Troubles endocriniens

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur soumet une partie des souris à une irradiation du corps entier suivie d'une greffe de cellules, et l'ensemble à des injections intrapéritonéales répétées et à des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les quinze jours pendant trois mois, qu'il reconnaît pouvoir altérer leur vision. Ce travail vise à comprendre le rôle d'une molécule dans une forme agressive de mastocytose, un cancer du sang. Il cite un "dépôt de brevet" et des financements parmi les retombées attendues et affirme le modèle animal "indispensable", la complexité des interactions cellulaires n'étant selon lui pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les mastocytoses systémiques (MS) sont des formes incurables de maladies du sang particulièrement difficiles à traiter. Ces maladies très hétérogènes allant de formes indolentes à des leucémies fatales, sont caractérisées par l’accumulation et l’activation incontrôlée des cellules immunitaires appelées mastocytes dans la moelle osseuse. Plus de 30% des patients atteints de MS agressives ne répondent pas aux traitements administrés en clinique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le métabolisme des cellules est fortement perturbé dans les cellules cancéreuses afin de répondre à leur besoin en énergie pour proliférer de façon aberrante. Nous avons donc identifié les altérations métaboliques dans les mastocytes de patients afin de tester le potentiel clinique de leur inhibition. Nous avons mesuré une forte concentration de kynurénine (L-Kyn), une petite molécule chimique, dans le plasma des patients atteints de formes agressives comparé aux indolentes et confirmé l’activité de la voie dont elle fait partie dans des mastocytes issus de la moelle osseuse de patients.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment la L-Kyn dont la concentration est élevée de façon physiologique dans le plasma des patients atteints de MS agressive, exacerbe les fonctions mastocytaires en régulant directement les fonctions des mastocytes ou leur microenvironnement (adipocytes médullaires). Ces analyses nous permettront d'une part de tester le potentiel de la voie de la kynurénine comme cible thérapeutique dans les MS agressives dans un contexte physiologique mais également d'identifier de nouvelles cibles en aval de la L-Kyn qui pourraient également être pertinentes. Cette étude est la première étape vers le développement de nouveaux médicaments ciblant ces régulations en combinaison ou non avec les traitements utilisés pour cette pathologie en routine clinique. Elle permettra également le dépôt de brevet et de financements indispensables pour la poursuite de ce projet. Ces pathologies agressives sont particulièrement invalidantes ; la médiane de survie des patients au diagnostic est de moins de 3 ans et de moins de 6 mois pour les formes les plus agressives. Cette étude est donc indispensable pour améliorer le devenir des patients et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de prévenir ou freiner le développement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux (procédures 1-2) recevront une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 3 fois par semaine pendant une semaine puis 5 fois par semaine pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins seront réalisés en rétro-orbital sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à l’atteinte des points limites. Les animaux (procédures 3-5) recevront une irradiation sous-létale sur corps entier sur animaux vigiles. Une greffe intraveineuse en rétro-orbital unique sera réalisée. Une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 5 fois par semaine sera réalisée pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins en rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à atteinte des points limites.

Impact sur les animaux

La manipulation et la pesée pourraient entraîner du stress chez les animaux. Une mauvaise tolérance à l’irradiation sous-létale pourrait entraîner une inactivité et une mobilité réduite pendant quelques heures après l’irradiation (rare). Le même phénotype pourrait être observé après une greffe partielle des cellules injectées quelques jours après la transplantation. Une perte de poids pourra être observée et sera monitorée. Les prises de sang répétées dans le sinus rétro-orbital pourraient causer des problèmes de vision aux souris.

Devenir

La totalité des individus impliqués seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation de plusieurs modèles cellulaires in vitro seuls ne permet pas de rendre compte de la complexité des interactions cellulaires impliquées dans la maladie. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal afin de valider notre hypothèse. A cette étape du projet, il n’existe aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Le calcul d’effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul d'effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul statistique approprié. Cette approche nous permet de conserver une méthode scientifique rigoureuse tout en réduisant au minimum le nombre d'animaux nécessaires. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes contrôles. Afin de réduire à son minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes contrôles seront commun à plusieurs tests d'efficacité. Enfin, afin de réduire le nombre d'animaux issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos expériences.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les expérimentateurs et le personnel qualifié de l'animalerie sont formés pour limiter au maximum le stress des animaux lors de leur manipulation. Les animaux utilisés dans ces expériences seront soumis à une surveillance quotidienne. Les objectifs de toute procédure étant de donner à l’animal la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute souffrance due aux procédures soit détectée et réduite. Pour ce faire, le suivi de la maladie se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs. Dès l’apparition des points limites, que nous avons choisis le plus précoce possible pour que l’animal reste asymptomatique, l’animal sera mis à mort. Par conséquent, cette mise à mort intervient avant l’apparition de symptômes et de nuisances dues à la pathologie. Nous optimiserons les conditions d'hébergement des animaux par la présence d'enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactes et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 4 ou 5 afin d'éviter le stress de l'isolement. Pour limiter au maximum la souffrance des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie, et une analgésie sera mise en place si nécessaire (voir points limites).

