Troubles endocriniens

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mettre au point un modèle de lésion rénale aiguë. Chaque animal subit une microchirurgie d'environ quarante-cinq minutes avec ablation d'un rein et interruption de la circulation de l'autre pendant trente minutes, suivie de prélèvements sanguins quotidiens et de traitements pendant sept jours. Le porteur liste parmi les effets attendus des lésions rénales, des douleurs et une anesthésie profonde pouvant entraîner la mort des animaux âgés. Il justifie ce modèle par le taux d'échec des essais cliniques, qu'il attribue à une "faible pertinence" des modèles existants, et affirme que les modèles in vitro ne peuvent "substituer" les tests sur animaux.

Objectifs

10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale conduisent à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant les lésions rénales aïgues. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.

Procédures

Chaque animal subira : - 1 seule procédure de microchirurgie d'une durée totale d'environ 45 min: Laparotomie, ablation du rein droit, puis clampage de l'artère et de la veine rénale du rein gauche pendant 30 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - prélèvements sanguin quotidien (sur 7 jours) de 20 à 100 ul de sang par légère incision au niveau de la queue ou via une ponction de la veine faciale (durèe environ 1 min par animal). - traitements quotidien par les candidats médicaments pendant 7 jours consécutifs (durèe inférieure à 1 min par animal).

Impact sur les animaux

Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons au développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la deuxième phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. L’animal recevra aussi une injection sous-cutanée d’analgésique pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture ainsi qu'un enrichissement adéquat dans les cages d'hébergement (igloo polycarbonates autoclavables et réutilisables + carton) . Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable (études in vivo de Tox. et PK/PD faites par les concépteurs des molécules), et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime. De plus, l'étude sera conduite par des personnels qualifiés et formés au respect des conditions du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’uninephrectomie + ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection postopératoire. La procédure sera réalisée sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées (Charles River ou Janvier laboratory). Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines. Le choix de cet âge est basé par la procédure décrite par des études scientifiques précedentes, qui ont identifié que 8 semaines représente l'âge optimal pour la réussite de cette procédure de microchirurgie.

313 souris génétiquement modifiées pour modéliser le syndrome NARP vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à quatre âges, des tests de force musculaire, de motricité, d'équilibre et d'endurance, ainsi que des IRM et échocardiographies sous anesthésie, le porteur attendant un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et musculaire. L'objectif est de caractériser cette lignée avant de tester des candidats médicaments, une étape que le porteur décrit comme "jamais faite auparavant de manière détaillée". Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires restent "incomplets" et que le recours à l'"organisme tout entier" est une "nécessité".

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

1500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant huit semaines, elles subissent chaque jour un stress de contention, olfactif, social, environnemental ou une perturbation de leur rythme circadien, pour reproduire un état dépressif et tester des molécules. Le porteur présente le projet comme une prestation offerte à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques pour la validation in vivo de leurs molécules, et prévoit de tuer les souris par dislocation cervicale afin d'analyser leur intestin et leur cerveau. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire l'état dépressif.

Objectifs

Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte environ 12% des hommes et presque 20% des femmes. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables (troubles du sommeil par exemple). De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression est associée une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu'une dysbiose du microbiote intestinal. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.

Procédures

Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le groupe G2 subira ces stress pendant 8 semaines. Le groupe G3 subira le protocole de stress pendant 8 semaines associé à un traitement antidépresseur connu. Les souris du groupe G4 subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple).

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu sur le groupe contrôle (non-CUS - G1). Les souris des groupes CUS (G2, G3 et G4) seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Le groupe G3 aura en plus un traitement antidépresseur. Ce groupe devrait avoir un aspect du poil bien entretenu. Ce traitement antidépresseur chez la souris n'est pas connu pour engendrer d'effet indésirable quelconque. Les souris du groupes G4 qui seront traitées avec des molécules à tester seront des molécules de type probiotiques ou prébiotiques ou compléments alimentaires ne faisant pas l'objet d'une quelconque dangerosité pour l'animal.

Devenir

Les souris seront ensuite euthanasiées par dislocation cervicale afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.

Remplacement

Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris C57BL/6J est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. L'accumulation de ces stress qualifie cette procédure de modérée. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.

