Troubles urogénitaux

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

4 332 souris vont être utilisées, chacune subissant selon la procédure jusqu'à douze prélèvements d'urine sous contention manuelle, cinq prises de sang, quatre injections, puis une injection létale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et durent dix à douze semaines par animal. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour vieillir plus vite, ce qui les fait mourir plus tôt, et le projet leur inflige une maladie auto-immune du rein pour observer comment l'âge en accélère l'installation. Le porteur écrit que le développement de cette glomérulonéphrite "n'est pas douloureux pour l'animal", tout en déclarant l'ensemble des procédures en gravité modérée.

Objectifs

L’altération progressive et irréversible du rein est une caractéristique du vieillissement chez l’homme conduisant à terme à l’insuffisance rénale chronique (IRC) puis à l’insuffisance rénale terminale nécessitant la mise en place de dialyse ou de greffe rénale Tandis que les fonctions immunitaires déclinent avec l’âge, le vieillissement est aussi caractérisé par une une augmentation du risque d’être atteint de maladies auto-immunes. Dans ces maladies, notre propre système immunitaire se retourne contre nous et produit des anticorps attaquant nos propre cellules. Parmi elles, la glomérulonéphrite extra-membraneuse (GEM) est une maladie auto-immune où des anticorps cible des cellules du rein. Bien que des avancées significatives aient été réalisées dans la compréhension de cette maladie, les facteurs favorisant son initiation restent peu compris, que ce soit du point de vue de l’induction de l’auto-immunité ou de la progression de la maladie. De plus, malgré un pic d’incidence de la GEM autour des 55-60 ans, l’influence du vieillissement sur la physiopathologie de la maladie n’a jamais été étudiée. Notre projet vise donc à déterminer les mécanismes par lesquels le vieillissement, au niveau rénal mais aussi immunologique, favorise l’induction et la progression de cette maladie rénale.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra une meilleure compréhension de l’impact du vieillissement sur l’induction et la progression de la GEM. Ceci permettra à terme de proposer de nouveaux outils diagnostiques ou pronostiques en identifiant des marqueurs de prédisposition à la GEM mais aussi d’ouvrir de nouvelles perspectives de voies thérapeutiques pour les patients atteints de cette maladie.

Procédures

Au cours de la procédure 1, par animal sur tous les animaux du projet (12 semaines) : - 4 injections sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 12 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection lethale. Au cours de la procédure 2, par animal sur tous les animaux du projet (10 semaines) : - 1 injection sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 5 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 10 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection léthale.

Impact sur les animaux

Certaines des souris utilisées sont génétiquement modifiées pour avoir une accélération du vieillissement, ce qui entraine une mortalité à des âges plus précoces. Lors des expériences, les souris pourraient être sujettes à un stress et angoisse liées à leur manipulation voire des douleurs liées aux injections, prélèvements d’urine et de sang effectuées sur ces souris. Des complications éventuelles peuvent survenir suite à l’utilisation de seringue notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement. Le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse n'est pas douloureux pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d'effectuer une cinétique d'induction ou de progression de la maladie.

Remplacement

L’analyse des altérations au cours du vieillissement peut être étudiée in vitro sur modèles de cellules en 3D. La mise au point dans notre équipe de ce protocole in vitro, est à un stade précoce. De plus, bien que ces modèles cellulaires aient un potentiel important pour remplacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La GEM étant une pathologie où le système immunitaire produit des anticorps ciblant les cellules du rein, seul un modèle animal permettra de caractériser et surtout d'établir une cinétique permettant de mieux comprendre les mécanismes favorisant au cours du vieillissement l’induction et la progression de la maladie.

