Troubles endocriniens

5 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Le projet crée des lignées privées d'un gène mitochondrial dans le cœur, les muscles ou les neurones, animaux qui développent une maladie cardiaque grave ou des crises d'épilepsie mortelles, puis teste une thérapie génique par injections, y compris chez des nouveau-nés anesthésiés par hypothermie. Chaque souris subit échocardiographies, prélèvements sanguins hebdomadaires et injections intrathécales, les tests comportementaux étant évoqués sans être précisés. Le porteur affirme ne pas pouvoir prédire sur cellules la quantité de protéine produite dans un organisme vivant et conclut à la nécessité du modèle murin, la thérapie pour les patients restant renvoyée à d'éventuels essais futurs.

Objectifs

Les mutations du gène d'intérêt sont responsables de maladies rares qui peuvent être graves. Ces maladies se manifestent souvent dès l'enfance et peuvent affecter plusieurs parties du corps, comme le cerveau, le coeur et le foie. Malheureusement, il n'y a actuellement aucun traitement pour ces maladies, et les traitements existants visent uniquement à soulager les symptômes sans arrêter la progression de la maladie. Ce gène d'intérêt est responsable de la production d'une protéine essentielle pour notre corps, en particulier pour produire de l'énergie dans nos cellules. Cependant, lorsque ce gène est altéré par des mutations, il provoque des problèmes dans la production d'énergie, ce qui peut être très dommageable. Notre projet vise à atteindre trois objectifs principaux : 1. Nous allons créer deux modèles de souris malades en les privant du fonctionnement du gène d'intérêt, soit dans le coeur et les muscles, soit dans les neurones. Nous pensons que ces souris développeront des problèmes similaires à ceux que l'on observe chez les humains. 2. Nous allons développer des virus spéciaux pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. Ces virus agissent comme des petits véhicules pour réparer le gène défectueux. 3. En utilisant ces modèles de souris, nous espérons développer un traitement pour les maladies liées aux mutations du gène d'intérêt en utilisant la thérapie génique. En injectant ces virus dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Parce que c'est difficile de faire en sorte que ces virus atteignent le cerveau, nous allons d'abord utiliser des souris où le gène d'intérêt est éteint dans le coeur et les muscles, comme modèle alternatif pour développer notre approche thérapeutique. Avant de tester ces virus sur des souris malades, nous allons d'abord effectuer des tests sur des souris en bonne santé pour comprendre comment le gène étranger fonctionne dans les organes affectés. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, il n'existe aucun traitement pour guérir ou contrôler l'évolution des maladies causées par les mutations du gène d'intérêt. Pour remédier à cette situation, nous travaillons sur la création de modèles de souris qui reproduisent ces maladies. Ces souris nous permettront d'évaluer en toute sécurité et sur le long terme l'efficacité des virus spéciaux conçus pour réparer le gène d'intérêt défectueux. Si ces tests sur les souris réussissent, cela signifie que nous pourrions éviter d'entreprendre des essais inutiles sur des humains, réduisant ainsi leurs souffrances. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques. Notre objectif principal est de développer des traitements pour les personnes atteintes de ces maladies en utilisant des virus adaptés à l'injection chez les humains. Cela pourrait apporter un grand espoir à ceux qui sont touchés par ces maladies.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les souris subiront les gestes suivants: 1. Échocardiographie : Un examen échographique du coeur qui dure 20 minutes par souris. Il sera effectué une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines lors de la création, et l'étude des souris malades ou une semaine avant l'injection lors de la sélection, de l'optimisation et du développement du traitement. La durée sera jusqu'au point limite adapté pour les souris contrôles malades, ou 12 semaines après ce point pour celles qui ont reçu des injections et présentent une amélioration de leur état de santé lors du développement et de l'optimisation du traitement. 2. Tests comportementaux durent de 5 à 30 minutes par souris. Ils seront réalisés une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines ou une semaine avant l'apparition de problèmes comportementaux, et se poursuivront jusqu'au point limite prédéterminé. 3. Injections : a) Injections dans la veine temporale dureront environ 5 minutes par souriceau et seront effectuées une fois, sous anesthésie par hypothermie. b) Les injections intrathécales, sous anesthésie générale (environ 40 min par souris), et dans la veine caudale (5 min par souris) seront réalisées une fois. 4. Le prélèvement de sang au niveau de la veine maxillaire, dure ~1 min par souris et sera effectué une fois par semaine. a) Pour les souris injectées par voie intrathécale et dans la veine caudale, les prélèvements de sang commenceront une semaine avant l'injection, puis 72 heures après l'injection, et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. b) Pour les nouveau-nés, les prélèvements commenceront à l'âge de trois semaines et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. Les tests comportementaux, les injections et le prélèvement de sang auront lieu dans un établissement n°1, et seulement l’échocardiographie sera réalisée dans un établissement partenaire n°2.