Choix des espèces

La souris C57BL/6J est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime riche en graisses et en sucres pendant douze semaines, avec des gavages de sucre et d'huile, des prélèvements de sang répétés et une prise de poids réduisant leur mobilité, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à montrer un effet protecteur de lipides végétaux contre l'obésité. Le porteur présente le résultat comme une "preuve de concept" pour de futures études chez l'humain.

Objectifs

La transition nutritionnelle vers des systèmes alimentaires sains et plus durables est en faveur de la végétalisation des régimes alimentaires. Il est devenu important de mieux comprendre le rôle et les mécanismes d’action des nutriments d’origine végétale d’un point de vue de la santé métabolique. Si les protéines végétales ont suscité un vif intérêt ces dernières années, certains lipides spécifiques des végétaux verts restent encore méconnus et peu exploités. Leur absorption et métabolisme in vivo sont jusqu’ici peu décrits. Des travaux préliminaires suggèrent néanmoins des effets anti-inflammatoires, des effets de réduction des lipides sanguins circulants, ainsi qu’une potentielle utilisation par les bactéries intestinales. Les lipides végétaux naturellement présents dans différents aliments végétaux pourraient donc constituer de potentiels prébiotiques (susbtrats pour les bactéries intestinales) avec des bénéfices importants pour la santé, et avoir ainsi un rôle à jouer dans le cadre de stratégies nutritionnelles préventives dans la lutte contre l’obésité. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre en évidence les potentiels effets protecteurs des lipides végétaux sur la mise en place de l’obésité chez la souris. Pour cela, nous étudierons leurs effets sur : le métabolisme des lipides et des glucides, la santé intestinale (absorption, fonction barrière, bactéries) et l’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette étude animale devrait permettre de montrer pour la première fois que la consommation de certains lipides végétaux peut éviter une altération du métabolisme, un déséquilibre des bactéries intestinales et une augmentation de l’inflammation. Les résultats de cette approche pourront alors constituer une preuve de concept pour de futures études cliniques d’intervention nutritionnelle chez l’Homme, notamment chez des personnes souffrant d’obésité.

Procédures

- Alimentation riche en graisses et en sucres pour 3 groupes de 12 souris pendant 12 semaines ; alimentation d’entretien pour 1 groupe contrôle de 8 souris pendant 12 semaines. - Mesure de la composition corporelle sur toutes les souris vigiles, contention dans un tube, moins de 2 minutes par souris, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Collecte de crottes de toutes les souris vigiles, 30 minutes dans une cage individuelle, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Mise à jeun (6h ou 12h) des animaux avant les gavages de toutes les souris, deux fois à 1 semaine d’écart. - Un gavage avec du sucre pour tester le métabolisme des glucides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage de sucre/souris sur les 12 semaines d’étude). - Un gavage avec de l’huile pour tester le métabolisme des lipides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage d’huile/souris sur les 12 semaines d’étude). - Les deux gavages seront espacés d’une semaine. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec du sucre (15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) sur toutes les souris vigiles lors de la 10ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun quelques secondes par souris. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec de l’huile (1, 2 et 4heures) sur toutes les souris vigiles lors de la 11ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun environ 30 secondes par souris. - Une injection dans l’abdomen des anesthésiques (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : quelques secondes. - Un prélèvement de sang sous anesthésie profonde sur toutes les souris (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une prise de poids est attendue chez les souris suivant une alimentation riche en graisses et en sucres. Cette prise de poids pourra entraîner une diminution de la mobilité des animaux concernés. Un isolement court (30 min) sera nécessaire pour la récupération des fécès et pourra induire un léger stress aux animaux. La mise à jeun (12h ou 6h avant gavage d’huile ou sucre) peut également induire un stress chez les animaux. Lors des deux gavages, léger stress dû à la contention de l’animal et gêne/irritation potentielle de l’œsophage liée au passage de la sonde. Les prélèvements sanguins réalisés après les gavages pourront induire un stress chez les animaux. Pour la mesure de composition corporelle, les souris sont introduites dans un tube cylindrique (espace réduit) pendant moins de 2 minutes, ce qui peut induire un léger stress aux animaux. L’injection dans l’abdomen des anesthésiants (avant le prélèvement terminal) peut induire une douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les effets des lipides végétaux sur le métabolisme de différents organes et l’inter-communication entre tous ces organes. Il est à l’heure actuelle impossible de reproduire dans des modèles de culture cellulaire les mécanismes métaboliques et inflammatoires en lien avec la modification des bactéries intestinales, et l’implication de toutes les voies de régulation au centre de la communication entre les différents organes. Par conséquent, le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à notre question scientifique. De plus, une étude clinique chez l’Homme ne peut pas être envisagée directement à ce stade car les comités d’évaluation des études cliniques demandent des résultats préliminiares précliniques (à l’échelle d’un organisme entier) pour démarrer une étude chez l’Homme.

