Troubles sensoriels

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, une inhalation et une irradiation reproduisant l'exposition à des substances génotoxiques comme l'acétaldéhyde, le formaldéhyde ou les UV, pour étudier la réparation de l'ADN et le risque de cancer. Le porteur indique que les irradiations peuvent provoquer une inflammation aiguë de la peau et affirme que l'exposition aux produits mutagènes sera trop courte pour causer des lésions visibles. Les souris sont ensuite tuées pour analyse des tissus et organes.

Objectifs

Les ultraviolets et les psychotropes comme le tabac ou l’alcool contribuent au développement de tumeurs. L’exposition à la lumière UV ainsi qu’aux drogues récréatives endommagent l’ADN des cellules humaines et augmentent le risque de cancers dans la population en induisant des mutations sur l’ADN. Les altérations produites par ces substances nuisibles à l’ADN sont pris en charge par des systèmes de protection de l’ADN tels que la réparation par excision de nucléotides (NER) et, à défaut, par les polymérases translésionnelles (TLS). Des lésions non réparées entraînent des mutations qui augmentent le risque de cancers. Ces produits communément présents dans de nombreuses drogues récréatives, tels que l’acétaldéhyde, le formaldéhyde et le benzo(a)pyrène, ainsi que l’exposition prolongée et chronique aux UVs, produisent une large gamme de lésions à l’ADN qui sont réparées par le NER. Xeroderma Pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare causée par une déficience constitutive du NER. Les patients XPs ont un risque de cancer de la peau 10 000 fois plus élevé, dû à leur inaptitude à réparer les dommages induits par les UV. Il a été montré que les patients XP ont un risque de cancer interne plus de 100 fois plus élevé. Les processus mutationnels impliqués ne sont pas bien compris. Il est possible qu’ils soient dus à l’action de sources mutationnelles interne ou externe au corps, telles que l’acétaldéhyde ou le formaldéhyde. De plus, une augmentation du risque de cancers corrélé à des mutations délétère sur un allèle (mutation inactivant une copie d’un gène, c’est-à-dire une mutation hétérozygote) de gènes du NER a été montrée dans des modèles murins et humains. La consommation excessive des psychotropes cités pourrait impacter le risque de cancer chez des porteurs de ces mutations NER dans la population générale. Certaines populations présentent ces mutations hétérozygotes de manière particulièrement fréquente, allant de 0,5 à 2% de la population. L’évaluation de la susceptibilité aux cancers associés à l’abus de ces substances, ainsi qu’à l’exposition excessive aux UV est donc de haute pertinence clinique. Notre projet vise à identifier les conséquences au niveau de l’ADN et des mutations engendrées par l’exposition chronique d’animaux adultes et pendant la grossesse à ces substances cancérigènes et au rôle joué par le NER et la voie des TLS.

Bénéfices attendus

Identifier la quantité et le type de mutations engendrés par ces sources cancérigènes chez nos souris nous permettra de préciser les diagnostiques fait pour les cancers humains, ainsi que la mise en évidence d’une potentielle population particulièrement à risque pour l’exposition à ces substances.

Procédures

Gavages: nombre= 3, durée = 2 minutes . 4 injections intrapéritonéales :30 secondes:. Inhalation (1), durée: 10 minutes. Irradiation (1) : durée: 14 minutes.

Impact sur les animaux

Les irradiations sont susceptibles de provoquer des inflammations de la peau de manière aigue et contenue à la zone d’irradiation. L'exposition aux produits mutagènes ne sera pas d'une durée suffisante pour provoquer des lésions macroscopiques qui entraîneraient des nuisances.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux se révèle essentielle pour l’étude de la mutagenèse dans un contexte prénatal. En effet il est impossible de répliquer ce processus complexe de développement ex vivo. Pour ce qui est de la tumorigenèse induite par les UV, les études In vitro, bien que points de départ nécessaires et importants, ne nous permettent pas de modéliser ni de prendre en compte le processus complexe qu’est la tumorigenèse chez un être vivant complet, avec toutes les interactions entre organes.