Impact sur les animaux

Les souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans les neurones naîtront sans signe de problème, mais elles développeront progressivement des difficultés de marche et de coordination. En fin de vie, ces souris connaîtront des crises d'épilepsie mortelles. Pour les souris où l'expression du gène d'intérêt est abolie dans le cœur et les muscles squelettiques, elles naîtront sans problème apparent, mais avec le temps, elles développeront une maladie du cœur grave, comme cela a été observé dans d'autres modèles de souris similaires. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les souris seront soumises à des situations stressantes liées à l'injection, aux tests comportementaux, au transport depuis l’institut jusqu'au centre spécialisé en échocardiographie, ainsi qu'à l'anesthésie pour les échocardiographies. Les injections intrathécales peuvent causer une certaine douleur après l'injection, mais des mesures seront prises pour minimiser leur inconfort.

Devenir

Mise à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

Nous effectuerons des tests sur des cellules pour identifier les morceaux génétiques qui n'expriment pas du tout ou très faiblement le matériel génétique prévu. Cependant, il est important de noter que, même si nous pouvons déterminer ces caractéristiques sur cellules, nous devons encore utiliser des modèles animaux pour nos recherches. C'est parce que nous ne pouvons pas prédire avec certitude combien de la protéine souhaitée sera produite à l'intérieur d'un organisme vivant, et si la quantité générée sera suffisante pour traiter la maladie.

Réduction

Nous avons utilisé des méthodes et des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour évaluer l'efficacité du traitement de manière fiable et statistiquement significative. Pour la création et l'étude des modèles de souris malades, nous réduirons le nombre d'animaux en effectuant plusieurs types d'analyses, lorsque cela est possible. Par exemple, la détermination du début et de la progression du phénotype sera effectuée en parallèle avec des tests comportementaux et les tissus extraits des souris à un stade avancé seront utilisés pour des expérimentations de biologie moléculaire. L'échographie est une autre méthode qui nous permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires, car elle permet de suivre l'évolution des souris au fil du temps, évitant ainsi une mise à mort répétée. Une approche similaire peut être appliquée à la sélection des vecteurs, l’optimisation et le développement du traitement.

Raffinement

Nous mettons en place des pratiques visant à réduire la souffrance des souris tout au long de notre recherche. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Les souris seront surveillées au moins deux fois par semaine pour détecter tout signe de souffrance ou d'anxiété. Lors des injections effectuées sur les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress. Cela inclut l'éloignement temporaire de la mère, la préservation de la litière de la cage maternelle, et un prélèvement de sang minime, effectué par un personnel expérimenté de la veine sous-maxillaire considérée comme étant une des zones les moins sensibles. Pour les injections intrathécales, une anesthésie générale sera administrée, et des analgésiques seront utilisés avant et après l'injection pour éviter toute douleur. Nous mettrons en place un suivi régulier des souris. Les cages seront aménagées avec des éléments pour leur bien-être, tels que des boules de coton, des maisons pour se cacher, et des objets à ronger. L'isolement prolongé sera évité autant que possible pour assurer une stimulation sociale. Le transport des souris entre l’institut et le centre expert en échocardiographie se fera dans des cages de transport spécialement conçues, dans des véhicules adaptés pour réduire les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

L'utilisation de mammifères est essentielle pour évaluer l'efficacité des virus dans le développement de la thérapie génique. Les souris sont couramment choisies pour les essais de phase I/II en raison de leur similitude physiologique avec les humains et de leur facilité d'élevage et de soins. De plus, les modèles de souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans le cœur et le cerveau peuvent développer une pathologie qui ressemble aux symptômes de la maladie gène d'intérêt chez l'homme. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines et plus. Nous commencerons par des nouveau-nés, car à cet âge, le virus peut atteindre le cerveau. Cependant, étant donné que l'expression du virus peut diminuer pendant la croissance rapide des nouveau-nés, nous utiliserons également des souris jeunes adultes (3 à 6 mois) pour certaines parties de nos expériences.

