Troubles urogénitaux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
Voies de synthèse d’un agent majeur du métabolisme énergétique, le nicotinamide adenine dinucléotide (NAD), au cours de l’insuffisance rénale : modulation et interventions thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Un rein retiré et le pédicule vasculaire de l'autre serré par un clamp, ou les deux pédicules bloqués pendant vingt-cinq minutes : 590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent une perfusion intraveineuse de cinq heures sous anesthésie pour une partie des animaux, des prélèvements d'urine répétés par massage abdominal et une mesure de filtration rénale demandant deux anesthésies séparées de deux heures. L'insuffisance rénale ainsi provoquée entraîne douleur, perte de poids et déshydratation, atteintes que le porteur décrit comme impossibles à éviter complètement puisque l'induction de la maladie est "absolument indispensable" au projet. Sur le remplacement, il indique que les organoïdes de rein existants n'ont pas de vascularisation et ne permettent donc pas de mesurer une fonction rénale.
Objectifs
L'insuffisance rénale aiguë correspond à un déclin soudain de la fonction rénale, survenant chez 10% des patients hospitalisés et 50% des patients en réanimation. Un épisode d'insuffisance rénale aiguë est un facteur de risque pour le développement d'une maladie rénale chronique, qui représente un fardeau majeur pour les soins de santé. Il n’existe actuellement aucun traitement de l'insuffisance rénale aiguë. La production d'énergie par les cellules rénales est fortement perturbée pendant une insuffisance rénale aiguë. Des études ont notamment décrit un blocage de la synthèse de NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l'alimentation. La supplémentation en vitamine B3 permet de restaurer la production de NAD et de limiter les conséquences d'une insuffisance rénale aiguë. Ces résultats sont très prometteurs mais, avant une application en clinique, il reste beaucoup de questions, qui constituent nos objectifs : - existe-t-il une corrélation entre la sévérité de l'insuffisance rénale aiguë et l'atteinte de la synthèse de NAD ?. - quelle est l'évolution de la synthèse de NAD après insuffisance rénale aiguë ? Les résultats publiés ne portent que sur la phase aiguë, précoce. Il faut maintenant compléter ces études en caractérisant l'évolution de cette synthèse la phase de récupération et la phase de transition vers la maladie rénale chronique. - la vitamine B3 est-elle bénéfique lorsqu'elle est administrée après la survenue de l'insuffisance rénale aiguë ? Les études publiées ont uniquement rapporté le bénéfice d'une administration commencée avant l'insuffisance rénale aiguë . Il faut maintenant déterminer si la vitamine B3 est efficace après la survenue de l'insuffisance rénale aiguë. Au cours de ce projet, nous caractériserons également l'évolution du rapport de deux molécules impliquées dans la synthèse de NAD, à savoir le rapport quinolinate/tryptophane. Ce rapport varie très tôt pendant l'insuffisance rénale aiguë, beaucoup plus tôt que les tests utilisés actuellement pour diagnostiquer une insuffisance rénale aiguë. La caractérisation de son évolution pendant les différentes étapes menant de l'insuffisance rénale aiguë à la maladie rénale chronique nous permettra de déterminer si ce rapport peut avoir un intérêt diagnostique et pronostique.
Bénéfices attendus
Il n'existe actuellement aucun traitement spécifique de l'insuffisance rénale aigue. L'administration de vitamine B3 est particulièrement prometteuse. Le projet décrit ici doit nous permettre de définir quand doit être administré ce traitement dans le contexte de l'insuffisance rénale aiguë et de sa transition vers la maladie rénale chronique. Le deuxième objectif du travail est la caractérisation d'un outil (le rapport quinolinate/tryptophane) diagnostique et/ou pronostique précoce de l'insuffisance rénale aiguë et de sa transition vers la maladie rénale chronique, qui manque aujourd'hui. Cet outil pourrait également permettre de déterminer le moment et le temps pendant lequel il faut administrer la vitamine B3. Ensemble, ces deux aspects du projet permettront de limiter l'administration de vitamine B3 à la période strictement nécessaire, réduisant ainsi non seulement le risque d'effets secondaires connus, comme la toxicité vis-à-vis du foie, mais également les effets nocifs potentiels sur le rein d'une activation à long terme de la production de NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) dans la phase de réparation après insuffisance rénale aigue ou lors de la transition vers la maladie rénale chronique.
Procédures
(1) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à exciser le rein droit et à poser un clamp autour du pédicule vasculaire rénal gauche Cette chirurgie dure entre 20 et 30 minutes. (2) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à clamper les deux pédicules vasculaires rénaux pendant 25 minutes. Ce protocole dure 45 minutes (exposition puis pose des clamps sur les pédicules, ischémie et sutures). (3) Une partie des animaux sera soumise à la mesure du débit de filtration glomérulaire qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter par voie intra-veineuse le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure 5 minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire 2h plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que 2 minutes. (4) Tous les animaux recevront au moins une injection intrapéritonéale. Cette procédure, effectuée sur animal vigile, dure moins d'une minute. (5) Une partie des animaux sera soumise à une perfusion intra-veineuse pendant 5h sous anesthésie gazeuse. (6) Des prélèvements de 50 microlitres d'urine seront effectués avant la chirurgie et à plusieurs temps après la chirurgie (miction spontanée ou léger massage abdominal). La durée de cette procédure, effectuée sur animal vigile, est de 1-2 minutes. Tous les animaux y seront soumis. (7) Tous les animaux seront soumis prélèvement sanguin effectué sous anesthésie suivi de l’euthanasie des animaux par une méthode réglementaire. Toutes les procédures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale associée à une analgésie. Un traitement analgésique sera également appliqué toutes les 6-8h après chirurgie pendant 48 heures.
Impact sur les animaux
La chirurgie et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : (1) douleur provoquée par la procédure chirurgicale nécessaire pour la néphrectomie et la pose du clamp vasculaire (ouverture des plans cutané et musculaire, sutures); (2) complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, stress thermique); (3) altération de l'état général : perte de poids, déshydratation; (4) stress induit par les manipulations quotidiennes. Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont en effet nécessaires post-mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Le rein est un organe complexe, composé de plusieurs types de cellules chargés chacun d'une mission spécifique, qu'il est actuellement difficile de reconstituer en dehors d'un organisme vivant. Si des équipes ont décrit la génération d'organoïdes ("organes dans une boîte") rénaux, elles n'ont pour l'instant pas réussi à mettre en place un système de vascularisation, indispensable pour reproduire fidèlement la situation de l'organisme. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet thérapeutique de la vitamine B3 est l'amélioration de la fonction rénale, qui ne peut pas être mesurée sur un organe sans circulation sanguine. Enfin, le foie joue un rôle crucial dans la synthèse et le métabolisme du NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide), une des sources d'énergie que nous étudions. Il est donc essentiel pour notre étude que l'interaction entre le foie et le rein soit présente.
Réduction
Le nombre total d'animaux que nous prévoyons d'utiliser est 590. Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité qui existe entre individu dans les deux modèles d'insuffisance rénale aigue que nous utilisons. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques appropriés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux) et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage. Des points limites ont été définis. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière pendant toute la durée du protocole.
Choix des espèces
L'étude d'un modèle expérimental de mammifère est indispensable puisque le but de notre travail est de pouvoir transposer un jour le résultat de nos études à la clinique humaine. Nous avons choisi la souris car nous maîtrisons parfaitement les protocoles expérimentaux dans cette espèce. Les procédures seront menées chez des souris mâles et femelles de 9-10 semaines, c'est-à-dire des animaux adultes. L'insuffisance rénale aigue touche en effet majoritairement des adultes.