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici l'hématopoïèse). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. En effet, bien que des formes ancestrales de systèmes hématopoïétiques aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers parmi lesquels, le poisson zèbre et la souris, sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, les outils développés chez cette espèce et l’absence d’expertise sur le poisson zèbre au sein de l’institut satisfait aux exigences d’utilisation de la souris comme espèce la moins susceptible de ressentir de la souffrance ou de la douleur pour les expérimentations proposées. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ces types de modèle de MS et ce type d'injection de cellules néoplasiques mastocytaires en intraveineux, c'est à dire des souris "jeunes adultes" âgées de 6 à 10 semaines au moment de la transplantation et/ou des injections intra-péritonéale prévues.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles enchaînent mises à jeun, contentions répétées, gavages et injections, et une inflammation intestinale leur est provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson, avant un prélèvement sanguin terminal. Le porteur décrit des signes de souffrance attendus, poil hérissé, perte de poids, léthargie, dos courbé, ataxie et tremblements. Il affirme que ces phénomènes sont "impossibles à étudier directement chez l'Homme", tout en indiquant avoir déjà utilisé des organoïdes intestinaux pour une partie des questions.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action intestinale de l'insuline contribue à l'hyperperméabilité et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales au cours du diabète. Notre projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les voies de signalisation permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes) -Un 1er lot d'animaux vigiles feront l'objet d'une mise a jeun (14h), de 2 à 7 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). Ce 1er lot d'animaux recevra également un traitement dans l'eau de boisson (7 jours) induisant une inflammation intestinale. -Un 2ieme lot d'animaux fera l'objet d'une mise a jeun (14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et de 2 injections de produit (1min). -Un 3ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 4 à 9 contentions (30 secondes chacune), de 2 à 7 administrations orale de produit (1min) d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). -Un 4ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune) de 1 à 6 administrations orale de produit (1min), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). - Tous les animaux seront placés sous analgésie anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

L'identification, les prélèvements, l’anesthésie/analgésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou liées à l’inflammation intestinale. Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale ou l’infection par des entéropathogènes, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend 816 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles présentent dès la naissance un déficit de poids et un défaut cardiaque, et reçoivent un gavage deux fois par jour pendant cinq mois ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaux, pour tester le repositionnement de quatre médicaments déjà commercialisés. La moitié est tuée pour prélèvements d'organes, l'autre moitié transférée vers une autre animalerie pour des analyses cardiaques puis tuée également. Le porteur affirme que le modèle cellulaire reste incomplet pour un "organisme tout entier" et conclut à la "nécessité" du modèle animal avant le passage à l'Homme.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (2 fois par jour pendant 5 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Si la procédure de gavage pose problème, comme des irritations, il pourrait y avoir éventuellement la pose de mini pompes 1 fois par/mois pendant 4 mois (de l'âge de 2 mois à 6 mois) où chaque intervention n'exéderait pas 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 5 mois. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10-12 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins rétro-orbitaux sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. Le prélèvement se fera dans un oeil différent d'une fois sur l'autre. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal . Les mises au points de gavage 2 fois par jour durant 3 mois lors d'une précédente DAP n'ont pas révélé de nuisances particulières.

Devenir

Euthanasie de 180 animaux (la moitié du nombre total d'animaux) pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet (DAP) précédentes. L'autre moitié (180 animaux) sera transféréé dans une autre animalerie (autre DAP acceptée) pour analyse par echocardiographie et course sur tapis (treadmill) et sera également euthanasiée afin de récupérer les organes pour analyses.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis la mise en place des conditions optimales pour le bien-être des animaux. Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des animaux modèles de la maladie (KO TAZ) inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance : si on dépasse les 25 pourcents d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure. Pour les animaux KO TAZ, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les animaux contrôles, non malades (WT) seront séparés des KO dans les cages.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation chirurgicale de la quasi-totalité des reins en deux opérations pour induire une maladie rénale chronique, puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, pour évaluer un probiotique. Le porteur indique une mortalité chirurgicale de moins de 5% et prévoit la mise à mort en cas de glycémie hors seuil. Les retombées cliniques, un éventuel "essai thérapeutique chez l'homme", restent conditionnées à des résultats positifs.