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Une maladie rénale chronique est induite par un régime enrichi en adénine pendant quatre semaines, suivie de six semaines d'administration de probiotiques dans la joue puis par gavage, avec incisions répétées du bout de la queue, test de tolérance au glucose et passage en cage métabolique. Le porteur reconnaît que les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage, tout en indiquant n'avoir observé aucun comportement anormal lors de protocoles similaires. Il affirme qu'aucun modèle mathématique ou cellulaire ne peut répondre à la question et conclut à la nécessité du modèle animal.

Objectifs

La maladie rénale chronique touche 3 millions de français(es). Elle se caractérise par une diminution du fonctionnement des reins et par l’accumulation de déchets, les toxines urémiques, que le rein ne peut plus éliminer. Actuellement, la seule option thérapeutique pour diminuer ces toxines est la dialyse (solution thérapeutique lourde, invasive et réservée aux patients au stade terminal de la maladie). Récemment, le microbiote intestinal a emergé comme un acteur majeur de la production de ces toxines. Ainsi, l’utilisation de probiotiques dans le cadre de la maladie rénale chronique est une stratégie attractive visant à restaurer l’équilibre du microbiote, diminuer les toxines et donc améliorer l’état de santé. Pour rappel, les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui excercent un effet positif sur l’organisme qui les ingère. L’objectif de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de 6 probiotiques, sélectionnés selon des critères spécifiques, regroupés en 3 combinaisons différentes chez des souris ayant une maladie rénale chronique. Les paramètres étudiés seront : la production de toxines, la fonction rénale, le métabolisme du glucose et l’équilibre du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’identifier un ou plusieurs probiotiques capables de diminuer la production des toxines à l’origine de la progression et des complications associées à la maladie rénale chronique. A moyen terme, ces probiotiques pourront être utilisés dans un essai clinique et ainsi, à plus long terme, être proposés comme solutions thérapeutiques aux patients souffrant d’une maladie rénale chronique. Comme mentionné précédemment, aucune solution n’est disponible pour ces patients.

Procédures

Grâce à une nourriture riche en adénine, la maladie rénale chronique sera induite de manière douce. 48 animaux recevront ce régime pendant 4 semaines (pause dans le régime tous les wek-ends, remise des croquettes contrôles). Les 8 autres souris recevront une alimentation normale pendant ces 4 semaines. Les fécès seront collectées avant le traitement aux probiotiques. Les 56 souris seront placées dans des cages individuelles propres pour collecter leurs fécès pendant 30 minutes. Un prélèvement de sang sera réalisé avant le traitement aux probiotiques et après 3 semaines de traitement pour mesurer l’urée (mesure le degré de fonction rénale). Une incision (- de 1mm) sera réalisée au scalpel sur souris vigiles à l’extrêmité de la queue et 15µL de sang seront recueillies avec un capillaire (propre et stérile). La durée du prélèvement sera inférieure à 1 minute/souris. Les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) dans le creux de la joue pendant les 3 premières semaines (5 jours/7). L’administration se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Pendant les 3 semaines suivantes, les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) par gavage dans l’estomac (6 jours/7). Le gavage se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Les 56 souris subiront un test de tolérance au glucose. Les souris seront mises à jeun le matin à 8h pour 6 heures pour mesurer la glycémie à jeun. Une incision (- de 1 mm) sera réalisée au scalpel à l’extrêmité de la queue et une goutte de sang sera deposée sur la bandelette de l’appareil mesurant la concentration de glucose. Ensuite, une injection de glucose sera réalisée dans l’abdomen puis la glycémie sera mesurée en recueillant au bout de la queue une goutte de sang à différents temps après l’injection (15, 30, 45, 60 et 90 minutes). Au cours de la dernière semaine, les 56 souris seront déplacées pour 24 heures, 2 par 2, dans des cages métaboliques pour collecter leur urine et leur fécès. A l’issue de la procédure, les 56 souris seront profondément anesthésiées par une injection dans l’abdomen (une fois 15 secondes contention comprise/animal) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).

Impact sur les animaux

Cette prodécure expérimentale devrait entraîner des nuisances modérées. La nourriture riche en adénine induit une diminution de la prise alimentaire et donc un léger ralentissement de la croissance pondérale pendant les 4 semaines d’induction de la maladie rénale chronique. La petite incision au bout de la queue pour récupérer du sang et mesurer l’urée peut générer du stress chez l’animal. Une contention quotidienne est nécessaire pendant 6 semaines pour réaliser l’administration des probiotiques dans le creux de la joue ou par gavage. Cette contention peut générer un stress chez l’animal le temps de la manipulation (moins d’une minute). La répétition des gavages pendant 3 semaines à raison de 6 jours sur 7 peut générer une irritation de l’œsophage et donc un inconfort pour les animaux. Pour le test de tolérance au glucose, l’incision du bout de la queue, le prélèvement d’une goutte de sang à 6 reprises et l’injection de glucose dans l’abdomen peuvent générer un stress et une légère douleur chez les animaux. Le changement d’environnement lors du passage en cages métaboliques peut générer un léger stress. Il est important de noter qu’au cours de protocoles similaires, il n’a pas été observé de comportements anormaux traduisant un stress, une souffrance, une douleur ou une anxiété des animaux.

