Troubles endocriniens

390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une microchirurgie de 45 minutes, avec ablation d'un rein puis clampage de l'artère et de la veine du rein restant pendant 30 minutes pour provoquer une ischémie, suivie de prélèvements sanguins et de traitements quotidiens pendant sept jours. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner des douleurs, une perte de poids et la mort sous anesthésie chez les animaux âgés, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que la complexité physiologique ne peut être reproduite in vitro et présente ce modèle comme un moyen de réduire l'échec des candidats médicaments en clinique.

Objectifs

10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale conduisent à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant les lésions rénales aïgues. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.

Procédures

Chaque animal subira : - 1 seule procédure de microchirurgie d'une durée totale d'environ 45 min: Laparotomie, ablation du rein droit, puis clampage de l'artère et de la veine rénale du rein gauche pendant 30 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - prélèvements sanguin quotidien (sur 7 jours) de 20 à 100 ul de sang par légère incision au niveau de la queue ou via une ponction de la veine faciale (durèe environ 1 min par animal). - traitements quotidien par les candidats médicaments pendant 7 jours consécutifs (durèe inférieure à 1 min par animal).

Impact sur les animaux

Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons au développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés : - Pour des données uniques en fin d'expérimentation, il seront analysés par ANOVA 1-way ou par le test de Kruskal-Wallis (en fonction de l'analyse des variances). - Pour des données enregistrées en longitudinales, celles-ci seront analysées par ANOVA 2-way + Bonferonni’s post-test.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (1mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture ainsi qu'un enrichissement adéquat dans les cages d'hébergement (igloo polycarbonates autoclavables et réutilisables + carton) . Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime. De plus, l'étude sera conduite par des personnels qualifiés et formés au respect des conditions du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’uninephrectomie + ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. La procédure sera réalisée sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées (Charles River). Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes puis des jeunes reçoivent par voie orale des composants du cannabis pendant dix à trente-cinq jours, pour tester l'hypothèse d'un lien entre cette exposition et le cancer du testicule. Le porteur signale le stress de l'administration orale et un risque de fausse route pouvant conduire à euthanasier l'animal, et met à mort les souris pour prélever le sang et les testicules. Il indique disposer de lignées cellulaires et de cultures d'organes humains mais affirme qu'elles ne remplacent pas l'animal.

Objectifs

Le cancer du testicule constitue le cancer le plus fréquent chez l’homme entre 15 et 40 ans. L’étiologie de ce cancer est encore mal comprise. Les données épidémiologiques convergent pour indiquer que l’exposition à des facteurs environnementaux pendant certaines fenêtres de vulnérabilité, telles que le développement et la puberté, est impliquée dans la tumorisation des cellules germinales testiculaires. Récemment, la consommation de cannabis, substance illicite la plus consommée par les adolescents et les femmes en âge de procréer, a été corrélée au développement de tumeurs du testicule chez de jeunes consommateurs. Il a été établi que le développement de ce type de cancer affecte la fertilité. Dans ce contexte et sur la base de nos résultats préliminaires, nous postulons que les cannabinoïdes (CA), molécules contenues dans le cannabis, favorisent l'apparition du cancer du testicule en perturbant la maturation des cellules souches germinales. Le but de ce projet est donc d’évaluer si une exposition aux principes actifs du cannabis pendant la vie fœtale et/ou la puberté affecte la différenciation et la fonction testiculaire et pourrait ainsi favoriser le développement de tumeurs germinales.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettrait de mettre en exergue les conséquences d'un cumul d'exposition auxquelles les populations les plus vulnérables sont soumises, et ce en comparaisons avec une exposition uniquement gestationnelle ou uniquement pubertaire.

Procédures

Traitement par administration orale repetée (pendant 10 jours ou pendant 35 jours). Ce geste est rapide (10 à 20 secondes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le stress induit par l'administration orale des souris gestantes pendant 10 jours ainsi que des souris prépubères pendant 35 jours. La possibilité de fausse route est également un risque induit par ce traitement. Bien que les doses utilisées ici sont des doses utilisées en thérapie humaine, nous ne pouvons exclure un effet néfaste des cannabinoïdes utilisés sur le développement pré- ou postnatale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les organes ainsi que les matrices biologiques à investiguer dans le cadre de notre étude. Il s'agit du sang, des testicules, de l'épidyme et du foie.