Objectifs

La maladie rénale chronique est un enjeu de santé publique majeur compte tenu de sa fréquence en constante augmentation et de ses conséquences en termes de décès. Elle est caractérisée par une diminution du fonctionnement des reins responsable de l’accumulation de déchets que le rein ne peut plus éliminer. Ces déchets sont appelés toxines urémiques et sont responsable d’une perturbation de la glycémie et de la progression de la maladie rénale. Le microbiote intestinal (bactéries de l’intestin) est responsable de la production de ces toxines urémiques issues de la dégradation des protéines de l’alimentation. Ainsi, la modulation du microbiote intestinal semble être une nouvelle stratégie thérapeutique pour réduire la production des toxines urémiques en plus des régimes pauvre en protéines proposés aux patients ayant une maladie rénale. Cependant réduire les protéines peut exposer les patients à un risque de dénutrition sévère et à des retards de croissance chez l’enfant. Les probiotiques qui sont des bactéries vivantes peuvent avoir un intérêt dans la maladie rénale en améliorant la composition du microbiote. Certains probiotiques semblent particulièrement intéressant. Par exemple, le probiotique Lactobacillus plantarum peut stimuler la croissance de souris juvéniles en condition de dénutrition. L’objectif de cette étude est d’étudier l’effet du probiotique Lactoplantibacille plantarum chez des souris ayant une maladie rénale chronique induite par chirurgie (ablation des 5/6èmes de reins, provoquant une maladie rénale chronique modérée) sous une alimentation pauvre en protéines chez des souris en croissance (souris jeunes) et chez des souris âgées. Nous cherchons à étudier l’impact de ce probiotique en particulier sur la croissance, la régulation de la glycémie, la fonction rénale et l’accumulation des toxines urémiques.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de mieux comprendre le rôle du microbiote intestinal dans la progression de la maladie rénale chronique, la production des déchets urémiques et leurs conséquences néfastes. Cela nous permettra de mieux définir si l’ajout d’un probiotique qui stimule la croissance et l’hormone de croissance, pourrait en plus de la modulation du microbiote lutter contre les effets délétères des régimes pauvre en protéines chez l’enfant et l’adulte. Si les résultats sont positifs, ce projet pourra faire l’objet d’un essai thérapeutique chez l’homme ayant une maladie rénale chronique.

Procédures

Le modèle de maladie rénale chronique sera induit par ablation chirurgicale des 2/3 du rein droit puis de la totalité du rein gauche 1 semaine plus tard. Chacune de ces opérations sera réalisée sous anesthésie générale et antalgie efficace. Le traitement antalgique sera poursuivi de façon systématique pendant 48 heures. Les chirurgies seront réalisées en conditions stérile et les souris seront installés sur des tapis chauffant afin d’éviter un refroidissement. Les souris contrôles auront une chirurgie factice au cours de laquelle le rein sera exposé selon la même procédure chirurgicale mais sans réaliser d’intervention au niveau du rein. Au cours de la chirurgie, l’opérateur vérifiera l’absence de saignement anormal. Les probiotiques seront administrés à la pipette dans la bouche des souris. Au cours de la procédure les animaux auront plusieurs prélèvements. Les prélèvements réalisés en condition vigile se feront par le biais d’une micro-incision à l’extrémité de la queue préalablement anesthésiée par crème anesthésiante locale. Un premier prélèvement sera réalisé avant la 1ère chirurgie et réitéré 3 semaines après la 2ème chirurgie. A 4 semaines, nous réaliserons un test de tolérance au glucose après 6 heures de jeûne. Le glucose sera injecté en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. A 5 semaines nous réaliserons un test de tolérance à l’insuline après 6 heures de jeûne. L’insuline sera injectée en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. La survenue d’une glycémie trop haute ou trop basse (malgré une injection intra-péritonéal de glucose) constitue un point limite et les animaux seront mis à mort selon la procédure (injection d’un anesthésiant à forte dose et dislocation cervicale). A 6 semaines, les souris seront placées 2 par 2, pendant 24 h en cage avec un fond contenant de trous millimétrique afin de récolter l’urine. A la fin de la procédure les souris seront mises à mort. Le dernier prélèvement sera réalisé à cœur battant, sous anesthésie générale afin de permettre le prélèvement d’un volume le plus grand possible pour permettre le dosage des toxines urémiques. La mise à mise sera réalisée sans réveil par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Dans de précédentes études, la mortalité chirurgicale était de moins de 5%. La mortalité est généralement liée à l'induction d'une maladie rénale chronique trop sévère et arrive généralement dans les 24-48h après la 2° chirurgie. De plus, il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant une souffrance ou une anxiété des animaux. Il n'a pas été noté de perte d'appétit en condition de régime pauvre en protéine dans nos précédentes études. L’appétence pour les probiotiques est bonne. L’utilisation de régimes pauvre en protéines peut cependant induire une agressivité chez les animaux. Au cours de cette étude l’administration du probiotique se fera en intrabuccale grâce à l’utilisation d’une simple pipette et d’un cône. Par ailleurs les souris seront amenées à subir des test métaboliques nécessitant un prélèvement d'un micro-goutte de sang par incision de la portion terminale de la queue. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale selon le protocole soit animaux.