Réduction

A notre connaissance, aucune étude sur la souris n’a encore été réalisée pour évaluer les effets de lipides spécifiques des végétaux verts dans un contexte d’obésité induit par une alimentation riche en graisses et en sucres. Nous ne disposons donc pas de données de la littérature pour réaliser un calcul d’effectif. S’agissant d’une étude pilote et exploratoire, une dizaine de souris par groupe semble nécessaire et suffisante (8 souris pour le groupe contrôle et 12 souris pour chacun des groupes avec alimentation riche en graisses et en sucres). De plus, l’étude sera lancée tout d’abord sur des souris mâles, et si les résultats sont significatifs chez les mâles alors la même étude sera réalisée sur des souris femelles (n=44) pour extrapoler ou non les résultats aux deux sexes

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en place pour veiller au bien-être des animaux et réduire au minimum toutes les nuisances potentielles : 1/ Ajout des lipides végétaux à l’alimentation des animaux pour éviter manipulation et contention quotidiennes des souris (contrairement à une supplémentation par gavage quotidien). 2/ Avoir le même expérimentateur (maximum 2) tout au long de l’étude et habituer les animaux à sa/leur présence (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. 3/ Avoir du personnel expérimenté et formé aux gestes techniques des différentes procédures (tests métaboliques, mise à mort), et à l’observation de comportements « normaux » des animaux. 4/ Surveillance étroite des animaux 2 fois par semaine (apparence physique, comportement, poids, prise alimentaire), 5/concernant les gavages : - l’administration par voie orale est une méthode moins invasive que l’injection par voie intraveineuse ; - pour limiter la potentielle irritation de l’œsophage des animaux lors des gavages une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté - les volumes de gavage seront réduits au minimum pour éviter tout incomfort aux animaux. - une surveillance étroite du comportement des animaux sera réalisée suite aux gavages, - les gavages seront espacés d’une semaine afin de réduire le stress des animaux, 6/ Les contentions prévues lors des pesées, gavages ou lors de la mesure de la composition corporelle seront toujours effectuées de manière brève par un expérimentateur formé, 7/ En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour éviter toute douleur au moment du dernier prélèvement sanguin, 8/ Mise en place de points limites précoces permettant, si l’un est atteint, d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

En raison de la grande similitude de régulation du métabolisme entre la souris et l’Homme, la souris est un modèle de choix pour étudier et caractériser les effets santé des lipides végétaux en situation d’obésité. Les souris débuteront l'étude à 8 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Le passage à une alimentation riche en graisses et en sucres à cet âge est très bien toléré par les animaux, et les perturbations du métabolisme attendues les semaines suivantes sont bien décrites et maîtrisées.

52 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux à quatre interventions chirurgicales sous anesthésie, la dernière sans réveil, avec des effets attendus comme douleur, perte de poids et troubles neurologiques. L'objet est d'optimiser la greffe de cellules endocriniennes encapsulées pour le diabète de type 1 et l'hypoparathyroïdie. Le porteur présente le porc comme un modèle proche de l'homme, après des essais déjà menés sur des rongeurs.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples. De manière générale, il s’agit d’optimiser les techniques de transplantation de cellules endocriniennes, ici îlots de Langerhans pour le traitement du diabète de type 1, et cellules parathyroïdiennes pour le traitement de l’hypoparathyroïdie. Cette optimisation se fera en étudiant les performances apportées par l’encapsulation des cellules et par le choix de sites alternatifs. De manière plus précise : - Développement d’un dispositif d’encapsulation de cellules endocriniennes pour la greffe : choix du biomatériau selon sa biocompatibilité et choix de son meilleur site d’implantation - Evaluation de l’apport bénéfique apporté par l’encapsulation sur la greffe d’îlots de Langerhans et de cellules parathyroïdiennes, en matière de survie et de fonction du greffon, dans un cadre d’autogreffe. - Evaluation l’intérêt de site alternatifs accessibles par voie endoscopique mini-invasive tels que la sous-muqueuse gastrique et rectale (sans encapsulation au sein de dispositifs).

