Troubles endocriniens

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie du cerveau sous anesthésie pour y injecter des virus, d'autres un jeûne de 24 heures, des injections répétées et un régime gras destiné à les rendre obèses, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la prise alimentaire. Le porteur décrit la découverte récente d'un gène jusque-là inconnu et renvoie les applications contre l'obésité et le diabète à un horizon lointain. Il affirme avoir déjà validé son approche in vitro mais conclut au "besoin" de la souris, seule à réunir les organes en jeu dans la régulation énergétique.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel autour d'une constante. Une dérégulation du système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont fortement associées comme le diabète. Nous avons récemment mis en évidence une fonction inattendue d’une protéine dans la régulation de l’appétit. Nos données mettent en évidence le rôle d’un variant génétique associé au diabète de type 2. Toutefois le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette découverte reste incomplet. Nous avons récemment identifié un nouveau gène jusqu’alors inconnu qui pourrait contribuer à la régulation de l’appétit chez la souris. Nos données préliminaires confirment que cette nouvelle cible pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant l'obésité. Par conséquent, ce projet vise à comprendre comment cette protéine est impliquée dans l’homéostasie énergétique.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'une nouvelle protéine clé dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Cette étude est pertinente et innovante pour plusieurs raisons. Nous avons déjà montré le rôle spécifique de cette voie de signalisation dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'avait jamais été mise en avant jusqu’à présent. Comme le contrôle de la prise alimentaire est très complexe, les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage le mécanisme moléculaire impliqué dans la prise alimentaire et le gain de poids. Cette étude nous permettra de déterminer si cette protéine jusqu'alors inconnue est une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité.

Procédures

320 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Les 320 animaux (+160 pas de stéréotaxie) seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 2 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou shRNA. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim). Une habituation des animaux sera nécessaire. Pour ce faire, une injection IP de NaCl 0.9% sera réalisée quotidiennement pendant 3 jours. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Une diète riche en gras pour créer un environnement obésogène sera mis en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les chirurgies stéréotaxiques potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Pour l'étude du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées. Les chirurgies stéréotaxiques pour l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgés de 18 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale

20 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transférés vers l'établissement voisin où ils seront tués à la fin du protocole. Ces rats rendus diabétiques reçoivent une injection quotidienne pendant douze semaines, des prises de sang hebdomadaires, des tests de tolérance au glucose et un test de mémoire en piscine de Morris, cette partie du projet se limitant à une séance d'imagerie par rayons X sous anesthésie. Le porteur indique attendre perte de poids, hyperglycémie et lésions de la queue liées aux prélèvements répétés dans l'établissement principal. Il présente sa myokine comme une biothérapie innovante et curative du diabète, et affirme que l'étude in vivo est indispensable car la maladie implique plusieurs organes.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (diabète de type 1, DT1), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit (diabète de type 2, DT2). Ainsi, dans les 2 cas, il y a un trouble de l’utilisation et du stockage du glucose apporté lors des repas, entrainant une hyperglycémie. Cette dernière peut au fil du temps provoquer des maladies cardiovasculaires, des néphropathies, des altérations cognitives (perte de mémoire) … La régulation de la fonction sécrétoire des cellules à insuline et leur survie jouent un rôle central dans la progression du diabète. Le muscle squelettique constitue l’organe le plus sensible à l’insuline de l’organisme et joue donc un rôle majeur dans l'équilibre glycémique de l'organisme puisqu’il constitue le site majoritaire de stockage du glucose sous l'action de l'insuline. Nous avons mis en évidence l’existence d’une communication croisée entre le muscle squelettique et les cellules à insuline par le biais de facteurs appelés myokines. Nous avons montré in vitro et in vivo, dans un modèle de transplantation d’îlots chez le rat DT1, qu’une myokine, appelée myokine X, permettait d'améliorer la survie, la fonction des îlots pancréatiques et l’équilibre glycémique des animaux diabétiques transplantés. Par ailleurs, nous avons montré qu’une injection quotidienne de notre Myokine X chez un modèle de rat DT2, permettait de prévenir l’apparition de cette pathologie. En particulier, les premiers résultats montrent un impact intéressant de la myokine X sur le tissu adipeux brun. Ce dernier représente un intérêt important de par sa capacité thermogénique qui améliore l’homéostasie glucidique grâce à une importante consommation des substrats dont le glucose. Le nom de cette myokine, représentant un intérêt thérapeutique important pour le patient diabétique, reste anonyme car un brevet est en cours de dépôt. L'objectif de l'étude réalisée dans l'EU 2/2 est de mesurer l'absorption des rayons X par les différents tissus du rat afin de quantifier la masse maigre et grasse. Ceci sera réalisé lors d'une séance d'imagerie non invasive à rayons X chez le rat anesthésié en fin de protocole.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est d’obtenir un effet curatif du DT2 par la Myokine X. Contrairement au Liraglutide, largement utilisé chez le patient diabétique qui peut présenter un certain nombre d’effets indésirables tels que des désordres intestinaux pouvant amener le patient à vouloir arrêter son traitement, nos études précédentes in vivo menées chez le rat diabétique n’ont pas montré de tels désordres. Ainsi, notre traitement pourrait constituer une biothérapie innovante pour le DT2. L'impact de la Myokine X sur le muscle squelettique (masse maigre) qui joue un rôle central dans la régulation de la glycémie sera évaluée avec l'utilisation de l'imagerie par rayons X chez l'animal anesthésié en fin de protocole.