Remplacement

Alternativement aux modèles animaux, il existe des lignées de cellules cancéreuses testiculaires humaines. Nous utiliserons ces dernières afin de travailler sur les voies de signalisation spécificiques modulées en présence de CBD et/ou THC. Nous utilisons également des modèles de cultures organotypqiques de testicules adultes et foetaux humain pour investiguer la réponse de l'organe aux traitements. Ces modèles ne permettent pas d'obtenir la réponse de l'organisme, contrairement aux modèles animaux, et notamment de prendre en considération les interactions mère-foetus tout comme l'effet des traitements sur l'axe hypothalamo-hypophysaire, axe régulant la fonction reproductive. Ils restent complémentaires mais ne peuvent se substituer à l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental sera de 6 pour nous permettre de mener à bien des études statistiques et de prendre en compte la "réduction" de la règle des 3R.

Raffinement

Pour réduire au maximum le stress des animaux, les traitements seront administrés par voie orale par des personnes expérimentées en présence de musique qui, nous l'avons constaté, a pour effet de relaxer les animaux comme l'expérimentateur. Les animaux seront observé quelques minutes après le traitement pour vérifier l'absence de fausse-route. Si une fausse-route s'avérait constaté, l'animal serait euthanasié. Plusieurs paramètres du bien-être des animaux (mobilité, poids,activité de toilettage) sont particulièrement surveillés pendant la procédure et des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

Nous avons choisis la souris Swiss ici pour sa fertilité élevée et sa facilité d'élevage et de traitement. Les animaux seront utilisés du stade embyonnaire jusqu'à 8 mois.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules, elles subissent des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces, et un tiers reçoit dans l'eau un produit qui enflamme l'intestin pendant sept jours, provoquant selon le porteur une douleur intestinale croissante et des diarrhées avant la mise à mort. Le projet étudie la rupture de l'équilibre entre l'hôte et son microbiote induite par un régime pauvre en fibres. Le porteur affirme l'impossibilité de modéliser cette dynamique in vitro ou in silico.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies non transmissibles (maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. Ces maladies sont associées à des signaux déclencheurs provenant de notre environnement (microorganismes de l’intestin, alimentation) et se caractérisent par une inflammation locale de l’intestin. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Ces maladies de longue durée résultent de l’association combinée de plusieurs facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux dont la nutrition et l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein de cet organe. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des altérations de la composition du microbiote intestinal chez des patients atteints de maladies non transmissibles. Cette altération de la symbiose hôte-microbiote est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du système immunitaire de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies non transmissibles, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par la diminution du potentiel fonctionnel du microbiote intestinal et de son hôte. Notre projet consiste à évaluer la mise en place et le maintien à long terme d’une rupture de symbiose hôte-microbiote induite par un régime pauvre en fibres et à déterminer les conséquences de ce changement de régime alimentaire sur la symbiose lors d’un stress inflammatoire aigu. L’objectif final de nos travaux est de caractériser la rupture de symbiose et d’en évaluer les conséquences sur la santé dans un modèle animal afin d’identifier des leviers, à la fois côté hôte et côté microbiote, qui permettraient de retarder, prévenir et/ou traiter sa survenue, son installation et sa persistance chez l’individu.

Bénéfices attendus

Les maladies non-transmissibles, qui sont en constante augmentation, sont une préoccupation majeure de santé publique. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. De nombreux travaux témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal due à un régime alimentaire appauvri en fibres. Notre projet amènera à une meilleure compréhension des mécanismes de la rupture de la symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire appauvri en fibre s ; compréhension qui permettra d’identifier de nouvelles solutions de dépistage et de traitement.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en cage indivuduelle tout au long de l'expérimentation. Les deux tiers des animaux recevront un régime appauvri en fibres pendant une durée de 4 semaines. Tous les animaux recevront une solution par gavage au minimum 2 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de contention sera de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux auront au minimum 1 et au maximum 3 prises de sang. Le temps de collecte, contention comprise, sera de 30 secondes à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans la procédure. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. Un tiers des animaux recevra dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin pendant sept jours consécutifs en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime inflammatoire, ce qui pourra entrainer une perte de poids. Les prises de sang engendrent une douleur modérée de courte durée et un stress léger dû à la contention. De même, les gavages seront réalisés par un expérimentateur confirmé à l’aide d’une sonde gastrique et engendreront un stress léger dû à la contention de quelques minutes mais ne causeront pas de douleur. L’absorption du produit inflammatoire entraine une douleur intestinale croissante pendant les 7 jours de traitement occasionnant des diarrhées avant la mise à mort des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire/modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 120 animaux pour le groupe contrôle et 240 animaux pour les groupes expérimentaux sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement composé d'un abri en propylène rouge et d’un Mouse Swing et d'un abri en propylène rouge afin de répondre au mieux à leurs besoins comportementaux naturels et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les cages seront transparentes afin que les animaux gardent un contact visuel avec leurs congénères et n’auront pas de couvercles filtrants afin de maintenir le contact sonore et olfactif. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur le poids, l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris qui sont largement utilisées pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes pauvres en fibres en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc une référence pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