Bénéfices attendus

A court et moyen terme, ce projet donnera lieu à plusieurs publications scientifiques ainsi que des communications orales lors de congrès nationaux et internationaux. A long terme, les résultats de cette étude permettront : - de pouvoir transplanter des îlots de Langerhans chez des patients diabétiques au sein de sites alternatifs moins invasifs que celui actuel (intrahépatique via un accès par la veine porte, nécessitant une laparotomie) - de développer une thérapie innovante, efficace et durable de l'hypoparathyroïdie - de limiter la perte de fonction du greffon au cours du temps - de diminuer les traitements immunosuppresseurs, très contraignants et à haut risque d'effets secondaires chez les patients

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront répartis en 4 différents groupes. La nature et le nombre d’interventions auxquelles les animaux seront soumis dépendra des groupes formés. Les animaux du groupe 1 seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la deuxième sera sans réveil. Ces interventions dureront au maximum 2 heures. Les animaux du groupe 2 seront soumis à 3 interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Les animaux de la procédure 3 seront soumis à 4 interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Des prélèvements de sang seront également effectués sur ces animaux, de manière vigile, à plusieurs reprises (maximum 7 fois). Ces prélèvements se déroulement sans douleur, grâce à la pose d’un cathéter de longue tenue au tout début du protocole (lors du premier bloc opératoire). Enfin, les animaux de la procédure 4 seront soumis à 6 procédures chirurgicales effectuées sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Deux de ces interventions n’impliqueront pas d’incision chirurgicale. Des prélèvements de sang seront également effectués sur ces animaux, de manière vigile, à plusieurs reprises (maximum 7 fois). Ces prélèvements se déroulement sans douleur, grâce à la pose d’un cathéter de longue tenue au tout début du protocole (lors du premier bloc opératoire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids, diminution de l’appétit, mobilité réduite, confusion, troubles neurologiques et métaboliques, stéréotypies. Ces effets pourront survenir pendant toute la durée du protocole (jusqu'à 3 mois) mais sont particulièrement attendus en période post opératoire.

Devenir

Aucun animal n'est gardé en vie à l'issue de chaque procédure. En effet, la réalisation de biopsies terminales en fin de procédure, en particulier estomac et rectum, n'est pas compatible avec la survie de l'animale.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de développer de nouveaux dispositifs d'encapsulation améliorant la survie et la fonctionnalité d'îlots de Langerhans et de cellules parathyroïdiennes greffés au sein d'un organisme, dans une optique thérapeutique contre le diabète de type 1 et l'hypoparathyroïdie. Au sein de ce projet, nous souhaitons évaluer la tolérance de ces dispositifs par l'organisme, la survie des cellules greffées et leur fonctionnalité in vivo, ainsi que le potentiel intérêt de sites alternatifs pour la greffe tels que la sous-muqueuse gastrique et rectale. Il s'agit donc d'une approche d'ordre physiologique et intégrée à un organisme, d'où la nécessité d'utiliser des animaux pour ce projet. Nous ne pouvons donc pas remplacer l'utilisation d'animaux car nous souhaitons évaluer le comportement du greffon in vivo.

Réduction

Nous utiliserons un minimum d’animaux pour notre étude qui correspond à une étude préclinique en vue d’une étude clinique future. Il est à ce jour impossible de calculer le nombre nécessaire d’individu dans chaque groupe car nous ne pouvons pas encore quantifier l’effet attendu de chaque technique en cours d’évaluation sur le phénotype. Cependant, par rapport aux études antérieurement réalisées sur le miniporc dans notre laboratoire, un nombre minimal standardisé de miniporc nécessaire par groupe a été établi. Les estimations déclarées ici sont maximales et nous pourrons réduire le nombre d’animaux en cours de protocole si l’effet attendu a pu être constaté.

Raffinement

Les procédures de raffinement suivantes seront appliquées : -Condition standard d'hébergement conformément à la réglementation : hébergement individuel, 12 heures d'éclairage par jour, enrichissement du milieu : jouets. - Prélèvements et expérimentations menés dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d’hébergement. -Administration d’anesthésiques et d’analgésiques adaptés : anesthésie gazeuse et opioïdes et/ou anti-inflammatoires -Soins apportés au besoin après avis vétérinaire (infection cathéters, ...). -Les animaux présentant au moins un point limite sont retirés de l’étude et mis à mort (prostration, immobilité, appétence, perte de poids) si nécessaire. -Une période de 10 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal entrant.

Choix des espèces

Le modèle pré-clinique porcin est un modèle à haute valeur translationnelle : sa proximité avec l'Homme est très grande, d'un point de vue métabolique, physiologique, ou encore anatomique. Par ailleurs, il permet une bonne transposition des techniques chirurgicales et présente un métabolisme glucidique semblable. La tolérance du dispositif et son effet sur la survie et la fonctionnalité des cellules greffées ayant déjà été étudié sur modèle rongeur, l'objectif serait de reproduire ces études mais sur un modèle à plus grande valeur translationnelle, afin de pouvoir transposer cette innovation thérapeutique directement sur l'Homme. Des miniporcs seront alors utilisés : ils présentent une taille et un poids adulte raisonnables permettant une stabulation moins compliquée que des porcs charcutiers (300 kg à l'âge adulte), plus lourds chez lesquels il aurait fallu utiliser des individus juvéniles au métabolisme quelque peu différent des individus adultes. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (d'au moins 1 an). Leur taille et leur poids permettra de faciliter les techniques chirurgicales et les prélèvements sanguins. Par ailleurs, leur métabolisme glucidique sera d'autant plus proche des patients adultes, cible de cette innovation thérapeutique.

480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 384 d'entre elles étant ensuite replacées en élevage et les autres tuées. Elles subissent un jeûne pouvant durer 24 heures, un hébergement isolé lors des tests de comportement alimentaire et des prélèvements de sang à la queue et à la joue, pour étudier le rôle de l'hormone hépatique FGF21 dans l'appétence au sucre et à l'alcool. Le porteur indique que le jeûne peut abaisser la glycémie et la température corporelle et que l'isolement peut stresser les animaux. Il affirme que ces mécanismes, faisant intervenir plusieurs organes, ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives.

Objectifs

Le foie est un régulateur central du métabolisme et du dialogue avec les autres organes, notamment avec le cerveau pour assurer le contrôle de différents types de comportements alimentaires. Dans ce dialogue entre le foie et le cerveau, la protéine FGF21 (pour Fibroblast Growth Factor 21), une hormone produite de manière prédominante par le foie (hepatokine), exerce divers effets métaboliques parmi lesquels le contrôle de l’appétence pour le sucre et l’alcool. FGF21 est aussi une hormone dont l’expression est fortement induite lors du jeûne. La majorité des recherches sur cette hormone a été réalisée grâce à l’utilisation de souris déficientes pour FGF21 dans tout l’organisme et avec des souris transgéniques surexprimant FGF21. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’implication de FGF21 spécifiquement du foie lors du jeûne et dans le comportement alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de valider notre modèle de délétion spécifiquement hépatique de FGF21. De plus, ce projet permettra de démontrer ou réfuter que FGF21 d’origine hépatique contrôle la préférence au sucre et à l’alcool. En effet, les résultats décrits jusqu’alors dans la littérature ont été obtenus à partir de souris délétées pour FGF21 dans tout l’organisme ou surexprimant FGF21 dans tout l’organisme. Ces modèles sont peu physiologiques et ne permettent pas de définir l’origine tissulaire de FGF21 dans ces effets.

Procédures

Dans la procédure 1, les animaux seront mis à jeun pendant 24h maximum. Pour la mesure de la glycémie, un prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse du taux de glucose circulant et une baisse de la température corporelle. La consommation d’eau sucrée et d’alcool peut entraîner une augmentation de la glycémie. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des tests de comportement alimentaire et des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. La piqûre pour mesure la glycémie ainsi que le prélèvement de sang peuvent entraîner une douleur.

Devenir

A la fin de la procédure 1 de jeûne, les animaux seront euthanasiés. A la fin de la procédure 2, les animaux seront replacés en élevage après examination par la vétérinaire référente.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car les phénomènes biologiques étudiés (jeûne et comportement alimentaire) sont complexes et font intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.

Réduction

Le nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures du laboratoire. Ce nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire mais suffisant afin d’obtenir des résultats exploitables.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance (inactivité, somnolence, respiration lente, déshydratation) avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (hébergement collectif, régime standard et aucune procédure réalisée).