Procédures

Dans l’établissement 1/2, les animaux recevront une injection quotidienne en intrapéritonéale durant 12 semaines. De plus, différents tests seront effectués sur l’ensemble des animaux pour suivre la glycémie et ainsi évaluer l’évolution du diabète. Tout d’abord, celle-ci sera mesurée quotidiennement et l’acte ne durera que quelques secondes. Par ailleurs, nous complèterons ce suivi par une prise de sang hebdomadaire afin de mesurer des marqueurs en liens avec la glycémie. La durée de la contention pour la prise de sang est de moins de 2 minutes. Pour évaluer le fonctionnement de l’ensemble des organes impliqués dans la régulation de la glycémie, un test de sensibilité à l’insuline sera réalisé la moitié des animaux et sur l’autre moitié un test de tolérance au glucose sera effectué. Ces deux tests dureront chacun 2h et avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l’eau ad libitum). De plus, nous évaluerons les effets de notre traitement sur les altérations cognitives pouvant être induites par le diabète à l’aide du test de la piscine de Morris. Ce test durera 2 min et sera réalisé 3 fois de suite pendant 3 jours au cours de 3 sessions réparties au cours des 15 semaines de l’étude sur 64 animaux.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus dans l’établissement 1/2 sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de Myokine X. – Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Hypoglycémie. - Hypothermie post test comportemental. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie liée au prélèvement sanguin. – Inflammation au point d’injection due aux injections répétées. Les nuisances attendues sur les animaux sont une anesthésié à l'isoflurane et une séance d'imagerie par rayons X d'une durée de 2 minutes. Il n’y a pas d’effets indésirables attendus dans le protocole réalisé dans l’EU 2/2 ; la dose de rayons X reçue lors de la séance unique d’imagerie TDM-X est largement inférieure au seuil d’apparition d’effets délétères cellulaires.

Devenir

A la fin de la procédure réalisée dans l'EU 2/2, les animaux retournent dans l'EU 1/2 pour terminer le protocole (saisine 40266). La mise à mort à lieu dans l’établissement 1/2

Remplacement

Le diabète est une pathologie complexe où de nombreux organes sont impliqués (pancréas, muscles, tissu adipeux…) et communiquent entre eux, ce qui ne peut être modélisé in vitro. De plus, comme décrit précédemment, l’impact de la Myokine X ayant déjà été évalué in vitro, il est maintenant primordial d’évaluer ses effets dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie glucidique sont présents. Pour cela, le recours à une étude in vivo est donc indispensable.

Réduction

La tomodensitométrie est une technique d’imagerie qui nous permettra de déterminer l’impact de la Myokine X sur l’ensemble de la composition corporelle, en complément des pesée d’organes réalisées sur l’ensemble des animaux au moment du sacrifice. Cette méthode de quantification étant très précise, nous utiliserons 5 rats par groupe. En effet, ce nombre d’animaux est suffisant pour nous permettre de réaliser des analyses statistiques sur les données de masse grasse et masse maigre des animaux.. De plus, la stratégie d’expérimentation est établie en tenant compte la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Pour cela, afin de réduire le nombre d’animaux et le stress que pourrait engendrer cette procédure sur chaque animal, une attention particulière est portée sur le fait que tous les animaux ne réaliseront pas la procédure de tomodensitométrie car ils sont déjà impliqués dans des procédures réalisées précédemment..