200 chiens, cochons et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins et des chirurgies d'implantation de dispositifs urologiques pouvant durer plusieurs heures sous anesthésie, avant une mise à mort suivie de nécropsie et d'examen des tissus. Le porteur décrit des suites post-opératoires douloureuses pouvant durer plusieurs jours selon l'invasivité. Il affirme que l'expérimentation sur "organisme entier" est "incontournable" et relève d'une "obligation règlementaire" pour valider ces dispositifs implantables.

Objectifs

La chirurgie uro-néphrologique s’est développée rapidement dans la deuxième moitié du XXème siècle avec par exemple l’avènement de la transplantation rénale (années 60-70), ou encore de l’hémodialyse (années 50-60) permettant de sauver des millions de personnes par an, le développement de nouvelles technologies comme les circuits extracorporels avec filtre de dialyse permettant la déviation du sang vers un filtre externe et ainsi sa purification artificielle. Il est possible dès lors de pallier des dysfonctions importantes du rein par exemple. De même, le traitement des affections prostatiques, tumorales par exemple a fait des progrès immense grâce par exemple à l’avènement de techniques chirurgicales peu invasives. Les progrès diagnostiques et thérapeutiques se développent rapidement pour l’ensemble des organes de l’appareil urinaire et ses annexes. L’évaluation et le développement de nouvelles méthodes, molécules, dispositifs et techniques pour les affections de l’appareil urinaire et ses annexes par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessitent une phase de recherche pré-clinique et développement qui permet de mettre au point ces méthodes et d’en vérifier leur sécurité. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. Les différentes versions de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites postopératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients humains représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être de tous les stades de développement : juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart, 180 sur 196, sont soumises à un régime gras induisant une obésité, puis reçoivent des administrations orales quotidiennes pendant vingt-huit à quatre-vingt-dix-huit jours et des prélèvements sanguins, pour tester un composé contre la stéatose hépatique au bénéfice d'un client pharmaceutique. Le porteur euthanasie tous les animaux pour prélever leur foie et affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur les troubles métaboliques. Les retombées annoncées, une première molécule autorisée contre cette maladie, sont renvoyées à l'issue favorable du développement.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment la stéatose hépatique non alcoolique. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a permis d'identifier ces candidats-médicaments. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris atteintes de stéatose hépatique non alcoolique (NASH). Deux modalités seront abordées: - l'effet préventif du traitement sur le développement de la stéatose hépatique - l'effet curatif du traitement sur le développement de la stéatose hépatique.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de première étude chez l'humain pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre la stéatose hépatique non alcoolique, une pathologie pour laquelle il n'existe aucun médicament sur le marché à l'heure actuelle. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché de la première molécule autorisée pour le traitement de la stéatose hépatique.

Procédures

Les animaux seront pesés régulièrement et leur prise alimentaire mesurée une à deux fois par semaine. Ces mesures durent environ 2-3 minutes. Des prélèvements sanguins sont prévus après 4 heures de mise à jeun. Les prélèvements en eux même durent environ 3 minutes. Des mesures de composition corporelle non-invasives seront réalisées. Ces mesures sont rapides (

Impact sur les animaux

La majorité des animaux (180 sur 196) seront soumis à un régime stéatogénique pendant l'intégralité de l'étude. Ce régime induit une obésité qui peut être source d'inconfort pour les animaux. Tous les animaux seront soumis à des administrations quotidiennes du composé test, du composé de référence ou de véhicule par voie orale pendant 28 jours (Groupes de la modalité CURATIF) à 98 jours (Groupes de la modalité PREVENTIF) ce qui est une source de stress. Les animaux seront également manipulés fréquemment pour les mesures de poids corporel et de prise alimentaire e qui pourrait être source de stress. Trois mesures de composition corporelle seront pratiquées, pouvant induire du stress chez les animaux malgré la nature non-invasive et la courte durée (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de l'étude afin de collecter les foies. Des analyses histologiques et biochimiques seront réalisées a posteriori sur ces derniers.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques comme la stéatose hépatique non alcoolique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, poids corporel cumulé, prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, histologie du foie, dosages sanguins, dosages tissulaires sur le foie (triglycérides, acides gras libres, cholestérol total).