Devenir

Les 56 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans la production des toxines et dans le développement de la maladie rénale chronique sont multifactoriels et le résultat de la communication entre plusieurs organes (intestins, reins, foie,…). Des modèles mathématiques ou de la culture cellulaire ne permettraient pas de répondre à la question scientifique. Une étude clinique chez l’homme n’est pas envisageable à ce stade car il est impossible d’étudier en profondeur la fonction intestinale, la fonction rénale et le métabolisme de façon non invasive. L’étude de l’impact des probiotiques sur la production des toxines et sur l’évolution de la fonction rénale ne peut donc se faire, à ce jour, sans l’aide d’un modèle animal.

Réduction

Les probiotiques utilisés ici n’ont jamais été testés dans le cadre de la maladie rénale chronique. Les dispositions nécessaires ont été prises pour éviter le double emploi de la procédure. Le nombre de souris par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel et sur la base des données obtenues dans de précédents procotoles utilisant des souris atteintes de maladie rénale chronique. Afin d’obtenir une différence significative entre les groupes expérimentaux un effectif de 12 animaux par groupe est nécessaire. Pour le groupe contrôle (pas de maladie rénale chronique), un effectif de 8 animaux est suffisant pour une obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre maximum d’animaux utilisés dans cette procédure sera de 56. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger suite à l’obtention des premiers résultats et pourront également être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.

Raffinement

L’utilisation du régime riche en adénine évite le récours à la méthode chirurgicale classique (2 interventions). Le régime sera interrompu tous les week-ends afin de limiter la perte de poids. Cette pause permet aux animaux de reprendre le poids perdu tout en ne nuisant pas au développement de la maladie. Les probiotiques seront donnés par gavage seulement pendant la seconde moitié du traitement (3 semaines/6) afin de réduire le stress et les irritations qui pourraient être liés aux gavages. Au cours des 3 premières semaines les administrations se feront dans le creux de la joue. Parmi les probiotiques testés certains sont anaérobies (ils ne doivent pas rentrer en contact avec l’air ambiant) et il a été démontré que l’administration de ces probiotiques par gavages donnaient de meilleurs résultats que l’administration dans le creux de la joue. Par conséquent, la phase de gavages ne peut pas totalement être éliminée du protocole au risque de diminuer fortement ses chances de réussite. Le volume des probiotiques administrés a été réduit au minimum. Les souris seront placées 2 par 2 dans les cages métaboliques pour limiter le stress dû à l’isolement et au changement d’environnement. Une période de 15 minutes d’habituation à ce nouvel environnement aura été réalisée un ou deux jours en amont afin de limiter encore d’avantage le stress des animaux. La concentration de la solution de glucose a été calculée de manière à limiter le volume injecté. Une seule incision au bout de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée en début de test pour recueillir la goutte de sang nécessaire à chaque mesure. Les animaux seront maintenus dans leur cage d’origine pour limiter le stress. La glycémie sera surveillée jusqu’à son retour à la valeur basale. Les animaux seront surveillés 3 fois/semaine pendant le régime adénine puis tous les jours par la personne qui réalisera les administrations de probiotiques. Les animaux seront pesés 2 fois/semaine. Les souris seront profondément anesthésiées pour permettre le prélèvement terminal de sang. Les gestes techniques : incisions du bout de la queue, administrations intra-buccales, gavages et injection seront réalisés par une personne expérimentée afin de limiter le stress de l’animal. Des points limites précis, prédictifs et précoces seront définis afin de mettre à mort tout animal le nécessitant. Lors de nos précédents protocoles de ce type aucun mal-être, douleur ou souffrance n’a été observé.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier la maladie rénale chronique et les effets bénéfiques pouvant découler de la supplémentation en probiotiques. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’homme et permet de reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients (accumulation des toxines, modifications du microbiote, modification du métabolisme). Des souris âgées de 8 semaines seront utilisées. A cet âge là, le régime riche en adénine est bien toléré par les animaux et on observe le développement d’une maladie rénale chronique modérée.

840 souris rendues obèses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un gilet plusieurs semaines, subissent rasages et applications cutanées quotidiennes ainsi que des séries de piqûres à la queue pour mesurer la glycémie, pour étudier le passage de médicaments à travers la peau et leur accumulation dans la graisse. Le porteur décrit un régime hypercalorique imposé et des manipulations répétées, tout en jugeant leur impact sur le "bien-être" limité. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas compte des interactions entre les tissus et qu'il faut prendre en compte "l'ensemble de l'organisme".

Objectifs

Notre projet vise à comprendre comment la composition des formulations utilisées pour appliquer des médicaments sur la peau influe sur la manière dont ces molécules pénètrent la peau et s'accumulent dans le tissu adipeux. Nous cherchons à établir une corrélation entre la nature chimique des substances actives et leur accumulation dans le tissu graisseux en fonction des formulations utilisées. En d'autres termes, nous étudions comment différentes molécules médicamenteuses se déplacent à travers la peau en fonction des composants qui les accompagnent. Cela nous permettra de formuler des médicaments de manière à minimiser leur passage dans le système sanguin, favorisant ainsi leur effet local dans les tissus sous-cutanés. L'objectif est de mieux comprendre la biodistribution des médicaments chez les personnes obèses lors d'une application cutanée.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de découvrir comment les produits utilisés pour appliquer des médicaments sur la peau peuvent influencer la façon dont ces médicaments se répartissent dans notre corps. Nous voulons comprendre comment ces produits affectent la manière dont les médicaments atteignent et restent dans les cellules graisseuses. Ces données permettront de mieux comprendre comment les médicaments se propagent dans le corps des personnes obèses lorsqu'ils sont appliqués sur la peau

Procédures

• Rasage des poils avec une tondeuse spécifique : cela concerne tous les animaux à la fréquence d’1/10j pendant 30j max • Application des formulations cutanées : cela concerne tous les animaux, tous les jours pendant 10 à 30j (durée du traitement) • Mise en place du gilet protecteur : il va représenter une gêne pour l’animal, il est donc nécessaire de l’habituer au port du gilet qui durera 10 à 30j. • Prélèvement sanguin mandibulaire : cela concerne tous les animaux qu’1 fois et sera réalisé sous anesthésie • Prélèvement d’une goutte de sang par piqure au niveau caudal pour la mesure de glycémie. Ce geste est réalisé sur animal vigile à la fréquence de 5 piqures en 2h qui sera renouvelé 3 fois sur l’expérimentation. Ce geste concernera tous les animaux.

Impact sur les animaux

Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant le démarrage de l’expérimentation afin de réduire le stress des animaux à leur arrivée à l’animalerie. Le régime va engendrer une prise de poids ayant un impact minimal sur leur bien être. Le rasage des poils, l’application des formulations n’induiront pas de nuisances et d’effets indésirables aux doses choisies. En effet, les composés associés à la substance active sont connus pour avoir des propiétées non irritantes. Les doses utilisées pour chaque molècule modèle ne devront pas induire d’effets irritant au niveau cutané ou générer des effets indésirables systémiques. L’apparition d’effets indésirables a été prise en compte dans le cadre des points limites et sera anticipée dans le choix des molécules modèles et des deux doses appliquées. Les souris porteront des gilets aérés afin d’éviter qu’elles lèchent les formulations déposées sur leur peau ou celle de leurs congénères ce qui limite le risque d’effets indésirables ou de modifier les résultats. Par le biais de ce dispositif, l’isolement des individus sera évité. Le gilet sera maintenu en place pendant toute la durée du traitement (10-30 jours) et une acclimatation sera prévue dès le début de l’expérimentation (1h/jour puis une pause d’une journée puis une augmentation du temps pour qu’au bout de deux semaines l’animal soit habitué à le porter pendant 24h. Le dernier mois il portera en permanence le gilet).

Devenir

Mise à mort car un prélèvement de différents organes doit être réalisé

Remplacement

Cette étude consiste à comparer la répartition dans le corps de substances actives en fonction des produits utilisés et des individus (obèses ou non). Nous examinons comment ces substances sont absorbées par la peau, comment elles se déplacent à l'intérieur de celle-ci, et dans quel type de graisses, ils se stockent. D'autres modèles notamment cellulaires ne nous permettent pas de comprendre comment ces deux types de tissus interagissent sur le long terme ni comment ces substances s'accumulent dans les différents types de gras corporel, comme le gras blanc ou brun. C'est pourquoi il est important de prendre en compte l'ensemble de l'organisme dans cette étude.