Réduction

Notre projet n’étudie pas de caractéristiques quantifiables sur les animaux mêmes, mais sur des séquençages fais à partir de tissus récupérés sur ces animaux. De ce fait, les statistiques elles-mêmes sont fait sur les résultats de séquençage, et ne prennent pas en compte le nombre d’animaux. Nous avons besoin de 10 individus différents par génotypes et traitements pour rendre nos statistiques robustes sur l’analyse haut débit.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux, ceux-ci sont suivis quotidiennement par le même manipulateur et les mêmes animaliers. Pour les interventions et procédures des anesthésies seront effectuées. Un traitement d’appoint sous forme de crème analgésique est prévu en cas d’inflammation cutanée suite aux expositions aux ultraviolets. Des points limite et des critères d'arrêt de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les 9 modèles nécessaires sont tous d’ores et déjà existants chez la souris sur un fond génétique C57BL/6 et/ou BALB/c. L’organisation du système vasculaire de la souris et les relations avec le microenvironnement tumoral sont très proches de celles observées chez l’Homme. L’utilisation de la souris permet d’obtenir des effectifs suffisants et des lots homogènes permettant une reproductibilité des résultats. Les stades choisis sont justifiés par les maladies qui peuvent apparaître, suivant les carcinogènes, à différents stades de la vie dans l'espèce humaine. Des femelles et mâles à maturité sexuelle (à partir de 8 semaines) pour les expériences sur les animaux adultes et pour permettre un maintien de la lignée. Des femelles pour les traitements au cours de la gestation. Pour analyser la mutagenèse prénatale après exposition aux différentes génotoxines, nous aurons besoin d'individus âgés de 2 à 3 semaines.

480 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des sons puis reçoivent des médicaments administrés localement dans l'oreille et subissent des tests auditifs sous anesthésie pouvant durer jusqu'à quatre heures, avant une mise à mort pour prélever les cochlées. Le porteur affirme que les expositions sonores, inférieures au seuil de douleur, ne produisent aucun effet indésirable, et choisit la gerbille pour son champ auditif proche de celui de l'humain. Il annonce des retombées thérapeutiques contre les surdités professionnelles et prévoit un dépôt de brevet, ces essais cliniques restant projetés à cinq ans.

Objectifs

Il est aujourd’hui admis que les forts niveaux de stimulations sonores provoquent la mort des cellules sensorielles de la cochlée et l’apparition d’une surdité définitive. Une exposition sonore à des niveaux modérés entraine une dégénérescence des fibres du nerf auditif, sans altération des cellules sensorielles. Fait surprenant, la perte de fibres auditives peut atteindre plus de 50%, alors que les seuils audiométriques demeurent strictement normaux. Autrement dit, une audiométrie normale n'est pas synonyme d'une audition normale. Cette neuropathie cochléaire pourrait résulter d’un excès de neurotransmetteur (excitotoxicité) libéré par les cellules sensorielles lors d’une surexposition sonore. Si cette hypothèse est validée, elle ouvre des pistes pharmaceutiques nouvelles qui consistent à utiliser des agents pharmaceutiques capables de protéger les neurones auditifs ou de stimuler leur repousse. Toutes les expériences seront réalisées in vivo chez la gerbille de Mongolie. En plus d’être un animal couramment utilisé dans des projets pharmacologiques, la gerbille présente comme avantage d’avoir un champ auditif proche du champ auditif humain facilitant ainsi le transfert clinique.

Bénéfices attendus

Les surdités sont un problème majeur de santé publique. L’organisation Mondiale de la Santé estime que 1,5 milliard de personnes dans le monde présentent des déficits auditifs et que ce chiffre devrait atteindre 2,5 milliards d'ici 2050. Il est reconnu que le traumatisme sonore est l'une des causes les plus fréquentes de surdité et un problème coûteux au sein du monde du travail. Outre la surdité, les traumatismes sonores sont responsables de la survenue d’acouphènes (sifflements, bourdonnements d’oreille), voire d’hyperacousie douloureuse (intolérance au bruit). Ce projet a pour finalité d’améliorer la santé des personnes exposées à des bruits environnementaux (militaires, musiciens, techniciens du son, ouvriers dans l’industrie). Les agents pharmaceutiques identifiés et évalués dans ce projet pourront être proposés à visée préventive (protection préexposition) ou thérapeutique (post-exposition). La démonstration de leur efficacité devrait à moyen terme dans les 5 ans déboucher sur des essais cliniques. Cette étude porte sur les traumatismes sonores devraient intéresser des personnes exposées à des bruits environnementaux (militaires, musiciens, techniciens du son, ouvriers dans l’industrie). Une fois la preuve de concept faite, nous déposerons un brevet.

