Troubles sensoriels

15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La peau de leur dos est incisée à trois endroits sur 4 cm en une seule chirurgie sous anesthésie, puis ils sont mis à mort à J21 pour prélever la ligne de suture et évaluer la cicatrisation. Le porteur compare des colles de suture développées par son laboratoire à des techniques courantes, dans une étude pilote de trois réplicas par formule. Il indique que le lapin est choisi parce qu'il tolère un gilet de protection là où les rongeurs arrachent la suture, et qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les forces mécaniques d'une plaie.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de différentes formules de suture nouvelle génération développées par notre laboratoire (comparativement à des techniques utilisées couramment) pour la suture d’incision chirurgicale. 1 – évaluer la qualité de la cicatrisation en fin du processus cicatriciel : un prélèvement histologique sera réalisé à J21 à la fin de la phase de ré-épithélialistaion de la plaie. 2 – évaluer la durée de cicatrisation : un contrôle visuel 2 fois par semaine permettra d’évaluer le stade de cicatristaion de la plaie.

Bénéfices attendus

La suture de plaie traumatique ou d’incisions chirurgicales est réalisée soit par colles chirurgicales, soit par un fil de suture, soit une agrafe. La suture par fil/agrafe créé des lésions du derme et implique la présence d’un corps étranger dans la suture, engendrant un risque d’apparition d’une infection cutanée post-opératoire. Ils ont également comme inconvénient de ne pas stabiliser parfaitement la plaie lorsque des tensions sont exercées dessus. Le bord à bord des berges cutanées est maintenu uniquement au niveau du point de suture ; ceci a pour conséquence de rouvrir la plaie, gênant la cicatrisation et laissant une cicatrice fibreuse voire des cicatrices hypertrophiques ou chéloïde. Des rapports montrent que l’incidence de la formation d’une cicatrice hypertrophique après une chirurgie se trouve entre 33% et 91%. D’après l’enquête nationale de prévalence des infections nosocomiales en France, la prévalence des patients infectés était de 4,97% en 2006 (au niveau du site opératoire dans 14% des cas). Ainsi, l’utilisation d’une colle chirurgicale ayant une force d’adhésion équivalente à une suture permettrait de résoudre les limites détaillées cidessus (bord à bord parfait, pas de corps étranger, pas de lésion, une parfaite stabilisation des berges de la plaie…). Les seuls produits actuellement utilisées pour cette application sont les colles de cyanoacrylate (Leukosan). Elles ont pour avantage d’avoir un temps de prise rapide et une haute résistance au déchirement. Cependant leurs faibles propriétés adhésives à la peau font qu’elles ne sont indiquées que pour les sutures de petites plaies avec un taux de déhiscence de 20%. Elles ne peuvent ainsi pas être utilisées en alternative d’une suture par fil ou agrafe. L’étude des propriétés adhésives des colles chirurgicales actuellement commercialisées montre que la faible adhérence de ces colles est due au fait qu’elles se fixent sur la surface desquamante des tissus biologiques. Or, il s’avère que l’adhésion à un tissu biologique repose sur un ancrage à son extrême surface. Les produits testés dans cette étude reposent sur ce principe. Cet ancrage à la superficie du tissu permet d’atteindre des performances techniques inégalées (équivalente à une suture par fil et dix fois supérieures aux colles chirurgicales)

Procédures

Procédure chirurgicale d’incision et suture cutanée sous anesthésie générale. L’anesthésie durera 30-45 min.

Impact sur les animaux

La peau du dos de l’animal va être incisée à 3 endroits en une chirurgie. Chaque incision mesurera 4 cm de long. L’animal sera endormi généralement au cours de la chirurgie. Pour limiter la douleur ressentie, l’animal recevra un traitement antiinflammatoire en pré chirurgie puis toutes les 24h jusqu’à ce que l’animal ne présente plus de signes cliniques d’inconfort. Au cours de l’anesthésie, l’animal pourrait se refroidir. Pour pallier cet inconfort qui pourrait engendrer une mauvaise récupération des suites de l’anesthésie, l’animal sera placé sur un tapis chauffant tout le long de la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort. A 21 jours, à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie, les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront réalisés le long de la ligne de suture pour évaluer la qualité de la cicatrisation.

Remplacement

Les plaies traumatiques et les incisions chirurgicales sont des plaies complexes qui touchent les différentes structures de la peau (allant de l’hypoderme à l’épiderme) et qui subissent des forces mécaniques qui peuvent être importantes en fonction de la localisation de la plaie. Il n’existe donc pas de modèles in vitro permettant de prendre en compte tous ces paramètres. Par ailleurs dans le développement d’un nouveau dispositif médical, il est nécessaire de tester les formulations sélectionnées sur des modèles animaux afin d’appréhender la biocompatibilité des matériaux avant le passage chez l’Homme.

Réduction

Cette étude est une étude pilote qui nous permet principalement de faire de l’imagerie pour observer les différences sur le processus cicatriciel en fonction de la solution de suture utilisée. Pour chaque formule trois réplicas seront réalisés afin de pouvoir observer et comparer la cicatrisation sur 3 individus (lapins). Ces 3 réplicas nous permettrons également de comparer la différence de temps de cicatrisation entre différentes solutions de suture.

Raffinement

Les animaux bénéficient de plateforme dans leurs cages, de jouets et de morceaux bois à ronger dans leur environnement de vie. Les animaux recevront un traitement anti-inflammatoire et antalgique les 3 premiers jours post opératoire qui permettra de réduire la douleur ressentie. Le traitement pourra se poursuivre en fonction des signes cliniques observés quotidiennement les jours suivants. Les animaux seront suivis environ 21j le temps de la cicatrisation puis seront mis à mort.

Choix des espèces

Les modèles animaux préférentiellement utilisés dans la littérature dans ce type d’expérimentation sont les rongeurs, le lapin ou encore le porc. Les rongeurs ont tendance à retirer/arracher tout corps étranger présent sur leur peau, ce qui empêche toute chance de conclusion sur l’efficacité d’un système de suture de plaie. Chez le lapin, il est possible de protéger la zone lésée grâce à un gilet de protection conçu sur mesure. Ce gilet permet à la plaie de cicatriser sans que l’animal ne sollicite sa suture. Ces gilets de protection sont conçu pour des animaux mature d’un poids d’environ 2.5kg. Par ailleurs, chez un lapin adulte de 2.5kg, la surface (cm²) du dos adaptée à la réalisation des incisions prévues dans cette étude. Enfin, un animal mature dispose de structures anatomiques cutanée et système immunitaire adaptés aux besoins de l’étude.

1600 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par les établissements partenaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après tonte et dépilation sous anesthésie, un produit est appliqué sur leur dos jusqu'à vingt-quatre fois pour induire un psoriasis, avec des injections sous-cutanées et des pesées répétées. Le porteur attend une perte de poids pouvant atteindre 20 %, un érythème, une desquamation et un épaississement de la peau, et précise que l'élevage préalable conduit aussi à tuer les animaux non sélectionnés. Il affirme ne pas pouvoir se passer de l'expérimentation animale pour cette maladie multifactorielle.

Objectifs

Le psoriasis est une maladie pro-inflammatoire chronique et multifactorielle de la peau (démangeaisons, plaques inflammatoires, …), touchant 2 à 4% de la population française, principalement bénigne et actuellement sans traitement curatif définitif. Dans 20% des cas, des formes sévères sont relevées montrant l’augmentation des risques cardiovasculaires et métaboliques chez ces patients. Le récepteur TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloide 1) est un acteur majeur dans la perception et l’intégration des sensations douloureuses (nociception), et est impliqué dans l’inflammation des couches superficielles de la peau (épiderme externe et derme plus profond), dans de nombreuses maladies, mais son rôle précis au niveau vasculaire local et/ou dans les échanges entre les différents types cellulaires, n’est pas clairement démontré à ce jour. Aujourd’hui, parallèlement à des études pharmacologiques en biologie cellulaire (in vitro sur cultures cellulaires) ou par des analyses biochimiques et de biologie moléculaire sur organes isolés (ex vivo, explants de peau ou prélèvements tissulaires de patient), notre objectif est de caractériser in vivo l’implication du récepteur TRPV1 dans un modèle induit de psoriasis chez des souris génétiquement modifiées. Ce projet inclus 2 procédures expérimentales. La procédure 1, de sévérité legère, est une procédure d'élevage permettant de générer 3 nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées « Knock-Out tissu-spécifique », où l’expression du gène TRPV1, soit le complexe protéique constitutif du récepteur TRPV1 exprimé à la membrane cellulaire, est spécifiquement invalidée dans l’un des 3 compartiments cellulaires suivants : vasculaire (microcirculation vasculaire locale), épidermique (relations entre les cellules constitutives de l’épiderme) ou nerveux (relations entre cellules sensitives), et de sélectionner au maximum de 1600 animaux d’intérêt. Ces animaux seront tous inclus dans la procédure 2, de sévérité modérée, permettant d’induire un modèle psoriasique selon 3 modalités : très court terme / précoce – 3 jours, court terme / aigüe – 6 jours et long terme / chronique – 9 semaines. Au terme de l’induction du modèle pathologique, des analyses fonctionnelles et biochimiques permettront de caractériser finement l’implication du récepteur TRPV1 au niveau des 3 compartiments précédents, de proposer une nouvelle approche de développement de traitements du psoriasis et/ou des pathologies dermatologiques similaires.

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif définitif, seuls des traitements symptomatiques aux résultats transitoires sont proposés aux patients étant atteint d’un psoriasis. L'idée novatrice de ce projet est d'étudier l'implication fine du récepteur TRPV1 et de le placer au centre de la dérégulation de l'équilibre homéostatique (constantes fonctionnelles régulées et maintenues à des valeurs bénéfiques pour l’organisme), incluant l'ensemble des acteurs, et d'identifier si possible le site d'inflammation privilégié (épithélial, neuronale, vasculaire) permettant d'envisager une possible nouvelle voie de développement d’un traitement diminuant le nombre et l’intensité des poussées.

Procédures

Les souris issues des 3 nouvelles lignées KO tissu-spécifique TRPV1, soit au maximum 1600 animaux, obtenues par la procédure 1 – élevage et obtention des 3 lignées de souris LoxP-Cre Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, seront incluses dans la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris et seront donc soumises à 3 types d’interventions : I – en amont du protocole d’induction (procédure 2), chaque souris sera tondue et dépilée (crème VEET « peaux sensibles »), sous anesthésie gazeuse ; intervention réalisée 1 fois et d’une durée maximale de 5 minutes, II – durant le protocole d’induction (procédure 2), chaque souris vigile recevra une application externe / topique de Vaseline® (condition contrôle) ou d’Aldara™ 5% (condition induite), sur la zone dépilée ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce – 3 jours », 5 fois pour la modalité « aigüe – 6 jours » et 24 fois pour la modalité « chronique – 9 semaines » et d’une durée de moins de 5 minutes, III – Durant la procédure 2, chaque souris vigile recevra une injection sous-cutanée préventive de NaCl 0,9% (300µL), après contention manuelle, pour limiter déshydratation générale liée à la procédure d’induction ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce », 3 fois pour la modalité « aigüe » et 6 fois pour la modalité « chronique », d’une durée d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont : I – du stress lors des pesées régulières (entre 2 et 7 fois par semaine, durée inférieure à 30 secondes) diminuant avec l’habituation, II – du stress lors des anesthésies gazeuses générales de préparation (tonte, dépilation) des animaux en amont de l’induction du modèle, de faible intensité (maximum 5 minutes), III – du stress et de l’inconfort lors des manipulations des animaux vigiles pour induire le modèle (application dorsale de crème, injection sous-cutanée préventive, observations comportementales, …), de faible intensité, et se réduisant avec l’habituation à la répétition journalière des opérations (5 minutes par animal et par jour), IV – une perte de poids corporel transitoire, attendue durant les premières 48 heures après début du traitement d’induction et pouvant atteindre 20% maximum, due à une déshydratation générale, soit d’une intensité modérée (maximum durant une semaine), V – L’apparition des « symptômes » induits, caractéristiques du psoriasis (rougeur / érythème, desquamation, épaississement cutané), d’intensité faible à modérée (durée totale de l’expérimentation) et VI - du stress lors de la réalisation des transferts des animaux vers nos partenaires (préparation, conditionnement, nouvel environnement transitoire, vibrations lors du transport, …), de faible intensité, sur 24-48h.

Devenir

Ce projet comporte 2 procédures expérimentales. Lors de la procédure 1 – Elevage et obtention des 3 nouvelles lignées de souris Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, l’apparition éventuelle d’un phénotype dommageable mettrait fin au projet et l’ensemble des animaux seraient mis à mort. Les animaux présentant les génotypes d’intérêt, ainsi que les géniteurs d’intérêt pour la cryoconservation de leurs gamètes, seront gardés en vie. Les animaux non-sélectionnés seront mis à mort. Les animaux sélectionnés en procédure 1, intègreront la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris, où ils seront transférés immédiatement vers nos partenaires (modalité « précoce – 3 jours » et « aigüe – 6 jours ») ou intègreront la modalité « chronique – 9 semaines », où ils débuteront le protocole d’induction du psoriasis, avant d’être transférés, à leur tour, vers nos partenaires, qui se chargeront de finaliser l’induction et de réaliser les expérimentations finales, puis mettrons à mort l’ensemble des animaux. Ils seront donc tous conservés en vie dans notre établissement.

Remplacement

Le psoriasis est une maladie multifactorielle, dont la physio-pathologie implique différents intervenants et composantes au sein de la peau (vasculaires, nerveux, barrière cellulaire, …), ne pouvant être reproduits et étudiés uniquement par le développement de modèles cellulaires et/ou l’utilisation de méthodes alternatives. Nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale et de la mise en place de protocoles in vivo pour prendre en compte l’ensemble de ces aspects.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu afin de réduire au maximum le nombre d’animaux sans compromettre l’interprétation statistique des résultats. De par la variabilité interindividuelle dans les tests fonctionnels finaux, nous devons inclure 20 animaux par double analyse fonctionnelle pour obtenir des résultats robustes. Si les variations des résultats expérimentaux sont « significatives », nous envisagerons de réduire le nombre d’animaux par groupe et ainsi diminuer le nombre global d’animaux nécessaire. De plus, nous limiterons le nombre de groupes « contrôle » dans les 3 modalités d’induction du modèle (précoce - 3 jours, aigüe - 6 jours, chronique - 9 semaines), en utilisant les animaux contrôles de la modalité d’induction « aigüe - 6 jours » pour la réalisation des analyses de la modalité « précoce - 3 jours ».

Raffinement

Les responsables du projet s’assureront du bien-être de l’ensemble des animaux au quotidien, par la réalisation d’observations comportementales et d’évaluations du poids corporel, au minimum 2 par semaine. Si nécessaire et en suivant une échelle de cotation adaptée, les responsables prendront en charge la gestion de la douleur ou du mal-être par une analgésie adaptée, et si un point limite est atteint, pratiqueront la mise à mort immédiate de l’animal concerné.

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle d’étude in vivo est courant en immuno-dermatologie. Son système immunitaire, humoral et cellulaire est largement décrit depuis de nombreuses années et font référence, ce qui nous permettra d’expérimenter sans avoir recourt à des espèces de mammifères plus proches de l’homme. Dans notre contexte, il nous semble d’autant plus pertinent d’induire un psoriasis sur cette espèce, car, commercialement, nous pouvons obtenir des animaux génétiquement modifiés d’intérêt (mutant KO total TRPV1, souris LoxP-TRPV1, souris Cre-tissu spécifique), et créer des souris Cre-LoxP KO spécifique TRPV1 par les méthodologies d’inactivation Cre-LoxP développées dans les années 2000. Le modèle inductible d’inflammation cutanée / psoriasis est documenté depuis plus de 10 ans, utilisé par de nombreuses équipes mondialement et nos partenaires sont rompus à son utilisation. Les 3 nouvelles lignées produites permettront de caractériser l’implication du récepteur TRPV1 au sein de 3 compartiments cellulaires impliqués dans le psoriasis induit chez la souris. Le psoriasis touche l’ensemble de la population, du jeune à l’adulte, avec un pic d’apparition de la maladie chez l’homme se situant entre 20 et 30 ans. Notre étude souhaite évaluer les phases précoces d’apparition du psoriasis, puis l’installation de la pathologie à court terme (phase aigüe) et l’évolution à long terme (phase chronique) dans un modèle induit de dermatite psoriasiforme chez la souris. Nous utiliserons donc des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et dont le poids variera entre 20 et 30g au moment de débuter le protocole d’induction du modèle.

1 452 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection d'iodate de sodium détruit leur rétine pour reproduire une dégénérescence comme la DMLA, puis des molécules candidates leur sont administrées par diverses voies, avec des tests comportementaux mesurant la baisse d'acuité visuelle, avant prélèvement des yeux. Le porteur mène ce criblage pour développer des médicaments et renvoie l'usage chez l'humain à une éventualité. Il qualifie le recours à l'animal de 'stricte nécessité' et d''indispensable', affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit un 'organisme entier'.

Objectifs

Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie in vitro et/ou in vivo, de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de maladies ophtalmologiques avec la mise en place d’un modèle animal de dégénérescence de la rétine chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la baisse d’acuité visuelle et la dégénérescence rétinienne.

Bénéfices attendus

Ce projet se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de molécules thérapeutiques pouvant avoir un effet sur la dégénérescence de la rétine comme observée dans la DMLA ou la maladie de Stargardt. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.

Procédures

tous les animaux subiront une injection systémique de sodium iodate (sauf le groupe 1, sérum physiologique) pour induire la pathologie. l'injection sera unique et se fera par voie intra-péritonéale sur animal vigile. les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 1 mois après l'induction du modèle). selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale ou par voie topique, sur animal vigile. tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Des tests comportementaux pour mesurer l’acuité visuelle seront également réalisés : une fois avant le début des traitements mais après l’injection de sodium iodate afin de confirmer l’induction du modèle et/ou de procéder à l’allocation des groupes (durant la 1ère semaine), puis jusqu’à 1 fois par semaine pendant 4 semaines après l’injection de sodium iodate soit 4 fois maximum pour la durée d’une étude (voir figure en annexe). Le premier type de test dure 5 minutes maximum et chaque animal est testé jusqu’à 10 fois avec un intervalle de 5-10 minutes entre chaque test. Le deuxième type de test dure environ 5 secondes et le test est répété trois fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque répétition.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction du modèle, les animaux vont avoir une diminution de l'acuité visuelle (visible par les tests comportementaux mis en place) qui est liée à une dégénérescence de la rétine sans autre effet indésirable attendu aux doses administrées. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) ni aux tests comportementaux (procédure légère pour tester l’acuité visuelle).

Devenir

euthanasie pour récupérer différents organes, dont les yeux, pour analyses histologiques ou autre

Remplacement

Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ces modèles in vivo permettent de mesurer l’acuité visuelle en reproduisant la physiologie d’un organisme entier. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 6 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (kruskal-wallis test).

Raffinement

Les animaux seront sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement: les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Si les signes persistent au bout de 24h, l’animal sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié.

Choix des espèces

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir en ophtalmologie implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers notre modèle reproduisent au mieux la pathophysiologie de la dégénérescence de la rétine humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’acuité visuelle ou l’histologie de l’oeil, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.

670 animaux non-humains, 520 souris et 150 hamsters dorés, vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les hamsters reçoivent de la testostérone pour élargir leur organe de flanc, les souris subissent des mesures de peau, et tous reçoivent quotidiennement des molécules contre l'acné avec imagerie sous anesthésie et prélèvements sanguins. Le porteur précise qu'aucune analgésie ne sera employée, car elle risquerait d'interférer avec l'analyse. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle capable de remplacer la peau comme tissu vivant et revendique un projet "nécessaire".

Objectifs

Ce projet est nécessaire pour l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques ayant une activité sur l'acné. Ces tests sont requis pour permettre le choix des meilleures molécules ou traitements thérapeutiques avant essai chez l’homme (tests cliniques).

Bénéfices attendus

L'acné est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus à des moments clés de la vie (l'adolescence, la femme jeune) et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints d'acné de guérir de l'acné et de son inflammation, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.

Procédures

Les Hamsters seront tondus pour identification au niveau des organes de flanc (durée d'intervention < 5 minutes), ils recevront le traitement sur les organes de flanc (durée d'intervention

Impact sur les animaux

L'injection de testosterone chez les Hamsters peut avoir une répercussion sur le comportement (augmentation de l'agressivité, excitation, dominance...). Des effets indésirables peuvent être observés lors de l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance pouvant entraîner une perte de poids, irritation en cas d'application topique.

Devenir

A l'issu des procédures tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale (isoflurane afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo pour l'évaluation de l'efficacité des traitements testés.

Remplacement

Nous n'utiliserons le modèle animal d'inflammation provoquée par l'acné qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles alternatifs qui permettent d’effectuer un premier test d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles alternatifs ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau - L’efficacité ne pouvant être complètement testée dans les modèles alternatifs, des premières preuves d’efficacité chez l'animal doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).

Réduction

Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence commercialisé type bétaméthasone). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés immédiatement. L'utilisation de l'imagerie permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du même animal. Les animaux seront anesthésies lors des prélèvements sanguins et les étapes d'imagerie OCT. Aucune analgésie ne sera employée car cette dernière risquerait d'interférer lors de la phase analytique.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris Rhino et hamster) sont d’excellents modèles d'acné. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de l'acné dans ces espèces. De plus, ces animaux présentent des lésions d'acné très semblables à celles observés chez l’humain. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Tous les animaux auront le même âge. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.

1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation entraînant une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent une injection intra-oculaire d'un composé à tester sous anesthésie, puis des examens du fond d'œil, une tomographie et un électrorétinogramme, avant d'être tuées au CO2 et par dislocation cervicale pour prélever les yeux. Le porteur signale que les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des décollements localisés de rétine et de petites hémorragies oculaires. Il présente le travail comme une preuve de concept dont le passage en clinique reste renvoyé au conditionnel.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’identifier des composés ayant un effet neuroprotecteur sur la dégénérescence des photorécepteurs dans un modèle murin de rétinite pigmentaire autosomale dominante. La finalité étant le développement de nouvelles thérapies pour le traitement de maladies rétiniennes héréditaires, pouvant bénéficier au plus grand nombre de patients possibles.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’un ou plusieurs composés sur notre modèle de rétinite pigmentaire autosomale récessive. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique ce/ces composé(s) à visée thérapeutique pour des maladies héréditaires rétiniennes induisant une dégénérescence des photorécepteurs, pour lesquelles le développement de traitement spécifique à chaque mutation identifiée n’est aujourd’hui pas possible.

Procédures

- Injection intra-oculaire : tous les animaux de l’étude (1296) recevront une injection intra-oculaire (injection sous-rétinienne ou intravitréenne) de la thérapeutique à évaluer ; néanmoins l’injection est rapide (5 à 10 minutes) et se fera sous anesthésie générale. - Fond d’œil : suite à l’injection sous-rétinienne, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est très rapide (2 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude (1296) seront soumis à cet examen. - Tomographie à cohérence optique (OCT) : l’OCT permet de visualiser la structure anatomique de la rétine. L’acquisition d’images dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée 4 semaines et 12 semaines après l’injection intra-oculaire de l’élément thérapeutique d’intérêt sur les animaux dont l’injection a été évaluée « correctement réalisée » lors de l’examen du fond d’œil, soit un maximum de 1296 souris. - Electrorétinogramme (ERG) : l’ERG permet d’évaluer la fonction de la rétine en conditions photopique et scotopique. L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée 4 semaines et 12 semaines après l’injection intra-oculaire de l’élément thérapeutique d’intérêt sur les animaux dont l’injection a été évaluée « correctement réalisée » lors de l’examen du fond d’œil, soit un maximum de 1296 souris.

Impact sur les animaux

Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). A l’issue de la procédure, les animaux seront sacrifiés par inhalation de CO2 et dislocation cervicale afin de prélever les yeux pour des analyses histologiques post-mortem.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé que dans un modèle in vivo car les propriétés pharmacologiques du traitement ne peuvent être évaluées que dans des conditions physiologiques, pour notamment étudier l’interaction entre les vecteurs AAV et le système immunitaire de l’hôte. De même que le fonctionnement de la rétine et la vision ne peuvent être évalués qu'in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (12 souris/groupe x 108 groupes = 1296 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Une anesthésie gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent, notamment pour les procédures courtes comme les injections sous-rétiniennes, les injections intravitréennes, les fonds d’œil et les OCT. Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections intra-oculaires et les ERG. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéales/sous-cutanées. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’ERG), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux commerciaux observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Le modèle murin transgénique utilisé dans ce projet reproduit la pathologie étudiée : la rétinite pigmentaire autosomale dominante. Comme chez l’Homme, la mutation induit une dégénérescence progressive des photorécepteurs. Ces souris présentent une dégénération sévère des photorécepteurs dès l’âge de 3 semaines et une quasi absence totale de photorécepteurs vers 2 mois. Le but de cette étude étant de tester l’effet neuroprotecteur de nouveaux composés thérapeutiques au cours de la dégénérescence rétinienne, l’intervention thérapeutique interviendra avant que la dégénérescence des photorécepteurs n’atteigne un stade avancé, soit chez des souris âgées de 7 jours, 14 jours ou un mois.