Sélection de composés pour le traitement de l’éjaculation prématurée dans un modèle d’éjaculation pharmacologiquement induite chez le rat anesthésié
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
720 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit le composé à tester, son véhicule ou la molécule de référence, jusqu'à deux fois par jour pendant douze semaines au maximum, avec des prélèvements de sang et d'urine hebdomadaires. L'expérience se termine par une chirurgie sous anesthésie sans réveil, pendant laquelle une éjaculation est provoquée par un médicament et enregistrée trente minutes durant. Le porteur limite le stress attendu au début de l'expérience et présente cette étape préclinique comme "indispensable" avant tout essai chez l'humain, pour une dysfonction sexuelle que deux médicaments traitent déjà en France.
Objectifs
L’éjaculation prématurée (ou précoce, EP) est une dysfonction sexuelle masculine caractérisée par (définition de la société internationale de médecine sexuelle): • une éjaculation qui survient toujours, ou presque toujours, avant la pénétration vaginale, ou au cours de la minute qui la suit (EP primaire), ou une diminution significative de la latence de l’éjaculation, souvent inférieur à 3 minutes (EP acquise) et • une incapacité à retarder l’éjaculation lors de toutes ou presque toutes les pénétrations vaginales, et • des conséquences personnelles négatives, telles que frustration, soucis, souffrance psychologique et l’évitement de l’intimité sexuelle. L'éjaculation prématurée, qui peut occasionner une altération significative de la qualité de vie et des difficultés relationnelles dans le couple, représente la dysfonction sexuelle masculine la plus répandue, affectant entre 5 et 30% des hommes selon les études. Aux Etats-Unis, aucun médicament n’a reçu d’autorisation pour la prise en charge des patients avec une EP. En France, à l’heure actuelle, seuls deux médicaments ont reçu une autorisation de mise sur le marché dans le traitement de l’EP. Mais leur efficacité, qui se traduit par la capacité à retarder l’éjaculation lors d’un rapport sexuel, demeure modeste et l’existence d’effets indésirables et interactions médicamenteuses potentielles laissent place à une amélioration du service médical rendu. La meilleure compréhension de la neurobiologie et neurophysiologie de l’éjaculation acquise ces 20 dernières années a permis d’identifier un certain nombre de cibles pharmacologiques pour moduler plus spécifiquement le contrôle central de l’éjaculation. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de la recherche et la sélection de nouveaux traitements médicamenteux dans la prise en charge de l’EP.
Bénéfices attendus
L’EP est la dysfonction la plus commune de la sexualité masculine. Elle peut avoir des conséquences personnelles négatives (comme la détresse, la peine, la frustration et ou l’évitement de l’intimité sexuelle), mais aussi des difficultés relationnelles dans le couple. Une fois diagnostiquée selon les critères de la société internationale de médecine sexuelle, la prise en charge des patients est multiple, associant les thérapies cognitivo-comportementales centrées sur la sexualité et les pharmacothérapies. Pour cette dernière, aucun médicament n’a l’autorisation de mise sur le marché pour le traitement de l’EP aux Etats-Unis, tandis que seuls deux médicaments l’ont obtenu en France. Ce projet permettrait donc de sélectionner les candidats médicaments qui auraient un potentiel thérapeutique dans le traitement de l’EP. Cette étape d’évaluation préclinique, dans un modèle animal validé, est indispensable pour tout futur médicament avant la réalisation des essais cliniques chez l’homme.
Procédures
Les animaux vont recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 12 semaines). Tout type d’administration, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min sur un animal anesthésié. Ensuite, une évaluation de la fonction éjaculatoire est réalisée chez le rat anesthésiée après le traitement, une fois, et sans réveil. L’enregistrement des réponses éjaculatories dure 30 minutes. L’ensemble de l'expérience dure environ une heure, incluant le temps de chirurgie. Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes.
Impact sur les animaux
L’administration des composés et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort chez les animaux. L’évaluation de la réponse éjaculatoire est réalisée sur des animaux anesthésiés. Un stress peut donc survenir mais seulement au début de l’expérience avant la médication.
Devenir
Tous les animaux du projet vont avoir une évaluation de leur fonction éjaculatoire à la fin de l'étude, qui est une procédure sans réveil. Tous les animaux vont donc être euthanasiés à la fin de l'expérience.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur la réponse éjaculatoire. En effet, l’éjaculation résulte de l’apparition concomitante d’une première phase d’émission, suivi de la phase d’expulsion chez l’homme.
Réduction
Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. Le résultat du calcul est n=11 et est corrigé, en prenant en compte les pertes dues aux difficultés techniques inhérentes au modèle expérimental, à n=12. Les tests statistiques utilisés pour une petite population sont le t-test non apparié pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant un éventuel ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie. L’évaluation fonctionnelle de la réponse éjaculatoire, comprenant la chirurgie, se fait sous analgésie et anesthésie générale et est sans réveil. De plus, une analgésie locorégionale par l’application de lidocaïne est réalisée au cours de la chirurgie. Ensuite, un suivi de la pression artérielle permet de suivre l’état général des rats lors de l’évaluation.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et le rat est l’espèce animale la plus largement utilisée dans le domaine de la médecine sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’éjaculation, ainsi que leurs innervations, chez le rat sont comparables à ceux de l’homme. De plus l’organisation des réseaux neuronaux du système nerveux central impliqués dans l’éjaculation chez le rat partage des similitudes avec ce qui est connu chez l’homme. Des rats mâles adultes de plus de 12 semaines sont employés, âge auquel les organes sexuels sont à maturité et des spermatozoïdes sont présents dans l’épididyme.
Maintien et production pour l’expérimentation de la lignée de souris kF-DH à phénotype dommageable
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Expédiées à deux ou trois mois vers un autre établissement pour y servir dans un projet distinct, les souris kF-DH sont élevées pour reproduire une maladie rénale liée au dépôt d'anticorps produits par une cellule cancéreuse. 640 souris porteuses de ce phénotype dommageable vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le génotypage se fait par poinçonnage du pavillon de l'oreille après dix-sept jours, une bague d'identification étant posée sur l'autre oreille. Celles qui restent pour la reproduction sont tuées avant six mois, soit avant que l'insuffisance rénale ne se déclare, et le porteur indique qu'à la fin du projet l'élevage sera arrêté et la lignée conservée sous forme cryoarchivée.
Objectifs
Dans certaines maladies rénales, un anticorps fabriqué par une cellule cancéreuse ou pré- cancéreuse va se déposer au niveau du rein et provoquer des lésions rénales. Ces lésions rénales vont aboutir à une insuffisance rénale terminale en l’absence de traitement, et potentiellement au décès du patient. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie rénale observée chez l’homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans un projet déposé visant à étudier les mécanismes de développement des lésions rénales en aval des dépôts d’immunoglobulines, afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’élevage de ces animaux permettra d'obtenir des animaux reproduisant de manière très fidèle la pathologie humaine. Ces animaux seront intégrés dans un projet scientifique plus large, déposé, pour lequel nous espérons plusieurs bénéfices : - Mieux comprendre les conséquences rénales des dépôts d’anticorps - Identifier des cibles thérapeutiques spécifiques au rein permettant d’envisager une thérapie plus ciblée que les actuelles chimiothérapie - Etendre les découvertes de ce projet à d’autres pathologies rénales (en particulier le diabète qui présente beaucoup de similarités avec cette maladie). Cela permettra in fine d’envisager des alternatives thérapeutiques aux actuelles toxiques chimiothérapies recommandées dans cette pathologie.
Procédures
Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 17 jours. Cette méthode consiste à prélever un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement les animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.
Impact sur les animaux
Les souris doubles mutées présentent à partir de 8 mois une perte progressive de fonction rénale. Les symptômes de l'insuffisance rénale terminale sont, chez l'homme et la souris, très peu spécifiques. Les principaux symptômes, ou nuisances, seront donc une asthénie, un amaigrissement et une altération de l'état général et du comportement traduite par un poil hérissé, une baisse de la réactivité, ou une prostration. Cependant, les animaux ne devraient pas souffrir de ces nuisances pendant la période d’élevage. Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage mais également lors de la pose de la bague d’identification sur l’autre oreille (douleur légère de courte durée).