Procédures

En principe aucun animal ne devrait souffrir au cours de la mise en œuvre de ce projet car les tests auditifs sont tous réalisés sous anesthésie générale. Tout au long de l'anesthésie qui dure au maximum 4 heures, l’expérimentateur surveille attentivement la profondeur de l'anesthésie et le bien-être de l'animal. Le pouls et la température corporelle sont monitorées durant toute l'anesthésie. A l’issue des tests, les animaux sont placés en zone de réveil. Après leur réveil, ils sont réintroduits dans leur cage habituelle et le suivi consiste en une visite quotidienne. Lorsque que l’animal sort du protocole, il est mis à mort pour prélever ses cochlées pour des observations morphologiques.

Impact sur les animaux

Les expositions sonores ne produisent pas d’effet indésirable sur l’animal. Les niveaux sonores utilisés dans ce projet sont bien inférieurs au seuil de la douleur de l’animal (~140 dB SPL). De plus, ce type d’exposition sonore est utilisé depuis plus de vingt ans dans des dizaines de laboratoire de recherche dans le monde. Les auteurs des études n’ont jamais observé d’effet indésirable post-exposition. Par ailleurs, l’administration locale de drogues thérapeutiques ainsi que les explorations physiologiques sont réalisées sur l’animal anesthésié donc la principale nuisance est liée ici à la piqûre de l'anesthésie.

Devenir

Chaque animal est mis à mort à l’issue de la chirurgie pour prélever les cochlées pour des observations morphologiques.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales. Dans ce projet, le modèle expérimental s’appliquera à la Gerbille (Meriones unguiculatus) qui possède une gamme auditive de basse fréquence représentant un modèle précieux pour la compréhension de l'audition humaine. Par ailleurs, une grande partie des études sur les mécanismes auditifs a été réalisée sur la gerbille de Mongolie, afin de permettre une comparaison des résultats obtenus avec ceux déjà publiés il est essentiel d’utiliser cette espèce. Elles possèdent également des caractéristiques anatomiques uniques qui permettent l'application locale de drogues dans l'oreille moyenne par voie transtympanique.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Une étude statistique nous a conduits à utiliser 480 gerbilles pour 3 procédures expérimentales lors de cette étude qui se déroulera sur 5 ans. Le nombre d'animaux par groupe experimental a été calculé en utilisant un logiciel statisitique.

Raffinement

Les animaux seront particulièrement surveillés après les expositions (bruit et drogue) pour évaluer tout signe de souffrance : en cas de baisse du poids, de modification de l’apparence (yeux mi-clos, le poil hérissé, le dos courbé, animal prostré), ou de problème post-chirurgical (saignement, ouverture de la cicatrice, infection cutanée). La reprise d’activité motrice ainsi que la reprise de l’alimentation normale (nourriture et hydratation) sont contrôlées deux fois par jours après les interventions. Les gerbilles conservées sont isolées dans des grandes cages dans un milieu enrichi, avec des copeaux dans la litière, des tunnels et des maisons en plexiglass. Les animaux potentiellement en souffrance (évaluation selon les signes de souffrance classiques incluant les mimiques faciales stéréotypées, le dos vouté, la prostration, le poil ébouriffé, l'anorexie) seront soulagés par une injection d'un analgésique ou mis à mort en cas de souffrance persistante au-delà de 24 heures. Une fiche d’évaluation de la douleur sera également utilisée pour consigner tout signe de souffrance des animaux.

Choix des espèces

Nous entreprenons cette étude chez la gerbille, un animal dont la gamme de sensibilité auditive recouvre de manière significative celle de l'homme et dont les différences de distribution des sous-types fonctionnels de fibres du nerf auditif sont connues. La gerbille est de plus un modèle expérimental bien établi pour la recherche auditive et permet d'utiliser toute la panoplie des approches électrophysiologiques, moléculaires et d'imagerie modernes. La facilité d'accès à la cochlée facilite également l'administration locale de médicaments. Les animaux utilisés seront agés de 8 à 20 semaines afin de se préserver des effets liés à l’âge sur l’audition (presbyacousie).