Remplacement

La production des déchets urémiques résulte à la fois de la diminution du fonctionnement du rein et de la composition modifiée du microbiote. Ces éléments ne sont pas modélisables sur un modèle cellulaire. De plus nous voulons étudier en autre les modifications de la structure l’intestin et de la régulation de la glycémie qui nécessite des examens trop invasifs pour être réalisé chez l’homme. Enfin l’étude de l’impact du probiotique sur la croissance dans une population d’enfant ayant une maladie rénale n’est pas possible à ce stade de développement du fait du risque potentiel infectieux de ce traitement. Ainsi toute expérimentation dans des modèles cellulaire ou chez l’homme est impossible à ce stade.

Réduction

Nous avons pris les dispositions nécessaires pour éviter le double emploi de notre procédure expérimentale. En effet, à notre connaissance, la question scientifique que nous posons ici n’a encore jamais été adressée. Il s’agit donc d’un projet totalement original et nous avons veillé, lors de l’élaboration de notre procédure, à éviter toute redondance dans les expérimentations. Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Le nombre de souris du groupe contrôle a été réduit au minimum car des données obtenues d’expérience précédente seront réutilisées. Nous utiliserons au maximum 260 souris.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. Des antidouleurs seront délivrés systématiquement au moment de la chirurgie et 48 après. Les interventions seront réalisées sur tapis chauffant. Une surveillance 2 fois par jour sera effectuée pendant les 48 premières heures après les chirurgies. Dans les suites, les souris seront surveillées 1 fois par jour 5 jours par semaine afin de repérer toutes situation d’inconfort, de stress, douleurs ou agressivité. Pour limiter l’anxiété, les animaux seront placés 5 par cage. L’agressivité sera en particulier évaluée chez les animaux sous régimes pauvre en protéines. Tout au long de notre expérimentation nous resterons également vigilants à la survenue des points limites. Si une atteinte des points limites définis est constatée, les animaux seront sortis du protocole et mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale. Les prélèvements réalisés sur souris vigiles seront réalisés par incision de l’extrémité de la queue préalablement anesthésiée par crème anesthésiante locale. Au cours des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, en cas de glycémie trop haute ou trop basse à la fin du test, cela constitue un point limite et les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale L’administration des probiotiques sera réalisée directement dans la bouche par le même opérateur durant toute la procédure pour éviter tout traumatisme des animaux. Nous évitons ainsi le gavage directement dans l’estomac qui pourrait causer des lésions internes.

Choix des espèces

Le présent protocole sera conduit sur des souris, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l'induction d'une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l'altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l'on peut observer chez l'homme (accumulation de toxines urémiques, hyperglycémie, modification du microbiote intestinale). Des souris âgées de 4 semaines ont été choisi car les souris sont dans une phase de croissance et d’étudier plus spécifiquement l’intérêt de ce probiotique sur la croissance. Des souris âgées de 12 mois seront utilisées afin d’évaluer l’impact du probiotique sur la dénutrition en particulier, reproduisant une situation retrouvée chez l’homme adulte.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, un gavage, des prélèvements de sang et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique, avec induction d'un diabète et d'une inflammation intestinale. Le porteur reconnaît une polydipsie, un poil hérissé, une léthargie, un dos courbé, une ataxie et des tremblements possibles. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale et assure donc un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinal et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales. Notre projet permettra l'identification dans l'épithélium intestinal des cibles cellulaires et des voies de signalisation dérégulées au cours de la résistance à l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

-1 lot d’animaux vigiles fera l’objet d’une mise à jeun (14h), de 6 à 7 contentions (45 secondes chacune), d’une administration orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -1 autre lot d’animaux vigiles fera l’objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 7 à 8 contentions (45 secondes chacune), de 2 administrations orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 480 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post-opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Par ailleurs, le choix de cette espèce est motivé par la volonté de comparer les résultats de ce projet obtenus sur des modèles de perte d'action globale globale de l'insuline à ceux d'un autre projet obtenus sur des souris génétiquement modifiées, déficientes pour l’action de l’insuline spécifiquement au niveau intestinal. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.