Raffinement

Les rats seront transportés entre les 2 établissements dans des boites de transport adaptées avec des croquettes, de l’eau en gel et de l’enrichissement. Ils ne resteront dans l’établissement 2 que le temps nécessaire à la réalisation de l’imagerie. Avant et après la séance d’imagerie, ils seront placés au calme dans la zone de quarantaine de l’animalerie avec un contrôle régulier afin de vérifier leur bien-être.

Choix des espèces

Le rat ZDSD (Zucker Diabetic Sprague Dawley) est celui qui mime le mieux le syndrome métabolique, le diabète de type 2 et l'obésité trouvé chez l’Homme. Les autres modèles de rongeurs actuellement disponibles pour le diabète et le syndrome métabolique manquent de translationnalité à la condition humaine. Ainsi, nous utiliserons le modèle de rat ZDSD. L’utilisation en parallèle de rats SD (Sprague Dawley) servira de contrôle afin d’évaluer l’impact de notre molécule en situation non pathologique. Ceci nous permettra de comprendre les mécanismes d’action physiologique impliqué notamment dans la régulation de la glycémie de notre Myokine X, encore à élucider à ce jour. Nous utiliserons des rats SD et ZDSD âgés de 16 semaines au commencement du protocole. En effet, le DT2 apparaitra à partir de 16 semaines de vie chez les rats ZDSD. Ainsi, comme le projet consiste à étudier l'effet curatif de notre Myokine X sur le DT2, il faut que les animaux aient au moins 16 semaine de vie avec un statut diabétique établi avant le commencement des traitements.

1 320 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent dès la naissance des injections intraveineuses sur animal vigile et des prélèvements d'urine quotidiens, puis des prélèvements de sang à la veine maxillaire, pour tester une thérapie par ARNm contre la leucinose. Le porteur indique qu'un quart des souris, porteuses de la maladie, ont un risque de mort de 50 % dans les trois premiers jours et de 100 % avant deux semaines, et que toutes sont tuées pour analyse des tissus. Il affirme que la démonstration ne peut se faire complètement que dans un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer des stratégies thérapeutiques pour traiter une maladie métabolique rare d’origine génétique, causée par la dysfonction d’une enzyme. La forme classique de cette maladie se caractérise par un coma en période néonatale pouvant conduire au décès en l’absence de traitement en urgence. Il existe également des formes moins sévères, chroniques, sans épisode aigu néonatal sévère et des formes se révélant par des troubles neurologiques lors d’épisodes aigus de stress métabolique (fièvre...). A ce jour, le principal traitement repose sur un régime alimentaire extrêmement strict, limité en protéines. Ce régime est très efficace mais il doit être poursuivi à vie et ne permet pas de prévenir le risque de complications graves, parfois mortelles. Un tel régime altère de façon significative la qualité de vie. Certains patients peuvent bénéficier d’une transplantation hépatique qui certes guérit la maladie, mais demeure associée à un risque propre de rejet et de décès. L’efficacité de la transplantation hépatique dans cette maladie nous a conduit à proposer le projet ici présenté. Notre objectif est de développer une stratégie de traitement de cette maladie métabolique par une approche de thérapie innovante basée sur l’utilisation d’ARN messagers, non-pathogènes, qui ont montré qu’ils pouvaient corriger de manière stable des maladies où d’autres protéines sont manquantes après une seule administration. La spécificité de cette étude est d’étudier l’efficacité à court terme de cette thérapie après injection unique dans des modèles murins de cette maladie métabolique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de faire la preuve de concept de l’efficacité de court terme de cette thérapie innovante chez la souris, ouvrant la voie du développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique chez l’homme.