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement des organes métaboliques est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

5 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées, dans le second volet d'un projet mené sur deux établissements. Comme dans le premier, des lignées privées d'un gène mitochondrial développent une maladie cardiaque grave ou des crises d'épilepsie mortelles, avant une thérapie génique par injections pratiquées jusque sur des nouveau-nés anesthésiés par hypothermie. Chaque animal subit échocardiographies, prélèvements sanguins hebdomadaires et injections intrathécales, les tests comportementaux restant non précisés. Le porteur affirme ne pas pouvoir prédire sur cellules la production de protéine dans un organisme vivant et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Les mutations du gène d'intérêt sont responsables de maladies rares qui peuvent être graves. Ces maladies se manifestent souvent dès l'enfance et peuvent affecter plusieurs parties du corps, comme le cerveau, le cœur et le foie. Malheureusement, il n'y a actuellement aucun traitement pour ces maladies, et les traitements existants visent uniquement à soulager les symptômes sans arrêter la progression de la maladie. Ce gène d'intérêt est responsable de la production d'une protéine essentielle pour notre corps, en particulier pour produire de l'énergie dans nos cellules. Cependant, lorsque ce gène est altéré par des mutations, il provoque des problèmes dans la production d'énergie, ce qui peut être très dommageable. Notre projet vise à atteindre trois objectifs principaux : 1. Nous allons créer deux modèles de souris malades en les privant du fonctionnement du gène d'intérêt, soit dans le cœur et les muscles, soit dans les neurones. Nous pensons que ces souris développeront des problèmes similaires à ceux que l'on observe chez les humains. 2. Nous allons développer des virus spéciaux pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. Ces virus agissent comme des petits véhicules pour réparer le gène défectueux. 3. En utilisant ces modèles de souris, nous espérons développer un traitement pour les maladies liées aux mutations du gène d'intérêt en utilisant la thérapie génique. En injectant ces virus dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Parce que c'est difficile de faire en sorte que ces virus atteignent le cerveau, nous allons d'abord utiliser des souris où le gène d'intérêt est éteint dans le cœur et les muscles, comme modèle alternatif pour développer notre approche thérapeutique. Avant de tester ces virus sur des souris malades, nous allons d'abord effectuer des tests sur des souris en bonne santé pour comprendre comment le gène étranger fonctionne dans les organes affectés. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, il n'existe aucun traitement pour guérir ou contrôler l'évolution des maladies causées par les mutations du gène d'intérêt. Pour remédier à cette situation, nous travaillons sur la création de modèles de souris qui reproduisent ces maladies. Ces souris nous permettront d'évaluer en toute sécurité et sur le long terme l'efficacité des virus spéciaux conçus pour réparer le gène d'intérêt défectueux. Si ces tests sur les souris réussissent, cela signifie que nous pourrions éviter d'entreprendre des essais inutiles sur des humains, réduisant ainsi leurs souffrances. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques. Notre objectif principal est de développer des traitements pour les personnes atteintes de ces maladies en utilisant des virus adaptés à l'injection chez les humains. Cela pourrait apporter un grand espoir à ceux qui sont touchés par ces maladies.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les souris subiront les gestes suivants: 1. Échocardiographie : Un examen échographique du cœur qui dure 20 minutes par souris. Il sera effectué une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines lors de la création, et l'étude des souris malades ou une semaine avant l'injection lors de la sélection, de l'optimisation et du développement du traitement. La durée sera jusqu'au point limite adapté pour les souris contrôles malades, ou 12 semaines après ce point pour celles qui ont reçu des injections et présentent une amélioration de leur état de santé lors du développement et de l'optimisation du traitement. 2. Tests comportementaux durent de 5 à 30 minutes par souris. Ils seront réalisés une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines ou une semaine avant l'apparition de problèmes comportementaux, et se poursuivront jusqu'au point limite prédéterminé. 3. Injections : a) Injections dans la veine temporale dureront environ 5 minutes par souriceau et seront effectuées une fois, sous anesthésie par hypothermie. b) Les injections intrathécales, sous anesthésie générale (environ 40 min par souris), et dans la veine caudale (5 min par souris) seront réalisées une fois. 4. Le prélèvement de sang au niveau de la veine maxillaire, dure ~1 min par souris et sera effectué une fois par semaine. a) Pour les souris injectées par voie intrathécale et dans la veine caudale, les prélèvements de sang commenceront une semaine avant l'injection, puis 72 heures après l'injection, et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. b) Pour les nouveau-nés, les prélèvements commenceront à l'âge de trois semaines et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. Tout le projet se déroulera dans dans l'établissement 1, à l'exception des échographies qui auront lieu dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Les souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans les neurones naîtront sans signe de problème, mais elles développeront progressivement des difficultés de marche et de coordination. En fin de vie, ces souris connaîtront des crises d'épilepsie mortelles. Pour les souris où l'expression du gène d'intérêt est abolie dans le cœur et les muscles squelettiques, elles naîtront sans problème apparent, mais avec le temps, elles développeront une maladie du cœur grave, comme cela a été observé dans d'autres modèles de souris similaires. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les souris seront soumises à des situations stressantes liées à l'injection, aux tests comportementaux, au transport depuis l’institut jusqu'au centre spécialisé en échocardiographie, ainsi qu'à l'anesthésie pour les échocardiographies. Les injections intrathécales peuvent causer une certaine douleur après l'injection, mais des mesures seront prises pour minimiser leur inconfort.