Devenir
Une partie des animaux portant le génotype d’intérêt kF-DH sera expédiée avant l’expression du phénotype dommageable avec leurs contrôles DH (sans phénotype dommageable) et utilisée dans un projet de recherche déposé dans un autre établissement utilisateur. Une autre partie des animaux kF-DH sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement. Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 6 mois, soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime, ou plus tôt si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g.si surplus). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie des dépôts d’immunoglobulines monoclonales. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présent dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 640 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, l’élevage sera arrêté et le modèle restera accessible sous forme cryoarchivé pour utilisation ultérieure.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (6 maximum par cage) comportant des enrichissements (nids). Tous les animaux kF-DH mutés de manière homozygote pour les deux modifications génétiques et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 8 mois seront suivis tous les jours à partir de deux mois et ce jusqu'à leur envoi à 2-3 mois vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés vers l’EU pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour les croisements et mis à mort avant 6 mois, soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime. Les animaux seront suivis avec la grille d’évaluation du bien-être animal contenant des mesures de raffinement (croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage) et des points limites précoces. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l'établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l'élevage.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les seules espèces permettant à ce jour de reproduire la maladie observée chez l’homme. Les souris doubles homozygotes kF-DH seront utilisées pour les croisement dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à 6 mois, soit avant le développement du phénotype dommageable. Dans l'article initial, les souris commencent à développer des lésions rénales à l’âge de 6 mois, et la présence de dépôts sans retentissement rénal est retrouvée dès l’âge de 2 mois. Les animaux doubles homozygotes kF-DH envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 2-3 mois.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de modèles murins permettant l’étude des mécanismes gouvernant le développement des cellules germinales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
13 000 souris vont être utilisées pour un unique geste de quelques secondes chacune, une biopsie de la queue pratiquée sur animal vigile dès l'âge de dix jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce prélèvement sert à trier les descendants de croisements destinés à invalider seize gènes de la reproduction. Le porteur reconnaît que la contention et le geste provoquent une douleur légère et un stress. Les souris dont le génotype ne convient pas sont tuées et leurs tissus récupérés, les autres restent en vie pour intégrer d'autres projets de recherche que le RNT ne décrit pas.
Objectifs
L’objectif principal du projet est d’acquérir de nouvelles connaissances fondamentales dans le domaine de la biologie de la reproduction. Plus précisément, ce projet vise à comprendre les mécanismes qui gouvernent la gamétogenèse, le processus biologique qui permet la formation des gamètes, les cellules sexuelles impliquées dans la reproduction. Pour cela seize gènes clefs vont être étudiés. Afin de mieux comprendre leur fonction nous étudierons l’effet de leur invalidation au cours de la gamétogenèse. Le second objectif de ce projet est d’identifier de potentielles causes génétiques d’infertilité. L’infertilité est une pathologie qui touche environ un couple sur six et dans de nombreux cas les causes en demeurent inconnues. Mieux comprendre les acteurs impliqués dans le processus de gamétogenèse et les mécanismes associés permettra de mieux diagnostiquer l’infertilité.
Bénéfices attendus
La fonction de reproduction est très particulière. C’est en effet une des premières à se mettre en place au cours du développement et une des dernières à devenir fonctionnelle à l’âge adulte (c.a.d. lorsqu’un individu souhaitera procréer). Il existe de ce fait une ‘boite noire’ entre le moment où cette fonction peut être altérée et le moment de la découverte de l’infertilité. Il est donc capital de prévenir autant que de ‘guérir’ toute atteinte à la fonction de reproduction et ceci implique une connaissance poussée des mécanismes biologiques impliqués. La compréhension du rôle des gènes est essentielle pour comprendre globalement la gamétogenèse, et donc ce qui assure la fertilité. Connaitre les gènes et comprendre les processus permettra d’identifier les causes génétiques et améliorera la prise en charge et le conseil apporté aux patients. Plus spécifiquement, notre projet améliorera cet aspect en apportant des connaissances fondamentales sur les étapes dérégulées lorsque des gènes impliqués en méiose sont invalidés. La méiose est le processus qui permet la formation des gamètes haploïdes (ovules et spermatozoïdes).
Procédures
Un biopsie de queue sera réalisé sur animal vigile afin de déterminer son statut génétique. La durée de cette procédure est de quelques secondes. Un prélèvement unique sera réalisé par animal. Celui-ci servira à déterminer le statut génétique de l’animal. En effet, afin d’étudier le rôle d’un gène dans la fonction de reproduction, nous produirons des animaux déficients pour ce gène à partir de croisements d’individus hétérozygotes (ne possédant qu’une copie sur deux du gène invalidés). Les descendants de ces animaux seront alors soit sauvages génétiquement (avec les deux copies du gène non mutées) soit hétérozygotes, soit homozygotes mutants (avec les deux copies du gène mutées). Nous allons comparer les tissus reproducteurs des animaux homozygotes à ceux des animaux sauvages pour comprendre l’effet de l’invalidation du gène candidat. Les animaux hétérozygotes serviront à maintenir la lignée. Exceptionnellement si le résultat de l’analyse génétique, n’est pas concluant, un second prélèvement peut être envisagé.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue est un geste qui provoque une douleur légère. L’animal est maintenu en contention (pour éviter qu’il bouge) lors du prélèvement ce qui représente une source de stress.
Devenir
A l’issue de la procédure (prélèvement d’un morceau de queue) tous les animaux sont maintenus en vie. au-delà, les animaux dont le génotype ne convient pas seront euthanasiés et leurs tissus pourront être récupérés post-mortem. Les autres animaux seront maintenus en vie pour intégrer des projets de recherche nécessitant ce type d’animaux.
Remplacement
La fonction de reproduction ne peut être efficacement modélisée in vitro car elle implique plusieurs tissus et types cellulaires en interaction. De plus, l’étape centrale de la gamétogenèse, la méiose, est absolument impossible à mimer avec une lignée cellulaire. En effet, la méiose est une division cellulaire différente de la mitose qui ne permet pas la multiplication cellulaire et donc exclut l’usage d’une lignée cellulaire par définition. La souris est un modèle de choix pour l’étude de la fonction de reproduction du fait de son cycle rapide de reproduction et de l’existence de nombreux modèles mutants avec des phénotypes finement décrits dans la littérature facilitant la comparaison des données. A ce jour cette méthode, la biopsie de queue, est la seule parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire pour le génotypage des souris portant des constructions génétiques spécifiques. Ce processus est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et permettre l’entretien de ces lignées.
Réduction
Sur la base de notre expérience, nous avons estimé le nombre d’animaux requis pour l’étude de ces différents gènes en fonction des étapes supposées être atteintes. Le croisement d’animaux hétérozygotes permettra de générer à la fois des animaux homozygotes et sauvages dont les phénotypes seront comparés. L’étude du processus de reproduction dans les deux sexes simultanément devrait limiter la génération d’animaux non exploités. Les animaux hétérozygotes issus des mêmes croisements serviront à maintenir les lignées.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les souriceaux âgés de 10 à 21 jours sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place. Dans les cas exceptionnels ou une seconde biopsie serait requise au-delà de 21 jours, un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place.
Choix des espèces
Les souris sont de petits animaux au développement et à la reproduction rapides. Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines, notamment l’infertilité, car les souris possèdent de grandes similarités génétiques avec l'être humain. La production des cellules sexuelles est bien décrite dans cette espèce et il est donc aisé, par comparaison, de positionner le rôle d’un nouveau gène. Chez les vertébrés, il n’existe pas d’autre modèle dans lequel autant de mutations affectant la fertilité aient été décrites. Chez les organismes modèles invertébrés (levure, ver, mouche) de nombreuses mutations affectant la fertilité sont rapportées mais la conservation des gènes est relativement faible vis-à-vis de l’espèce humaine. Les biopsies de queues sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 10 jours. Le génotypage (pour visualiser le(s) gène(s) d’intérêt) des lignées est essentiellement réalisé à cet âge pour permettre d'avoir le résultat au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.
Etude fonctionnelle de dispositifs médicaux d’endoscopie pour l’exploration de la vessie ou des poumons
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Troubles urogénitaux
Deux truies d'une trentaine de kilos reçoivent un endoscope introduit par les voies urinaires ou par les voies respiratoires, sous anesthésie générale, pour une intervention pouvant durer jusqu'à six heures. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisées dans un autre projet. L'enjeu porte sur la validation de deux dispositifs commerciaux avant leur essai chez l'humain, chaque animal permettant l'évaluation par quatre chirurgiens au maximum. Le porteur écrit que la procédure "n'a pas de conséquence sur le bien-être de l'animal", après avoir listé parmi les effets possibles un rétrécissement de l'urètre, des déchirures de ses parois et des sécrétions de mucus avec traces de sang.
Objectifs
Une endoscopie est un examen peu invasif qui relève de l’imagerie médicale et qui permet d’obtenir des images de l’intérieur d’un organe ou d’une cavité et de les exploiter. L’endoscopie est habituellement recommandée dans un but diagnostique ou pour des interventions chirurgicales mineures. Elle est réalisée à l’aide d’un instrument appelé endoscope, se présentant sous la forme d’une tige rigide ou souple, dont la taille et le diamètre dépendent de la zone à examiner, une source de lumière et une caméra. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer les performances cliniques et techniques de 2 endoscopes à usage unique de conception technique très proche. Le premier est utilisé pour l’exploration du système urinaire et plus particulièrement la vessie, le deuxième pour l’exploration de l’arbre bronchique. Cette technologie à usage unique innovante supprime le besoin de décontaminer l’endoscope après son utilisation. Cette procédure longue et coûteuse comporte toujours un risque pour le personnel manipulant les solutions détergentes ainsi que pour les patients. En effet, des agents pathogènes peuvent persister après décontamination incomplète. Les endoscopes évalués sont stériles et suppriment par conséquent le risque de contamination croisée améliorant ainsi la sécurité des personnels et des patients (ce dernier point n’est cependant pas évalué dans ce projet). Dans ce projet, une exploration des voies urinaires et de l’arbre bronchique seront effectuées, en utilisant le porc comme modèle, par les chirurgiens en activité et compétents dans ces domaines respectifs afin d’évaluer les performances mécaniques de chaque endoscope, sa qualité d’image et sa maniabilité. Les endoscopes ayant des conceptions très proches, ils sont opérants sur le même système vidéo permettant le suivi de l'examen.
Bénéfices attendus
Les essais permettront d’évaluer les performances de deux endoscopes à usage unique, notamment les améliorations apportées sur le traitement d’image sur un système de visualisation opérant aussi bien pour des endoscopes d’urologie que bronchiques. Cela permettra de valider la conception de ces deux intruments qui pourront ensuite faire l’objet d’une étude clinique chez l’homme avant leur commercialisation. Ces types d’endoscope suppriment les risques de contamination croisées liés à l’utilisation de dispositifs conventionnels réutilisables.
Procédures
Introduction d’un dispositif médical endoscopique par les voies naturelles sous anesthésie générale, soit par les voies urinaires (1 animal, 1 fois, durée de la procédure maximale de 6h), soit par les voies respiratoires (1 animal, 1 fois, durée de la procédure maximale de 6h)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - le stress lié à la contention et à la manipulation avant l'induction de l'anesthésie générale - les effets indésirables liés à l’anesthésie générale et à la ventilation mécanique : rares risques d'inflammation trachéale liée à la sonde trachéale, d'infection respiratoire. - les effets indésirables liés à une cystoscopie qui sont limités : rare infection urinaire nécessitant un traitement antibiotique, rétrécissement de l’urètre en raison de la formation de tissu cicatriciel, dommages ou déchirements des parois de l’urètre - les effets indésirables liés à une bronchoscopie qui sont limités : rares sécrétions de mucus avec traces de sang, quintes de toux, faible taux d’oxygène dans le sang, infections. Ces effets ne durent pas plus de quelques jours.
Devenir
La procédure est une procédure peu invasive qui est réalisée par les voies naturelles. Elle ne provoque que peu d’irritation et n’a pas de conséquence sur le bien-être de l’animal. Par ailleurs, aucun prélèvement de tissu ni d’organe n’est prévu.
Remplacement
Des évaluations ont été menées en phase précoce de développement sur mannequins afin de valider l’interface utilisateur et le design des dispositifs. Des essais sur cadavres et organes disséqués d’animaux ont ensuite été réalisés pour permettre d’évaluer la compatibilité du dispositif avec d’autres accessoires et équipements (laser, forceps…) dans un environnement proche du bloc opératoire. Cependant, ces essais sont nécessaires sur animaux vivants pour l’évaluation de la qualité d’image (limitée sur cadavre), ainsi que de l’exploration du système urinaire et bronchique en présence du tonus musculaire ou de la ventilation respiratoire, conditions très proches d’une utilisation sur patient.
Réduction
Aucun test statistique n’a été réalisé pour déterminer le nombre d’animaux à inclure dans l’étude. Il s'agit d'une étude pilote ayant pour vocation de déterminer la faisabilité de conduire un examen d’endoscopie dans des conditions proches de leur utilisation réelle sur patient, en utilisant le minimum d’animaux possible. Un animal sera utilisé par dispositif et permettra l’évaluation par 4 évaluateurs maximum chacun. Aucune analyse statistique des résultats ne sera effectuée.
Raffinement
Les porcs sont préalablement hébergés en groupe sociaux, ils disposent d’enrichissements leur permettant d’exprimer leurs comportements naturels comme le fouissage (hébergement sur litière de copeaux de bois), l’exploration d’objets à mâchouiller (ballons, balles au mur, balles au sol permettant la distribution de friandises, chainette métallique). Une surveillance et des soins quotidiens sont apportés par une équipe qualifiée de techniciens et vétérinaires. L'animalerie est en cycle jour/nuit de 12h/12h avec des paramètres d'ambiance contrôlés. Les animaux bénéficient d'un minimum de 7 jours d'acclimatation mis à profit pour les habituer à la présence et à la manipulation par l'Homme, lors du change des boxes et la distribution de nourriture, par la distribution de caresses et de friandises (morceaux de fruits). Le protocole prévoit des procédures non-invasives (passage par les voies naturelles), réalisées sous anesthésie générale, par des chirurgiens formés à la manipulation de ces dispositifs endoscopiques. Les animaux reçoivent une analgésie pendant et après la procédure, ainsi qu'une couverture antibiotique préventive.
Choix des espèces
Le modèle animal porcin est celui qui se rapproche le plus de l’anatomie de l’homme, aussi bien pour le système urinaire que pour les voies respiratoires. L’expérimentation ne peut être réalisée que sur les femelles d’environ 30 kg pour des contraintes de compatibilité avec les longueurs utiles des dispositifs médicaux utilisés. Porcs juvéniles de 30 kg ; anatomie la plus proche de l’humain à ce stade.
Evaluation de l’effets de candidats médicaments dans des modèles mimant différentes pathologies de la prostate.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Tester des candidats médicaments fournis par des clients, dont le porteur écrit ne connaître ni la nature ni les effets secondaires possibles : 2 160 rats sont utilisés pour cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs tissus. On leur provoque une prostatite ou une hypertrophie de la prostate, avec des chirurgies pour injecter des composés directement dans la prostate, poser des pompes osmotiques ou des cathéters vésicaux externalisés, après quoi ils passent jusqu'à 48 heures en cage individuelle. S'ajoutent jusqu'à 24 heures en cage à métabolisme, trois heures trente en cage de restriction pour la cystométrie et une heure de contention pour un test de douleur. Le porteur écrit qu'aucun test statistique n'a servi à calculer les effectifs, retenus à douze animaux par groupe sur la base de son expérience et de la littérature.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des modèles mimant différentes pathologies de la prostate (prostatite, hypertrophie bénigne de la prostate). La population vieillissant, de nombreuses pathologies de la prostate chez l’homme engendrent des problèmes urinaires ayant un impact important sur le bien-être et la qualité de vie (problème de sociabilisation, sujet tabou…). Il est donc nécessaire de réaliser des études expérimentales pour cette thématique de recherche.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et/ou avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de pathologies de la prostate (prostatite et hypertrophie bénigne de la prostate).
Procédures
Les animaux seront traités avec des candidats médicaments ou des agents inducteurs de pathologie par des voies d’administration classiques. Ces gestes, réalisés par du personnel qualifié et ayant de l’expérience, seront rapides (environ 1 min) pour limiter la manipulation des animaux et la gêne occasionnée. Les animaux auront des chirurgies pour l’administration de composés directement dans la prostate ou via l’implantation de pompes osmotiques ou d’implants (chirurgie rapide, environ 15 min). Les animaux pourront avoir une chirurgie un peu plus longue (environ 30 min) avec l’implantation de cathéters externalisés (cathéter vésical et d’administration). Les animaux pourront avoir des prises de glycémie donc un léger prélèvement sanguin à la queue (1 goutte) étant très rapide (1 min) 2 fois par semine. Des prélèvements sanguins plus importants pourront être réalisés au cours des traitements selon les protocoles expérimentaux (geste rapide 1-2 min) sur animal vigile (1 fois par semaine maximum). Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme pendant 24H maximum ou être mis dans des cages de restriction pour évaluer le profil mictionnel via la cystométrie (pendant 3H30). Après l’implantation de cathéters externalisés, les animaux seront mis dans des cages individuelles pendant 48H maximum. Les animaux subiront un test comportemental de douleur où ils seront dans des « cages » de restriction pendant 1 heure environ (30-45 min acclimatation pour que l’animal se calme et test de douleur pendant 15 min). Ce test comportemental sera réalisé avant l’induction de la pathologie et à différents temps après l’induction de la pathologie.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, ces modèles miment des pathologies prostatiques humaines, les animaux pourront ressentir les mêmes symptômes tels que des troubles urinaires, une douleur pelvienne. De plus, une chirurgie peut toujours entraîner une gêne post-opératoire lors de la cicatrisation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet car des tissus seront collectés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique réellement efficace pour le traitement des pathologies prostatiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience sur ces modèles et les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux groupes et des tests pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes). Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) notamment pour le suivi mictionnel via l’utilisation de cages à métabolisme. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, morceau de bois…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Un antalgique sera administré pour diminuer la douleur des chirurgies. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Nous essayons d’utiliser des méthodes non invasives (test de comportement, cages métaboliques) et d’acclimater les animaux avant l’expérimentation aux différentes installations afin de limiter au maximum le stress des animaux. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Les différents modèles sont bien décrits chez le rat dans la littérature et permettent de mimer les 2 pathologies prostatiques non cancéreuses les plus diagnostiquées et impliquant des troubles urinaires et/ou douleurs engendrant une diminution non négligeable de la qualité de vie des patients. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Effets de candidats médicaments sur le mécanisme de fermeture de l’urètre et sur un modèle d’incontinence à l’effort chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 1800
3000 rongeurs, 1800 rats et 1200 souris, vont être utilisés, tous tués sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur cautérise l'urètre sous anesthésie générale pour provoquer une incontinence, on leur implante des cathéters dans la vessie, la veine jugulaire ou l'estomac, puis on comprime leur abdomen par pressions croissantes jusqu'à ce qu'une goutte d'urine sorte, quatre fois de suite. Les molécules testées viennent de clients dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires possibles. Il qualifie ce test de compression de "non invasive", n'indique pas le nombre de jours de traitement et reconnaît qu'aucun calcul statistique ne fonde l'effectif de dix animaux par groupe.
Objectifs
L’incontinence urinaire d’effort est un des problèmes majeurs du vieillissement. Cette pathologie est souvent sous-évaluée car tabou mais a un impact important dans la qualité de vie des patients. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de candidats médicaments sur le mécanisme de fermeture de l’urètre et sur l’incontinence urinaire d’effort induite par cautérisation de l’urètre.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’incontinence urinaire.
Procédures
Les animaux vont subir des traitements de produits à tester. Chaque geste classique (type gavage, administration intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire…) étant réalisé par du personnel qualifié, ces derniers devraient durer environ 30 sec à 1 min par animal. Le nombre de jours de traitement étant dépendant de chaque protocole expérimental, nous ne pouvons pas indiquer le nombre d’intervention pour ces gestes. Les animaux vont subir une chirurgie (lésion de l’urètre) sous anesthésie générale qui devrait durer 30 min maximum. Pour les tests de Leak Point Pressure (LPP) ou test de point de fuite, des cathéters pourront être placés dans différents organes (vessies, veine jugulaire, intragastrique par exemple…). Ces chirurgies dureront environ 20 min et l’animal ne la subira qu’une fois. Le test de LPP se fait sous anesthésie générale (anesthésie sans réveil). Ce test consiste à appliquer des pressions croissantes sur l’abdomen de l’animal (principalement au niveau de la vessie) et d’arrêter ces pressions dès qu’une goutte d’urine apparaît. Chaque session de ce test dure environ 30 sec. Et un animal aura plusieurs sessions (environ 4) avec 10-15 min de repos entre chaque.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, certains clients nous informent de potentiels effets secondaires pouvant apparaître avec leurs molécules. Des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, des lésions et une légère douleur (douleur de l’aiguille). Le modèle physiologique de ce protocole mimant une incontinence urinaire, les animaux subiront les effets secondaires de cette pathologie (pertes fréquentes et incontrôlées d’urines).
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort car anesthésies avec un anesthésiant irréversible (sans réveil).
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’incontinence urinaire. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Pour évaluer l’effets de candidats médicaments, la méthode du LPP (link point pressure ou pression du point de fuite) est une méthode non invasive qui consiste à appliquer des pressions croissantes au niveau de la vessie de l’animal et d’observer une fuite urinaire. Cette méthode se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Cette méthode sera réalisée par du personnel qualifié et validé pour cette technique, ce qui permettra d’obtenir des résultats significatifs avec un nombre minimum d’animaux. Aucun test statistique n’est réalisé pour définir le nombre d’animaux par groupe, mais avec notre recul et notre expérience, nous savons que n=10 animaux par groupe est le minimum nécessaire pour avoir des résultats significatifs. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux ou plusieurs groupes. Nous pensons réaliser 3 études par an chez le rat et 2 études par an chez la souris.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de signes cliniques avant l’atteinte de points limites à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Des antalgiques seront utilisés pour les chirurgies afin de limiter la douleur. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux grâce à un entrainement pour les rendre à l'aise avec les gestes techniques, les supports de contention ou les appareils utilisés pendant l'expérience.
Choix des espèces
Notre expertise chez le rongeur et en particulier chez le rat dans les études urologiques ainsi que les informations de la littérature sont les raisons qui nous ont fait choisir le rat en priorité. Toutefois, ces procédures peuvent très bien être extrapolées chez le souris, selon la demande de nos clients (expérimentations déjà réalisées dans notre laboratoire). Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Evaluation de l’effet de candidats médicaments sur la contraction vésicale induite par des agents contractants chez le rat anesthésié
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Les uretères sectionnés après ouverture de l'abdomen, un cathéter poussé dans la vessie par les voies naturelles et un autre dans la veine jugulaire, puis des agents contractants injectés pour faire se contracter la vessie : l'intervention dure une trentaine de minutes. 600 rats vont être utilisés, tous tués sous anesthésie sans réveil, pour tester des candidats médicaments contre l'hyperactivité vésicale. Le porteur écrit ne connaître ni la nature ni les effets secondaires des molécules confiées par ses clients, ce qui l'empêche d'anticiper les nuisances. Ces procédures sont pourtant déclarées d'un niveau de souffrance léger, seule catégorie renseignée pour les 600 animaux.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer, chez le rat, l’effet de candidats médicaments, sur l’amplitude des contractions vésicales induites par un agent contractant en dose unique ou en doses croissantes, mais aussi sur l’augmentation de la salivation, effet secondaire observé chez les patients traités par des médicaments contre l’hyperactivité vésicale.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’hyperactivité vésicale.
Procédures
Les animaux seront traités par des candidats médicaments via des gestes classiques (per os, intrapéritonéal, sous-cutané ou autre) ou via l’implantation de cathéter lors de la chirurgie. Ces gestes sont rapides (environ 1 min) et seront réalisés par du personnel compétant pour limiter le stress des animaux et réduire le temps de manipulation. Les animaux seront anesthésiés (sans réveil) et au minimum un cathéter veineux sera implanté dans une veine jugulaire. D’autres cathéters pour administrer les composés à tester pourront être implantés (intragastrique, intrapéritonéale…). Après une laparotomie, les uretères seront sectionnés, un cathéter vésical sera inséré via les voies naturelles et fixé au méat urinaire. Dans son ensemble, la chirurgie durera environ 30 minutes. Ensuite, la vessie sera perfusée avec du liquide physiologique pour atteindre une pression particulière et des agents contractants seront administrés afin de provoquer des contractions vésicales. Les animaux recevront plusieurs séries d’administration de produits contractants pour pouvoir évaluer un effet moyen des candidats médicaments. De plus, de la salive sera récupérée à différents temps à l’aide d’une pipette par exemple (méthode non invasive).
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées (jusqu’à 3 semaines), prélèvements de sang, anesthésies et chirurgie sur les animaux peuvent provoquer du stress et une douleur.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés car ils seront sous anesthésie irréversible sans réveil.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’hyperactivité vésicale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Ce modèle est déjà établi dans notre laboratoire. De par notre expérience et en accord avec la littérature, un nombre de 12 animaux par groupe est le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement différents et interprétables). Nous pensons réaliser 2 études par an pour ce modèle.
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale sans réveil avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et l’utilisation d’antalgique pour diminuer la douleur. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Ce modèle est bien décrit chez le rat dans la littérature. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Endometriose : validation de modèles souris et évaluation de l’efficacité de candidats médicaments
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Injectées d'hormone à trois reprises pour développer leur endomètre, puis tuées pour qu'on le leur prélève, des souris donneuses fournissent les fragments utérins qu'on injecte dans l'abdomen d'autres souris, munies la veille d'une mini-pompe implantée sous anesthésie. 2 400 souris femelles vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend une perte de poids d'environ 15 % et une douleur persistante, qu'il mesure jusqu'à trois fois par semaine au filament de Von Frey et sur plaque chauffante, une heure par séance. La mise à mort sert à récupérer les organes et de grands volumes de sang, pour juger de l'effet de molécules candidates sur une endométriose provoquée en laboratoire.
Objectifs
L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Les lésions peuvent se situer au niveau de la paroi musculaire de l’utérus (myomètre), des ovaires, ou dans la paroi abdominale sur le péritoine. Ces lésions sont associées à de la fibrose. Cette maladie entraîne des douleurs cataméniales importantes (dysménorrhée), des douleurs pelviennes, abdominales, ombilicales, lombaires chroniques, et une infertilité. Il n’existe pas à ce jour de traitement de l’endométriose, d’où l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour but de développer un modèle murin (souris) d’endométriose profonde, la forme la plus grave d’endométriose. L’objectif est donc d’obtenir des lésions d’origine endométriale, encapsulées dans les tissus et/ou organes abdominaux environnants, et présentant des signes de métaplasie en muscles lisses, et des signes de fibrose importants. Une étude pilote sera réalisée afin de vérifier l’induction d’endométriose et que ces lésions remplissent les critères de l’endométriose profonde. Dans un second temps, des candidats de traitement de l’endométriose seront administrés aux animaux afin de tester leur efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouveaux agents chimiques ou biologiques candidats pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’endométriose profonde. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées voire absentes.
Procédures
Ce projet vise à tester des molécules chimiques ou biologiques dans un modèle d’endométriose chez la souris. Pour mettre en place l’endométriose, un groupe de souris donneuses recevra trois injections de benzoate d’estradiol à D-7, D-5, D-3 qui développeront l’endomètre, puis ce groupe sera euthanasié pour récupération du tissu utérin. Plusieurs groupes de souris receveuses seront pourront être implantés ou non avec une mini-pompe osmotique délivrant de la substance P ou du sérum physiologique à D-1,. La pose sera réalisée sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques : dérivé morphinique (Buprénorphine) et alpha2. La plaie sera ensuite désinfectée régulièrement et un cicatrisant (Dermaflon crème) pourra être appliqué. Si besoin, la suture sera reprise sous anesthésie à l’isoflurane. Ces souris recevront ensuite à D0 une injection intrapéritonéale de fragments utérins issus des souris donneuses. La substance P participera à la mise en place de l’inflammation caractéristique de l’endométriose. Les souris receveuses pourront recevoir un composé chimique ou biologique à tester, ou un placebo : Administrations intra veineuses, intra vaginales, intrapéritonéales, sous cutanées sous anesthésie générale si nécessaire ; intra musculaires, intra dermiques sous anesthésie générale avec analgésie systématique (buprénorphine) Administration per os : gavage sous contention Des tests visant à quantifier la douleur abdominale des animaux seront réalisés (1 heure maximum par animal, maximum 3 fois par semaine). Des prélèvements de sang et de tissu (après la mort) pourront être réalisés in vivo afin de doser des paramètres d’intérêt de la maladie et donc d’évaluer l’efficacité des composés administrés sur le développement de l’endométriose. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de protocole.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous suspectons une douleur persistante modérée ou sévère transitoire, et des pertes de poids transitoires, c’est pourquoi il sera classé en sévère. Ce degré sera revu suite à l’étude pilote. Nous nous attendons à observer une perte de poids transitoire chez les animaux du fait de l’inflammation générée, environ 15%, au début de l’induction de la maladie (pendant la première semaine), avec ensuite une reprise de poids. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. Des tests de douleur pourront être réalisés et génèreront un stress et une douleur modérée. En début d’étude, les animaux seront randomisés pour créer des groupes homogènes en poids, ce qui sera à l’origine de remaniements des groupes et donc un stress léger. La pose de mini pompe osmotique nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur la maladie d’intérêt.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront dans la mesure du possible été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez la femme.
Réduction
Un nombre minimum de 8 souris receveuses adultes par groupe sera par exemple nécessaire pour pouvoir observer une réduction significative de l’étendue des lésions et de leur fibrose suite à un traitement. Ce nombre pourra monter jusqu’à 16 en cas d’ajout d’autres paramètres devant être mesurés comme le dosage des cytokines, d’autres colorations en histologie et/ou l’expression de gènes dans les lésions, certaines analyses étant incompatibles les unes avec les autres. Cette analyse sera effectuée au moyen du test ANOVA. Par ailleurs, on comptera entre une et deux souris donneuses par souris receveuses selon le nombre de lésions visées par receveuse.
Raffinement
Le poids des animaux sera suivi au moins 2x/semaine, et quotidiennement en cas de perte de poids >10%. En cas de perte de poids constatée >10% sur certains animaux, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages. Les pertes de poids >20% ou persistantes (15 à 20% pendant 3 jours consécutifs) seront un point limite. Indépendamment des tests comportementaux (Von Frey, hotplate), une grille de scoring de douleur a été mise en place et sera raffinée après la première étude (cf procédure). Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. Dans ce cas, un traitement antalgique (buprénorphine) pourra être administré. Les AINS seront évités afin de ne pas modifier l’induction de la maladie. En cas de test de hotplate, un animal ne présentant pas de réponse au test sera systématiquement retiré de la plaque au bout d’une minute de contact. Une habituation à la plaque la veille sera prévue (30 secondes à une minute). Une habituation au plancher grillagé du test de Von Frey sera prévue la veille (30min) et sera mise en place avant les tests à chaque mesure (30min). En début d’étude, les animaux seront randomisés pour créer des groupes homogènes en poids, ce qui sera à l’origine de remaniements des groupes. Les animaux seront surveillés afin de détecter des signes d’agressivité ou de stress. Les animaux agressifs seront séparés de leurs congénères, et en cas de stress des enrichissements supplémentaires seront apportés. Les animaux seront monitorés matin et soir. La pose éventuelle de mini pompe osmotique nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée. La plaie sera inspectée quotidiennement jusqu’à complète cicatrisation. En cas de besoin, une désinfection pourra être réalisée, ainsi que l’application d’une crème cicatrisante. En cas de déhiscence de plaie dans les trois jours post-chirurgie, la plaie pourra être reprise en suture. En cas de non cicatrisation de la plaie et de persistance au-delà d’une semaine d’une plaie déhiscente, l’animal concerné sera euthanasié.
Choix des espèces
- Les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées a minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Des femelles sevrées (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés, le modèle d’endométriose profonde étant bien décrit chez les animaux adultes.
Maintien et production pour l’expérimentation de la lignée de souris col4a3 KO
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
220 souris porteuses d'une invalidation du gène col4a3 vont être utilisées dans un élevage classé en souffrance légère, expédiées à quatre ou cinq semaines vers un autre établissement où l'expérimentation aura lieu. Celles qui ne portent pas la mutation sont gardées pour maintenir la lignée, et les homozygotes non transférées sont mises à mort avant six semaines, avant que la maladie rénale ne se déclare. Le porteur indique que ces souris développent une perte auditive vers six à huit semaines puis une fibrose rénale vers dix semaines, tout en écrivant qu'elles ne devraient pas en souffrir pendant la période d'élevage. Sur le remplacement, il affirme que la fibrose ne peut s'étudier que sur "organisme entier" et conclut qu'il faut recourir à l'expérimentation animale.
Objectifs
La fibrose est définie comme une cicatrisation anormale des tissus (durcissement et perte d’élasticité) constatée après agression desdits tissus. Cette affection est irréversible et s'aggrave au cours du temps. Ce phénomène peut affecter la plupart des organes dont les poumons, les reins, le foie ou encore le coeur et représente un problème majeur de santé publique. En effet, 45% des décès dans les pays industrialisés seraient liés à la présence d’une composante fibrotique. Cependant, les mécanismes à l'origine de ce processus restent actuellement largement méconnus. L’objectif de cet élevage est de produire des souris déficientes de manière homozygote pour le gène col4a3. En effet, le gène col4a3 code pour la chaîne α3 du collagène IV, un composant majeur de la membrane basale des glomérules (unités fonctionnelles du rein). L’invalidation de ce gène chez les souris conduit au développement d’une glomérulonéphrite progressive sur un temps court (environ 10 semaines). Cette déficience permettra d’obtenir des animaux mimant phénotypiquement le syndrôme d'Alport, une néphropathie héréditaire conduisant au développement d'une fibrose rénale qui seront par la suite utilisés dans un projet déposé visant à étudier les causes et les mécanismes de cette fibrose afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cet élevage est l’obtention de souris déficientes pour le gène col4a3 qui seront des modèles de fibrose spontannée utilisés dans le cadre d’un projet plus large visant à étudier les causes et les mécanismes de cette fibrose afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué. Cette méthode consiste à prélever un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes pour le gène col4a3 présentent à 6-8 semaines une perte auditive neurosensorielle modérée et développent à 10 semaines une glomérulosclérose associée une fibrose rénale. Cependant, les animaux ne devraient pas souffrir de ces nuisances pendant la période d’élevage. Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage mais également lors de la pose de la bague d’identification sur l’autre oreille (douleur légère de courte durée).
Devenir
Les animaux portant le génotype d’intérêt (col4a3 KO et contrôles col4a3 WT) seront expédiés et utilisés dans un projet de recherche déposé dans un autre établissement utilisateur. Les animaux ne portant pas la mutation de manière homozygote et les animaux col4a3 WT non expédiés ne présentent pas de phénotype dommageable, ils seront utilisés pour maintenir l’élevage
Remplacement
Des résultats préliminaires in vitro obtenus au sein du laboratoire demandeur pour la lignée générée ont permis d’obtenir de nombreux résultats. Cependant, les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le développement des lésions de fibrose. En effet, le processus de fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier et de ce fait nécessite de recourir à l’expérimentation animale.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 220 animaux au phénotype dommageable est nécessaire pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (4 maximum par cage) comportant des enrichissements (nids). Tous les animaux mutés de manière homozygote pour le gène col4a3 et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 6-8 semaines seront suivis quotidiennement à partir du sevrage réalisé à 3-4 semaines et ce jusqu'à leur envoi à 4-5 semaines vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation : une observation individuelle sera réalisée chaque jour de la semaine selon les critères d’une grille de score. En fonction du score total, des mesures seront mises en place et, notamment, chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l'établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l'élevage. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés vers l’EU pour l’expérimentation, ces derniers seront mis à mort avant 6 semaines soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime.
Choix des espèces
Le modèle murin constitue un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire de par notamment les nombreuses similitudes avec la pathologie observée chez l’homme. Les souris déficientes pour col4a3 vont notamment être particulièrement adaptées pour l’étude la fibrose rénale car il s'agit d’un modèle mimant le syndrôme d’Alport, une néphropathie héréditaire conduisant au développement d'une fibrose rénale. Des souris adultes, en âge de procréer pour maintenir l’élevage, seront utilisées. Les animaux envoyés pour expérimentation auront un âge de 4-5 semaines (avant les premiers signes d’expression du phénotype dommageable et du commencement de la fibrose rénale).
Elucider le rôle d’un récepteur de l’immunité innée dans le développement de la fibrose et de l’inflammation rénales à l’aide d’un modèle murin d’obstruction chirurgicale des voies urinaires.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sous anesthésie générale une chirurgie qui obstrue le flux urinaire d'un rein pour provoquer une maladie rénale chronique, puis un prélèvement de sang rétro-orbital le jour de sa mise à mort. Le porteur indique que la plaie peut s'infecter et que l'animal peut souffrir, se désorienter et perdre du poids. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies contre l'insuffisance rénale, sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant d'évaluer le rôle d'un récepteur de l'immunité innée. Sur le remplacement, il affirme que les cultures de tubules rénaux ne reproduisent ni la vascularisation ni le flux urinaire, et conclut qu'aucune approche in vitro ne peut se substituer à la souris.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques sont des maladies génétiques ou acquises. Le rein va subir de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein et à son remplacement progressif par un tissu cicatriciel aboutissant à sa destruction. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale qui nécessite le recours à la dialyse et la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. Plusieurs études ont montré le rôle délétère de l’immunité innée dans le développement des lésions rénales dans différents modèles murins de maladies rénales chroniques. L’étude proposée ici a pour objectif d’évaluer le rôle d’un récepteur de l’immunité innée dans l’apparition de lésions rénales dans un modèle murin chirurgical de maladie rénale chronique. Ce modèle utilise une chirurgie rapide sous anesthésie générale sur animaux adultes qui permet d’obstruer le flux urinaire d’un des 2 reins et ne compromet pas la fonction rénale du rein restant. L’invalidation génétique de ce récepteur de l’immunité innée sera évaluée à différents temps après la chirurgie : 1, 4 et 14 jours.
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre d’élucider le rôle d’un récepteur de l’immunité innée sur le développement des lésions rénales en vue de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de freiner la progression des maladies rénales chroniques.
