Troubles sensoriels

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée une plaie cutanée qu'on infecte par des bactéries avant de poser un pansement au chitosane, avec un suivi par imagerie sous anesthésie pendant cinq à quatorze jours. Le porteur indique que l'infection peut provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie. Il présente l'étude comme une preuve de concept préalable à des tests sur "gros animal" puis à un essai clinique humain.

Objectifs

Les infections de plaies traumatiques et chirurgicales sont un problème majeur dans le domaine médical. L’émergence de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques est un phénomène inquiétant. La notion de «bon usage » des antibiotiques doit être élargie à la notion de « moindre usage ». Dès lors, il existe un besoin croissant d’utilisation de produits antimicrobiens topiques (application directement sur le site d'infection) pouvant être appliqués sur des plaies potentiellement infectées. Le chitosane est utilisé pour de nombreuses applications médicales et pharmaceutiques. Les préparations de chitosane ont beaucoup attiré l’attention en raison de leurs propriétés biologiques potentiellement bénéfiques. Ces propriétés incluent notamment l'hémostase (la coagulation), l'activité antimicrobienne et la stimulation de la guérison. L'activité antimicrobienne à large spectre du chitosane a suggéré qu'il pourrait être utilisé comme pansement pour plaie.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de montrer qu’un pansement guérit une plaie cutanée infectée sans traitement antibiotique : c’est une alternative à la thérapie actuelle, lourde et source de résistance aux antibiotiques. Cette preuve de concept sera un préalable à une étude de confirmation sur gros animal et ensuite un essai clinique chez des patients humains.

Procédures

Les souris subiront une intervention chirurgicale sur la peau (création de la plaie + traitement, 30 minutes en tout) puis seront suivies 5 jours (18 souris, 5 suivis) ou jusqu'à 14 jours (24 souris, 8 suivis) par imagerie PhotoImageur. Chaque procédure PhotonImageur dure 5 minutes (les souris seront anesthésiées).

Impact sur les animaux

L’expérimentation implique l'anesthésie, la réalisation de la plaie, l’inoculation des bactéries, la pose du pansement avec une suture, puis la réalisation d’imagerie. L’infection provoquée pourra provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie cutanée.

Devenir

Suite à l’euthanasie, la plaie sera observée : - Signes inflammatoires locaux - Présence d’abcès - Taille de la plaie. Une analyse bactériologique et histologique sera réalisée sur chaque plaie avec les tissus adjacents.

Remplacement

En raison des interactions complexes entre l'hôte et l'agent pathogène, les systèmes in vitro ne peuvent pas reproduire fidèlement les conditions d'infection et de guérison des tissus. Il est donc nécessaire de disposer de modèles animaux qui reflètent l'infection des tissus pour évaluer les stratégies d'ingénierie tissulaire.

Réduction

Un suivi par photonimagerie diminue le nombre de souris nécessaires à l’étude en permettant un suivi bactérien longitudinal et en évitant les sacrifices aux temps intermédiaires. L’étude sera réalisée sur 6 souris par groupe et les résultats seront analysés avec les tests statistiques adaptés.

Raffinement

- Un personnel qualifié sera mobilisé autour des animaux avant, après et pendant les interventions. Le chirurgien est chevronné. - Les conditions expérimentales ne provoquent pas de contraintes pouvant affecter le bien-être des animaux : pas de diminution de l’enrichissement ni de la socialisation, accès normal à l’eau et à l’aliment et respect des comportements normaux. L’hébergement est réalisé en cages ventilées individuellement. Elles sont stérilisées par autoclavage. L’enrichissement est adapté. - Des protocoles précis de prémédications, d’analgésie, d’anesthésie et de mise à mort sont mis en place. - Plusieurs points limites éthiques généraux et spécifiques seront suivis tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les résultats de cette étude préclinique serviront pour la prise en charge de plaies infectées avec la mise en place d’un nouveau pansement. Cette étude ne peut en effet être réalisée directement chez le patient mais détient un potentiel translationnel car elle est réalisée chez le mammifère. La souris est un modèle couramment utilisé dans les études sur la cicatrisation de la peau et l’effet de différentes modalités de traitement. La région dorsale sera utilisée pour l’évaluation des pansements pour la réduction des possibilités de grattade par la souris et la facilité d’évaluation quotidienne. L’utilisation des souris permet de répondre à un certain nombre de questions et d’être prédictif des résultats chez l’homme car il tient compte de la biologie tissulaire. En effet, le modèle animal cherche à répliquer l’environnement biologique et la réponse biologique face aux bactéries. Les souris seront âgées de 7 semaines et pèseront environ 20-25gr. Des souris âgées de plus de 6 semaines sont choisies afin qu'elles aient atteint une taille adulte pour diminuer les risques anesthésiques et pour faciliter l'intervention chirurgicale. Toutes les souris auront le même âge pour une meilleur comparaison des résultats mais également pour que la taille de la plaie soit proportionnelle à la taille de la souris.

1 800 rats et souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des plaies circulaires leur sont découpées à l'emporte-pièce sous anesthésie, entourées d'un anneau collé et suturé, et suivies jusqu'à quinze semaines chez des animaux souvent rendus diabétiques et hébergés seuls. Le porteur indique que ces plaies provoquent une douleur modérée et peuvent s'infecter, les animaux étant anesthésiés jusqu'à deux fois par semaine pour photographier les plaies puis tués pour prélever peau et sang. Il affirme que les modèles cellulaires ne reproduisent pas la réparation d'un tissu vivant, ce qui justifierait le recours au rongeur.

Objectifs

L’objectif est de tester l’efficacité cicatrisante de composés chimiques ou biologiques dans le cadre de la cicatrisation de plaies, notamment chez le sujet diabétique qui est plus enclin à développer des plaies non cicatrisantes, avec à la clef des complications infectieuses et nécrosantes. Il est estimé que 20 % de toutes les hospitalisations pour le diabète sont liées à des complications de lésions cutanées au niveau du pied. En effet, le risque de gangrène chez le sujet diabétique est multiplié par 17 comparé à celui de la population non diabétique. Les amputations consécutives à des lésions de gangrène, de nécroses, ou d'ulcérations sont chiffrées à plus d’un million par an dans le monde. Il est donc essentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour favoriser la cicatrisation et ainsi éviter la chirurgie d’amputation chez le sujet diabétique. Dans ce contexte, un modèle animal est nécessaire pour étudier les différentes phases de la cicatrisation, car les modèles cellulaires in vitro ne permettent pas de mimer tous les processus mis en place lors de la réparation tissulaire in vivo, avec l’implication de types cellulaires différents au cours du temps. Les composés chimiques ou biologiques évalués dans ce projet seront pré-sélectionnés in vitro sur des critères d’efficacité et de faisabilité de développement, afin de limiter le nombre de produits à tester chez l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour accélérer la cicatrisation de plaies. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies pour les plaies étendues et/ou à cicatrisation trop lente, par exemple chez les diabétiques.

Procédures

Des biopsies de peau (plaies circulaires de petite taille) seront réalisées sur des rats ou souris diabétiques et potentiellement non diabétiques anesthésiées avec analgésie (anesthésie d’une heure environ, une fois dans l’étude), à l’emporte-pièce, puis des anneaux de caoutchouc ou silicone seront fixés autour de la plaie (colle chirurgicale et sutures), et les plaies seront protégées par des pansements. Si les sutures d’un anneau venaient à se rompre, elles seraient reprises sous anesthésie générale (anesthésie d’environ une heure). Suite à cela, les animaux devront être hébergés individuellement, dans des cages à parois transparentes leur permettant de voir leurs congénères. Les études dureront au maximum 15 semaines et la cicatrisation des plaies sera suivie. Les animaux pourront recevoir des traitements pour vérifier l’effet de ces traitements sur la cicatrisation. Les traitements douloureux seront réalisés avec une analgésie préalable et sous anesthésie (une heure d’anesthésie environ). Les traitements stressants seront réalisés sous anesthésie (une heure environ). Les traitements peu stressants seront réalisés vigile (5 minutes environ). Les traitements seront réalisés au maximum 3 fois par jour sur toute la durée de l’étude (maximum 15 semaines). Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine (manipulation d’un quart d’heure), manipulés pour observer les plaies tous les jours (manipulation d’un quart d’heure), et anesthésiés pour photographier les plaies au moins 2 fois par semaine (anesthésie une heure). Des prélèvements sanguins et urinaires pourront être réalisés durant l’étude si besoin de mesurer le taux de produit circulant ou d’autres biomarqueurs pertinents. Les prélèvements peu stressants seront réalisés vigile (10 minutes environ) et les prélèvements stressants seront sous anesthésie (1 heure environ). Au maximum, 3 prélèvements par jour seront réalisés. En fin d’étude, les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de sang et de peau.