Devenir

Mise à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

Nous effectuerons des tests sur des cellules pour identifier les morceaux génétiques qui n'expriment pas du tout ou très faiblement le matériel génétique prévu. Cependant, il est important de noter que, même si nous pouvons déterminer ces caractéristiques sur cellules, nous devons encore utiliser des modèles animaux pour nos recherches. C'est parce que nous ne pouvons pas prédire avec certitude combien de la protéine souhaitée sera produite à l'intérieur d'un organisme vivant, et si la quantité générée sera suffisante pour traiter la maladie.

Réduction

Nous avons utilisé des méthodes et des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour évaluer l'efficacité du traitement de manière fiable et statistiquement significative. Pour la création et l'étude des modèles de souris malades, nous réduirons le nombre d'animaux en effectuant plusieurs types d'analyses, lorsque cela est possible. Par exemple, la détermination du début et de la progression du phénotype sera effectuée en parallèle avec des tests comportementaux et les tissus extraits des souris à un stade avancé seront utilisés pour des expérimentations de biologie moléculaire. L'échographie est une autre méthode qui nous permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires, car elle permet de suivre l'évolution des souris au fil du temps, évitant ainsi une mise à mort répétée. Une approche similaire peut être appliquée à la sélection des vecteurs, l’optimisation et le développement du traitement.

Raffinement

Nous mettons en place des pratiques visant à réduire la souffrance des souris tout au long de notre recherche. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Les souris seront surveillées au moins deux fois par semaine pour détecter tout signe de souffrance ou d'anxiété. Lors des injections effectuées sur les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress. Cela inclut l'éloignement temporaire de la mère, la préservation de la litière de la cage maternelle, et un prélèvement de sang minime, effectué par un personnel expérimenté de la veine sous-maxillaire considérée comme étant une des zones les moins sensibles. Pour les injections intrathécales, une anesthésie générale sera administrée, et des analgésiques seront utilisés avant et après l'injection pour éviter toute douleur. Nous mettrons en place un suivi régulier des souris. Les cages seront aménagées avec des éléments pour leur bien-être, tels que des boules de coton, des maisons pour se cacher, et des objets à ronger. L'isolement prolongé sera évité autant que possible pour assurer une stimulation sociale. Le transport des souris entre l’institut et le centre expert en échocardiographie se fera dans des cages de transport spécialement conçues, dans des véhicules adaptés pour réduire les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

L'utilisation de mammifères est essentielle pour évaluer l'efficacité des virus dans le développement de la thérapie génique. Les souris sont couramment choisies pour les essais de phase I/II en raison de leur similitude physiologique avec les humains et de leur facilité d'élevage et de soins. De plus, les modèles de souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans le cœur et le cerveau peuvent développer une pathologie qui ressemble aux symptômes de la maladie gène d'intérêt chez l'homme. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines et plus. Nous commencerons par des nouveau-nés, car à cet âge, le virus peut atteindre le cerveau. Cependant, étant donné que l'expression du virus peut diminuer pendant la croissance rapide des nouveau-nés, nous utiliserons également des souris jeunes adultes (3 à 6 mois) pour certaines parties de nos expériences.