Réduction

Avant de réaliser des tests sur les animaux, nous allons d'abord vérifier si les substances que nous utilisons pour administrer les médicaments se mélangent bien entre elles en laboratoire. Cela nous aidera à réduire le nombre de combinaisons que nous devrons tester. Ensuite, après avoir fait des tests sur les animaux, nous pourrons éliminer certaines de ces combinaisons. C'est pourquoi nous avons prévu de tester 15 combinaisons différentes, en utilisant 10 médicaments modèles et 5 substances de transport.

Raffinement

Des personnes formées s'occuperont des animaux en veillant à minimiser leur stress. Nous avons veillé à ce que les souris s'habituent à porter les gilets de protection afin de ne pas les stresser. Pendant le traitement, nous veillerons à ce que les souris gardent une interaction sociale durant toute l’expérimentation et un enrichissement de leur environnement. Pour les souris en surpoids, nous tiendrons compte du fait qu'elles peuvent rencontrer des difficultés à bouger, et nous les surveillerons de près afin qu’elles aient accès à la nourriture et à l’eau de boisson. Si elles semblent avoir du mal, nous mettrons la nourriture près d'elles et leur donnerons de l'eau sous forme de gel. Pendant le traitement, nous vérifierons tous les jours si les souris réagissent bien aux médicaments. Si elles semblent avoir mal, nous évaluerons leur niveau de douleur grâce à des critères spécifiques décrits par Lloyd et Wolfensohn (1998).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce a été défini suite à une étude bibliographique de référence qui a été établie sur cette espèce avec des souris âgées de 6 semaines en début de régime alimentaire adapté afin qu’elles atteignent un poids d’environ 150 g pour celles qui auront le régime hautement énergétique.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques par cinq injections de streptozotocine, elles reçoivent des îlots humains encapsulés par chirurgie abdominale, puis sont suivies trois mois avec prises de sang par section de la queue et tests de tolérance au glucose avant une seconde chirurgie et la mise à mort. Le porteur liste parmi les effets une perte de poids, une hyperglycémie et une possible nécrose de l'extrémité de la queue. Il juge le recours à l'animal "indispensable" et choisit la souris pour consommer moins d'îlots humains, "tissu rare", que le rat.

Objectifs

La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie prometteuse du diabète de type 1. Celle-ci vise à remplacer les cellules béta pancréatiques (sécrétrices d’insuline) défectueuses par l’injection d’îlots sains (issus de dons multi-organe) par voie intra-portale dans le foie de patients diabétiques. Cette stratégie thérapeutique qui permet une régulation glycémique plus physiologique et moins contraignante que les injections pluriquotidiennes d’insuline. Cependant, cette approche thérapeutique comporte encore de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Depuis les années 80, de nombreuses équipes ont tenté de mettre en place un pancréas bioartificiel basé sur l’encapsulation des îlots pancréatiques. Néanmoins, à ce jour, aucun système n’a réellement montré d’efficacité à long terme sur la survie et la fonction des îlots. Ainsi, cette approche de protection des îlots doit être encore améliorée et c’est dans ce contexte que nous situons notre projet de recherche. Ainsi, dans le but de promouvoir cette thérapie en levant ces verrous, nous souhaitons tester différentes méthodes d’encapsulation des îlots à l’aide d’hydrogels. Nous souhaitons donc tester in vivo l’impact de l’encapsulation d’îlots humains dans le cadre d’une xénogreffe (le donneur est d'une espèce biologique différente de celle du receveur) dans la cavité abdominale de souris rendues diabétiques par injection intra-péritonéale de streptozotocine. Cette étude permettra d’évaluer l’effet protecteur de notre encapsulation sur les réactions de rejet et les réactions inflammatoires.

Bénéfices attendus

La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans la cavité abdominale permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.

Procédures

L’injection de streptozotocine se fera en intra péritonéale à l’aide d’une aiguille 23G. L’injection réalisée sur animal vigile par 1 injection par jour sur 5 jours. La durée de l’intervention (et la contention) durera quelques secondes pour chaque injection. 24 h après la dernière injection, une mesure de glycémie sera effectuée à l’aide d’un glucomètre à partir d’une micro goutte de sang prise à la queue pour vérifier si l’animal est bien diabétique (durée de l’acte quelques secondes). Chez les souris devenus diabétiques, 2 modules d’encapsulation seront implantés dans l’abdomen. Ceci nécessitera une incision de l’abdomen de 1 cm. Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée et durera environ 15 minutes. Des anti-inflammatoires seront administrés post-chirurgie au maximum pendant 3 jours. Concernant le suivi de la survie et de la fonction des îlots implantés, celui-ci durera 91 jours. Pour cela, tous les 15 jours la prise de poids (quelques secondes), la glycémie capillaire (lecteur de glycémie, quelques secondes) seront mesurées, une prise de sang par incision de l’extrémité de la queue sera effectuée pour la réalisation de divers dosage plasmatique (durée 5 minutes par souris) et un test de tolérance au glucose sera réalisé. Ce test est nécessaire afin de déterminer la fonction réelle de la greffe. Ce test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capillaire à l’aide d’un lecteur de glycémie toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l'eau ad libitum). Une mesure de la glycémie sera effectuée à jeun juste avant l'injection intrapéritonéale du glucose (durée par mesure de quelque seconde). 84 jours après implantation, les implants seront retirés (même méthodologie dispositions prises et durée d’intervention que pour l’implantation). Enfin, 7 jours plus tard les animaux seront mis à mort pour prélèvement final des organes.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids en lien avec l’induction du diabète - Douleurs post-opératoires faisant suite à la chirurgie réalisée pour la mise en place des hydrogels (Laparotomie) - Risque d’infection suite aux implantations des hydrogels - Stress en lien avec la répétition des injections d’insuline (si nécessaires) ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude et durant les tests de tolérance au glucose - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques -Hémorragie post section de la queue - Périodes de mise à jeun.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Nous souhaitons valider de nouveaux hydrogels sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique. Or la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier si un pancréas bio artificiel est efficace, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours de la réalisation de nombreuses études métaboliques réalisées sur animaux rendus diabétiques par injection de STZ. Cette étude nécessitera 360 souris. Enfin, la succession des interventions sur les mêmes animaux permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour répondre à nos hypothèses.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages collectives ventilées et enrichies. En cas de procédure invasive une anesthésie et une analgésie adaptées seront mise en place. De plus, des points limites prédictifs et précoces ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux demeurant diabétique recevront une insulinothérapie. Les souris immunodéficientes seront maintenues et manipulées dans des conditions permettant de garantir leur état de santé.

Choix des espèces

Pour répondre à nos objectifs, nous avons choisi le modèle de la souris pour recevoir les îlots encapsulés car celui-ci a l’avantage d’avoir des caractéristiques physiologiques proches de l’Homme. De plus, dans un implant nous souhaitons encapsuler 10000 îlots/kg de poids corporel (quantité utilisée dans le cadre de la transplantation d’îlots chez l’homme nécessaire pour rétablir un équilibre glycémique). Ainsi, nous utiliserons moins d’îlots humain (tissus rare) que si nous utilisions le modèle du rat qui est 10 fois plus gros que la souris. La souche C57BL/6 nous permettra d’évaluer la capacité immuno protectrice de nos hydrogels sur les îlots pancréatiques humains. La souris de souche NSG nous permettra de contrôler la survie et la fonction de nos îlots humains encapsulés et implantés dans un environnement immunodéficient (Contrôle). Pour ce projet les souris seront uniquement utilisés à un stade adulte (Age: 8-12 semaines à leur arrivée à l’animalerie), stade de maturité sexuelle et possédant un système immunitaire mature.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mises à jeun hydrique et isolées, elles passent dix-sept tests de double choix entre deux boissons pour mesurer leur préférence pour des "faux lipides", avant un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. Le porteur indique que l'isolement pendant les tests peut être source de stress et prévoit un enrichissement supplémentaire. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut remplacer la souris pour l'évaluation orosensorielle liée à l'obésité.

Objectifs

Des études récentes chez l’Homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) que les saveurs sont détectées. Les récepteurs de lipides (CD36, GPR120) exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Ainsi ces deux lipido-récepteurs pourraient représenter la cible pour développer de nouvelles molécules (agoniste / antagoniste) permettant de moduler le comportement alimentaire lipidique chez les obèses. Dans le but de réduire la prise alimentaire des aliments gras, nous avons synthétisé de faux lipides (agonistes de lipido-récepteurs), à partir de d’acides gras naturels, capables d’interagir avec les lipido-récepteurs mimant le goût du gras sans apporter de calories car ils ne sont pas métabolisables. Nous avons démontré l’absence d’effets génotoxiques et tératogènes de ces faux lipides. Cette demande représente l’extension de la précédente autorisation accordée concernant les faux lipides A et faux lipides B et qui sont brevetés L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de nouvelles molécules biosourcées « faux lipides » sur la préférence des aliments gras, et portera essentiellement sur l’évaluation orosensorielle vis-à-vis de ces faux lipides chez souris C57/BL6. Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules réduisent l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules modifient la préférence pour les molécules lipidiques et réduisent à long terme l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Procédures