Procédures
L’ensemble des animaux (120 souris) sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale. L’acte chirurgical en lui-même est d’environ 5 minutes. Le temps global de la procédure de chirurgie (préparation, anesthésie, chirurgie, suture et réveil) est de 2 heures. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement de sang (30secondes) sous anesthésie générale le jour de la mise à mort. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir 2 injections pour l’anesthésie pré-opératoire et lors de la mise à mort ce qui peut induire un stress momentané lors de la contention et une douleur aigüe lors de l’injection. Le modèle chirurgical n’induit pas par lui-même de nuisance puisqu’un seul des 2 reins étant obstrué, l’autre rein maintient une fonction rénale normale. En revanche, suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir (désorientation, éventuelles douleurs, perte de poids) et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection (douleur aigüe). Le prélèvement sanguin rétro-orbital sous anesthésie générale peut induire une douleur aigüe.
Devenir
L’ensemble des 120 animaux sera mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro ne permettent pas l’étude intégrée d’un rein ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Il n’est donc pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et lors de l’évaluation des points limites par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. Les souris présentant une infection de la plaie se verront appliquer une solution de désinfection ainsi qu’une pommade anti-septique jusqu’à disparition des symptômes. A l’issue de la procédure, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage.
Choix des espèces
La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Les souris utilisées sont déficientes pour une protéine de l’immunité innée. Ces souris ont été décrites dans la littérature scientifique comme le modèle de référence pour étudier la voie de l’immunité innée dont le rôle est questionné dans cette étude. Les animaux subiront une chirurgie à l’âge adulte (8-12 semaines) après la fin de maturation des reins.
Implants de tissus pour la reconstruction/réparation de vessie dans un modèle d’augmentation vésicale de porc
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Une partie de la vessie retirée puis remplacée par un implant du commerce, huit cochons miniatures subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont ensuite hébergés seuls pendant trois à six mois, le porteur reconnaissant que l'isolement d'une espèce grégaire peut créer stress et anxiété, avant une cystoscopie sous anesthésie puis la mise à mort pour analyse de la vessie, du foie et des reins. Il s'agit de vérifier qu'un implant de 4 à 8 cm de diamètre régénère du tissu vésical à une taille jugée transposable à la chirurgie humaine, deux essais précédents ayant porté sur des implants plus petits. Le texte du RNT décrit six animaux répartis en deux groupes, alors que huit sont déclarés au titre des atteintes attendues, sans que cet écart soit expliqué.
Objectifs
Le projet porte sur le développement d'un implant tissulaire pour la reconstruction de la vessie. La reconstruction de la vessie est nécessaire dans certaines malformations congénitales. La référence en matière de remplacement de la vessie est l’utilisation d’un segment d’intestin mais le contact entre les urines et l’intestin entraîne des complications telles qu'une production excessive de mucus, des calculs urinaires, des troubles métaboliques et, à long terme, même une tumeur maligne. C’est pourquoi les chirurgiens recherchent de nouvelles méthodes de reconstruction de la vessie. L’ingénierie tissulaire constitue une approche prometteuse pour fabriquer des substituts de novo à la vessie. Plusieurs stratégies peuvent être envisagées mais nous pensons que la médecine régénérative guidée avec laquelle on fournit un « squelette » implanté qui fournit une structure architecturale temporaire et orchestre l'attachement/la croissance cellulaire et la régénération du tissu in vivo est plus attractive avec des produits disponibles dans le commerce et prêts à l'emploi. Jusqu'à présent, ces implants ont été utilisés avec succès pour la réparation d'urètre chez le lapin et le chien et la sécurité des implants a été confirmée dans une étude préliminaire chez l’Homme sur la réparation des sténoses urétrales. Ces implants ont également démontré une régénération tissulaire dans un modèle d'augmentation vésicale de lapin (2,5 cm x 2,5 cm) et un modèle d’augmentation vésicale de porc (2 porcs, implant de 4,5 cm de diamètre). Par contre, la taille de l’implant était trop petite par rapport aux besoins cliniques chez l’Homme. Il est donc nécessaire de poursuivre nos recherches avec des implants de plus grandes tailles qui représentent mieux la réalité clinique. Ainsi, l'objectif de cette étude est de démontrer la capacité des implants de 4 et 8 cm de diamètre (taille d'implant cliniquement pertinente) de régénérer du tissu vésical dans un modèle d’augmentation vésicale de porc.
Bénéfices attendus
Une intégration réussie de l'implant suivie d'une régénération tissulaire au site d'implantation confirmerait le potentiel de l’implant régénératif à devenir une option thérapeutique pour les patients nécessitant une augmentation ou une reconstruction vésicale partielle de la vessie. Un implant du commerce et prêt à l'emploi permettrait d'éviter un deuxième site chirurgical en chirurgie reconstructive de la vessie et réduirait ainsi tous les risques liés au prélèvement de tissu intestinal actuellement utilisé pour la reconstruction de la vessie. Les avantages de l'implant peuvent être résumés par des risques moindres de complications postopératoires, des durées chirurgicales plus courtes et une récupération plus rapide.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de type cystectomie partielle (opération qui consiste à enlever seulement une partie de la vessie) avec réparation par implant régénératif. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés pour une durée de 3 mois (n = 2) ou 6 mois (n = 4) avant euthanasie. Avant l'euthanasie des animaux, ils seront soumis à une cystoscopie (réalisés sur animaux anesthésiés).
Impact sur les animaux
Le premier effet indésirable potentiel est en lien avec la chirurgie subie par les animaux. Parmi les effets indésirables possibles en lien à la chirurgie, il est possible que l’animal éprouve une douleur malgré le protocole d’analgésie, la plaie chirurgicale peut aussi saigner, s’infecter ou mal cicatriser. Le second effet indésirable potentiel est lié l’hébergement des animaux. En effet, suite à la chirurgie et pendant une durée de 3 à 6 mois, les animaux seront hébergés individuellement. Les porcs étant une espèce grégaire cela pourrait créer un stress et une anxiété chez les animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort suite à la procédure car des prélèvements post-mortem doivent être réalisés pour analyse histologique (vessie, foie, rein).
Remplacement
Les implants ont subi de nombreux tests in vitro pour démontrer leur sécurité, leur conformité chirurgicale et leurs interactions favorables avec les cellules. Les tests in vivo sur le site clinique pertinent sont la seule possibilité d'évaluer la régénération fonctionnelle des tissus. La régénération tissulaire est une interaction complexe entre l'implant et le tissu environnant du site d'implantation avec ses cellules vivantes et ses processus médiés par les intégrines. Par conséquent, il est important de tester un implant d’une taille cliniquement pertinente sur le site d’implantation clinique ciblé.
Réduction
Ce projet est une étude de faisabilité. L'étude est donc réalisée avec un nombre réduit d'animaux (n = 6 avec 2 tailles d'implants testés 4 (n = 2) et 8 cm (n = 4).
Raffinement
La chirurgie est réalisée par des chirurgiens spécialisées en collaboration avec des personnels scientifiques et techniques formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie sur modèle porcin. L'anesthésie et l’analgésie durant les interventions ont été conçues pour supprimer la douleur induite par une chirurgie et la manipulation des viscères. Après la chirurgie, les animaux bénéficieront d’un suivi assuré par les techniciens en expérimentation ainsi que par les différents intervenants. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera contrôlée, et les animaux suivis dans les minutes ou heures qui suivent. En cas de souci de santé, le vétérinaire sera consulté et les animaux traités en conséquence.
Choix des espèces
Le miniporc est très proche de l’Homme en terme de physiologie et d’anatomie. La taille de sa vessie est appropriée pour réaliser une cystectomie avec une taille d’implant cliniquement pertinente. Le recours au mini-porc est donc pertinente pour pouvoir transposer les résultats à l’humain. Les animaux seront adultes. La croissance d’un animal jeune pourrait interférer avec la reconstruction de la vessie.