Impact sur les animaux

Des plaies seront induites chez les animaux, et celles-ci cicatriseront plus ou moins lentement selon les animaux (cicatrisation particulièrement lente chez les animaux diabétiques). Ces plaies induiront une douleur modérée et potentiellement une légère réduction de mobilité. Des traitements antalgiques seront mis en place si besoin, et de l’eau et de la nourriture gélifiée seront mises en place en fond de cage. Les signes d’infection seront suivis tout au long de l’étude (3-4 semaines) car ces plaies de longue durée pourraient avoir tendance à s’infecter. En cas d’utilisation d’animaux diabétiques, ceux-ci présenteront de facto un phénotype dommageable (diabète).

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes, de peau et de grands volumes de sang.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être évaluée chez le rongeur.

Réduction

Nous estimons qu’un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe sera nécessaire pour observer une réduction significative d’un seul paramètre d’intérêt (taille de la plaie). Ce nombre pourrait monter jusqu’à 12 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement (analyse histologique). Les effectifs minimums seront réévalués à l’issue des premières études afin de trouver le bon compromis entre réduction du nombre d’animaux et atteinte des seuils de significativité statistique.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. En cas de perte de poids, ils seront réhydratés. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. La douleur est évaluée pour décider de la nécessité d’administrer un traitement antalgique et l’atteinte des points limites. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation. Si les signes persistent, une décision de suivi ou d’euthanasie devra être prise. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus constatés lors des premières études et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. Les souris et rats diabétiques boivent beaucoup et urinent beaucoup, donc les cages et biberons seront donc changés tous les jours. Afin de pouvoir si possible limiter l’hébergement individuel, des essais d’habituation au pansement seront réalisés lors des études pilotes.

Choix des espèces

Les troubles de la cicatrisation chez les rats diabétiques et souris diabétiques des deux sexes sont bien documentés et s’apparentent à ceux observés chez les humains diabétiques. Des rats ou souris hétérozygotes pourront être utilisés comme contrôles de par leur proximité génétique mais leur absence de phénotype dommageable. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum). En effet, dans la bibliographie, les études de cicatrisation chez les animaux diabétiques sont réalisées sur des animaux adultes.

6 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur œil est exposé à un laser d'imagerie dont la puissance dépasse d'un facteur dix la norme au niveau de la cornée, le porteur indiquant que des ulcères, des lésions ou une cataracte peuvent apparaître, puis ils sont tués pour analyse histologique des tissus oculaires. L'objet est de vérifier l'innocuité d'un dispositif développé par une entreprise avant un éventuel passage chez l'humain. Le porteur affirme que ce test doit "obligatoirement" être mené in vivo, aucun modèle ex vivo ne pouvant reproduire l'œil.

Objectifs

Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) permettant d'effectuer des images proches de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer l'innocuité sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin)comme la constipation (absence de fèces), selles liquides.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'œil sous sédation. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois : à J0 (x2 + imagerie avec la nouvelle technique d'OCT), J2 et J7 pour le groupe 1 ou J0 préop post, J2 et J21 pour le groupe 2. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT (docking + imagerie) durera 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'éclairement du laser du LC OCT est de 0.82 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35).Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).

Devenir

En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type d'imagerie indolore.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (séfdation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentative de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour du D-galactose par voie intrapéritonéale pendant huit semaines pour induire un vieillissement accéléré, avec prélèvements sanguins, traitements et mesures cutanées, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur indique des effets indésirables possibles des molécules testées, perte de poids et irritations cutanées. Sur le remplacement, il affirme que le modèle animal est "incontournable" et qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du vieillissement de l'"organisme entier".

Objectifs

À l’échelle mondiale, la proportion de personnes âgées de 60 ans et plus est en constante augmentation depuis plusieurs années. En France, d’après les projections de l’Institut national de la statistique et des études économiques (Insee), un individu sur trois aura 60 ans et plus en 2050 (ils étaient un sur cinq en 2005). Accompagner ce vieillissement de la population est donc devenu un enjeu de santé publique mais aussi socio-économique. Ces dernières décennies, de nombreux modèles animaux de vieillissement ont été développés. Dans ce projet, on utilisera un modèle murin de vieillissement accéléré induit par le D-galactose avec pour objectif d'évaluer l'efficacité de nouvelles approches à visée thérapeutique. Le D-galactose est un nutriment physiologique, il s'agit d'un sucre réducteur qui, lorsqu'il est administré en excès chez la souris, contribue à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), à un dysfonctionnement mitochondrial, à la formation excessive de produits glyqués et est associé à de l'inflammation et à un déclin progressif des capacités cognitives. Ces changements miment le processus de vieillissement dans différents tissus et organes incluant le cerveau, le coeur, les poumons,le foie, les reins, le système reproducteur, la peau, les os, les muscles squelettiques, la réponse immunitaire et dans le sérum. Ainsi, ce modèle présente des caractéristiques mimant la senescence du vieillisement naturel et est adapté à l'évaluation d'efficacité de nouvelles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le vieillissement est un processus physiologique qui intervient chez tous les êtres vivants. Il correspond à un déclin qui altère, à l’échelle moléculaire et cellulaire, les capacités fonctionnelles de l’individu et ses possibilités d’adaptation face à un évènement aigu auquel il est confronté (une maladie, un stress). Dans le contexte biologique, le vieillissement se caractérise par l’accumulation d’évènements qui détériorent les fonctions des organes, et par une augmentation, avec le temps, des risques de décès ou de développer des maladies (cancer, diabète, troubles cardiovasculaires ou cérébraux, etc.). La recherche biologique sur le vieillissement s’intéresse, par définition, à l’étude de cette accumulation d’innombrables évènements inévitables qui apparaissent au cours de la période comprise entre la conception et le décès de l’individu. Il est donc important d'avoir un modèle préclinique prédictif du vieillissement afin d'évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le but d'appréhender le vieillissement de manière à "vieillir mieux".

Procédures

Les animaux seront administrés quotidiennement par voie intrapéritonéale (durée d'intervention

Impact sur les animaux

Dans la littérature, il n'y a pas d'effet indésirable décrit pour ce modèle de vieillissement accéléré. Des effets indésirables peuvent être observés lors de l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance pouvant entraîner une perte de poids, irritation en cas d'application topique...

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de prévlever les tissus et réaliser des analyses ex vivo (histologie, dosages de cytokines, dosages enzymatiques...) pour l'évaluation d'efficacité des traitements testés.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est incontournable afin d’étudier les mécanismes du vieillissement, mais aussi afin d’améliorer la compréhension des processus impliqués dans la survenue des syndromes de vieillissement accéléré. Il est indispensable d'améliorer les connaissances sur le vieillissement et les pathologies qui y sont associées. La complexité du vieillissement physiologique repose en fait sur la globalité de son impact : il intéresse l’ensemble des organes ; il est modulé par des facteurs qui peuvent être internes (c’est-à-dire physiologiques) mais aussi externes (environnementaux). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du vieillissement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décrits pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine.