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Afin de respecter le caractère social de l'espèce, les animaux seront hébergés par 2 ou 3 en cage individuellement ventilée. Les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères des autres cages et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique et des canules souples à usage unique et pourvues d'embout de silicone seront employés afin de s'affranchir de toute lésion du carrefour aéro-digestif. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs (100μL de sang par prélèvement). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques (Buprénorphine).

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6NTac est un modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. Il est très classiquement employés dans le cadre des études précliniques dans le domaine de la stéatose. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de 19 semaines au début des traitements. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et par le fait qu'un pré-conditionnement de 13 semaines avec une nourriture stéatogénique est nécessaire pour induire la stéatose (8 semaines de pré-conditionnement à la nourriture stéatogénique chez notre fournisseur chez des souris âgées de 6 semaines + 5 semaines de conditionnement dans notre animalerie après réception).

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras fournissant 60 % de l'énergie sous forme de graisses, elles reçoivent des administrations orales quotidiennes pendant huit à vingt-neuf jours et des prélèvements sanguins répétés, pour tester un composé anti-obésité destiné à un client pharmaceutique. Le porteur reconnaît que le régime gras "constitue une nuisance" et euthanasie tous les animaux pour prélever tissu adipeux, foie et muscle. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids corporel et que l'étude pharmacocinétique exige un "organisme entier".

Objectifs

Le présent projet vise au développement d'un composé d'intérêt thérapeutique en développement dans le domaine de l'obésité. Ce composé a fait l'objet d'études in vitro préalables ayant donné des résultats prometteurs. Ces données semblent indiquer que le composé serait capable de réduire le poids corporel chez le sujet obèse par une action augmentation des dépenses énergétiques. Le présent projet vise à vérifier cette hypothèse dans un contexte in vivo. Le projet est scindé en trois étapes indépendantes qui seront menées successivement, le succès de chacune de ces étapes conditionnant la réalisation de la suivante : - Etape 1 : étude des propriétés pharmacocinétiques du composé en conditions de traitement aigu ou chronique (7 jours) chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse (60% de l'énergie fournie par les graisses). - Etape 2 : étude court terme de l'effet du composé sur les dépenses énergétiques en condition de thermoneutralité chez la souris obèse rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse (60% de l'énergie fournie par les graisses). - Etape 3 : étude long terme de l'effet du composé sur le poids corporel chez la souris obèse rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse (60% de l'énergie fournie par les graisses). L'objectif final est ainsi de vérifier l'efficacité du composé testé sur l'obésité avant de pousser son développement sur les étapes préclinique et clinique règlementaires nécessaires à sa mise sur le marché.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composés anti-obésité visant l'humain. Alors que de nombreuses molécules anti-obésité ont été commercialisées puis retirées du marché en raison d’effets secondaires graves, seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l’obésité. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Procédure 1 : Les souris recevront des traitements quotidiens par voie orale pendant 8 jours. Les souris seront soumises à deux séries de 5 prélèvements sanguins. Procédure 2 : Les souris recevront des traitements quotidiens par voie orale pendant 3 jours. Les souris seront soumises à trois jours de mesures des échanges respiratoires. Procédure 3 : Les souris recevront des traitements quotidiens par voie orale pendant 29 jours.

Impact sur les animaux

Procédure 1 : Les animaux seront soumis à des administrations quotidiennes du composé test, du composé de référence ou de véhicule par voie orale pendant 8 jours. Par ailleurs des prélèvements sanguins réalisés à la pointe de la queue seront pratiqués. Les animaux seront également manipulés quotidiennement pour les mesures de poids corporel. Procédure 2 : Les animaux seront soumis à des administrations quotidiennes du composé test, du composé de référence ou de véhicule par voie orale pendant 2 jours. Par ailleurs, les animaux seront placés dans des cages couplées à de la calorimétrie indirecte. Les animaux seront également manipulés quotidiennement pour les mesures de poids corporel. Procédure 3 : Les animaux seront soumis à des administrations quotidiennes du composé test, du composé de référence ou de véhicule par voie orale pendant 29 jours. Les animaux seront également manipulés quotidiennement pour les mesures de poids corporel. Il est à noté que, pour les trois procédures, les animaux seront hébergés en conditionde thermoneutralité. Enfin, les animaux seront rendus obèse par une alimentation enrichi en graisse ce qui constitue une nuisance aux animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes (tissu adipeux, foie, muscle gastrocnémien) sont prévus après euthanasie pour mesures biochimiques ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques. Par ailleurs, dans le cadre de l'étude des paramètres pharmacocinétiques du composé développé, ce type de protocole ne peut être réalisés que sur organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisses. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. L'animal obèse est également employé dans la procédure 1 (étude pharmacocinétique) car il est déjà connu que le composé test est capable de se complexer avec les lipides circulants; les dyslipidémie observées chez la souris obèse seraient ainsi fortement susceptible d'induire une modification des paramètres pharmacocinétique comparatvement à l'animal sain. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique et des canules souples à usage unique et pourvues d'embout de silicone seront employés. Les animaux seront hébergés en cages collectives pour la procédure 1 (éude pharmacocinétique) mais en cages individuelles pour les procédure 2 et 3 du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus dans la procédure 1 seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultèrieurs (30µL de sang par prélèvement) et seront réalisés en bout de queue pour minimiser l'inconfort des animaux. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6 nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet.

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène pour inactiver un gène, puis des prélèvements réguliers de touffes de poils et de fèces pendant six mois, pour étudier le rôle des hormones somatotropes dans le maintien des tissus au cours du vieillissement. Le porteur qualifie ces gestes de peu invasifs et compare la douleur du prélèvement de poils à celle d'interactions entre souris. Il affirme que la souris est la seule espèce vertébrée permettant cette approche transgénique et qu'un "organisme entier" est "indispensable".

Objectifs

Vieillir en bonne santé est un objectif majeur de notre société. La découverte de traitements anti-âge efficaces ou de comportements nutritionnels mieux adaptés pourrait avoir un impact spectaculaire sur la santé publique, en réduisant les problèmes de santé liés à l'âge tels que la démence, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies cardiaques. Cette découverte devrait permettre de maintenir une qualité de vie acceptable au sein d’une population de plus en plus vieillissante. Plusieurs caractéristiques d’un vieillissement en bonne santé ont été identifiées à ce jour. Notamment, au cours du temps, il est connu que les tissus constituant les organes s’altèrent et ont donc besoin d’être renouvelés voire remplacés. Ce maintien tissulaire dépend fortement de l’alimentation, qui peut être considérée comme le premier stress environnemental d’un organisme à travers l’action des nutriments sur les tissus. D’ailleurs, une restriction calorique montre en effet une meilleure longévité dans des modèles animaux. L’expression des hormones somatotropes qui participent à la détection des nutriments est diminuée lors de cette restriction alimentaire. Ces hormones somatotropes et leurs récepteurs cellulaires ont été clairement identifiées comme étant des facteurs qui influencent la durée de vie des mammifères. Elles ont de plus des rôles critiques dans le développement, la croissance et le métabolisme des organismes. Le blocage de cette régulation hormonale somatotrope conduit à une augmentation de longévité. Selon notre hypothèse, cet accroissement de longévité devrait s’appuyer sur un meilleur maintien des tissus au cours du vieillissement. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces hormones somatotropes dans le maintien et le renouvellement tissulaire au niveau de différents organes. Le rôle de ces récepteurs hormonaux dans le maintien tissulaire sera exploré dans des modèles où cette signalisation somatotrope est altérée. Notamment, nous ferons varier les taux de blocage du récepteur impliqué et nous suivrons le devenir des cellules inactivées au sein des tissus au cours du vieillissement par des mesures longitudinales des taux d’inactivation sur des souris transgéniques mutantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment l’axe somatotrope influence le devenir des cellules souches responsables du bon maintien des tissus au cours du vieillissement. Cette étude ne peut être effectuée qu’in vivo sur des modèles animaux de mammifères proches de l’homme où les tissus/organes sont dans un contexte permettant à différents types de cellules d’interagir entre eux au cours du temps. L’aspect intégré du modèle est essentiel pour comprendre dans son ensemble les mécanismes gérant l’activité des cellules souches dans les processus de régénération et de maintien à l’équilibre des tissus constitutifs d’organes. L’évaluation du rôle du récepteur hormonal dans l’homéostasie tissulaire proposée ici sera bénéfique en santé humaine, car elle permettra de proposer des pistes dans la prévention d’une meilleure santé humaine dans notre population vieillissante.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les souris seront injectées en intrapéritonéale avec contention sur animal vigile par trois doses différentes de tamoxifène afin d’induire l’inactivation du gène cible (environ 30 secondes par animal). Les poils et les fèces seront prélevés sur l’ensemble des animaux vigiles sur une période de 6 mois à raison d’un prélèvement par quinzaine, soit au total 14 prélèvements de touffes de poils et de crottes par souris (nombre maximum). Ces prélèvements ne durent pas plus de quelques minutes par animal (environ 2 minutes). A la fin de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales de tamoxifène nécessaire pour induire le modèle implique une contention qui entraine un léger stress et une douleur de courte durée liée à l’injection. La récolte de fèces nécessite un isolement de quelques minutes qui peut également être source d'un léger stress mais n’a aucun impact sur le comportement global de l’animal. Le prélèvement de poils sera effectué par prise de petites touffes avec une pince plate et sera espacé d’au moins deux semaines. Ce type de prélèvement induit une légère douleur similaire à celle des interactions sociales entre deux souris.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus. La récupération des tissus post-mortem permettra une analyse des taux d’inactivation du gène cible par amplification quantitative de l’ADN.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, utiliser l’animal vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le maintien des tissus d’un organisme au cours du vieillissement. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu, notamment pour caractériser les compétitions/interactions existant entre des cellules inactivées pour le récepteur hormonal au sein des tissus d’un organisme multicellulaire. De plus la stimulation de croissance suite à l’inhibition de la voie de signalisation ne peut être obtenue que dans des modèles in vivo où les régulations hormonales peuvent se mettre en place. Notre objectif étant d’évaluer la possibilité de remplacement cellulaire au sein d’un tissu complexe, il ne peut être atteint que dans notre modèle de souris transgénique.