590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques et obèses par leur lignée db/db, elles sont exposées à des sons de forte intensité, jusqu'à 116 décibels, provoquant des pertes auditives, puis subissent des mesures d'audition sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés. Leur oreille interne est prélevée après la mise à mort, ce prélèvement ne pouvant se faire sur un animal vivant. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives validées" et conclut à la "nécessité" du recours à l'animal.

Objectifs

La transmission d’un son de l’oreille externe en signaux aux cellules ciliées, cellules sensorielles de l’oreille interne situées dans la cochlée et reliées au nerf auditif. La vibration du tympan est transmise via la fenêtre ovale au liquide de l’oreille interne via les osselets (marteau, enclume et étrier). Les ondes sonores transmises dans le liquide de l’oreille interne sont traduites en signaux électriques par les cellules ciliées. Ces signaux électriques sont transmis au cerveau par le nerf auditif. Lorsque les cellules ciliées sont lésées, par une substance chimique, un traumatisme ou par le vieillissement, la personne a une perte auditive. Plus de 90% des pertes auditives sont dues à une destruction des cellules ciliées ou du nerf auditif (Hildebrand et al., 2008; Kujawa and Liberman, 2019). Dans le cadre du diabète et plus particulièrement celui de type-2, le mécanisme conduisant à une surdité n’est pas clairement établi. Plusieurs hypothèses ont été avancées, notamment une atteinte vasculaire au niveau de la cochlée, par analogie avec la rétinopathie et la néphropathie diabétique résultant d’une altération des micro-vaisseaux sanguins avec l’épaississement du sang par l’hyperglycémie. En parallèle, le diabète de type 2 induit une inflammation systémique chronique qui à terme peut avoir des répercussions au niveau de l’oreille interne et entraîner une dégradation des cellules ciliées, ou une augmentation de la susceptibilité au bruit. Chez la souris, il a été démontré qu’un trauma acoustique modéré, provoquant une surdité temporaire chez les animaux sains, induisait une surdité permanente chez des animaux diabétiques (Han et al., 2018). Enfin, une neuropathie périphérique ciblant le nerf auditif pourrait également conduire au développement de la surdité en lien avec le diabète. Il n’existe aucun traitement pharmacologique pour la surdité et les traitements du diabète, bien que permettant un meilleur contrôle de la glycémie ils ne traitent pas le cause de l’hyperglycémie qui reste élevée avec des conséquences au long-terme. Face à l’augmentation constante de la prévalence de ces deux pathologies, la recherche d’une solution thérapeutique adaptée reste un enjeu majeur de santé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices escomptés sont de valider ou d’invalider l’efficacité de candidats médicaments dans ces indications thérapeutiques. Ceci permettra de mieux sélectionner les candidats médicaments et de concentrer la rechercher et développement uniquement sur les candidats médicaments avec un haut potentiel d’efficacité.

Procédures

Les animaux vigiles seront exposés à des sons de forte intensité 2 intensités seront testées 100 et 116dB. Trois protocoles d’exposition seront testés : 100dB durant 2 heures 100dB durant 2 heures chaque jour jusqu’à 7 jours consécutifs 116dB pendant 1 heure Des mesures d’audition seront réalisées chaque semaine sous anesthésie générale. Un prélèvement de sang sera réalisé chaque semaine (au maximum 100µl) L’administration de traitement sera réalisée. Le traitement pourra être administré chez les animaux vigiles lors des traitements administrés par voie orale, intra-péritonéale, intraveineuse, sous cutanée. Le traitement sera réalisé chez des animaux sous anesthésie générale lors des traitements par transtympanique.

Impact sur les animaux

Développement d’un diabète de type 2 et d’une obésité. Pertes auditives consécutives à l’exposition au son de forte intensité

Devenir

Les animaux sont euthanasiés car des prélèvements de l’oreille interne sont réalisés pour des analyses anatomopathologiques. Le prélèvement de l’oreille interne ne peut se réaliser sur des animaux vivants donc les animaux sont euthanasiés en vue de ces prélèvements.