Réduction

La stratégie d'expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale). Cette approche expérimentale permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA) et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d'initier les phases de traitement. Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester ou la molécule à tester). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15%, une puissance de 70% et une différence à souligner de 20% entre groupes témoins et tests comparativement à l'approche classique. Cette approche permet donc de réduire le nombre d'animaux de 50% au moins. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par l’expérimentateur afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson, comportement...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, igloo, cotons,bâtonnets de bois) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué au 2 fois par semaine, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. De la nourriture humidifiée ou du gel diététique pourra être ajouté dans leur cage. Au moindre signe de déshydratation, les animaux recevront une injection intra-péritonéale de sérum physiologique (20mL/kg). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Etre Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et /ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation; - Perte de poids >20% du poids normal maintenue sur 72h; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication au site d'injection (présence de plaie, douleur...) Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs se sont rapidement imposés au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. L’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique (faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales) ; l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes de plus de 8 semaines d'ages seront utilisés dans ce projet (cf Parameshwaran K et al, Rejuventation Research, 2010).

80 souris et 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés jusqu'à 168 heures dans des cages à métabolisme, sur grille et exposés à la lumière, ce que le porteur décrit lui-même comme un inconfort, après administration de candidats médicaments par diverses voies. Ces études d'excrétion s'inscrivent dans le cadre réglementaire obligatoire pour la mise sur le marché d'un médicament, et les animaux sont tués pour doser ce qui reste dans leur corps. Le porteur indique qu'il n'existe "aucun modèle in vitro" applicable à l'excrétion dans un organisme vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées dans le cadre des études de pharmacocinétique réalisées chez les rat ou les souris. Chaque étude permet d’évaluer le devenir de molécules contenues dans un candidat médicament dans l'organisme. L’objectif est de récolter des données concernant la quantité des molécules excrétées par rapport aux quantités administrés ainsi que de déterminer la durée d’excrétion. Après l'administration, des recueils d’urines, fèces ou de bile pour mesure de la concentration de la molécule seront réalisés. L’objectif de ces tests n’est pas de démontrer une efficacité de la molécule ou de mettre en relief les effets secondaires possibles, mais de démontrer que le produit est bien excrété du corps après une période définie.

Bénéfices attendus

Ce type d'étude permet de comprendre comment et pendant combien de temps des molécules sont excrétées de l'organisme après leur administration et sont nécessaires pour évaluer la sécurité d'un médicament.

Procédures

Les animaux sont placés individuellement dans les cages pendant une certaine durée : Pour les études d’excrétion biliaire (procédure 1), 3 à 4 jours d’acclimatation des rats sur litière + 24h maximum dans les cages à métabolisme. Pour les animaux utilisés pour les études d’excrétion urine et fèces (procédure 2), la durée, seul dans les cages à métabolisme, est au maximum de 168h. Les administrations iv, vaginale, rectale, oculaire, intranasale, intra-auriculaire, topique sont réalisées une seule fois sous anesthésie en moins d'une minute Les administration PO sont réalisées une seule fois sur animaux vigile en moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans le cas des études pour récupérer l'urine et fèces, les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme. Les animaux sont seuls dans la cage, sur grille et plus exposé à la lumière que dans les cages classiques, ce qui provoque un inconfort chez l’animal et ne correspond pas à son environnement habituel.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’étudier l’excrétion d’une molécule dans un organisme vivant. Un autre modèle n’est pas applicable dans la mesure où ces études rentrent dans un cadre réglementaire obligatoire pour la sécurité d'un médicament.

Réduction

Pour les études réglementaires le nombre minimum utilisé est défini par les guidances. Pour les études précoces dans le développement d’un médicament, un nombre d’animaux inférieur ou égal à celui recommandé par les guidances est utilisé. Dans la mesure du possible un maximum de données est collecté sur un même animal afin de ne pas avoir à reproduire l’expérimentation.

Raffinement

Une procédure de point limite est en place au laboratoire. Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, les cages sont regroupées sur le même portoir afin que les animaux soient proches l’un de l’autre pour favoriser le lien et la communication entre animaux (instinct grégaire). Une plaque métallique finement perforée est ajoutée dans les cages afin de permettre à l’animal de se reposer. Des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites (voir annexe) basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort.

Choix des espèces

Les espèces rat ou souris seront utilisées conformément aux guidances techniques. Le choix de l’espèce pour chaque étude sera en cohérence avec les espèces utilisées pour toutes les études nécessaires pour le dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) de la molécule. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 6 à 12 semaines conformément aux recommandations de la règlementation.