Réduction

Le projet impliquera un total de 130 animaux. Nous limitons systématiquement le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque souris est utilisée pour un maximum de protocoles expérimentaux, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. La procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris comme un ajustement des doses de tamoxifène à injecter. Le suivi longitudinal du taux d’inactivation du récepteur qui sera effectué par prélèvement de petites touffes de poils et de fèces au cours de la vie de la souris, permet de réduire substantiellement le nombre de souris nécessaire pour l’étude proposée. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée tout en tenant compte des impératifs de réduction. Les taux d’inactivation seront comparés au sein de chaque groupe par un test statistique adapté.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi en continu à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés quand cela est possible/nécessaire. Les prises de touffes de poils prélevés seront réduites au minimum nécessaire pour les analyses par amplification quantitative de l’ADN et les volumes injectés de tamoxifène seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce vertébrée qui permet une approche par transgénèse avec élaboration de modèles génétiques complexes. Dans le cadre d’une étude intégrée au sein d’un organisme du devenir du maintien des tissus, elle représente un modèle de choix. De plus, l’utilisation de souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles les gènes de l’axe somatotrope peuvent être invalidés. La souris représente un modèle de choix pour l’analyse exploratoire de ces gènes impliqués dans l’homéostasie tissulaire au cours du vieillissement. Les premières études menées sur ces modèles transgéniques ont permis d’aborder des questions fondamentales au niveau du maintien de la fonctionnalité des organes qui n’auraient pas pu être obtenues à partir de lignées cellulaires. Les expériences seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 3 mois ou d’un an, et seront suivies pendant six mois. Les deux âges choisis sont les plus adaptés à l’étude du maintien tissulaire au cours du vieillissement et sont assez éloignés des stades du développement où la croissance de l’animal peut perturber le remplacement tissulaire.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par une alimentation à 60 % de lipides, elles reçoivent chaque jour pendant douze semaines un composé par voie orale, avec prélèvements sanguins après jeûne et hébergement individuel, pour le compte d'un laboratoire client préparant un médicament contre l'obésité. Le porteur indique que la perte de poids peut devenir une nuisance si elle est trop rapide, et prévoit une mise à mort pour prélever les organes. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier ces régulations métaboliques.

Objectifs

L'obésité dans le monde a plus que triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 1 milliard de personnes obèses aujourd'hui, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Dans ce contexte, notre client souhaite évaluer l'effet des nouveaux composés sur les symptômes liés à l'obésité chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). Notre entreprise mènera, pour le compte de notre client, une étude in vivo visant à évaluer les effets des composés clients sur la prise alimentaire, le poids corporel et le métabolisme du glucose chez la souris obèse. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ces composés induisent une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ces composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris soumises à une alimentation enrichie en graisses (HFD; 60% de l'énergie fournie par les lipides). A termes, ces données seront incluses dans un dossier de demande d'autorisation d'essais cliniques dans le but d'obtenir une autorisation sur le marché d'une nouvelle classe de médicaments visant à traiter les troubles métaboliques.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier de demande de premier essais cliniques chez l'humain dans le but d'obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un composé thérapeutique luttant contre l'obésité et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Les animaux seront pesés régulièrement et leur prise alimentaire mesurée. Ces mesures durent environ 2-3 minutes. Des prélèvements sanguins sont prévus après 4 heures de mise à jeun. Les prélèvements en eux même durent environ 3 minutes. Des mesures de composition corporelle non-invasives seront réalisées. Ces mesures sont rapides (

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance si celle-ci s'avère trop rapide. D'autre part, des prélèvements sanguins avec mise à jeun préalable de 4h, les administrations quotidiennes per os pendant 12 semaines, les mesures de composition corporelles et le test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h préalable) peuvent être source de nuisance pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu de l'étude afin de collecter des organes d'intérêt. Des analyses biochimiques seront réalisées a posteriori sur ces derniers.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la régulation glycémique dans les cas de troubles métaboliques. En effet, les paramètres physiologiques impactés impliquent une communication hormonale et nerveuse entre différents organes qui produit des effets au niveau de l'ensemble des cellules de l'organisme et il n'existe pas à l'heure actuelle de modèle non animal capable de reproduire ou de prédire l'impact d'un composé sur ces phénomènes de régulation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), composition corporelle (mesures de la masse de tissu gras, de la masse de tissu maigre et de la masse de fuides non liés), test de tolérance au glucose (glycémie, insulinémie et aires sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes. Dans le cadre des groupes expérimentaux obèses, le nombre d'animaux a été fixé à 12/groupe en prenan également en compte l'hétérogénéité du modèle, certains animaux présentant naturellement une résistance à l'induction de l'obésité. Concernant le groupe témoin du modèle d'obésité (Groupe 1, nourri avec la nourriture sandard et traité au véhicule), nous avons réduit le nombre à 10 animaux.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles mais conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Concernant les prélèvements sanguins, un anesthésique local sera appliquée sur la queue des souris 30 minutes avant. Avant les mesures de composition corporelle, les animaux seront préalablement habitués au système. Pour les mesures de glycémie, la mise à jeun préalable sera limitée à 4h afin de limiter l'inconfort. Concernant les traitements, ceux ci seront réalisés par des expérimentateurs rodés à geste expérimental en utilisant des canules souples pourvues d'embouts en silicone. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de jeune adulte adulte au début des traitements (7 semaines d'âge). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime appauvri en fibres et pro-inflammatoire, des gavages répétés et des prises de sang, et 40 % d'entre elles absorbent un produit induisant une inflammation intestinale pendant sept jours, cinq fois de suite. Le porteur indique attendre une perte de poids de 5 à 10 % et des diarrhées durant les phases inflammatoires, et héberge les souris seules pour éviter la coprophagie. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de modéliser in vitro la rupture de la symbiose entre l'hôte et son microbiote.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles, dont maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète…, ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à notre environnement (microbiote, régime alimentaire). Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins des êtres vivants. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres au sein du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Récemment il a été montré que ce déséquilibre résulte d’une altération de la symbiose hôte-microbiote, elle-même caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Nos travaux suggèrent que ce déséquilibre résulte d’une rupture du dialogue microbiote-hôte due à des signaux inducteurs inflammatoires. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies chroniques, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par une diminution qualitative du microbiote. L’objectif de notre projet est d’étudier la mise en place d’une rupture de symbiose microbiote-hôte occasionnée par un stress inflammatoire chronique chez l’animal et d’évaluer les conséquences de cette rupture sur le vieillissement des animaux et leur descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’humain et permettront d’identifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques inflammatoires intestinales.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. Dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales, une perturbation du microbiote intestinal est souvent associée à une dérégulation de l’état de santé chez l’humain. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance de cette perturbation conduit souvent à une succession de phases aigües de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et inducteur d’inflammation susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Tous les animaux adultes recevront une solution par gavage au minimum 4 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de gavage contention comprise est de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue de 40 µL. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 1 et au maximum 2 prises de sang à la joue de 200 µL. Le temps de collecte contention comprise est de 30 seconde à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux adultes seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans les procédures. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. 40% des animaux adultes recevrons dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin durant sept jours consécutifs répéter 5 fois avec une semaine de récupération entre chaque prise.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle, entrainant un stress modéré, afin d’éviter des contaminations croisées de microbiote par coprophagie. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise de poids et soient sujets à des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues. Des prises de sang engendrant un léger stress de très courte durée seront réalisées et les animaux seront également gavés oralement avec des solutions permettant d’évaluer respectivement le temps de transit et la perméabilité intestinale. Ces protocoles constitueront un stress modéré notamment dû à la contention. Des signes de douleurs intestinales (diarrhée) sont attendus pendant les phases inflammatoires.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte. En effet, comprendre et caractériser l'évolution de la symbiose microbiote-hôte nécessite la mise en place d'intéractions bidirectionnelles complexes entre l'hôte et son microbiote. Ces intéractions sont difficilement controlables et pertinentes dans des modèles in vitro actuel de type microbiote/organoïde, notamment sur des temps longs tels que ceux décrient dans notre projet, ou nous ciblons particulièrement les périodes post stress et plus particulièrement la résilience ou non de la symbiose.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 134 animaux pour le groupe contrôle et 188 animaux pour le groupe expérimental sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux, leur comportement et leur prise de poids.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras puis hébergées seules à thermoneutralité, elles reçoivent chaque jour pendant plus de six semaines un composé par gavage ou injection, avec pesées, prélèvements sanguins et test de tolérance à l'insuline, pour un laboratoire pharmaceutique client. Le porteur décrit l'isolement et les administrations quotidiennes comme des nuisances et affirme que le choix du modèle a été "validé avec le client". L'objectif déclaré est commercial, constituer un dossier d'autorisation puis mettre sur le marché un médicament contre l'obésité.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré qu'une série de composés en développement induit une perte de poids corporel associée à une diminution de la prise alimentaire chez des souris obèses. L'objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l'impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique (60% de l'énergie issue des graisses) pendant 10 semaines avant réception. Les traitements seront administrés par voie orale ou sous-cutanée pendant 5 semaines, pendant lesquelles les animaux seront soumis au même régime enrichi en graisses. Au cours du traitement, les paramètres suivants seront mesurés : poids corporel et prise alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, tolérance à l'insuline. Par ailleurs, afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°C).

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de sécuriser le développement des composé tests, notamment dans le but de prioriser ceux ayant les effets les plus marqués. Ainsi, ls données obtenues permettront de constituer un dossier de demande d'autorisation pour la réalisation d'études cliniques. A terme, cela permettrait à la société cliente d'obtenir une AMM et de commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) un état d'obésité induit par l'aliment enrichi en graisses (Régime fournis pendant 12 semaines avant réception des animaux et 7 semaines après réception) - 2) un hébergement individuel sur toute la longueur de l'étude (Durée: 7 semaines après réception) - 3) une administration orale ou sous-cutanée quotidienne du traitement test, du véhicule ou du composé de référence à partir de D-11 et jusqu'à D35 (46 jours; durée de l'acte : environ 1-2 minutes) - 4) une pesée quotidienne de D-18 à D-1 (durée de l'acte : environ 1-2 minutes) - 5) une mise à jeun de 4h + un prélèvement sanguin à la queue à D-6 (durée de l'acte : environ 5 minutes)- 6) des mesures de prise alimentaire et de poids corporel trois fois par semaine à partir de D1 (soit un total de 15 mesures; durée de l'acte : environ 2-3 minutes) - 7) deux analyses de leur composition corporelle à D-6 et D29 (Durée de l'acte < 2 minutes) -8) un test oral de tolérance à l'insuline (ITT) à D29 [(Mise à jeun pendant 6h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 0, 15, 30, 60 et 120min après administration du glucose; Durée de l'acte : 2,5 heures) . - 9) Une anesthésie générale et euthanasie à D35 (Durée de l'acte: environ 5 minutes) .

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire et les mesures en cages métaboliques prévues en cours d'étude imposent un hébergement individuel des animaux imposent un hébergement individuel des animaux constituant une nuisance. Afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°). Les animaux seront pesés régulièrement afin d'administrer le bon volume de véhicule ou de traitement. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins pour mesure de glycémie, un test de tolérance à l'insuline (avec une mise à jeun de 6h), et deux analyses de la composition corporelle par RMN sont prévus et pourront être source de stress ou de nuisance pour les animaux. Enfin, les gavages oraux et les administration sous-cutanées quotidiens à partir de D-11 et jusqu'à D35 (soit 46 jours) sont une source de nuisance. Il est à noter que les administrations (orales ou sous-cutanées) d'habituation effectuées entre D-11 et D1 s'avèrent nécessaires car sans cette précaution, ces procédures induiraient des modification du prise alimentaire et de poids corporel au début du traitement et seraient et donc seraient à même de fausser les résultats de l’étude.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète des effets des composés test.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt compte tenu des paramètres mesurés dans la présente étude mais également de l'hétérogénéité connue du modèle obèse. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance à l'insuline (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jeun, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas), HbA1c, triglycérides et le poids du tissu adipeux inguinal gauche et droit.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Par ailleurs, nous avons remarqué que la litière en cellulose permet non seulement une bonne absorbance mais également un enrichissement (nidification). Pour chaque prélèvement sanguin, de la lidocaïne en gel sera appliquée à l'extrémité de la queue 30 minutes avant prélèvement afin de prévenir la douleur pouvant résulter de ce geste. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. En cas de signe de souffrance de l'animal, un analgésique (buprénorphine) sera administré. Si aucune amélioration n'est constatée passé un certain délai, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (16 semaines à réception). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.