micro CT) et en histologie. Ces études, réalisées sur des rattes, ont pour but d’évaluer l’effet protecteur de différents produits anti-adhérence en comparaison à un produit de référence déjà présent sur le marché. Ce modèle in vivo est représentatif à la fois des adhérences observées après des chirurgies des cornes utérines chez la femme, mais également des modalités d’administration du futur produit chez le sujet traité. Les analyses par imagerie µCT permettrons d’évaluer les structures luminales de l’utérus et ainsi visualiser et localiser les potentiels adhérences. Ces analyses seront complétées par des analyses histologiques en fin de phase expérimentale.
Bénéfices attendus
Les adhésions sont une complication commune après de nombreuses chirurgies, incluant les chirurgies gynécologiques. Les adhésions post chirurgies peuvent entrainer des problèmes médicaux importants, comme l’infertilité, de la douleur chronique ou une perte de fonction. Des produits anti-adhérences peuvent ainsi aider à prévenir ou réduire le risque d’adhérences post-chirurgie en créant une barrière entre les tissues et l’organe pendant le process de réparation. Ce modèle animal permet de mimer ce qui est observer chez les femmes et ainsi tester de nouveaux produits. Ainsi, les dommages potentiellement infligés à un nombre restreint d’animaux lors de ces études sont justifiés au regard des futurs bénéfices éventuels dont pourront profiter les patientes présentant des adhérences intra-utérines.
Procédures
Tous les animaux subiront une laparotomie en vue d’une chirurgie des cornes utérines (à l’exception de l’animal contrôle chirurgie qui ne subira qu’une laparotomie) pour administration locale des produits anti-adhérence sous anesthésie générale réalisée par un chirurgien vétérinaire compétent.
Impact sur les animaux
Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de produits anti-adhérence sur les tissus intra-utérins post-chirurgie. La chirurgie abdominale (laparotomie) peut entrainer des douleurs post-opératoires. Une surveillance poussée des plaies abdominales et l’utilisation d’analgésiques est donc prévus pendant la durée nécessaire au rétablissement des animaux.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les cornes utérines et analyser les adhérences des tissus post-mortem via des analyses d’imagerie à rayons X et histologiques.
Remplacement
L’étude in-vivo chez le rongeur est la meilleure alternative en en termes de modèle chirurgical et de sélection de nouveaux produits candidats. La procédure expérimentale décrite dans le présent projet ne dispose pas de modèle in-vitro ou in-vivo sur une espèce alternative. Les produits tests ont été préselectionnés par méthode alternative in-vitro.
Réduction
L’utilisation des 2 cornes utérines de chaque ratte permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation de l’organe et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes.
Raffinement
Afin d’éviter les phénomènes d’automutilation qui peuvent survenir suite à la chirurgie, une période d’acclimatation est prévue. Les animaux bénéficieront de 12 jours d’acclimatation minimum dont une période d’habituation de 7 jours minimum permettant aux groupes sociaux de se faire plusieurs jours avant la chirurgie. De plus, une surveillance accrue et quotidienne des rattes pendant 7 jours après la chirurgie (avec observation clinique de l’état général, observation des plaies abdominal, pesées) et l’utilisation d’analgésique pendant 3 jours après la chirurgie est prévu afin de prévenir et réduire la douleur post-chirurgicale. Des points limites adaptés à la procédure ont également été définis : - Perte de plus de 20% du poids maximum relevé dans l'étude, - Un état général de l'animal altéré associant différents signes cliniques (poil hérissé, dos vouté, prostration, perte de mobilité rendant l'abreuvement ou alimentation difficile, détresse respiratoire particulièrement si elle est accompagnée d’un écoulement nasal et/ou de cyanose, saignement ou écoulement purulent d’un orifice, écoulement au niveau des yeux, ataxie, tremblement) à l'appréciation des personnels en charge des animaux. - En soins post-opératoire : infection et/ou un gonflement de la zone opérée non compatible avec le comportement normal de l'animal, gonflement de la cicatrice, extériorisation d'organes par rupture de points.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée pour réaliser des modèles chirurgicaux. En effet, l’anatomie du rat est bien connue et sa taille facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des plus petites espèces. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). De plus, c’est une espèce largement décrite dans la littérature pour la recherche sur les adhésions utérines et les traitements associés. Des rattes adultes seront utilisées dans ce projet pour avoir des utérus matures.
Programme d’immunisation de souris en vue du développement d’anticorps monoclonaux.
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.
Bénéfices attendus
Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).
Procédures
4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle
Raffinement
Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.
Choix des espèces
La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole