Troubles endocriniens

Opérés d'un bypass gastrique ou d'une bipartition du transit sous anesthésie générale, 240 rats et 80 cochons vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les cochons portent un cathéter posé une seule fois et laissé en place pendant tout le protocole, les rats sont saignés par la queue. Le porteur prévoit douleur, perte de poids, chute importante de l'appétit et mobilité réduite pendant toute la période postopératoire, trois mois chez les rats et un mois chez les cochons, et indique que les biopsies intestinales de fin de protocole sont incompatibles avec la survie. Il justifie le recours au miniporc par une anatomie digestive et un métabolisme du glucose proches de l'humain, et celui du rat par la possibilité d'y faire de l'imagerie.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique et un problème de santé publique majeur qui touche près de 17% de la population française. Son incidence est en constante augmentation depuis plusieurs années. Actuellement, la chirurgie de l’obésité, qui enlève une partie de l’estomac et souvent court-circuite une partie de l’intestin est le traitement de référence de l’obésité quand celle-ci est dite morbide (IMC ≥ 40). L’intervention chirurgicale de référence est appelée « Bypass Gastrique Roux-en-Y » (RYGB en anglais). Cependant près de 20% des patients sont en échec à long terme après cette chirurgie. Nous étudions les changements métaboliques entraînés par différents types de chirurgies de l’obésité, les voies de signalisation entre différents organes cibles (foie, intestin, pancréas) et leur dialogue en fonction des différentes chirurgies. Ces différentes chirurgies seront comparées à l’intervention de référence, le bypass gastrique. Nos hypothèses de travail portent sur les effets bénéfiques rapportés par la chirurgie bariatrique sur l’amélioration de la glycémie chez les patients diabétiques ou non. Ces effets bénéfiques peuvent être dus à la perte de poids mais aussi aux modifications des voies de signalisations hormonales entraînées par la chirurgie. Nous pensons que chaque type de chirurgie bariatrique crée un résultat différent sur l’amélioration de l’obésité et de ses comorbidités. Nous défendons ici l'idée qu’une forte composante de cette réponse à la chirurgie est associée aux sécrétions d’une facteur de croissance peu étudiée. Notre objectif est de découvrir quel type de chirurgie génère le meilleur résultat sur la sécrétion de ce facteur de croissance et de les rapporter aux bénéfices cliniquement intéressants des chirurgies à l’étude. Nous nous attacherons également à explorer le rôle de la partie court-circuitée de l’intestin et notamment son rôle dans la sécrétion d’hormones digestives et le rôle que cela peut avoir sur l’amélioration de l’état de santé lié à l’obésité. Nous utiliserons des rats afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables en 2 à 3 ans en raison de la réalisation d’une imagerie faisable uniquement chez les rongeurs. L’utilisation de porcs est également très intéressante afin d’obtenir une meilleure transposition des résultats chez l’Homme. En effet, le porc présente des caractéristiques anatomiques digestives très proches de l’être humain, bien plus que celles du rat.

Bénéfices attendus

À court et moyen terme, ce projet aboutira à une meilleure compréhension des mécanismes de l’obésité chez l’Homme et des moyens de la traiter efficacement par la chirurgie ou par les médicaments. Les résultats de ce projet de recherche pourraient permettre d’offrir une médecine plus personnalisée et adaptée à chaque patient atteint d’obésité. Plusieurs publications scientifiques et à des communications orales lors de congrès, tant au niveau national qu’international seront réalisées, même en cas de résultat non probants, afin de compléter les connaissances scientifiques à ce sujet. À long terme, cette étude contribuera à une meilleure compréhension des voies de signalisation entre les différents organes, ouvrant la voie à de potentiels développement de traitements médicamenteux, pour éviter une chirurgie si elle n’est pas nécessaire. Cette innovation vise également à améliorer l'efficacité des interventions chirurgicales tout en réduisant les effets indésirables post-opératoires, offrant ainsi des soins de meilleure qualité.

Procédures

Les animaux seront opérés d’une des différentes chirurgies à l’étude, sous anesthésie générale (animal endormi ; durée environ 1 heure pour les rats à 2 heures pour les porcs). Ils auront un repas test préopératoire et un postopératoire, accompagnés des prises de sang par prélèvements à la queue pour les rats ou par cathéter pour les porcs. Le cathéter pour la prise de sang chez le porc est mis en place une seule fois par animal et laissé pour toute la durée du protocole. Toutes les procédures sont réalisées pour infliger le moins de douleur possible à l’animal (analgésie ou anesthésie générale). L’euthanasie se fera sous anesthésie générale (animal endormi). La durée totale du protocole est de 6 mois pour les rats (en comptant la phase de prise de poids) et de 1 mois pour les porcs.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des procédures de classes modérées. Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids modérée, diminution importante de l’appétit, mobilité réduite. Ces effets pourront survenir pendant toute la période postopératoire du protocole (3 mois rats, 1 mois porcs).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure (3 mois pour les rats, 1 mois pour les porcs) qui comporte des prélèvements de tissus. En effet, la réalisation de biopsies terminales en fin de procédure, en particulier intestinales, n'est pas compatible avec la survie de l'animal.

Remplacement

Les modèles animaux sont essentiels pour étudier les mécanismes physiopathologiques de l’obésité et évaluer les interventions chirurgicales avant leur application clinique. Ils permettent une compréhension approfondie des effets métaboliques des procédures chirurgicales, difficilement réalisables uniquement par des études cliniques. Les modèles animaux (rat et porc) de chirurgie de l'obésité sont centraux pour les études expérimentales sur les mécanismes des maladies et les stratégies thérapeutiques. Les miniporcs présentent des similitudes anatomiques et physiologiques significatives avec les humains, notamment en ce qui concerne le système digestif et le métabolisme du glucose. De plus, les miniporcs ont été utilisés pour des recherches semblables et ont démontré leur utilité. Bien que les modèles in vitro et informatiques offrent des informations précieuses, ils ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des interactions présentes dans un organisme vivant. Les modèles animaux, tels que les miniporcs, permettent l’étude de la physiologie, du métaboliques et du comportement aux interventions chirurgicales, fournissant des données cruciales pour la compréhension et l’amélioration des techniques chirurgicales. En conclusion, l’utilisation des miniporcs en chirurgie de l'obésité est justifiée par leurs similitudes avec l’homme et leur capacité à fournir des informations détaillées sur les effets globaux des interventions, informations qui ne peuvent être obtenues par d’autres méthodes.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimum d’animaux pour notre étude pré-clinique (avant une potentielle étude chez l’Homme). Il est difficile d’établir un nombre précis d’individus nécessaires mais des calculs statistiques de nombre d’individus nécessaires par des logiciels prévus à cet effet nous ont permis d’estimer au plus près le nombre d’animaux nécessaires sans devoir prévoir une « marge » trop importante. Cette marge a été réduite au minimum par les calculs de puissance statistique. Grâce à ces estimations, nous pourrons réduire encore le nombre d’animaux utilisés en cours de protocole si l’effet attendu est atteint avec un plus petit nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d’optimiser le bien-être animal, des mesures de raffinement rigoureuses seront appliquées.Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires : logement individuel, cycle lumineux de 12 h et enrichissement adapté. Les rats disposeront de tunnels en carton, briques en bois, papier kraft et coton. Les porcs bénéficieront de balles, de Kongs garnis de bouillie, de luzerne et de friandises.Les procédures seront réalisées dans des salles dédiées, distinctes des espaces d’hébergement. Une prise en charge analgésique optimale sera assurée. Les soins seront réalisés sous avis vétérinaire en cas de complications (infection des cathéters…).Un suivi quotidien, voire pluriquotidien, garantira une évaluation rigoureuse. Les critères de retrait immédiat incluront :Douleurs sévères non soulagées sous morphiniques (12 h),Perte de poids excessive (≥20 % chez le porc, ≥20 % chez le rat),Infections résistantes après 48 h,Prostration, absence de réaction ou escarres.En cas d’infection locale, une réintervention sous anesthésie sera réalisée avec nettoyage chirurgical et rinçage antiseptique. L’analgésie pourra être renforcée. Une infection généralisée nécessitera une antibiothérapie adaptée . Un antiémétique sera administré si besoin.Une phase d’adaptation de 10 jours précédera toute expérimentation. Un suivi minutieux de la cicatrisation assurera un rétablissement optimal, garantissant des conditions expérimentales rigoureuses et éthiques.

Choix des espèces

Rat: Permet la chirurgie métabolique (modèle largement utilisé pour ce genre de recherche, et souris trop petite) et permet l’utilisation de l’imagerie. De nombreux articles ont étudié ces effets sur le rat, nous apportant une source de validation externe indispensable. Miniporc: Régime alimentaire omnivore, anatomie et métabolisme digestif semblables à l'Homme Nous utiliserons des rats mâles adultes âgés de 12 semaines minimum rendus obèses par un régime riche en graisses durant 12 semaines, avec un poids minimal de 200g au départ.

Pour montrer que des particules de fer permettraient de baisser les doses des traitements contre la carence martiale, 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord privées de fer pendant six semaines jusqu'à l'installation d'une anémie, puis traitées pendant quatre semaines par voie orale ou sous-cutanée. Une goutte de sang est prélevée à l'aiguille dans leur queue deux fois par semaine pendant dix semaines. Les souris témoins restent anémiées sans traitement, avec la faiblesse musculaire et la baisse d'activité que le porteur décrit, et l'effectif de 144 animaux n'est appuyé par aucun calcul statistique, le porteur qualifiant l'étude d'exploratoire.

Objectifs

La carence en fer est le résultat de toute condition dans laquelle l’apport alimentaire en fer ne répond pas aux besoins de l’organisme. C’est un problème de santé publique touchant environ 1,5 milliards d’individus dans le monde, principalement les enfants ou les femmes enceintes, bien que les hommes soient également touchés. Le déficit en fer est responsable de multiples conséquences comme la fatigue chronique, les essoufflements, les palpitations, une tachycardie, un retard de développement psychomoteur, des défauts cognitifs, et une anémie. Les traitements actuels de la carence en fer sont essentiellement à base de fer ferreux par voir orale et nécessitent l’utilisation de doses importantes en fer car les sels ferreux sont faiblement absorbés (entre 10 à 15% de la dose ingérée). Ces fortes doses entrainent d’importants effets secondaires gastro-intestinaux. Dans ce projet, des petites particules contenant du fer seront utilisés pour réduire les doses de fer et engendrer moins d’effets secondaires dans un modèle de souris soumis à un régime carencé en fer pendant 6 semaines. Une fois l’anémie établie, les souris recevront, dans un premier temps, un traitement oral à base de petite particules contenant du fer ou de fer ferreux durant 4 semaines maximum. Dans un second temps, et seulement dans le cas d’une absence de résultats pour le traitement oral, d’autres souris recevront un traitement par voie sous-cutanée de petite particules contenant du fer ou de fer ferreux durant 4 semaines maximum.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait démontrer que le traitement à base de petites particules contenant du fer, mieux absorbé par l’organisme, permettra de réduire les doses en fer administrées. Ainsi, en clinique humaine, cela conduirait à réduire les effets secondaires, principalement intestinaux, en comparaison du traitement classique.

Procédures

Une ponction d’une goutte de sang (qq sec) à la queue est réalisée 2 fois par semaine par aiguille chez l'ensemble des souris pendant 10 semaines pour permettre de contrôler le paramètre sanguin hémoglobine et suivre l'évolution du bilan en fer.

Impact sur les animaux

Les souris carencées en fer ne recevant aucun traitement montreront une anémie modérée pouvant être responsable d’une faiblesse musculaire et d’une baisse de l’activité générale. Dans le cas des souris traitées par fer ferreux (médicament de référence à fortes doses), des effets secondaires principalement intestinaux (diarrhée, ou constipationavec possibilité d'apparition d'un bouchon anal dues respectivement à une inflammation des intestins ou au ralentissement du transit, variables en fonctions des individus) peuvent apparaître au cours du traitement (une grille de scoring a été déterminée pour évaluer de façon précises ces effets secondaires intestinaux). L'apparition d'un inconfort ou d'un stress lié au gavage, à l'injection quotidienne ou le prélèvement sanguin pourrait être observé.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, toutes les souris de l'étude seront anesthésiées et mises à mort dans le but de récupérer le sang et les organes pour des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.

Remplacement

En parallèle de ce projet, des analyses encore en cours sont réalisées sur des cellules hépatiques et intestinales humaines. Cependant, le projet porte sur la restauration physiologique du métabolisme du fer et l’amélioration des paramètres sanguins en fonction de la réponse au traitement. L’anémie est un syndrome global qui ne peut être étudié de façon complète que sur des animaux avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes (principalement le lien sang, foie et moelle osseuse). C’est pourquoi, il est essentiel d'observer l'effet d'un traitement pharmacologique (dose et impact sur les effets secondaires intestinaux) sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris utilisées par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour une étude exploratoire. L’étude prévoit 6 souris par groupe avec 3 mâles et 3 femelles réparties, dans un premier temps, en 12 groupes d'études, soit un total de 72 souris destinées à l'étude dose-réponse par administration orale. Dans un second temps, et dans le cas où aucun effet par voie orale ne serait observé, 12 autres groupes, soit un total de 72 autres souris seront destinées à l’étude dose-réponse par administration sous-cutanée. Un maximum de 144 souris au total sera utilisé dans ce projet. Ce projet mettant en oeuvre une étude à viser exploratoire, aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Dès la réception des souris, une période d’acclimatation de 7 jours sur le site d’accueil sera respectée. Tout au long du déroulement des expérimentations, l’état clinique global des souris sera observée quotidiennement pour anticiper et éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable par la SBEA et permettant la mise en place de mesures pour diminuer ou supprimer la douleur des souris de l’étude. Une arbre décisionnel est mis en place de la cas d'observations de points limites liés (1) à l'anémie, (2) au traitement et/ou (3) à la perte de poids et ceci en allant de l'arrêt partiel du traitement, la diminution des doses administrées, à la programmation de la mise à mort de l'animal. Dans le cas des prélèvements sanguins, la queue sera préalablement désinfectée à la chlorhexidine 0,05 % pour limiter tout risque d’infection. Une anesthésie locale à lidocaïne liquide avec action rapide sera effectuée pour limiter la douleur liée à la piqure d’aiguille. Une attention particulière sera portée au site de prélèvement en veillant à changer de site de prélèvement (en allant de l’extrémité de la queue à la base). Un point de compression sera effectué ensuite pour stopper un éventuel écoulement sanguin. Une surveillance accrue de site de prélèvement sera effectuée les jours suivants.

Choix des espèces

La souris a été choisi pour cette étude pour sa disponibilité, sa facilité d’utilisation. Elles sont généralement utilisées dans le cas des carences nutritionnelles en fer permettant d’avoir des paramètres connus du métabolisme du fer de ces souris. Les souris de l’étude seront âgés de 6 semaines. La carence en fer nutritionnelle est un déficit observé à généralement à l’âge adulte. C’est pourquoi, la mise en place de la carence nutritionnelle et le traitement seront effectués chez des souris adultes.

Des prises de sang toutes les six minutes pendant deux heures, deux séances d'IRM de deux heures et deux semaines d'isolement en cage individuelle après la pose chirurgicale d'une pompe sous la peau : 72 souris de 12 à 14 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Ces souris portent des mutations qui reproduisent des traits de la maladie d'Alzheimer et perdent progressivement leurs capacités cognitives. Le projet évalue si une hormone de la reproduction délivrée en continu restaure leurs connexions cérébrales, piste ouverte par des résultats obtenus chez des personnes porteuses d'une trisomie 21. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet de mesurer en même temps performances cognitives, connectivité cérébrale et effets secondaires.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées. Sa prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et elle touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Les mécanismes de neurodégénérescence évolutive de la MA ne sont pas encore clairement compris, néanmoins on sait que les phénomènes d’agrégation de protéines caractéristiques de la maladie sont responsables de modifications/pertes de connectivité entre différentes structures du cerveau avec des conséquences fonctionnelles. Il parait donc essentiel de comprendre et tenter de rétablir les connexions cérébrales dans cette maladie. Dans un modèle de souris mimant la MA, des troubles de la mémoire caractéristiques de la maladie évoluent progressivement entre 3 et 12 mois de vie. Une étude récente en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) a révélé que, dès 5 mois, ces souris présentent des modifications de la structure et de la fonction du cerveau. Par ailleurs, une diminution de la sécrétion d’une hormone, l’hormone principale de la reproduction (gonadotropin-releasing hormone) a été observée à l’âge de 12 mois chez ces animaux, période où les déficits cognitifs sont bien marqués. Récemment, il a été démontré que chez des patients atteints de trisomie 21, rétablir la libération pulsatile de GnRH à l’aide de pompe, améliore les connexions cérébrales ainsi que la cognition. Dans notre modèle de souris, ce traitement a permis de restaurer la mémoire à un niveau similaire à celui des animaux sains. L’objectif de ce projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement hormonal de GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau d’un modèle de souris génétiquement modifiée mimant la maladie d’Alzheimer. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) différents EU1 et EU2. Plus précisément, nous chercherons à : • caractériser les modifications cérébrales de ces souris en lien avec la maladie d’Alzheimer, afin d’avoir une référence pour évaluer les effets du traitement ; • étudier l’impact du traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau, pour vérifier s’il améliore ces paramètres. Pour cela, nous réaliserons des images cérébrales par IRM avant et après le traitement hormonal afin d’observer d’éventuels changements dans l’anatomie et les connexions du cerveau.

Bénéfices attendus

Près de 70 millions de personnes dans le monde sont atteintes de la maladie d'Alzheimer, et aucun traitement réellement efficace n'existe à ce jour. Les thérapies actuelles, notamment celles visant à éliminer certaines protéines impliquées dans la maladie, n'ont montré que des effets limités. Face à cette situation, les professionnels de santé disposent de peu d’options pour soulager les patients, tandis que leurs proches doivent faire face à une évolution inexorable de la maladie. Un traitement hormonal, déjà testé avec succès dans une autre maladie neurologique (la trisomie 21), pourrait offrir une nouvelle piste. En étudiant son effet sur un modèle de souris, nous espérons mieux comprendre son impact sur le cerveau et ouvrir la voie à un essai clinique chez l’humain. L’objectif est de développer une approche qui améliore la qualité de vie des patients et offre un nouvel espoir aux familles concernées.

Procédures

Afin d’évaluer la perte cognitive (anxiété/locomotion), la mémoire spatiale à court terme et la discrimination d’odeurs, des tests comportementaux (maximum trois tests, espacés d’au moins deux jours) seront réalisés dans l’EU2 chez les souris, tous les deux mois à partir de l’âge de 4 mois. La durée maximale d’un test est de 15 minutes. À l’âge de 12 à 14 mois, les souris seront transférées sur le site de l’EU1. Les interventions ci-dessous se dérouleront dans l’EU1. Les animaux seront soumis à une chirurgie courte sous anesthésie générale de 25 minutes pour implanter une petite pompe pour délivrer le traitement . Après la chirurgie les animaux seront placés dans des cages individuelles pendant deux semaines . Les souris subiront deux sessions d’IRM, espacées de 15 jours : une avant et une après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, sous anesthésie. Entre les deux sessions d’IRM, les animaux seront soumis à des tests comportementaux visant à évaluer différentes fonctions cognitives et motrices. Ces tests seront réalisés dans un environnement calme, après une période d’habituation de 30 minutes pour limiter le stress. Chaque souris passera 2 tests, espacés d’au moins deux jours pour éviter toute surcharge.. Afin de s’assurer de l’efficacité du traitement, les animaux subiront 4 jours après le début du traitement, des prélèvements de sang toutes les 6 minutes pendant 2h Les surfaces et équipements seront nettoyés entre chaque passage pour éviter toute influence extérieure. Deux prélèvements vaginaux seront effectués après la première et la deuxième IRM. La durée du prélèvement vaginal est de 3 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation de la pompe sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Les prises de sang peuvent générer une douleur ponctuelle au moment de la piqure. L’hébergement en cage individuelle peut provoquer un stress. Les tests de comportement consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives peuvent entraîner une augmentation temporaire du stress. Une légère réduction de l’activité spontanée peut être observée après certaines manipulations, mais celle-ci reste transitoire. Les sessions d’IRM, bien que réalisées sous anesthésie pour éviter tout inconfort, nécessitent une récupération progressive de l’animal après l’examen. Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort. Notre modèle de souris mime la maladie d’Alzheimer avec une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de 3 mois et maximale à 12 mois.

Devenir

À l’issue du protocole, toutes les souris seront mises à mort afin de procéder à des analyses anatomiques et histologiques. Ces analyses sont indispensables pour compléter les données d’imagerie et vérifier les effets du traitement à un niveau cellulaire et tissulaire. L’examen des structures cérébrales permettra d’évaluer d’éventuelles modifications induites par le traitement, telles que des changements dans l’intégrité des tissus ou la connectivité entre différentes régions du cerveau. De plus, des analyses histologiques permettront d’étudier des marqueurs spécifiques impliqués dans la maladie, afin de mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et d’évaluer son potentiel pour une application clinique future.

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau chez un modèle préclinique de souris afin d’évaluer son efficacité et sa sécurité avant d’envisager des études cliniques chez l’humain. À ce jour, il n’existe pas d’alternatives non animales permettant de mesurer simultanément les performances cognitives, la connectivité cérébrale et d’éventuels effets secondaires du traitement. Les approches in silico ou in vitro, bien qu’utiles pour certaines analyses moléculaires et cellulaires, ne permettent pas d’étudier l’effet global du traitement sur un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour évaluer l’impact du traitement sur les fonctions cérébrales, identifier d’éventuels effets indésirables et déterminer les conditions optimales d’administration. Ces données sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et appuyer son éventuelle application clinique.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et de sa fonctionnalité en réponse à l’administration du traitement hormonal. Nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi au cours du temps. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet de regarder de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés avec le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés par le même chercheur qui ne changera pas au cours du protocole. Ils seront manipulés par cette personne pour s’habituer à lui et à son odeur. Cela permet de limiter le stress de la souris lorsqu’elle commence le protocole. Les souris devront être transportées entre deux animalerie où le projet se réalise. Un raffinement sera apporté lors du transport. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie puis placés dans des cages individuelles. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Pour la prise en charge de la douleur, une analgésie sera assurée 30 minutes avant la procédure. Une ré-administration pourra être effectuée si nécessaire, selon l’évaluation clinique des animaux. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. Mise en place de points limites précoces. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. La mise à mort sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement hormonal (GnRH) a été mis au point chez la souris, nous gardons cette espèce pour obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle génétiquement modifié qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA), pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase pré-clinique. Les animaux utilisés sont des adultes de 3 à 15 mois ; en effet l’étude de l’hormone GnRH dans ce modèle de souris nécessite d’utiliser des animaux adultes qui commencent à développer des altérations cognitives marquées autour de l’âge de 12 mois et ces troubles persistent jusqu’à la fin de la vie de l’animal. Nous avons déjà des données préliminaires dans cette tranche d’âge et pour pouvoir comparer les données il est nécessaire de respecter cette limite d’âge.