Les animaux, seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel (test de double choix entre deux boissons) afin de déterminer si les souris présentent une certaine préférence pour les molécules d'intérêt. Pour ce faire, Les animaux seront soumis à une mise à jeun hydrique de 4h avant les tests et pendant le test orosensoriel (durée 4h) les souris seront individualisées, les croquettes seront retirées et auront à leur disposition une bouteille d’eau et une bouteille de solution « test » pendant le test. Chaque lot de 15 souris subira 17 tests de double choix, avec une pause de deux ou trois jours entre les tests. A la fin de l’étude Les animaux seront mis à jeun pendant 4h et soumis à un prélèvement de sang terminal en intra-cardiaque sous anesthésie à l’Isoflurane (3%). Enfin, après mise à mort de l’animal, des prélèvements d’organes auront lieu. Aucun autre prélèvement sur animal vigile n’est envisagé.

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact chez les souris puisqu’on est amené à les mettre en cages individuelles (pendant 12 h) lors des tests de double choix. Les animaux peuvent subir un stress suite à l’individualisation pendant la durée des tests. Pour minimiser l'effet de ce stress, un enrichissement supplémentaire (igloo en cellulose en plus des sizzle pad) sera apporté.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

L’utilisation du modèle animal (souris) s’impose dans ce projet d’une part du fait que nos molécules « faux lipides » sont nouvelles et par conséquent il n’existe aucun outil pharmacologique qui aurait pu permettre la mise en place d’une étude clinique et d’autre part par le besoin d’analyser les mécanismes multifactoriels impliqués dans la perception gustative. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En effet, malgré les résultats obtenus, in vitro, utilisant des cellules gustatives, Il n’est pas possible de se limiter à des approches in vitro pour des évaluations orosensorielles de faux lipides

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux

Raffinement

Les animaux seront parfois isolés pendant la durée du teste double choix (4 h), cependant en dehors des périodes de tests Les animaux seront hébergés en groupes (3-4 souris par cage) dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo en cellulose en plus des sizzle pad). L’état général des animaux sera surveillé de façon régulière et dès l’apparition de signes précoces de souffrance (des points limites adaptés et des critères d’arrêt sont prévus), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix lors de l’étude des évaluations orosensorielles et les investigations de la modulation du comportement alimentaire par les faux lipides et son incidence à long terme sur l’obésité. A la suite de ce projet nous envisageons dans une seconde étape de tester les molécules les plus préférées par les souris sur l’incidence de l’obésité dans le même modèle de souris. La souris est le modèle de l’obésité qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte (entre 3 et 4 semaines), ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles de 8 semaines seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel.

480 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué et une inflammation ou une infection intestinale induite, avec jeûnes prolongés, gavages, injections, prélèvements sanguins et pose d'une pompe sous la peau, pour étudier si la résistance à l'insuline fragilise la barrière intestinale. Le porteur décrit des signes de souffrance possibles, poil hérissé, perte de poids, léthargie, dos courbé, ataxie et tremblements. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais conclut que la complexité des dialogues entre organes impose le recours à l'animal.

Objectifs

L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) la sécrétion d’hormones et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinale et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Sur animaux vigiles : 240 animaux: (1 mise a jeun de 16h, 6 à 7 contentions de 45 secondes pour 1 administration orale de produit, 3 prélèvements de sang (2 caudal de 30 secondes, 1 mandibulaire de 1 minute) et 2 à 3 injections de produit de 45 secondes), 240 animaux : (1 mise à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 16h, 7 à 8 contentions de 45 secondes pour 2 administrations orale de produit, 3 prélèvements de sang (2 caudal de 30 secondes, 1 mandibulaire de 1 minute) et 3 à 9 injections de produit de 45 secondes). Sur animaux anesthésiés : 240 animaux (un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)). 240 animaux (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique (20min par souris) et un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)).

Impact sur les animaux

L’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Les souris rendues diabétiques présenteront une augmentation de leur prise hydrique et de leur volume urinaire. Les incisions cutanées chirurgicales peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des bactéries pathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.