Remplacement

Remplacer : le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour évaluer l’audition et développer des modèles pathologiques de trauma acoustique ou d’acouphènes. Les atteintes des cellules ne peuvent pas être étudiées via la culture cellulaire ou les modèles informatiques car nous ne pouvons pas reproduire la complexité des mécanismes conduisant aux troubles de l’audition. L’influence d’une pathologie métabolique telle que le diabète de type-2 sur la surdité est complexe, impliquant plusieurs facteurs (vasculaires, inflammatoires et modifications lipidiques) qui ne peuvent être évalués que in vivo chez l’animal. Néanmoins nous réalisons une veille bibliographique active afin de suivre les modèles de remplacement qui sont susceptibles d’être développés à l’avenir.

Réduction

Réduire : le nombre d’animaux nécessaire a été calculé, selon des méthodes de biostatistiques, en tenant compte de la variabilité des modèles et des méthodes d’induction des troubles auditifs. Cette approche nous permettra d’obtenir des résultats fiables

Raffinement

Raffinement : dans nos études, les impératifs éthiques associés, tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu, la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal, seront intégrés avec une attention particulière pour le phénotype diabétique et obèse (entre 5 et 25 semaines d’âge fenêtre d’âge des animaux inclus dans nos études). Un contrôle hebdomadaire de la glycémie et du poids des animaux nous permettra de suivre l’hyperglycémie et l’obésité dans le temps. Parmi les complications liées au diabète possiblement attendus, la polyurie (augmentation de la fréquence et du volume d’élimination urinaire), la polydipsie (augmentation de la sensation de soif) et la polyphagie (augmentation de la sensation de faim) sera prise en charge via des conditions d’hébergement adaptés (change des cages plus fréquent, mise à disposition de plus d’eau et de nourriture) . Une attention particulière sera portée aux procédures anesthétiques sur animaux obèses, par rapport au stockage de certains produits anesthésiants dans les graisses.

Choix des espèces

Le modèle de diabète chez la souris db/db est bien établi et caractérisé. Nous sommes en mesure de suivre l’évolution de l’audition chez cette espèce. C’est pourquoi nous avons choisi de travailler avec cette espèce dans le cadre de ce projet. Concernant le stade de développement nous allons inclure de jeunes adultes (développement du diabète à partir de 5 semaines et jugé non délétère selon la bibliographie de l’éleveur jusqu’à 25 semaines). Pour s’affranchir des pertes auditives liées à l’âge et se focaliser sur l’influence du diabète.

9 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement laser oculaire sous anesthésie puis des séances d'imagerie sur trois semaines, pour qu'une entreprise vérifie que son laser de traitement de la rétine ne provoque pas de cataracte avant un passage chez l'humain. Le porteur indique qu'une cataracte est possible, voire systématique dans le groupe le plus exposé, avec perte définitive de la vision de l'œil traité et stress pouvant entraîner une perte de poids. Il affirme que l'essai doit "obligatoirement" être mené in vivo et présente le lapin comme le seul animal à l'anatomie oculaire proche de l'humain.

Objectifs

Une société Suisse a développé un traitement laser (proche infrarouge) des maladies chroniques de la rétine (DMLA, glaucome, Rétinopathie diabétique) qui a pour but d’interagir avec le métabolisme cellulaire rétinien. Dans ce cadre, elle souhaite réaliser une expérimentation animale préliminaire pour vérifier que la technologie laser utilisée n’est pas cataractogène. L’apparition de cataracte est liée soit à un effet photothermal du laser (échauffement de tissus absorbant l’énergie laser comme l’iris) et/ou à un effet photo-chimique. Le traitement laser étudié n’étant pas ciblé sur l’iris et le cristallin étant optiquement transparent (absorption de l’énergie faible à nulle), il est supposé que l’effet photothermal du laser utilisé sera négligeable et non associé à un risque de cataractogenèse. Néanmoins, un effet photochimique (réaction chimique catalysée par la lumière) ne peut être exclu et est variable en fonction de l’intensité d’énergie utilisée. La présente étude propose ainsi d’évaluer l’absence de cataractogenèse liée au traitement laser étudié 1/à une énergie de travail qui serait utilisée chez l’Homme, 2/à une énergie seuil de référence (énergie maximale autorisée par législation par exemple), 3/ainsi qu’une énergie très supérieure à la dose maximale utilisée. Sera étudiée à court terme l’apparition d’une cataracte dans le cristallin de lapins après les tirs lasers.