Nourries quatorze semaines avec un régime enrichi en graisses et en sucres, injectées une fois par jour pendant deux semaines, prélevées quatre à six fois au sang après quatre heures de jeûne, puis isolées 48 heures en cage individuelle : 591 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur descendance suit le même régime pendant neuf semaines, avec des lésions cutanées dues à un hypertoilettage que le porteur classe en nuisance légère. Le projet cherche à savoir si traiter des parents obèses protège la génération suivante de l'obésité et du diabète. Toutes sont mises à mort en fin de procédure pour prélever leurs organes.

Objectifs

La fréquence de l'obésité et du diabète a atteint les proportions d'une pandémie au cours des dernières décennies et l'obésité est désormais considérée comme l'un des principaux facteurs de risque pour la santé dans les sociétés modernes. Les possibilités de traitement sont malheureusement très limitées, la chirurgie bariatrique (bypass gastrique) représentant jusqu'à présent pour de nombreux patients quasiment la seule possibilité de perte de poids durable et d'amélioration du métabolisme glucidique, mais elle est non réversible, liée à de nombreuses complications post-opératoires et n’est envisageable que pour un très petit nombre de personnes extrêmement obèses. En-dehors des caractères génétiques, l'hérédité dite épigénétique des caractères acquis, contribue probablement de manière décisive à la pandémie d'obésité et de diabète observée dans le monde entier. L'épigénétique s'intéresse aux mécanismes et modifications chromosomiques héréditaires qui ne sont pas dues à des changements de la séquence d'ADN, mais des modifications chimiques ultérieures de l'ADN. Dans une étude précédente, nos collaborateurs ont pu montrer que la transmission épigénétique via les cellules reproductrices (spermatozoide, ovocyte) augmente la prédisposition à l'obésité et au diabète de type 2, l'information transmise à la descendance étant déjà ancrée dans les cellules reproductrices. Ces observations peuvent être mises en relation directe avec les études épidémiologiques menées chez l'homme, qui montrent que l'indice de massse corporelle de la descendance est significativement corrélé avec le degré d'obésité parentale, tant paternelle que maternelle. Dans ce projet, nous souhaitons étudier dans quelle mesure il est possible d'influencer l'obésité transmise par voie épigénétique en intervenant sur les parents par traitement pharmacologique ou en adaptant leur régime alimentaire et de déterminer si et dans quelles conditions l'hérédité épigénétique est réversible. Il s’agit ainsi de voir si la génération suivante peut être saine, lorsque les parents obèses sont traités de manière appropriée par voie pharmacologique ou par adaptation du régime alimentaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'appréhender les mécanismes liés à la transmission épigénétique de l'obésité et du diabète d'une génération à l'autre, d'évaluer une nouvelle approche thérapeutique en traitant les parents pour protéger la génération suivante de ces pathologies, et ainsi par le gain de ces connaissances proposer une solution pour influencer durablement la santé des générations futures.

Procédures

Alimentation avec une diète enrichie en graisses et en sucres (durée 14 semaines pour les parents (fondateurs) ou 9 semaines pour la descendance). Injections (1x/jour, sur une durée de 2 semaines; durée de chaque administration: environ 1min). Prélèvements sanguins (4-6 prélèvements; durée 1-3 min par prélèvement). Mesure de la composition corporelle, méthode non-invasive (2 fois; durée 3 min). Mesure de la dépense énergétique dans des cages d'hébergement individuelles (durée 48h)

Impact sur les animaux

Lors de la réalisation de ces protocoles, le régime enrichi en graisses peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hypertoilettage (nuisance légère). Les prélèvements sanguins à la queue, après une mise à jeun de 4h, peuvent induire un stress et une douleur légère (pendant 1-3min). Les animaux seront isolés pour une période de 48h dans des cages spécifiques pouvant engendrant un stress modéré. L’évaluation de la composition corporelle sera faite par une méthode non invasive (qNMR), et les pesées hebdomadaires ne vont pas induire de nuisances ou stress particulier.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédures pour prélever des organes en vue d'analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre l'impact des modifications épigénétiques de l'ADN sur le développement de l'obésité et du diabète, et plus particulièrement la transmission de cette information d'une génération à l'autre, en traitant les parents, puis en analysant le métabolisme de la descendance. Cette analyse ne peut être proposée que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Par ailleurs, seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (régulation des lipides, des glucides, de la balance energétique..), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle pour proposer une approche thérapeutique pour la population humaine.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné sur la base de nos expériences dans le domaine métabolique. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que qu'un effectif de 8 souris par sexe et par condition constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, composition corporelle) qui seront analysées à l'aide d'analyses statistiques appropriées. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique et permettre d’observer un effet du traitement.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Durant la période d'alimentation avec la nourriture enrichie en graisses et un sucres, de la nourriture sera mise à disposition sous forme de pâte dans des coupelles au fond des cages. Si la litière est souillée rapidement, le change sera fait deux fois par semaine. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..).

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère qui permet une première approche informative concernant les mécanismes épigénétiques, et en cas de traitement des parents, l'évaluation de la protection attendue sur la génération suivante. Ces données pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de proposer une approche thérapeutique à long terme pour traiter l'obésité et le diabète en clinique humaine. Les animaux démarreront le protocole après le sevrage, à partir de 4 semaines où la régulation métabolique est déjà mise en place, et jusqu'à 18 semaines d'age.

Les porcs sont retirés du protocole en cas de douleurs sévères que les morphiniques ne soulagent pas en douze heures, de perte de poids d'au moins 20 %, d'infections résistantes, de prostration ou d'escarres. 400 souris et 40 miniporcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue parce que les biopsies prévues sont incompatibles avec la survie. Chaque animal subit deux chirurgies, l'une pour poser un implant d'hydrogel dans l'abdomen, l'autre pour le retirer, jusqu'à deux heures chez le porc, et les souris sont saignées chaque semaine de 7,5 % de leur volume sanguin. Le porteur annonce des publications scientifiques à court terme et, à plus long terme, un implant de cellules pancréatiques qui dispenserait les personnes diabétiques de traitement anti-rejet.

Objectifs

Le diabète de type 1 touche 8,4 millions de personnes dans le monde et résulte d'une auto destruction de cellules du pancréas, responsables de la sécrétion d'insuline et donc de la régulation glycémique. La greffe d’îlots pancréatiques issus de donneurs constitue une approche thérapeutique prometteuse, permettant à certains patients de retrouver un contrôle glycémique sans injections d’insuline. Cependant, son application est limitée par le manque de donneurs et la nécessité de traitement anti-rejet lourd. L’objectif de ce projet est de développer un biomatériau innovant permettant la transplantation de cellules pancréatiques fonctionnelles sans recours aux anti-rejets. Pour cela, un hydrogel a été conçu afin d’assurer la diffusion des nutriments et de l’insuline tout en empêchant l’attaque des cellules greffées. Ce biomatériau devra être compatible avec les îlots issus de donneurs. Le projet vise à : 1/ Choisir un hydrogel et un site d’implantation réaliste, 2/ Confirmer la sécurité et la tolérance du dispositif médical chez la souris et le porc, 3/ Valider dans le modèle porcin la faisabilité de la transplantation par une technique opératoire routinière chez l'Homme. Nous prévoyons d’utiliser 400 souris et 40 miniporcs. L’utilisation de porcs est extrêmement intéressante afin d’obtenir une meilleure transposition des résultats chez l’Homme ; notamment sa taille et son espace au niveau de sa cavité abdominale qui en fait un bon candidat pour cette étude.

Bénéfices attendus

A court et moyen terme, ce projet aboutira à plusieurs publications scientifiques internationales. A moyen et long terme, cette étude aboutira à la mise au point d'un implant porteur de cellules pancréatiques facilitant la greffe chez les patients diabétiques de type 1. En effet, l'implantation du dispositif se faisant au niveau abdominal à la place de l'intraveineux, cela réduit à son minimum le risque de formation d'un caillot sanguin au niveau du foie. Aussi, il pourrait permettre de réduire voir s'abstenir de tout traitement anti-rejet et offrant ainsi des soins de meilleures qualités.

Procédures

Tous les animaux de l'étude seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place du dispositif médical et une procédure chirurgicale finale afin d'extraire et d'étudier l'implant et son impact sur l'individu. Pour le porc, la chirugie se tiendra sur une durée estimée de 2 heures maximum. Pour la souris, l'implantation durera environ 15 à 30 minutes. Les souris seront prélevées chaque semaine d'un volume sanguin correspondant à un maximal de 7,5% du volume total. Ce prélèvement sera réalisé à la queue (ponction). La durée du prélèvement sera de quelques minutes chaque semaine du suivi.

Impact sur les animaux

Chez le porc, les effets indésirables aprés chirurgie peuvent inclure des douleurs abdominales, des ballonnements et des troubles digestifs, ainsi que des hématomes au niveau de la paroi abdominale. Une sensation de corps étranger ou une gêne locale liée à la prothèse peuvent également être ressenties. Plus rarement, des infections superficielles des plaies voire une infection de la prothèse peuvent survenir. A noter que la chirugie se tiendra sur une durée estimée de 2 heures maximum. Les animaux seront suivis au maximum durant 3 mois. Chez la souris, les implants sont placés par voie chirurgicale. Un risque de d'inconfort, voire de douleur est possible. Néanmoins, celles-ci seront traitées de façon adéquate par des anti-douleurs. De plus, la transplantation de cellules du pancréas pourrait éventuellement induire des baisses de glycémies majeures dans les premiers jours après la transplantation. Un suivi accru du taux de sucre dans le sang dans les premiers jours après chirurgie et un traitement au glucose pourront pallier ce problème. L'implantation durera environ 15 à 30 minutes par animal. Les animaux seront suivis au maximum durant 3 mois.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car les prélèvements de biopsies ne sont pas compatible avec la survie de l'animal

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation d’animaux est strictement limitée à cette étude où aucun modèle alternatif ne permettrait de répondre aux questions scientifiques posées. En amont, une série de tests in vitro sera réalisée afin de sélectionner et d’optimiser les implants d'hydrogel-candidats, réduisant ainsi le nombre d’expérimentations in vivo nécessaires. Cependant, malgré ces efforts, le remplacement total des modèles animaux demeure actuellement difficile. Les interactions complexes entre l’implant, les cellules encapsulées et l’environnement biologique ne peuvent être entièrement reproduites par des modèles in vitro ou par des approches alternatives comme les organoïdes ou les simulations informatiques. Les études sur des modèles animaux sont donc indispensables pour évaluer la tolérance, la fonctionnalité et l’efficacité de l’implant dans un organisme vivant, en tenant compte des paramètres immunologiques, vasculaires et métaboliques.

Réduction

Le protocole expérimental est conçu pour minimiser le nombre d’animaux utilisés. Les études seront réduites au maximum. De plus, les observations seront effectuées en combinant différentes analyses afin d’exploiter chaque modèle au maximum, réduisant ainsi le besoin de nouveaux groupes expérimentaux. 400 souris et 40 miniporcs sont prévus dans ce projet. Nous avons estimé avec les moyens statistiques adéquats le nombre de souris et de porcs par groupe à 10 afin d'obtenir des résultats qualitativement et quantitativement robustes. Nous utiliserons le juste nombre d'animaux, soit 10 animaux par groupe - 4 groupes expérimentaux par série (patch d'hydrogel testé) afin d'obtenir des résultats satisfaisants. 10 manipulations souris et 4 chez le porcs sont estimées dans ce projet soit un total de 400 souris et 40 porcs (40 souris * 10 séries et 10 porcs sur 4 séries).

Raffinement

Chez le Porc, afin d’optimiser le bien-être animal, des mesures de raffinement rigoureuses seront appliquées. Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires : logement individuel, cycle lumineux de 12 h et enrichissement adapté. Les porcs bénéficieront de balles, de Kongs garnis de bouillie, de luzerne et de friandises. Les procédures seront réalisées dans des salles dédiées, distinctes des espaces d’hébergement. Une prise en charge de la douleur sera assurée. Les soins seront réalisés sous avis vétérinaire en cas de complications. Un suivi quotidien, garantira une évaluation rigoureuse. Les critères de retrait immédiat incluront :Douleurs sévères non soulagées sous morphiniques (12 h),Perte de poids excessive (≥20 % chez le porc),Infections résistantes après 48 h,Prostration, absence de réaction ou escarres.En cas d’infection locale, une réintervention sous anesthésie et avec rinçage antiseptique. un traitement antidouleur pourra être renforcé. Une infection généralisée nécessitera l'usage d'antibiotiques adaptés. Un suivi minutieux de la cicatrisation assurera un rétablissement optimal, garantissant des conditions expérimentales rigoureuses et éthiques. Les souris utilisées dans ce projet seront hébergés dans des cages de 5 animaux maximum . Ils auront accès à volonté a l'eau et nourriture et traités avec soin. La chirurgie sera pratiquée sous anesthésie et traitement de la douleur. De plus, un complément alimentaire sous forme gélifié est prévu juste après la chirurgie pour une meilleure récupération. Le bien être animal sera observé́ au quotidien, et tout constat de mal-être pourra être traité à l'aide d'un arbre décisionnel construit pour ce projet. Il permettra le traitement des douleurs/mal être de façon gradée pour éviter d'atteindre un point-limite.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de modèles permettant de contourner l’utilisation d’animaux pour ce projet. Les essais chez l'animal sont conduits sur les espèces décrites dans la littérature. Dans les phases initiales du projet, le rongeur est privilégié en première intention, car c’est une espèce qui permet de répondre à l’ensemble des questions du projet (site optimal d’implantation, fonctionnalité), tout en étant facilement accessible et relativement économique. Pour la compréhension de certains résultats, des animaux avec un systeme immunitaire affaiblit sont utilisés, afin de s’affranchir de l’effet de la réponse immunitaire sur la fonctionnalité des cellules transplantées et de n’évaluer que l’impact de l’hydrogel. La preuve de concept de l’implantabilité, du retrait et de la tolérance est réalisée chez le cochon adulte. En effet, la translation à l’homme des résultats obtenus dans les modèles rongeurs est limitée du fait de leur anatomie et physiologie particulières. Le modèle cochon adulte est plus adapté car il possède de nombreuses similarités avec l’Homme, incluant la taille, et les caractéristiques anatomiques (permettant d’évaluer la chirurgie d’implantation envisagée chez l’Homme), physiologiques et pathophysiologiques. Pour les souris, nous utiliserons des souris Adulte - minimum 7 semaines - Cela permettra une chirurgie plus aisée. Pour les porcs, nous utiliserons des animaux adultes pour d'une part se rapprocher de la réalité clinique, et d'autres part faciliter le geste chirurgical.

56 souris rendues obèses par douze semaines de régime gras avant même leur arrivée reçoivent chacune 35 injections et 12 administrations du candidat médicament, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent seize pesées, cinq mesures de composition corporelle et trois prélèvements sanguins en boîte de contention, chaque manipulation étant décrite comme une entrave brève aux mouvements. L'enjeu est autant commercial que thérapeutique : la sémaglutide fait fondre le muscle en même temps que la graisse, et le composé testé doit lever cet obstacle à des traitements prolongés. Seuls des mâles sont utilisés, le porteur indiquant qu'inclure des femelles obligerait à doubler les effectifs, une étude chez la femelle étant renvoyée au cas où l'efficacité serait démontrée chez le mâle.

Objectifs

Le sémaglutide est utilisé comme médicament antidiabétique et anti-obésité. Son efficacité s'avère excellente, et son emploi relativement sûr. Cependant, outre la perte de masse grasse qu'ils induisent, les traitements chroniques à la sémaglutide sont également associés à une importante fonte musculaire, qui est considérée comme un effet indésirable. Le candidat médicament a été initialement développé comme un médicament visant le muscle dans le cadre de pathologies induisant une atrophie musculaire. Le présent projet vise à élargir les indications thérapeutiques potentielles du candidat médicament et de tester notamment sa capacité a compenser les effets délétères de la sémaglutide sur la masse musculaire lors d'un traitement chronique chez la souris obèse.

Bénéfices attendus

La Sémaglutide est aujourd'hui autorisée et utilisée en tant que médicament anti-obésité et anti-diabétique. Néanmoins ce composé à pour inconvénient d'induire une perte de masse et de force musculaire lors de traitements prolongés, réduisant la possibilité de son utilisation sur des périodes prolongées. Le développement du candidat médicament permettrait, en co-administration, de bloquer totalement ou partiellement cet effet délétère de la sémaglutide, autorisant son utilisation sur des périodes plus prolongées et ainsi, une meilleure prise en charge thérapeutique des troubles métaboliques chez l'humain.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (16 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration du candidat médicament (12 administration; durée : 1 minute); 3) Injections de composés (35 injections; durée : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (3 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations de traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légère et de courte durée et de stress. Enfin, le caractère obèse des lots de souris concernés sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les groupe constitués de souris non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel et la composition corporelle) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs parfaitement formés et rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3-4 souris /cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention utilisés pour les mesures de coposition corporelle et pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Ce modèle est sensible aux effets anti-obésité de la sémaglutide et présente également les effets secondaires de fonte musculaire observée chez l'humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, âgés de 18 semaines à la réception (25 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 12 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur afin d'induire le phénotype obèse.

Génétiquement modifiées pour développer un diabète de type 2, les souris de ce projet grossissent jusqu'à une obésité que le texte qualifie lui-même de sévère et de "source de souffrance et d'inconfort". 1 080 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements jusqu'à deux fois par jour pendant dix semaines, subissent des ponctions dans une veine de la mâchoire en état vigile, une incision à la pointe de la queue, quatre séances d'imagerie cardiaque sous anesthésie, et passent jusqu'à vingt heures seules sur une grille, sans nourriture ni litière, pour le recueil d'urine. Les mâles restent isolés pendant tout le protocole. La mise à mort intervient après ouverture du thorax et mesure de la pression directement dans le cœur, et l'effectif prévoit 20 % d'animaux supplémentaires pour compenser la mortalité attendue en cours de route.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie progressive qui se caractérise par une incapacité du cœur à assurer un débit de sang suffisant pour couvrir les besoins du corps en oxygène, d’abord en cas d’effort puis même au repos. L'insuffisance cardiaque peut se caractériser par une diminution de la capacité du coeur à se remplir de sang, et ses causes sont multiples : âge, hypertension, obésité, diabète… Malgré les nombreuses recherches et études cliniques menées ainsi que l’arsenal thérapeutique déployé et testé, aucune thérapie semble être efficace en termes d’allongement de la durée de vie des patients atteint de cette maladie. Afin de pouvoir tester de nouveaux composés médicaments, le développement et l’utilisation de modèles animaux aux plus proches des atteintes cardiovasculaires de l'insuffisance cardiaque est nécessaire. Le modèle de souris génétiquement modifié pour exprimer des troubles du mébolisme et de la fonction rénale permet d'entrainer une insuffisance cardiaque similaire à ce que l'on retrouve chez l'Homme. Ainsi, l’objectif du projet est d’utiliser ce modèle d'insuffisance cardiaque pour évaluer l’efficacité de nouveaux composés à visée thérapeutique sur la progression de l’insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements sur un modèle de souris génétiquement modifiée d’insuffisance cardiaque . Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant de cette maladie.

Procédures

Au cours du protocole, plusieurs prélèvement de sang seront réalisés sur animaux vigiles au niveau de l'une des veines de la machoire et au niveau de la queue après une légère incision (1min par prélèvement). Les animaux seront soumis à plusieurs analyses d'imagerie cardiaque (4 fois maximum, 30min par analyse) réalisées sous anesthésie générale. Durant plusieurs heures (

Impact sur les animaux

Ce modèle de souris génétiquement modifié présente un phénotype dommageable et se traduit par le développement naturel de troubles métaboliques (exemple: augmentation du glucose dans le sang) et aboutit à un diabète de type 2. Ces effets entrainent une suralimentation et provoque une obésité sévère, source de souffrance et d’inconfort. Les souris mâles seront hébergées individuellement dans des cages et génére du stress. Le prélèvement de sang sur animal vigile nécessite une contention de l’animal pouvant être source de stress, ainsi qu’une ponction avec une aiguille dans l'une des veines de la mâchoire pouvant générer une douleur. L’étude du glucose sanguin nécessite une légère incision à la pointe de la queue entrainant un court saignement pouvant générer une douleur et du stress, et peut nécessiter une privation de nourriture lorsqu'elle est faite à jeun. L’utilisation des cages permettant de récolter l'urine requière l’hébergement individuel des souris sans alimentation et dans laquelle les souris sont uniquement placées sur une grille sans sciure et enrichissement et ce, sur plusieurs heures (20h au maximum). Des anesthésies gazeuses, provoquant une légère irritation des voies respiratoires, pourront être réalisées au cours du protocole afin de réaliser des examens du coeur sur plusieurs semaines. De même, en fin de protocole, des mesures de la pression sanguine seront effectuées dans la carotide et le coeur sur animal anesthésié à la suite de l’intubation des animaux et après l'ouverture du thorax pouvant être suivi par un prélèvement de sang dans le coeur. Un des effets indésirables potentiels est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. Le traitement par injection intra-péritonéale peut entrainer une inflammation de l'abdomen et le traitement par voie orale peut entrainer des fausses routes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car les mesures effectuées en fin de procédure sont des mesures terminales nécessitant l’ouverture de la cage thoracique pour les mesures de pression.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composés in vivo. Afin d’évaluer l’effet du composé sur l’insuffisance cardiaque, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’étudier les répercussions de la pathologie dans un système complexe entier ni d’évaluer l’efficacité d’un composé dans les organes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe (n=18) pour ce projet est basé sur des données obtenues dans la littérature (n=12) qui prennent en compte que des critères d’inclusion stricts peuvent être appliqués (+ 20%) et que du fait des différentes procédures prévues il peut y avoir une mortalité des animaux (+ 20%). Les animaux sont répartis de manière homogène à la suite des pesées et mesures de glucose sanguin à jeun initiales. L’examen cardiaque par imagerie permet de faire un suivi tout au long du protocole sur le même animal limitant ainsi le nombre d’animaux. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus des animaux contrôles sont conservés en interne pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). Cela permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Avec le recul de plusieurs études, le nombre d’animaux par groupe pourra être revu à la baisse.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 7 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux sous anesthésie lors de l’imagerie cardiaque seront placés sur un tapis chauffant et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux. Après chaque prélèvement, une réhydratation sera réalisée afin de compenser la perte de vu volume sanguin. Les doses et volumes d’injection des anesthésiques chimiques, analgésiques et de sérum physiologique seront réalisés selon les recommandations éthiques (doses, volume). Les mesures de pression sanguine réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'un analgésique.

Choix des espèces

La souris, classiquement utilisée en laboratoire, présente des similitudes importantes avec l’humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie vasculaire et cardiaque. La réponse pathophysiologique de la souris dans l'insuffisance cardiaque est comparable à celle des humains notamment en termes de modification du tissu cardiaque et de modification des pressions sanguines. De plus, ce modèle génétiquement modifié de souris développe des facteurs de comorbidités tels qu'un diabète de type 2 pouvant être à l’origine de l’insuffisance cardiaque chez l’Homme. Les souris utilisées auront au minimum 8 semaines. En effet, ce modèle est sensible à l’âge et la survenue de la pathologie apparait progressivement au cours du développement de l’animal. Un âge de 8 semaines correspond à l’âge minimum pour lequel les premiers symptômes apparaissent chez ces souris.