Réduction

Les souris disposant de deux reins, nous optimiserons l’utilisation de ces souris en effectuant différentes méthodes d’analyses sur chaque rein. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet en prenant en compte les effets attendus et le type de tests statistiques effectués.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures, tels que les traitements, que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de douleur, de complications ou de perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire une fois par semaine sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de suivi adaptée au modèle.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle de choix en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ce qui nous permettra d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser de nombreuses analyses nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, des études au sein de nombreuses équipes, dont la nôtre, montrent que les méthodes d’induction de la maladie utilisées reproduit l’ensemble des symptômes observés chez les patients GEM. Ceci permet d’établir ce modèle de souris comme un bon modèle de la maladie humaine. Enfin, les souris génétiquement modiiées pour avoir un vieillissement prématuré sont un modèle qui est déjà disponible et nous avons les expertises nécessaires pour diriger un modèle murin.

Des molécules fournies par des clients, dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires possibles, sont testées ici sur un modèle de règles douloureuses. 500 souris et 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des hormones pendant dix jours et jusqu'à vingt administrations de composés, puis une injection d'ocytocine qui provoque des crampes abdominales, avant d'être placés seuls en cage pendant une heure pour que ces crampes soient comptées. Le porteur indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer les dix animaux par groupe et s'en remet à son expérience du modèle.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des rongeurs dans un modèle de dysménorrhée primaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysménorrhée.

Procédures

Les animaux vont avoir des administrations d’hormones et de candidats médicaments pendant 10 jours maximum. Ces gestes sont très rapides (moins d’une minute, 10 administrations pour les hormones et jusqu’à 20 administrations pour les composés médicaments) et seront réalisés par du personnel qualifié pour diminuer le stress des animaux. Une administration d’ocytocine (30 sec, 1 fois) provoquera des crampes abdominales et les animaux seront observés dans des cages individuelles pendant 1 heure pour compter ces dernières et observer le comportement de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, les animaux vont ressentir les mêmes symptômes que la pathologie induite à savoir des crampes abdominales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et des tissus seront prélevés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des dysménorrhées. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe au début de l’expérimentation mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et dans ce modèle, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum e 10 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. A la fin de l’expérience, des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure…Pour les procédures sous anesthésie, l’animal sera placé sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie. Si un animal présentait un symptôme d’un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit dans la littérature chez le rat et la souris. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

840 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant recevoir jusqu'à 28 administrations en deux semaines. Ils subissent une chirurgie d'une vingtaine de minutes pour l'implantation de cathéters, puis une instillation de prostaglandine dans la vessie qui provoque l'hyperactivité vésicale recherchée, avec les mêmes symptômes que chez l'humain. Le porteur indique que cette chirurgie peut induire des douleurs post-opératoires malgré les antalgiques, des saignements voire des hémorragies. Il précise tester des molécules clients dont il ne connaît ni la nature ni les effets secondaires possibles, et reconnaît ne pas pouvoir anticiper les nuisances qui en découleront.

Objectifs

Ce projet a déjà reçu une autorisation par le Ministère en 2018 qui nécessite une révision au bout des 5 ans de validité. L’hyperactivité vésicale est un trouble urologique chronique redéfinie par l’International Continence Society en 2002 comme un syndrome clinique nécessitant au moins l’existence d’une urgenturie mictionnelle (besoin soudain d'uriner qui est, incontrôlable et difficile à retarder) associée ou non à une incontinence et généralement associée à des contractions involontaires du muscle lisse de la vessie, le détrusor. Quand on souffre d’hyperactivité vésicale, le détrusor, se contracte de façon involontaire même lorsque la vessie n’est pas encore pleine, ce qui provoque une envie soudaine et parfois extrêmement pressante d’uriner. Les principaux symptômes de l’hyperactivité vésicale sont donc : une urgenturie mictionnelle, une fréquence mictionnelle augmentée (besoin d’uriner au moins huit fois pendant la journée), une nycturie (se réveiller plus de deux fois pendant la nuit pour uriner) et une incontinence urinaire (fuites urinaires involontaires). Le syndrome de la vessie hyperactive entraine au quotidien des problèmes : besoin d’avoir des toilettes à proximité en permanence pouvant conduire au refus de sortir, fuites urinaires… pouvant créer un handicap aussi bien au niveau personnel que professionnel. Ainsi, l’hyperactivité vésicale peut affecter sérieusement la qualité de vie de nombreux patients. En Europe comme aux Etats-Unis, on estime que l’hyperactivité vésicale affecte environ 16% de la population, dont un tiers (principalement des femmes) présentent également une incontinence urinaire. De plus, les traitements de première intention n’apportent pas toujours de résultats satisfaisants. C’est pourquoi différents modèles expérimentaux sont développés dont un modèle d’irritation vésicale obtenu par l’instillation intravésicale de prostaglandine chez le rongeur éveillé provoquant une hyperactivité vésicale. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments dans un modèle d’hyperactivité vésicale chez le rat éveillé.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’hyperactivité vésicale.

Procédures

Les animaux seront administrés avec des candidats médicaments (voies d’administration et durée dépendantes de chaque protocole expérimental mais 28 administrations maximales pendant 2 semaines). Tous ces gestes d’administration sont très rapides (1 minute) mais peuvent procurer un stress à l’animal du fait de la contention, de la douleur de l’aiguille. Les animaux subiront également une chirurgie pour l’implantation de cathéters extériorisés afin de réaliser une cystométrie. Cette chirurgie assez rapide (environ 20 minutes) peut induire des douleurs post-opératoires (même avec l’utilisation d’antalgiques), des saignements voire des hémorragies… Des prélèvements sanguins durant l’expérimentation (2 maximum avant la cystométrie) ou en terminal juste avant la mise à mort pourront être réalisés sur animal vigil (lors de traitements avant la cystométrie) ou anesthésié (geste rapide).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies et chirurgies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, ce protocole mime une hyperactivité vésicale donc les animaux auront les mêmes symptômes que chez l’Homme à savoir augmentation du nombre des mictions pouvant occasionnée une gêne.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et des prélèvements de tissus pourront être réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’hyperactivité vésicale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Ce modèle est très bien établi dans notre laboratoire. De par notre expérience et en accord avec la littérature, un nombre de 14 animaux par groupe et 6 groupes expérimentaux est le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement différents et interprétables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux groupes

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures nécessitant une anesthésie générale seront réalisées en maintenant la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Les procédures chirurgicales (implantation de cathéters) seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe avec utilisation d’analgésiques afin de limiter la douleur. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement (tunnel, morceau de bois à ronger) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes comme prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure… pouvant amener à des points limite. Si un animal présentait des symptômes de douleur, prostration, plaies… il sera soigné (désinfection de la plaie par exemple), isolé si nécessaire, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, et qu’un des points limite était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle d’irritation vésicale induite par la perfusion intravésicale de prostaglandine PGE2 chez le rat éveillé est largement décrit dans la littérature. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

38 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation de Listeria monocytogenes dans l'œil, dont le porteur indique qu'elle va "certainement" provoquer une infection et une zone inflammatoire locales, puis subissent une prise de sang et un prélèvement vaginal par semaine pendant quatre semaines, maintenues éveillées sous contention. L'infection peut aussi entraîner fièvre, prostration, perte d'appétit, diarrhée voire des complications neurologiques, alors que la dose recherchée est justement celle qui installe un portage sans symptôme. Le recours à l'animal est présenté comme "indispensable" et le travail sur "organisme entier vivant" comme le seul possible, la mise à mort étant justifiée par la "nécessité" de prélever les tissus pour y chercher la bactérie en dormance.

Objectifs

La Listeria monocytogenes est une bactérie qui peut contaminer l’alimentation et induire chez la femme enceinte un accouchement prématuré ou une fausse couche. Il a été découvert ces dernières années, que la bactérie pouvait persister dans les cellules sans être détectable (dormance de la bactérie) par des méthodes classiques de bactériologie. Les objectifs du projet sont de mettre au point des outils et méthodes de détection de ces bactéries en dormance lorsqu’elles sont cachées dans les cellules en utilisant un modèle biomédical, ici la lapine. L’objectif est de définir la dose de Listeria, qui induit le portage de la bactérie mais sans symptôme de façon à tester les nouveaux outils de détection. Les résultats de cette étude, effectuée sur des lapines, permettront de valider les outils de détection de la Listeria et apporteront une meilleure connaissance des stratégies adaptatives développées par Listeria pour se cacher chez son hôte sans symptôme clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure connaissance des stratégies d’adaptation développées par Listeria monocytogenes pour se cacher (dormance) pendant plusieurs semaines, chez son hôte. Ces résultats serviront de preuve de concept pour étudier les échantillons d’endomètre humain prélevés chez des femmes présentant des fausses-couches à répétition.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure d’instillation oculaire (38 animaux, 1 seule fois, environ 3 minutes), prise de sang (2 ml, 1 fois par semaine pendant 4 semaines sur 20 animaux, environ 3 minutes) sur animal vigile, sous contention légère; à des prélèvements vaginaux (à 72h puis 1 fois par semaine sur 20 animaux), sur animal vigile, sous contention légère.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux liés à la Listeria qui peut induire comme signes cliniques : de la fièvre, une prostration, une perte d’appétit, des toubles digestifs (plutôt diarrhée) voire des complications neurologiques. Ces signes peuvent potentiellement apparaître dans un pas de temps limité dans la mesure où les doses de Listeria choisies ne doivent pas induire de symptomes cliniques. Cependant l’instillation oculaire de la Listeria va certainement induire localement, au niveau des yeux, une infection et une zone inflammatoire transitoire (quelques jours). Concernant les prélèvements, des prélèvements vaginaux et une prise de sang seront réalisées, nécessitant une contention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour plusieurs raisons : - infection à une souche de Listeria infectant l’espèce humaine - nécessité de prélever les tissus pour rechercher la Listeria entrée en dormance

Remplacement

Le recours à l’animal est indispensable puisqu'il s'agit d’étudier si le portage asymptomatique (hébergement sans exprimer de symptome de la maladie) de la Listeria est possible dans différents tissus, il peut donc y avoir des bactéries dans les tissus sans manifestation de signe clinique donc cela necessite de travailler sur organisme entier vivant pour prendre en compte la complexité des processus physiologiques engagés. Il n'est donc pas possible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou un modèle de simulation informatique.

Réduction

Lors de la conception du protocole expérimental, nous avons déterminé le nombre minimum d'animaux à utiliser. Pour cette raison, nous avons prévu une étude pilote pour définir la plus faible dose permettant d’induire un portage asymptomatique de la Listeria (3 doses testées, 18 animaux en tout). Ensuite, la plus faible dose retenue permettant un portage asymptomatique de la Listeria sera testée sur 20 animaux de façon à collecter tous les tissus et valider les tests de détection de la listeria. Nous avons prévu un maximum de 20 lapines pour pouvoir valoriser ces données. L’hypothèse du portage asymptomatique a été validée in vitro sur plusieurs types cellulaires en culture, toutefois la littérature n’a pas de recul sur la proportion de lapines chez lesquelles Listeria sera soit complètement éliminée (lapines guéries) ou soit entrée en dormance chez des individus asymptomatiques après cette infection, cas de figure recherché, ou encore mortelle (non attendu). Un premier lot de lapines sera exposé, en fonction de la réponse de ces lapines et si nécessaire, un 2nd lot sera exposé pour conforter les premiers résultats et compléter les effectifs.