Procédures

Tous les animaux de cette étude (N = 360 + 960 dans amendement) seront soumis à des injections par voie intraveineuse dans la veine temporale le jour de la naissance sur souris vigile et à des prélèvements d'urine quotidiens la première semaine de vie puis deux fois par semaine. Les animaux de l’étude de survie (N = 90 + 160 dans amendement) seront soumis à des prélèvements de sang au niveau de la veine maxillaire à partir d’une semaine de vie sur souris vigile. Les animaux de l’étude pharmacocinétique (N = 270 + 800 dans amendement) seront soumis à un prélèvement de sang unique au niveau de la veine maxillaire au moment de la mise à mort sur souris vigile. Ces différents actes seront le plus brefs possibles (1 min pour les injections néonatales, 1 min pour les prélèvements d’urine, 1 min pour les prélèvements de sang) et pratiqués par du personnel entrainé.

Impact sur les animaux

Les souris KO malades (25% des souris comptées dans le projet) présentent un phénotype grave : risque de 50% de décès au cours des 3 premiers jours et 100% au cours des 14 premiers jours. Les nuisances que subiront les souris seront : une douleur associée à une injection IV sur souris vigile (injection initiale unique sur souriceau), un stress lié à un prélèvement d’urine sur souris vigile réalisé quotidiennement la première semaine de vie puis deux fois par semaine et une douleur associée à un prélèvement sanguin sur souris vigile, à partir d’une semaine de vie, de façon hebdomadaire pour les souris de l’étude de survie ou au moment de la mise mort pour les souris de l’étude pharmacocinétique.

Devenir

Mise à mort pour analyse des tissus.

Remplacement

Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux dans ce projet, nos collaborateurs ont déjà testé différentes formulations d’ARNm in vitro. sur des cellules de foie cultivées en laboratoire. Ceci leur a permis de sélectionner des traitements candidats. Cependant la capacité des nanoparticules à franchir les défenses immunitaires ne peut être démontrée complètement que dans un organisme physiologique "entier".

Réduction

Toutefois, la seule utilisation de la souche « malade » pose certains inconvénients : en sachant qu’un animal sur 4 est affecté par cette maladie à la naissance et compte-tenu du nombre de souris nécessaires pour notre projet, le nombre de souris en élevage serait trop important pour répondre à l’ensemble des questions posées. Aussi, dans l’optique de réduire au maximum l’utilisation de ces souris malades, les meilleures formulations sélectionnées in vitro ont été testées par nos collaborateurs dans un organisme physiologique entier, chez des souris saines, afin de sélectionner les plus efficaces et la plus apte à franchir les défenses immunitaires. Le nombre d'animaux nécessaire par lot a été déterminé grâce aux études publiées précédemment développant une approche similaire. Nous étudierons les réponses à nos traitements à la fois pour les mâles et les femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’accouplements et aussi le nombre de souris atteintes non utilisées. Afin de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires à la détection de l’effet de nos traitements, nous avons établi le paramètre le plus important (concentration plasmatique de leucine) et nous avons utilisé un test bilatéral standard de comparaison des moyennes (t-test) afin d’avoir 90% de chance de détecter une diminution des concentrations de leucine dans le plasma de souris traitées avec l’ARNm comparées aux contrôles, avec un risque d’erreur de 1%.

Raffinement

Nous allons utiliser des procédures de raffinement pour éviter la souffrance des souris lors de prélèvements sanguins et pendant l'injection du vecteur thérapeutique. Au moment de l’injection chez les nouveaux-nés ; la mère sera éloignée afin de minimiser son stress. Les souriceaux seront recouverts de sciure de la cage de la mère et replacés rapidement dans la cage. Au niveau expérimental, les quantités minimales de sang et d'urine seront prélevées par du personnel expérimenté en veillant à réaliser les prélèvements sur les zones les moins sensibles possibles. Une surveillance régulière sera mise en place et des points limites adaptés ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l'animal si nécessaire. Les souris seront gardées dans des portoirs ventilées dans lesquels nous ajouterons du coton, une maisonnette et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la maladie humaine avec son phénotype clinique et biochimique sévère. Le modèle souris, facile à produire par comparaison aux autres modèles disponibles (bovins), permet d’étudier les différents organes, types cellulaires et mécanismes de défense immunitaire, pertinents pour notre étude et inaccessibles in vitro. Amendement : Deux modèles murins pertinents et complémentaires de la maladie seront utilisés. Nouveau-nés de 0 à 2 jours de vie car la maladie présente un phénotype très sévère entrainant un décès de la souris dans les 15 premiers jours de vie ; souriceaux et souris adultes jusqu’à 2 mois pour l’étude de survie.