Bénéfices attendus

Ce projet permetterait de connaître la sécurité pour le cristallin de l'utilisation d'un laser innovant ayant pour but de traiter des rétinopathies chroniques jusqu'ici très difficile à traiter voir impossible. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise developpant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique.

Procédures

Les 9 animaux recevront à j0 un traitement laser sans contact, sans docking et sous anesthésie générale qui a une durée théorique de 1 minute. Puis à J0 (postlaser immédiat), J1, J7, J14 et J21, la rétine et le cristallin des 2 yeux de l'animal seront observés par des techniques d'imageries sans contact (Lampe à fente, tomographie à cohrence optique et rétinographe) et sous anesthésie générale. Les observations ont une durée théorique de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Une cataracte (opacification du cristallin) de l'oeil traité par le laser est possible pour les groupes 1 et 2 voir systématique pour le groupe 3. Cette atteinte du cristallin n'est pas douloureuse, mais est accompagné d'une perte de la capacité visuel définitive de l'oeil cataracté et par conséquent cela peut entrainer un stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme la constipation (absence de fèces), selles liquides. Les atteintes rétiniennes par un laser n'entraine aucune douleur et hémorragies. Le côté thermique du laser aura pour effet de cautériser les saignements. Le seul impact délétère pouvant être une atteinte de la capacité visuel de l'oeil traité. Si cela était le cas, le stress induit sera alors surveillé selon les mêmes critères que pour les atteintes du cristallin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésiant sous anesthésie générale.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois le laser chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de l'histologie du cristallin.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour l’expérimentation pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type de traitement laser indolore.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant tout manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (anesthésie générale pendant le traitement laser et les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie et la technique laser se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Le traitement est indolore. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que le traitement soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

2 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui provoque une fibrose de la peau et un phénotype "dommageable" (posture voûtée, pelage hirsute, organes thoraciques plus gros), et subissent biopsies d'oreille, prises de sang et administrations d'un traitement pendant six semaines. Le porteur indique retenir la lignée selon le critère "requis par le client". Les animaux sont tués pour prélèvements, le remplacement étant écarté au motif qu'un "organisme entier" est nécessaire.

Objectifs

Le but de ce projet est de caractériser un modèle de souris atteintes de fibrose de peau et d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’un traitement sur ce modèle. Ces souris sont issues d’une mutation spontanée. Bien que le mécanisme ne soit pas clairement établi, cette mutation conduirait à une augmentation de la matrice extracellulaire et une fibrose des tissus concernés. Cette lignée mutante est utilisée en recherche pour étudier les pathologies humaines lourdes liées à la fibrose et ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêt pour des études cliniques.

Bénéfices attendus

Cette lignée mutante est utilisée en recherche pour étudier les pathologies humaines liées à la fibrose comme le syndrome de Marfan, la sclérodermie, l’emphysème pulmonaire ou la cardiomégalie. Ce sont des pathologies lourdes pouvant être très handicapantes, voire léthales et pour lesquelles aucune thérapie efficace n’existe. C’est pourquoi il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués et de développer de nouvelles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêt pour des études pré-cliniques et cliniques.

Procédures

Prélèvements sur animaux vigiles : une biopsie d’oreille (durée environ 20s), sang (veine saphène ou submandibulaire ; maximum 1/sem pendant 6 semaines maximum; il faut compter environ 3 min pour un prelevement de sang). Un prélèvement terminal sur animaux anesthésiés : sang par voie retro-orbitaire (environ 3 min). Administration sur animaux vigiles : sous cutanée ou intra-péritonéale ou intra-veineuse ou orale pendant 6 semaines maximum (il faut compter environ 1 min par admnistration).

Impact sur les animaux

Les souris mutantes ont un phénotype dommageable et présentent une hyperplasie du tissu conjonctif, du cartilage et des os. En revanche, les tendons sont plus courts en comparaison à des souris contrôles. Aussi, les organes thoraciques (cœur, poumons) sont plus gros, mais les autres organes ne sont pas affectés par la mutation. Les mâles et femelles mutants sont fertiles mais leur performance de reproduction est légèrement inférieure à la normale. Selon la littérature, les animaux mutants sont reconnaissables dès 7 jours par la « rigidité » cutanée et à mesure que les souris vieillissent, les souris développement une posture voutée et un pelage hirsute. Il n’y a cependant à notre connaissance aucune donnée dans la littérature sur une mortalité prématurée des souris mutantes. Ces animaux seront surveillés quotidiennement et une grille d’observation a été établie afin de limiter les effets indésirables sur les animaux.

Devenir

Mise à mort. Des prelevements tissulaires pour analyse seront effectués sur les animaux.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.

Réduction

La stratégie expérimentale permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés puisque : - seules des molécules candidates optimisées in vitro seront testées sur l’animal - les deux sexes pourront être utilisés, - les souris mutante et contrôles seront issues de la même portée permettant ainsi d’utiliser des tests statistiques plus puissants avec un nombre d’animaux limités. Au cours de l'étape de validation du modèle des tests statistiques adaptés seront appliqués dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés : tests statistiques paramétriques de type Student’s t-test, pour comparer les groupes 2 à 2, ou ANOVA, pour comparer plusieurs groupes.

Raffinement

La stratégie expérimentale permet de réduire la souffrance et l’angoisse des animaux puisque le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement par l’observation générale des signes cliniques (week-ends et jours fériés inclus). Les animaux présentant des signes de souffrance seront pesés et suivis quotidiennement selon une fiche d’observation/points limites. Les animaux ayant atteint les points limites seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

La finalité de ce projet est d’évaluer une thérapie sur un modèle animal présentant une fibrose de peau. La lignée murine Tsk1 correspond au critère requis par notre client (phénotype, croissance rapide, données dans la littérature, ...), c’est pourquoi cette espèce est utilisée dans ce projet. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte pour le maintien de lignée et l’obtention de jeunes souris. Aucun animal n’est gardé au-delà de 10 mois, âge auquel la reproduction est moins efficace (Procédure 1). Dans les études, les animaux sont utilisés entre 5 et 12 semaines d’âge (Procédure 2). L’utilisation de ces souris nous permet de faire un parallèle avec l’Homme et de couvrir une période au cours de laquelle le traitement serait potentiellement utilisé.

468 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Ces souris génétiquement modifiées deviennent progressivement aveugles, et reçoivent dans l'œil une injection de vecteurs viraux sous anesthésie, suivie de tests visuels répétés. Le porteur reconnaît que l'injection, geste délicat, peut provoquer des lésions irréversibles, tout en espérant restaurer en partie la vision pour tester une thérapie génique contre le syndrome de Bardet-Biedl. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut reproduire un organe aussi complexe chez un animal aussi jeune.

Objectifs

Le principal objectif de ce projet est de déterminer si, dans le cadre d'une maladie rare telle que le syndrome de Bardet Biedl (BBS), il est possible de développer un traitement basé sur de la thérapie génique pour ralentir l'atteinte de la rétine qui est observée chez les animaux modèles de cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous espérons restaurer au moins partiellement l'atteinte de la rétine qui est habituellement observé chez les 3 modèles murins Bbs étudiés. Le projet que nous proposons devrait servir à valider le schéma experimental proposé. Nous pourrons alors envisager de l'appliquer à d'autres modèles murins. Ce projet pourrait être considéré comme une étude préclinique pour la mise en oeuvre d'un traitement de la dégenerescence rétinienne des patients BBS par thérapie génique.

Procédures

L'injection dans l'oeil des souris se déroule sous anesthésie générale et dure au maximum 1 minute par animaux et sera réalisé une seule fois à 14 jours sur toutes les souris, tous génotypes confondus. Pour mise en évidence un potentiel effet bénefique de cette injection, nous comptons soumettre toutes les souris à 3 tests fonctionnels différents. L'ERG (Electrorétinogramme) permet d'enregistrer le signal électrique généré par les cellules de la rétine suite à un stimulation lumineuse. Il sera réalisé sur des animaux sous anesthésie générale et dure au maximum 20 minutes. L'OCT (tomographie en cohérence optique) est basé sur le principe de l'échographie et permet de visualiser et mesurer l'épaisseur des différentes couches de la rétine. Il est également réalisé sur des animaux sous anesthésie générale et l'acquisition des photos ne dépasse pas 10 minutes. L'optomoteur permet de tester si les souris voient correctement en déterminant si elles sont capables de suivre le décor tournant qui les entoure. Il est réalisé sur des animaux vigiles et dure entre 30 minutes et 1 heure. Ce trio de tests sera répété 2, 3 ou 4 fois afin de suivre d'évolution de l'effet en fonction du temps.