Raffinement

Les lapines seront hébergées en cage individuelle mais avec un contact visuel avec les autres lapines. Ces cages disposent de plateformes pour se mettre en hauteur ou, dessous, de se cacher, des jouets en plastique, des cubes de foin ou des batons de bois à ronger, du papier kraft ciselé sont également mis à disposition. Les paramètres d'ambiance de l'animalerie sont contrôlés. Une acclimatation d’une semaine sera réalisée pendant laquelle les lapines seront habituées à la présence humaine, au change des cages et aux manipulations par le personnel. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Ce suivi inclura l’observation du niveau d’activité, le comportement, la posture au repos, l’apparence (pelage), l’alimentation, les mouvements à la sollicitation et la manipulation d’une zone douloureuse. De plus, l’évaluation de l’état de l’œil, à savoir si l’œil est propre et brillant, sera suivie. Si la lapine présentait une douleur élévée alors une décision serait prise en concertation avec le vétérinaire quant à un recours à la mise à mort de cet animal. Des points limites reposant sur une grille de score intégrant ces différents paramètres ont été établis. Ainsi l'ensemble de ce suivi nous permettra d’intervenir rapidement et de manière graduelle si des signes de souffrance apparaissaient. En cas de signes de douleur, ceux-ci seront pris en charge par l'administration d'analgésiques adaptés (anti-inflammatoires, opioïdes).

Choix des espèces

L'objectif est de reproduire des expériences anciennes de contamination par la Listeria chez la lapine, par conséquent seule cette espèce peut être utilisée pour en explorer les mécanismes. A la suite de ce projet, notre objectif est d’explorer les effets de la Listeria rentrée en dormance sur la gestation. Or ce modèle est pertinent pour étudier le placenta dont la structure est plus proche de l’homme que celle des modèles rongeurs. Nous nous appuyerons sur ces résultats pour le futur projet, le cas échéant. Seules des lapines adultes seront utilisées car l’objectif est d’évaluer le portage asymptomatique de la Listeria chez des lapines pubères.

Le test de molécules fournies par des clients passe ici par 900 rats immatures de 4 à 5 semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour la collecte de tissus. Deux injections intraveineuses déclenchent une néphrite de Heymann, maladie rénale qui provoque œdèmes et insuffisance rénale, puis les composés sont administrés jusqu'à six semaines, parfois par pompe osmotique implantée sous la peau du cou. Chaque animal passe deux fois par semaine vingt-quatre heures seul en cage à métabolisme et subit jusqu'à deux prises de sang hebdomadaires. Le porteur reconnaît ne connaître ni la nature ni les effets secondaires possibles des molécules testées, et indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer les effectifs, arrêtés à douze animaux par groupe sur la base de son expérience.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester des candidats médicaments pour leur efficacité sur la protéinurie induite par le développement d’un modèle de néphropathie.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de ce syndrome.

Procédures

Les animaux auront 2 administrations intraveineuses pour l’induction de la pathologie, des administrations de composés pendant 6 semaines maximum. Ces gestes sont rapides (environ 1 min) pour limiter au maximum le stress des animaux. Les animaux pourront également avoir une pompe osmotique implantée en sous-cutané au niveau du cou. Les animaux seront mis dans des cages à métabolisme pendant 24H (2 sessions par semaine maximum) et seront donc isolés de leurs congénères pendant cette période. Les animaux pourront avoir des prélèvements sanguins sur animal vigile au cours de l’expérience (maximum 2 prélèvements par semaine, durée du geste 2 min) et un prélèvement terminal plus important sur animal vigile ou anesthésié.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur. De plus, la récolte des urines se fait via l’utilisation de cage à métabolisme individuelle. Les animaux seront donc séparés temporairement de leurs congénères pouvant provoquer un certain stress. De plus, ce modèle mimant une néphropathie, les animaux pourront donc être gênés par les différents symptômes de cette pathologie à savoir des œdèmes, insuffisance rénale.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et des tissus seront collectés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la néphropathie passive de Heymann. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience sur ces modèles et les publications scientifiques, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes. Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) notamment pour le suivi mictionnel via l’utilisation de cages à métabolisme. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Différents types d’enrichissement seront ajoutés aux animaux (tunnel, morceau de bois). En accord avec la règle de raffinement, les procédures sous anesthésie seront réalisées avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et des antalgiques seront administrés. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure... Si un animal présentait un symptôme pouvant aller jusqu’à l’atteinte d’un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle de néphropathie passive de Heymann permettant de mimer le cadre clinique de la néphropathie glomérulaire chez l’Homme est décrit dans la littérature chez le rat immature de 4-5 semaines.