1 080 rongeurs, 864 souris et 216 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète de type 1 est induit par injection de streptozocine, puis les animaux reçoivent des candidats médicaments, parfois par pompe osmotique implantée, et subissent des tests de glycémie avec prises de sang répétées. Le porteur indique que les administrations et la contention peuvent provoquer stress et douleur. Il présente ces molécules comme sélectionnées après des tests in vitro et destinées à d'éventuels essais cliniques, et prévoit la mort de tous les animaux en fin de procédure.

Objectifs

Le glucose est décrit comme étant le principal carburant de l’organisme, et son taux plasmatique est régulé par l’insuline, une hormone secrétée par les cellules bêta du pancréas. Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose, appelé aussi hyperglycémie, dans le sang. On distingue principalement 2 types de diabète : le diabète de type 1 (DT1) et le diabète de type 2 (DT2). Le DT1 est due à la détérioration des cellules bêta du pancréas entraînant une carence en insuline, tandis que le DT 2 est causé par une baisse de la production d’insuline ou l’apparition d’une résistance à l’insuline produite. Le DT 1 est une maladie auto-immune, en effet, il fait suite au dysfonctionnement des cellules immunitaires (lymphocytes T), qui se mettent à identifier les cellules bêta du pancréas comme des cellules étrangères et à les éliminer. Le DT1 représente environ 10 pour cent des cas de diabètes, dont la moitié se déclare avant l’âge de 20 ans. Il a une incidence d’environ 15 cas pour 100 000 enfants de moins de 15 ans. L’insulinothérapie est le traitement de référence du DT1, qui consiste à des injections sous-cutanées d’insuline plusieurs fois par jour. Un traitement bien suivi permet le plus souvent de réguler la glycémie, néanmoins, c’est un traitement lourd et chronique, nécessitant en même temps une mesure de la glycémie par le patient plusieurs fois par jour. A noter que c’est un traitement qui permet une prise en charge, et non une guérison, et donc à prendre à vie. Par ailleurs, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter au rythme de 3 à 4 % par an. Ainsi, la recherche continue, soit à décrypter les mécanismes de la maladie pour mieux la prévenir, soit en améliorant les traitements. Ce projet a donc pour objectif de tester des nouveaux candidats médicaments pour le traitement du DT1 chez le rat ou chez la souris.

Bénéfices attendus

Depuis une vingtaine d’année, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter tous les ans, tandis que le traitement de référence reste l’insulinothérapie, un traitement lourd et à vie. Ce projet vise à rechercher et sélectionner les candidats médicaments efficaces pour traiter le DT1 chez l’animal, afin d’obtenir une preuve d’efficacité pour d’éventuels essais cliniques chez l’homme par la suite.

Procédures

Les interventions que vont avoir les animaux sont : - Une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à tester, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. Tout type d’administration sur animal vigil, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute. L’administration à l’aide d’une pompe osmotique dure moins d’un quart d’heure. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour, pendant 1 à 48 semaines). - Une administration intrapéritonéale de streptozocine si le modèle animal requiert l’induction du diabète de type 1. Ce traitement durera 5 jours au maximum avec une administration par jour, réalisé par des personnels tutorés, et dure moins d’une minute. - Un test de supplémentation au glucose ou en insuline (comme réalisé chez l’homme). Ce test consiste à une administration de glucose ou d’insuline, puis à des prélèvements sanguins permettant le dosage de glucose et ou d’insuline dans le sang. Le test est réalisé une seule fois pour chaque animal, et les prélèvements sont réalisés au maximum 5 fois chez la souris et 7 fois chez le rat, dans les 2 heures qui suivent la supplémentation. Chaque prélèvement sanguin par des personnels tutorés dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induit par l’administration du composé à tester, qui nécessitera une contention, et l’implantation de pompe osmotique si besoin - Stress potentiellement dû à l’isolation pour les prélèvements d’urine en cage à métabolisme (moins de 24 heures) ou dû aux prélèvements sanguins.