Impact sur les animaux

Les 3 lignées de modèles murins Bbs que nous allons étudier deviennent progressivement aveugles dès 10 semaines. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui naissent en étant plus petits que des souris génétiquement modifiées. L'injection dans l'oeil que nous allons réaliser est un geste délicat qui s'il est mal executé peut mener à des lesions irréversibles et ainsi rendre les animaux aveugles. De la même manière, l'ERG et l'OCT sont des tests nécessitant une anesthésie durant lesquels les yeux des animaux doivent être hydratés fréquemment pour limiter les risques de cataracte résiduelle. Par contre, l'effet attendu suite à l'injection devrait être bénéfique pour les animaux car nous nous attendons à ce que les souris Bbs traitées aient une vision restaurée par rapport à leurs congénères non traités et nous espérons que cette restauration soit maintenue dans le temps.

Devenir

Dans un premier temps, les animaux utilisés dans les croisements pour la génération des cohortes d'animaux explorées seront gardés en vie. A la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiées.

Remplacement

Le recours à n’importe quel autre modèle alternatif (cellulaire, informatique…) ne permettrait pas l’étude d'un organe aussi précocément (14 jours de vie) avec une telle diversité et complexité cellulaire comme chez la souris. Dans notre cas, l’utilisation d’un modèle murin permet d’avoir un modèle proche de la maladie humaine et de pouvoir effectuer les tests in vivo tels que l'électrorétinogramme (ERG), la tomographie par cohérence optique (OCT) et l'optomoteur qui mesurent les capacités visuelles des souris et aident à déceler une potentielle atteinte rétinienne.

Réduction

Les effectifs pour chaque analyse ont été déterminés d’après la littérature en prenant en compte la variabilité interindividuelle, la vulnérabilité des modèles murins étudiés. Ils correspondent aux nombres minimaux de souris à inclure pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et exploitables entre les différents groupes étudiés. Nous nous sommes également basés sur d’autres études publiées sur d'autres modèles murins Bbs (Bbs1, Bbs4 …) pour confirmer ces effectifs.

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupes sociaux pour éviter l'appartition de comportements anormaux ou de stéréotypie. Un milieu enrichi en coton de nidification, tubes cartonnés et morceaux de bois sera mis à leur disposition pour les occuper et réduire leur stress, ils pourront ainsi occuper l'espace de leur cage, ronger et les femelles pourront contruire le nid qui accueillera et réchauffera leurs nouveaux-nés. Ils auront accès à l’eau et la nourriture « ad libitum ». Nous nous assurerons du bien-être des animaux en contrôlant le pelage, l’aspect général des souris, leurs comportements individuels et vis-à-vis de leurs congénères. Une observation quotidienne et une pesée hebdomadaire permettront de détecter les souris présentant des signes de souffrance, douleur, détresse. Nous avons établi, en annexe, des points limites à rechercher afin de soutraire les animaux à la souffrance

Choix des espèces

L’utilisation d’un modèle murin de syndrome de Bardet-Biedl (BBS) permet d’avoir un modèle proche de la maladie humaine et de pouvoir effectuer les tests fonctionnels nécessaires à l’étude tels que tomographie par cohérence optique (OCT) et l’électrorétinogramme (ERG) qui mesurent les capacités visuelles des souris et permet de déceler la dégénérescence rétinienne. Ces tests sont des tests applicables à l’homme ce qui les rendent pertinents dans le cadre de ce projet qui étudient des modèles murins de maladies génétiques rares humaines. On ne peut pas substituer notre étude "in vivo" par des études "in vitro" puisqu'il est impossible d'obtenir un système intégré et une diversité cellulaire similaire à la rétine, à un stade aussi précoce. Pour ce projet, nous effectuerons l'injection dans les yeux des souris à 14 jours : âge à partir duquel elles ouvrent les yeux puis nous poursuivrons nos expériences jusqu'à l'âge de 8 mois.