Devenir

Tous les animaux vont avoir un diabète de type 1 et ou vont recevoir un traitement contre cette maladie. Ainsi, au vu des traitements réalisés sur les animaux, ils seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

Les composés testés dans ce projet sont ceux ayant montré au préalable des effets positifs dans des tests in vitro (screening).

Réduction

Tout d’abord, seuls les composés ayant montré des effets positifs lors des sélections in vitro seront étudiés dans ce projet, limitant le nombre d’animaux à utiliser. Ensuite, selon la littérature et notre expérience, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Et en prenant en compte les exclusions ou pertes potentielles tout au long de l’étude (environ 20 pour cent), 12 animaux par groupe seront étudiés. En considérant que pour l’étude d’un composé pharmacologique, 6 groupes seront nécessaires, et que l’analyse des résultats sera réalisée en 4 mois, 3 sélections sont prévues par an sur 5 ans. Ainsi, le nombre estimé d’animaux est de : 6 groupes d'animaux x 12 animaux par groupe x 3 sélections par an x 5 ans. Soit un total de 1080 animaux, rats et souris confondus. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les animaux sont hébergés à au moins 2 par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de frisure de papier pour leur permettre de nicher et de bûchettes de peuplier pour ronger. - Un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Une anesthésie, anesthésie et un traitement antibiotique prophylactique sont réalisées si la procédure d’implantation de pompes osmotiques est réalisée.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine du diabète. Les rats et les souris sont bien décrites sur le plan physiologique et comportemental, et pour lesquels il existe de nombreux modèles répondants à l’approche thérapeutique envisagé (diabète de type 1). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. L’étude du diabète nécessite l’apparition des caractéristiques qui sont stables et établies au-delà du stade juvénile.

3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, comme modèles du syndrome de Wolfram. Chaque animal subit un jeûne de 16 h, des injections intrapéritonéales et des incisions caudales répétées sur neuf mois, pour caractériser un diabète et tester cinq composés. Le porteur indique que le modèle Wolfram-like développe progressivement cécité, surdité et troubles vestibulaires, et que les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il affirme que ces modèles murins sont "indispensables", seul "recours mammifère autre que l'humain" à reproduire ces symptômes, alors que les retombées thérapeutiques restent une "preuve de concept" à venir.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. De même, le syndrome de Wolfram-like est caractérisé par un diabète sucré de type 1, une surdité neurosensorielle et une atrophie optique bilatérale. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de ces maladies n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de caractériser l'apparition du diabète dans deux modèles murins de ces maladies et déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur ce diabète.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans les syndromes de Wolfram et Wolfram-like sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, dans un premier temps, de caractériser le diabète des modèles murins de référence pour le syndrome de Wolfram et Wolfram-like. Il permettra ensuite d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur ces deux modèles.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : contrôle alimentaire (durée 16h) -identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale via créme anesthésiante). Chaque animal sera identifié une fois. Les animaux subiront 1 contrôle alimentaire (durée 16h), 2 injections en intrapéritonéal (1 min) à au moins 3 jours d’intervalle, 2 incisions caudales (première fois coupure puis retrait de la croute) à 1 mois. Ces interventions seront répétées à 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins, pour un total de 5 contrôles alimentaires, 10 injections en intrapéritonéal et 10 incisions caudales sur une période de 9 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Le contrôle alimentaire sur un durée de 16h peut également engendrer un stress. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels (cécité, surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins des syndromes de Wolfram et Wolfram-like pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Nous avons basé la taille de notre lot sur les données bibliographiques de souris développant un diabète, non induit par un régime spécifique. Nous avons estimé que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires et suffisants pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle. De plus, des analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe et ce nombre sera révisé au besoin. De même, les animaux utilisés pour la réalisation des tests métaboliques seront ensuite euthanasiés et leurs organes collectés afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet. Ces tissus seront utilisés pour lors de nombreuses analyses, morphologiques, histologiques, afin de disposer du plus large éventail de données possibles à l’issue d’une procédure expérimentale et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Des points limites ont été établis afin de surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le projet . Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations métaboliques dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests métaboliques seront réalisés sur les animaux à 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins.