Troubles endocriniens

4 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras puis exposées à des cocktails de perturbateurs endocriniens entre le cinquième et le onzième jour après la fécondation, elles servent à étudier la progression des maladies du foie gras, avec une atteinte hépatique et une nage altérée attendues. Le porteur présente la larve comme un modèle "alternatif" au rongeur qui limite l'usage de mammifères, tout en qualifiant l'expérimentation animale d'"indispensable". Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit les interactions entre organes nécessaires à l'étude.

Objectifs

Les maladies du foie gras sont devenues une priorité de santé publique car elles touchent plus de 20 % de la population générale et surtout les personnes obèses (>70% de personnes atteintes). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. L’exposition aux perturbateurs endocriniens, seuls ou en mélange, notamment via l’alimentation, est reconnue comme un facteur pouvant participer au développement de ces maladies. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact de ces molécules sur la santé et en particulier sur les maladies du foie gras. Etant donné la nature complexe de ces maladies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est nécessaire d’avoir une approche utilisant des organismes entiers et donc uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Le premier objectif de ce projet est donc de poursuivre l’évaluation de la larve de poisson-zèbre comme modèle alternatif aux modèles rongeurs pour l’étude des effets cocktail des perturbateurs endocriniens sur les maladies du foie gras. En outre, l’un des mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication important entre les organes participant à la progression de ces maladies du foie. Ces vésicules représentent également de potentiels biomarqueurs d’exposition et/ou de progression de la maladie dans la mesure où elles sont facilement accessibles par prélèvement sanguin. Ainsi, un second objectif de ce projet est de caractériser la production des vésicules extracellulaires issues du foie suite à l’exposition à un cocktail de perturbateurs endocriniens.

Bénéfices attendus

Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le potentiel de ce modèle de larve de poisson-zèbre en alternative au modèle murin classiquement utilisé. En parallèle, des travaux seront d’ailleurs conduits sur un modèle murin pour compléter ce projet (ces travaux sont intégrés à une autre saisine). En outre, ce projet permettra de vérifier nos hypothèses sur les vésicules extracellulaires et, en cas de confirmation, ouvriront la voie à des études plus avancées sur le rôle de ces vésicules dans les maladies du foie gras ou à leurs utilisations en tant que potentiels biomarqueurs.

Procédures

Alimentation avec un régime enrichi en graisse de 4 à 10 jours post-fertilisation des oeufs. Exposition à des cocktails de perturbateurs endocriniens (de 7 à 11 jours post-fertilisation des oeufs)

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons, cependant celui-ci devrait rester modéré et se traduire éventuellement par des modifications légères du comportement (nage altérée).

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement), l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste toutefois une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.Plus précisément, l’un des objectifs de ce projet est de déterminer si les vésicules extracellulaires produites par le foie peuvent servir de biomarqueurs d’exposition et/ou d’atteintes hépatiques dans le contexte d’exposition à des polluants environnementaux. Pour cela, il est nécessaire de reconnaitre spécifiquement les vésicules issues du foie au sein de toutes les vésicules produites par l’organisme et d’identifier les changements qualitatifs ou quantitatifs de cette population de vésicules qui pourraient corréler avec les niveaux d’exposition aux polluants ou avec les atteintes du foie. Ainsi, seule l’expérimentation sur un modèle in vivo peut permettre d’évaluer de manière intégrative la production de vésicules et le développement de ces maladies du foie (maladies qui dépendent en partie de la communication entre différents organes). A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternatives (in vitro, in silico ou ex vivo) permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre organes liées à ces maladies du foie ni la grande variété de vésicules retrouvées dans un organisme entier.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Ainsi, nous avons prévu de réaliser des tests de comparaison de moyennes ANOVA avec un seuil de significativité à 5% (p

Raffinement

Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale. Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux. En outre, les animaux seront attentivement suivis et l’atteinte éventuelle des points limites évalués selon des critères adaptés, gradés et précis entrainera l’arrêt des expérimentations.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens en mélange sur l’apparition et la progression des maladies du foie gras. Le modèle de poisson- zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et limite ainsi l’utilisation de ces modèles mammifères. L’objectif de ce projet est en partie de renforcer cette notion en particulier pour l’étude des perturbateurs endocriniens et des vésicules extracellulaires. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude avec l’Homme notamment concernant le foie et les maladies du foie gras (types cellulaires et métabolisme); une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 5 et 11 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des maladies du foie gras (induite par l’alimentation notamment).

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par une alimentation grasse et sucrée, elles sont gavées chaque jour pendant cinq semaines, puis soumises à des tests de tolérance au glucose et aux lipides avec incision de la queue, pour comparer des bactéries probiotiques. Le porteur mentionne comme effets un gonflement de l'œsophage, une prostration possible et une infection au point d'incision, les souris étant anesthésiées puis mises à mort pour prélever leurs organes. Il justifie l'usage de la souris par l'impossibilité éthique de prélever ces organes chez l'humain.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie reconnue comme une priorité urgente et un enjeu majeur de santé publique. La mortalité et la morbidité associées à cette maladie entraînent des coûts exorbitants de santé dans le monde. A ce jour, malgré un arsenal thérapeutique important, le traitement est loin d'être optimal. Il apparaît urgent d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour optimiser le traitement des patients. Une nouvelle voie s’est ouverte depuis que des études ont montré que l’un des effets bénéfiques d’un médicament anti-diabétique très largement prescrit résulte de sa capacité à modifier les populations de bactéries présentes dans l’intestin. Actuellement, des souches de bactéries probiotiques sont développées pour améliorer l’état du métabolisme des patients diabétiques de type 2. Les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantité suffisante, confèrent un bienfait pour la santé de l’hôte. Récemment, dans modèle de souris, une nouvelle souche de bactérie probiotique ciblant le diabète de type 2 a été identifiée. Ce projet vise à identifier le mécanisme d’action de cette nouvelle souche en la comparant avec des bactéries probiotiques déjà connues et qui ont des effets bénéfiques sur le diabète.

Bénéfices attendus

A court teme, ce projet permettra de comparer les effets d’une nouvelle bactérie probiotique avec des bactéries probiotiques déjà connues sur le métabolisme du glucose et des lipides afin identifier son mécanisme d’action. A plus long terme, les résultats de ce projet ouvriront la possibilité de valider l’effet anti-diabétique de la nouvelle bactérie vivante ou de préférence de la bactérie sous une forme inactivée pasteurisée (risque sanitaire réduit) chez des personnes diabétiques au cours d’un essai clinique. Ainsi, ce projet doit permettre de développer un nouveau traitement pour les patients avec un diabète de type 2, ce qui est particulièrement précieux face à des traitements médicaux existants qui ne sont pas optimaux.

Procédures

Toutes les souris éveillées seront gavées pendant 5 semaines (tous les jours, une fois par jour, 15 secondes au maximum par souris). A l’issue des 3 premières semaines de traitement à l’âge de 13 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test sanguin permettant de mesurer l’effet du traitement sur la capacité de leur organisme à utiliser le glucose injecté dans la cavité abdominale (une fois, 15 secondes). L’évolution du taux de sucre dans le sang après l’injection du glucose sera mesuré 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère inscision à la queue de l’animal (une seule incision, 5 secondes par prélèvement). A l’âge de 14 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test de charge en lipides donnés par gavage pour tester leur capacité à absorber les lipides (une fois, 15 seconde). L’évolution des taux de lipides dans le sang sera suivie 4 fois par un prélèvement d’une goutte de sang à la queue des souris (5 secondes par prélèvement). A l’âge de 15 semaines, toutes les souris seront anesthésiées par injection (une fois 15 secondes) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).

Impact sur les animaux

On pourrait observer après gavage du sang sur la canule, un gonflement de l’œsophage et/ou une prostration de la souris. Dans les jours qui suivent l’incision superficielle de la veine de la queue (une seule fois par test), une infection au point d’incision peut être observé. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé.

Devenir

A l’issue du protocole, à l’âge de 15 semaines, tous les animaux seront anesthésiés avant une dernière prise de sang, puis les souris seront rapidement mises à mort pour récupérer les organes nécessaires aux analyses biologiques pour permettre l’identification du mécanisme d’action de la bactérie probiotique.

Remplacement

Comme l’effet attendu d’un anti-diabétique se fait par des modifications physiologiques coordonnées entre plusieurs organes (foie, intestin et tissus adipeux, entre autres) et qu’il n’est pas possible éthiquement de réaliser ces prélèvements dans chacun de ces organes chez l’Homme, ils seront réalisés chez la souris, un animal qui fonctionne physiologiquement de manière similaire à l’Homme pour les paramètres physiologiques analysés.

Réduction

Le nombre de 16 animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance statistique et par l’expérience acquise dans des protocoles précédemment réalisés. Avec cet effectif de 16 souris par groupe, les données recueillies pourront être comparées entre le groupe contrôle et les groupes traîtés à l’aide de tests statistiques ce qui permetta de répondre aux questions initialement posées. Plusieurs bactéries seront testées en parallèle afin de ne consituter qu’une seule fois les groupes contrôles et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours avec une attention particulière en période de gavâge pour vérifier l’apparition de troubles du comportement ou de stress. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé. De plus, la personne qui va manipuler les souris lors du gavage est très expérimentée (si possible toujours la même), et réalisera un geste rapide et précis pour limiter la souffrance et l’angoisse des animaux.

Choix des espèces

Au sein de la communauté scientifique, les travaux effectués dans le domaine des bactéries probiotiques sont majoritairement réalisés chez la souris ce qui permet la comparaison des résultats obtenus par les différentes équipes. Comme la physiologie du métabolisme des sucres et des lipides chez la souris est proche de celle de l’Homme, les expériences seront réalisées chez cette espèce animale. La souris C57BL/6J est reconnue comme une souche de référence pour les études du métabolisme et tolère très bien la nourriture riche en gras et en sucres. De plus, les altérations du métabolisme glucidique et lipidique induites chez les souris par une nourriture riche en gras et en sucres sont très bien décrites et maîtrisées. L’intervention nutritionnelle débutera chez les souris âgées de 10 semaines car à cet âge, les souris sont adultes et présentent un microbiote intestinal mature. De plus, à l’âge de 10 semaines de vie, les souris sont métaboliquement prêtes à consommer une nourriture riche en gras et en sucres et à développer les altérations métaboliques voulues.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras, elles reçoivent des injections répétées induisant fibrose puis cancer du foie, avec des prélèvements sanguins, pour évaluer le rôle de deux protéines dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur résume les retombées en une phrase, la validation des "effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs". Il affirme qu'"il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé" et conserve les organes pour tirer un maximum de données de chaque souris.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs ont été déjà identifiés (diabète, inflammation, modification du microbiote intestinal). Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à 2 acteurs clefs impliqués dans le développement de ces maladies. Ces acteurs peuvent agir de pair favorisant le développement de ces maladies chroniques du foie. Pour une meilleure compréhension de leurs rôles, nous évaluerons sur des animaux, l’impact potentiellement bénéfique de leur absence sur le développement et la progression de ces maladies du foie.

Bénéfices attendus

Ces études précliniques valideront les effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs dans les maladies chroniques du foie .

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la cicatrisation hépatique. Pour la procédure 2 : les souris recevront une injection 2 fois par semaine pendant 6 semaines à partir de 7-8 semaines d’âge. Pour la procédure 3 : une unique injection sera réalisée sur les souris mâles âgés de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont les contentions, les prises de poids régulières ainsi que les injections en fonction des procédures. Les effets indésirables attendus pourraient être principalement une faible inflammation locale au site d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, certains aspects du projet seront réalisés sur des cellules. Cependant, il est nécessaire de réaliser des études précliniques car les études sur cellules ne permettent pas de reproduire la maladie humaine. Ainsi, il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé pour ces études.

Réduction

Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes et exploitables. Les expériences seront reproduites pour confirmer la significativité statistique. Les organes obtenus à partir des souris seront conservés et stockés pour des analyses ultérieures afin d'enregistrer autant de paramètres que possible à partir d'une seule souris.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières (grille d’observation) nous permettront d'identifier précocément tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée et pertinente pour étudier ces maladies. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La maladie développée par la souris récapitule les symptômes et les caractéristiques de la maladie chez homme. Pour la procédure 1, la mise sous régime riche en graisse débutera lorsque les souris auront 8-10 semaines d’âge. En effet, un tel régime induit une prise de poids importante et peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Cette procédure permet d’analyser la progression des maladies chroniques du foie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline. Pour la procédure 2, le traitement chimique induisant la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge. Cette procedure permettra d’étudier les mécanismes moléculaires associés à la fibrose hépatique. Pour la procédure 3, l’injection du réactif induisant le cancer hépatique sera effectuée à environ 2 semaines d’âge (âge approprié pour cette procédure) et la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge (animaux relativement jeunes). Cette procédure permettra d’étudier les stades le plus avancés de la maladie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles naissent avec un déficit de poids et développent des atteintes cardiaques et musculaires, puis sont gavées deux fois par jour, soumises à des échographies et à des courses forcées sur tapis avant la mise à mort. Le porteur teste le repositionnement de médicaments déjà commercialisés pour d'autres maladies. Il présente le passage à l'humain comme rapide en cas de succès, sans traitement curatif existant à ce jour.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants (prélèvements terminaux de différents organes sur animaux euthanasiés). Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (2 fois par jour pendant 1 semaine maximum; quelques secondes pour chaque geste) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste).

Impact sur les animaux

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 5 mois. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10-12 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 2 fois par jour durant 3 mois lors de la DAP précédente n'ont pas révélé de nuisances particulières. Les prélèvements sanguins et l'echocardiographie sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet (DAP) précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Ces mêmes animaux seront également communs entre cette demande d'autorisation de projet (DAP) et une autre DAP. Par ailleurs, si les faibles doses ont un effet positif, les doses supérieures ne seront pas testées, diminuant ainsi le nombre total d'animaux. On passera à la dose supérieure uniquement si aucun effet sur dosages sanguins mais également sur poids, échocardiographies, treadmill et analyses sur organes n'est observé. Les mises au point actuelles montrent qu’un n de 5 est suffisant pour obtenir des statistiques robustes. Le logigramme montre que si l’étape 2 (sacrifice pour prélèvements d’organes et de sang) n’est pas engagée alors on aura des lots de 10 en étape 3 et si l’étape 2 (sacrifice pour prélèvements d’organes et de sang) est engagée alors on aura des lots de 5 en étape 2 et en étape 3. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis la mise en place des conditions optimales pour le bien-être des animaux. Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des animaux inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance : si on dépasse les 20 pourcents d'écart par rapport à l'animal lui-même, alors l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste, développés dans chaque procédure. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir, l'animal sera immédiatement euthanasié. Lors des échocardiographies, la surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux modèle de la maladie, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les animaux contrôles seront séparés des anaimaux modèle de la maladie dans les cages.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront élevés et gavés quotidiennement avec les candidats médicaments dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP à l'âge de six mois (âge où un défaut en échocardiographie et sur tapis de course a été mis en évidence lors d'une précédente DAP).

11 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'injection d'un vecteur de thérapie génique censé faire produire au foie un facteur de coagulation, puis dix-huit prélèvements sanguins sous anesthésie sur six mois et une ponction de moelle osseuse juste avant la mise à mort. Le porteur décrit une étude de dose préalable à un développement clinique encore "potentiel", et justifie le recours au primate par une reconnaissance du vecteur limitée aux cellules humaines ou de primates. La mise à mort est présentée comme "nécessaire" pour prélever les tissus.

Objectifs

L’hémophilie B est une maladie génétique dont l’origine est un déficit en facteur IX, un facteur de coagulation. Elle se traduit par un déficit de la coagulation sanguine. Les patients hémophiles B non traités présentent des symptômes tels que des saignements excessifs lors de blessure et parfois même des hémorragies spontanées pouvant être fatales si non traitées. L'activité biologique du facteur IX s'évalue en pourcentage de la normale. L'individu normal étant considéré comme ayant 100% d'activité. Si l'activité est indétectable (inférieur à 1%), il s'agit d'une hémophilie sévère, si l'activité est comprise entre 1 et 5%, l'hémophilie est dite modérée; au-delà et jusqu'à 30% l'hémophilie est mineure. L’intervention au niveau de l’activité biologique de ces facteurs peut avoir un bénéfice substantiel pour les patients avec hémophilie sévère. Le traitement que nous souhaitons évaluer dans ce projet est basé sur l’utilisation d'un vecteur de thérapie génique (vecteur lentiviral) qui, suite à une injection systémique, est capable de cibler les cellules du foie et permettre la sécrétion de facteur IX humain dans le flux sanguin. Le vecteur lentiviral qui sera testé dans cette étude a été conçu pour être peu reconnu par le système immuntaire de l'organisme qui le reçoit, ce qui améliore la délivrance du gène thérapeutique dans les cellules du foie et réduit les réponses inflammatoires aiguës. L'objectif de la présente étude est de réaliser une étude de dose avec de vecteur lentiviral chez des primates non humains (cynomolgus macaca) après administration intraveineuse.

Bénéfices attendus

L’hémophilie B, qui touche environ 1 homme sur 30000, entraîne un déficit de la coagulation sanguine en réponse à une hémorragie. Les patients non traités présentent des hémorragies prolongées ou spontanées pouvant être fatales. Le traitement actuel de l’hémophilie B est substitutif. Il repose sur l’administration intraveineuse plusieurs fois par semaine de concentrés de facteur IX, issus du plasma ou produits par biotechnologie. Ce traitement préventif est contraignant, coûteux, ne permet qu’une correction transitoire et partielle du déficit et est associé au risque de développement d'une réponse immunitaire, qui inhibe par la suite l'efficacité du traitement. Les résultats préliminaires des études d'efficacité de thérapie génique sont très prometteurs, mais demandent encore à être optimisés pour réduire leur coût mais également l'immunogénicité des vecteurs viraux utilisés. L'objectif de la présente étude est de réaliser une étude de dose, chez le primate non humain, d'un nouveau type de vecteur de thérapie génique (vecteur lentiviral) développé pour traiter l'hémophilie B. Les résultats fourniront des données importantes sur la dose minimale efficace de ce produit chez les primates non humains, avant les études de toxicologie réglementaire ultérieures et son développement clinique potentiel.

Procédures

Chaque animal de cette étude sera soumis aux interventions suivantes: - Dans les 2 mois avant injection: 3 à 4 prélèvements sanguins, sous anesthésie (maximum 15 à 30min) - La veille de l’injection : un traitement immunosuppresseur appliqué par voie intraveineuse, sous anesthésie (maximum 30min) - Le jour de l’injection (J0) : un traitement immunosuppresseur appliqué par voie IV + une injection du vecteur thérapeutique, par voie intraveineuse, le tout sous anesthésie (maximum 3h) - Le jour de l’injection (+3h) : Un prélèvement sanguin, sous anesthésie (maximum 15min) ou sur animal vigile - Entre 1 jour et 6 mois post-injection : un total de 18 prélèvements sanguins, sous anesthésie (maximum 15 à 30min) - A 6 mois post-injection (J180): un prélèvement de moelle osseuse + un prélèvement sanguin, le tout sous anesthésie (maximum 45min), avant euthanasie par injection intraveineuse d’une dose léthale de pentobarbital.

Impact sur les animaux

La majorité des gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs (injection du vecteur thérapeutiques par voie IV et prélèvements sanguins par ponction veineuse). Ils seront réalisés sur animaux anesthésiés. Le seul acte douloureux par lui-même sera la ponction de moelle osseuse (dans l’os d’une hanche) qui sera réalisé juste avant la mise à mort des animaux. Cet acte sera également réalisé sous anesthésie, et une injection de morphine sera réalisée avant l’acte afin de garantir une analgésie. D'autre part, l’injection systémique d’un vecteur lentiviral peut induire, au moment de son injection, une réaction inflammatoire et allergique transitoire. Cette réaction, asymptomatique chez les animaux, est limitée grâce à l’administration d’un traitement immunosuppresseur à base d’un corticostéroïde et d’un antihistaminique. Enfin, il n’est pas attendu que l’expression de la protéine facteur IX (exprimée par le vecteur lentiviral) pendant une durée de 6 mois soit associée à des phénomènes toxiques ou délétères provoquant des symptômes sévères chez l’animal. Malgré tout, un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute anomalie.

Devenir

Les 11 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant 6 mois après l'injection du vecteur lentiviral puis euthanasiés pour prélèvements de tissus post mortem. L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements de tissus sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques réalisées. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier et sur le long terme (plusieurs semaines après injection). L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier (i) l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: foie, coeur, muscles squelettiques et autres tissus majeurs), et (ii) la réponse immunitaire contre un vecteur de thérapie génique. Ce projet ne peut donc être réalisé in vitro. D'autre part, la tolérance immunologique de ce vecteur (et donc son efficacité) passe par la reconnaissance d'un facteur spécifique présent à la surface de ce vecteur, et ne pouvant être reconnue que par des cellules humaines ou de primates non humains. Pour que cette étude de dose soit pertinente, il donc est important qu'elle soit réalisée dans un modèle animal pouvant reconnaître cette protéine, d'où le choix du primate non humain.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux a été réalisée sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique. La constitution de groupes de 3 animaux permettra d’obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans être excessif. Ce nombre d’animaux permettra une analyse statistique.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L'état de santé des animaux est surveillé tout au long des expériences afin d’éviter l'apparition éventuelle d'une souffrance. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et les animaux disposent de nourriture et d'eau ad libitum. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés et l’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie anticipée.

Choix des espèces

La tolérance immunitaire (et donc son efficacité) du vecteur lentiviral de thérapie génique testé dans cette étude passe par la reconnaissance d'un facteur spécifique présent à la surface de ce vecteur, et ne pouvant être reconnue que par des cellules humaines ou de primates non humains. Pour cette raison, les primates non humains sont les espèces les plus pertinentes pour réaliser une étude de dose du vecteur lentiviral testé dans cette étude. Les résultats seront plus prédictifs de ce qui pourra se passer chez l'Homme, au contraire des résultats qui pourraient être obtenus en réalisant cette étude dans une autre espèce. Le traitement évalué dans ce projet s'adressait, dans le futur essai clinique, à des patients hémophiles adultes. Les animaux inclus seront inclus à l'âge d'environ 3 ans. Il s'agira de jeunes adultes, matures sur le plan métabolique.

77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs ovaires sont retirés par chirurgie pour reproduire l'ostéoporose post-ménopause, puis elles reçoivent des injections tous les deux jours pendant jusqu'à huit semaines et deux prélèvements de sang. Le porteur admet une mortalité chirurgicale acceptée jusqu'à 10 %, et une mise à mort finale pour analyser les tissus osseux. Le test porte sur une famille de molécules développée avec des chimistes, dont l'effet reste à consolider.

Objectifs

L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Dans le cadre du développement de traitements contre l’ostéoporose nous avons développé, conjointement avec une équipe de chimistes, une famille de molécules agissant à la fois sur les symptômes directs de la maladie associés au remodelage osseux (pertes osseuses) mais également sur les phénomènes inflammatoires associés. L’objectif de ce projet est donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de ces molécules, en étudiant la restauration du phénotype osseux associé à leurs emplois, dans un modèle murin d’ostéoporose induit chez l’animal par le retrait des ovaires (ovariectomie). Cette approche expérimentale permet de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause et impactant l’homéostasie tissulaire osseuse (ostéoporose post-ménopause). Ce travail permettra donc, à terme, de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre l’ostéoporose.

Bénéfices attendus

L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse ou des substituts hormonaux, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques. En traitement de première intention, si certaines molécules bloquent la formation et l’activité des cellules qui dégradent naturellement l'os limitant ainsi la perte osseuse, cette approche thérapeutique ne permet pas de récupérer de la densité osseuse car elle bloque également à terme la reformation osseuse. Par ailleurs de nombreux effets secondaires sont associés à ces différents types de traitements : douleurs musculo-squelettiques et troubles digestifs auxquels s’ajoute un risque de destruction des os de la mâchoire avec certaines molecules. L’approche proposée vise à l’obtention d’une efficacité similaire à celle de ces molécules via des modes d’actions différents, laissant présager de ne pas reproduire leurs effets indésirables principaux, favorisant la prise en charge des patientes souffrant d’ostéoporose post-ménopause.

Procédures

Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30min sous anesthésie générale visant au retrait de leurs ovaires, puis des injections tous les 2 jours pendant 8 semaines au maximum sur animaux vigiles, sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale. Les animaux auront également deux prélèvements sanguins (100µL chacun) à la queue, sous anesthésie générale, le premier en pré-opératoire et le second à 4 semaines post-opératoires.

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque non négligeable de mortalité. Une mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie de 10% est le maximum acceptable au-delà duquel la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée en post-opératoire, est attendue dans les premiers jours.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés suite à la nécessité de réaliser un prélèvement sanguin puis de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner et analyses histologiques et immunohistochimiques afin de pouvoir évaluer l'efficacité des traitements.

Remplacement

A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme. Les modèles d’organes isolés ne peuvent pas, à notre connaissance, fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.

Réduction

Des analyses à mi-parcours avec dispositif d’arrêt de l’expérience si l'expérmentation ne peut statistiquement pas donner de résultat seront appliquées. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Nous proposons donc d’effectuer une première série de 5 animaux par groupe, avec une analyse statistique intermédiaire permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique satisfaisante dans la limite de 10 animaux par groupe au maximum. Des tests statistiques adaptés aux effectifs de cette étude seront ensuite utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton…) permettant aux animaux d'améliorer leur milieu. A chaque intervention les animaux seront anesthésiés si nécessaire afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’approche chirurgicale, une douleur post-opératoire sera anticipée avec l’injection préventive et curative d’antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois jours suivants la chirurgie et dès les premiers signes d’inconfort détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours lors des injections de façon à contrôler l'absence de points limites tout au long de l'étude. Les molécules choisies seront injectées sur animaux vigiles sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale (afin de réduire le stress des animaux) tous les deux jours pendant 28 à 56 jours. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés sous anesthésie générale gazeuse.

Choix des espèces

La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures de l’équipe ont donné des résultats exploitables concernant les traitements dans d’autres champs d’application. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.

6 000 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois avec adjuvant, et des prélèvements de sang pouvant aller jusqu'à quatre par jour, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et des médicaments. Hébergés seuls alors que l'espèce est sociale, ils sont tués en fin de protocole, un prélèvement de sang final important rendant leur maintien en vie impossible selon le porteur. Celui-ci reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques).

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 2 mL répartis sur 4 à 8 sites maximum pour la voie sous-cutanée, 0.5 mL sur 4 sites maximum pour la voie intra-musculaire, 5 mL/kg pour la voie intraveineuse, 2mL sur 40 sites maximum pour la voie intra dermique. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique mais seront au maximum espacés d’un à deux jours sur une durée totale d’un mois. En cas de durée supérieure à un mois, la structure en charge du bien-être animal sera contactée pour évaluer le bénéfice / risque. Concernant les prélèvements, les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de 5 minutes. Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à une anesthésie générale par injection d’un anesthésique par voie intraveineuse ou à une anesthésie locale répétée par application d’une pommade anesthésiante. Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, la contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Il est en effet impossible de : réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre protocole d’immunisation, réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre projet effectué par l’établissement utilisateur. Lors du prélèvement final de la procédure, un volume significatif de sang est récupéré et cela rend incompatible la réutilisation de l’animal.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

Également, à travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les lapins sont hébergés individuellement en gardant un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. De l’enrichissement est mis à leur disposition (balles de cellulose et/ou foin, anneau en plastique, mousqueton…) Un cycle jour nuit est présent en zone d’expérimentation (12h/12h). Les animaux sont observés de manière quotidienne par du personnel formé et compétent et pesés toutes les semaines. Durant cette pesée, un examen approfondi de l’état clinique des lapins est effectué par le technicien (e.g. : vérification des points d’injection, maux de patte éventuels, dentition…). Également, durant ce processus, des caresses aux animaux sont prodiguées. Des points limites intermédiaires associés à des actions spécifiques et des points limites terminaux sont en place. Par exemple, en cas de perte de poids ≥ 20% sur une semaine, une nourriture appétante est proposée à l’animal. Également, en cas d’apparition de certains signes cliniques (exemples : masses sans douleur pour l’animal, abcès sans lésion, fécalome) des protocoles de soins validés par un vétérinaire sont prodigués aux animaux. Certains gestes douloureux (injections intra-dermique) sont réalisés sous anesthésie générale et les injections répétées sont effectuées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Choix des espèces

Le lapin est l'animal le plus utilisé pour la production d’anticorps étant l’espèce animale la plus adaptée pour cela, de par la production de volumes suffisants d'antisérum qualitatif et à titre élevé. Cela permet donc d’utiliser moins d’animaux pour l’objectif scientifique requis. Age minimum des lapins : 10 semaines. A cet âge, les lapins ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus diabétiques, ils reçoivent des injections quotidiennes d'une molécule tenue secrète, la "myokine X", subissent des prises de sang répétées à la queue, un test de mémoire en piscine de Morris et une exposition au froid à 4 °C pendant 24 heures, avant d'être tués pour analyse des organes. Le porteur attend une perte de poids, des désordres intestinaux et une détérioration de la queue liés aux prélèvements. Il compare sa molécule, en cours de brevet, au liraglutide déjà utilisé chez les patients et affirme "indispensable" le recours à l'animal.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (diabète de type 1, DT1), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit (diabète de type 2, DT2). Ainsi, dans les 2 cas, il y a un trouble de l’utilisation et du stockage du glucose apporté lors des repas, entrainant une hyperglycémie. Cette dernière peut au fil du temps provoquer des maladies cardiovasculaires, des néphropathies, des altérations cognitives (perte de mémoire) … La régulation de la fonction sécrétoire des cellules à insuline et leur survie jouent un rôle central dans la progression du diabète. Le muscle squelettique constitue l’organe le plus sensible à l’insuline de l’organisme et joue donc un rôle majeur dans l'équilibre glycémique de l'organisme puisqu’il constitue le site majoritaire de stockage du glucose sous l'action de l'insuline. Nous avons mis en évidence l’existence d’une communication croisée entre le muscle squelettique et les cellules à insuline par le biais de facteurs appelés myokines. Nous avons montré in vitro (îlots pancréatiques de Rat et Humain) et in vivo, dans un modèle de transplantation d’îlots chez le rat DT1, qu’une myokine, appelée myokine X, permettait d'améliorer la survie, la fonction des îlots pancréatiques et l’équilibre glycémique des animaux diabétiques transplantés. Par ailleurs, dans une autre étude in vivo réalisée récemment, nous avons montré qu’une injection quotidienne de notre Myokine X chez un modèle de rat DT2, permettait de prévenir l’apparition de cette pathologie. En particulier, les premiers résultats montrent un impact intéressant de la myokine X sur le tissu adipeux brun. Ce dernier représente un intérêt important de par sa capacité thermogénique qui améliore l’homéostasie glucidique grâce à une importante consommation des substrats dont le glucose. Le nom de cette myokine, représentant un intérêt thérapeutique important pour le patient diabétique, reste anonyme car un brevet est en cours de dépôt. Désormais, le premier objectif de cette demande est de déterminer si notre Myokine X pouvait également avoir un effet curatif sur un modèle de Rat DT2 ainsi que sur les complications citées précédemment. Le second objectif de cette étude est de comparer les effets de notre Myokine X avec les effets du Liraglutide, qui est aujourd’hui un antidiabétique largement utilisé chez l’Homme mais qui peut présenter certains effets secondaires.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est d’obtenir un effet curatif du DT2 par la Myokine X. De plus, cette étude permettra de comparer les effets de notre molécule avec ceux du Liraglutide, qui est très largement utilisé chez le patient diabétique. Néanmoins, le Liraglutide peut présenter un certain nombre d’effets indésirables tels que des désordres intestinaux qui peuvent amener le patient à vouloir arrêter son traitement. Par ailleurs, nos études précédentes in vivo menées chez le rat diabétique n’ont pas montré de tels désordres. Ainsi, notre traitement pourrait constituer une biothérapie innovante pour le DT2.

Procédures

Afin d’évaluer l’évolution du diabète, différents tests seront effectués sur l’ensemble des animaux pour suivre la glycémie. Tout d’abord, celle-ci sera mesurée quotidiennement et l’acte ne durera que quelques secondes. Par ailleurs, nous complèterons ce suivi par une prise de sang hebdomadaire afin de mesurer des marqueurs en liens avec la glycémie. La durée de la contention pour la prise de sang est de moins de 2 minutes. Pour évaluer le fonctionnement de l’ensemble des organes impliqués dans la régulation de la glycémie, un test de sensibilité à l’insuline sera réalisé la moitié des animaux et sur l’autre moitié un test de tolérance au glucose sera effectué. Ces deux tests dureront chacun 2h et avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l’eau ad libitum). De plus, nous évaluerons les effets de notre traitement sur les altérations cognitives pouvant être induites par le diabète à l’aide du test de la piscine de Morris. Ce test durera 2 min et sera réalisé 3 fois de suite pendant 3 jours au cours de 3 sessions réparties au cours des 15 semaines de l’étude sur 64 animaux. Enfin, nous étudierons sur 40 animaux l’effet de notre traitement sur l’activation du tissu adipeux en réponse au froid. Pour cela, les animaux seront exposés au froid (4°C) pendant 24h.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de Myokine X et de Liraglutide. - Désordres intestinaux liés au Liraglutide. - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Hypoglycémie. - Hypothermie post test comportemental. - Hypothermie au cours de la mise au froid 4°C–8°C. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie liée au prélèvement sanguin. – Inflammation au point d’injection due aux injections répétées.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Le diabète est une pathologie complexe où de nombreux organes sont impliqués (pancréas, muscles, tissu adipeux…) et communiquent entre eux, ce qui ne peut être modélisé in vitro. De plus, l’impact de la Myokine X a déjà été évalué in vitro sur des ilots pancréatiques. Il est maintenant primordial d’évaluer ses effets dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostaie glucidique sont présents. Pour cela, le recours à une étude in vivo est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux qui sera utilisé par groupe est déterminé selon une étude récente qui a démontré que seulement 75% des rats ZDSD devenait diabétique. Ainsi, pour pallier à ce pourcentage d'obtention de rats diabétiques, à ces variations glycémiques et afin d'obtenir des données statistiquement analysables, nous utiliserons 15 rats par groupe. Par ailleurs, ce nombre est basé sur notre longue expérience obtenu au cours des nombreuses études métaboliques réalisées au laboratoire. Cette étude nécessitera donc 120 rats. De plus, la stratégie d’expérimentation est établie tenant en compte la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d’animaux et le stress que pourrait engendrer l’ensemble des procédures sur chaque animal, une attention particulière est portée sur le fait que tous les animaux ne seront pas utilisés pour l’ensemble des procédures. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque procédure a été défini d’après notre expérience dans le domaine du diabète ainsi que d’après la littérature.

Raffinement

Le raffinement a principalement lieu au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. Ainsi, les animaux développant un diabète après alimentation enrichie en gras seront traités par insulinothérapie. Un suivi quotidien sera réalisé afin de mesurer la glycémie afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Si les animaux présentent des signes de douleur, des antalgiques seront administrés en fonction du degré déterminé.

Choix des espèces

Le modèle de rat diabétique utilisé est celui qui mimique le mieux le syndrome métabolique, le diabète de type 2 et l'obésité trouvé chez l’Homme. Les autres modèles de rongeurs actuellement disponibles pour le diabète et le syndrome métabolique manquent de translationnalité à la condition humaine. Ainsi, nous utiliserons ce modèle de rat. L’utilisation en parallèle de rats sains servira de contrôle afin d’évaluer l’impact de notre molécule en situation non pathologique. Ceci nous permettra de comprendre les mécanismes d’action physiologique impliqué notamment dans la régulation de la glycémie de notre Myokine X, encore à élucider à ce jour. Nous utiliserons des rats âgés de 16 semaines au commencement du protocole (Arrivée dans notre animalerie à 14 semaines donc 2 semaines d’habituation). En effet, le DT2 apparaitra à partir de 16 semaines de vie chez les rats de ce modèle. Ainsi, comme le projet consiste à étudier l'effet curatif de notre Myokine X sur le DT2, il faut que les animaux aient au moins 16 semaine de vie avec un statut diabétique établi avant le commencement des traitements.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'anorexie mentale, elles subissent une chirurgie d'implantation d'une pompe sous la peau, un isolement de dix-neuf jours, des lavages vaginaux quotidiens pour les femelles et deux IRM de deux heures sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses. Le porteur indique que la chirurgie et les prélèvements peuvent provoquer de la douleur, prise en charge par analgésiques. Il affirme qu'un animal vivant est "nécessaire" pour étudier l'effet du traitement sur le poids et la prise alimentaire, en vue d'un essai clinique chez l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement pour la prise en charge de l’anorexie mentale (AM) sur la structure et les fonctions cérébrales chez la souris. L’AM est une maladie complexe et multifactorielle avec une auto-restriction de l’apport alimentaire et entrainant des troubles de la reproduction qui persistent même après rémission. La régulation de la fonction de reproduction repose sur la communication entre certains neurones de notre cerveau : les neurones qui sécrètent l’hormone gonadolibérine (neurones à GnRH), l’hypophyse et les gonades (ovaires et testicules). Toute perturbation des neurones à GnRH entraîne une perturbation importante de cette communication. Des études par imagerie par résonnance magnétique (IRM) ont montré une altération de la structure et du fonctionnement de certaines aires cérébrales dans l’AM. Nous avons développé un modèle de souris chez lequel nous bloquons génétiquement la sécrétion de GnRH de ces neurones. Ces souris mangent beaucoup moins que celles qui ont des neurones à GnRH fonctionnels, mais il en résulte des souris femelles plus grosses que des souris sauvages et des mâles plus maigres et plus petits que des souris contrôles. Ce modèle mime une partie des caractères physiopathologiques de l’AM. L’implantation sous la peau de petites pompes délivrant des taux physiologiques de GnRH de manière physiologique chez ces souris, permet de restaurer une prise alimentaire et un poids normal. Ces données laissent penser que les neurones GnRH pourraient être impliqués dans les maladies nutritionnelles comme l’AM ou l’obésité. Les objectifs de ce projet sont : - de caractériser notre modèle de souris sur le plan cérébral, tant anatomique que fonctionnel en se basant sur ce qui est connu sur le sujet dans l’AM. Cette caractérisation servira de référence pour l‘étude des effets du traitement ; - d’étudier l’impact du traitement à la GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau afin d’obtenir des arguments solides des effets positifs du traitement sur ces paramètres en vue d’un passage en essai clinique chez l’humain. Dans ce but, nous acquerrons en IRM à haute résolution des images anatomiques et fonctionnelles du cerveau de nos souris modèles avant et après traitement à la GnRH.

Bénéfices attendus

L’AM est une pathologie qui touche essentiellement des populations jeunes et représente la pathologie psychiatrique la plus mortelle. A ce jour, aucun traitement pharmacologique n’existe et le risque de rechute est de 41 %. La re-nutrition et la prise en charge psychologique échouent dans la grande majorité des cas. De plus, la prévalence de cette maladie ne cesse d’augmenter, notamment depuis le début de la crise sanitaire liée à la pandémie de Covid-19. Les professionnels de santé qui prennent en charge cette maladie sont démunis face au taux de rechute et à l’inefficacité à long terme de la renutrition. Les patients de leurs côtés ne disposent pas de prise en charge efficace et durable ce qui conduit au décès de 10% des patients. Une meilleure compréhension de l’effet du traitement au GnRH dans le modèle préclinique devrait permettre, à l’issue du projet, de démarrer un essai clinique de prise en charge chez l’humain. Notre but est de potentialiser l’effet de la prise en charge nutritionnelle et psychiatrique par un traitement mettant l’organisme dans de bonnes conditions métaboliques pour favoriser le retour à un état physiologique. Ce traitement porte un espoir de guérison pour ces patients sans solution thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie courte (10-15 minutes) sous anesthésie générale pour implanter la petite pompe sous la peau au niveau de leur dos. Après la chirurgie les animaux seront isolés pendant 19 jours, pour le suivi de la prise alimentaire. Les femelles auront un lavement vaginal d’une durée de moins de 30 secondes par souris et qui seront réalisés tous les matins de la période du traitement soit sur une durée de 19 jours. Pour les mâles, l’indication connue du bon fonctionnement du traitement est le retour d’un taux de présence normale de testostérone dans le sang. Avant et après le traitement, les animaux auront une petite prise de sang pour doser cette hormone dans le sang. Cela représente deux prélèvements d’une durée maximale de 30 secondes par souris. Pour les deux sexes, les souris auront deux sessions d’IRM, l’une avant, et l’autre après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, les souris sont anesthésiées.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation des pompes sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Ils seront réalisés par une personne formée et habituée à les réaliser. La prise de sang peut générer une douleur ponctuelle au moment de la piqûre. Elle sera réalisée par un expérimentateur formé. Les animaux seront suivis très scrupuleusement pluri-quotidiennement tout au long du protocole afin de repérer tout signe de douleur et d’y pallier par l’administration d’analgésiques dans les plus brefs délais. Enfin les animaux seront placés en hébergement individuel après la chirurgie afin de mesurer leur prise alimentaire.

Devenir

A l’issue des deux IRM toutes les souris du protocole seront euthanasiées afin de procéder aux analyses anatomiques et histologiques des organes après traitement

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la modulation de la structure et du fonctionnement du cerveau chez d’un modèle préclinique de souris pour un test d’efficacité du traitement juste avant le transfert chez l’humain. Cela nous limite dans la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des solutions alternatives qui ne soient pas des animaux vivants. De ce fait, nous avons besoin d’un animal vivant pour étudier l’effet du traitement sur les améliorations des paramètres pertinents comme le poids ou la prise alimentaire, ce que l’on ne pas reproduire autrement. Il faut aussi pouvoir détecter d’éventuels effets néfastes, déterminer les durées idéales du traitement, analyser ses effets positifs et comprendre les mécanismes d’action du traitement pour permettre son utilisation en clinique humaine.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et des fonctions cérébrales en réponse à l’administration du traitement à la GnRH. Nous avons déterminé le nombre maximal d’animaux en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Les analyses des IRM se feront pour chaque souris juste après le passage dans l’imageur sans attendre que toutes les souris aient été examinées. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi longitudinal. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet d’étudier de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés par le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulées par le même chercheur, qui s’en occupera quotidiennement et ne changera pas au cours du protocole. Cela permet aux souris de s’habituer à la présence et à l’odeur de l’expérimentateur et de limiter le stress des animaux lorsqu’ils commenceront le protocole. Les souris devront voyager entre leur animalerie d’élevage et l’animalerie du site où le projet se réalise. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie, puis isolés. Les animaux disposeront de matériel d’enrichissement (papier pour faire un nid, morceau de bois à ronger) et maisonnettes en plastique pour les animaux en groupe. Une fois isolés les animaux n’auront plus de maisonnette à disposition, la pompe en gênant l’accès. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Par la suite, du paracétamol sera délivré dans l’eau de boisson pour pallier aux douleurs liées à l’acte chirurgical, jusqu’à cicatrisation de la plaie. Les animaux seront suivis tous les jours pour repérer et prendre en charge immédiatement tout signe de douleur. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. L’euthanasie sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie.

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement de la GnRH a été mis au point chez la souris. Nous utilisons la même espèce pour permettre d’obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle de souris génétiquement modifiée qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de l’anorexie mentale, pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase préclinique. Les animaux utilisés sont de adultes de 4 à 8 mois parce que l’étude des effets de l’hormone GnRH nécessite d’utiliser des animaux adultes. Le vieillissement agit sur la fonction de reproduction et la régulation de la prise alimentaire, c’est pourquoi nous ne dépasserons pas l’âge de 8 mois. Nous avons déjà des données préliminaires chez des animaux dans cette tranche d’âge et la nécessité de pour pouvoir comparer les données impose de respecter cette limite d’âge.

102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux mâles reçoivent à deux jours de vie une injection de streptozotocine qui détruit une partie de leur pancréas, puis un régime gras et des prélèvements sanguins répétés, avant d'être tués pour prélever le foie, les mères et souriceaux femelles étant également tués. Le porteur teste un composé contre la stéatose hépatique dans un modèle qu'il indique avoir validé "avec le client". Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier l'efficacité réelle d'un composé sur cette maladie.

Objectifs

La stéatose est l’accumulation de graisses à l’intérieur de cellules qui, normalement, n’en contiennent pas ou peu. Le foie, qui comporte très peu de graisses lorsqu’il est sain, peut être le siège de cette concentration. On parle alors de stéatose hépatique. Ainsi, un foie qui contient trop de graisses (triglycérides) est un foie stéatosique. La stéatose hépatique est fréquemment associée à l’obésité mais certains sujets non obèses peuvent présenter cette pathologie. Au début, l’accumulation de triglycérides dans les cellules du foie est responsable d’une stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD - non alcoholic fatty liver disease). Dans cette forme simple, le foie est très riche en graisses et des mesures hygiéno-diététiques permettent la guérison. Le foie retrouve alors son aspect normal. Si la surcharge en triglycérides se poursuit, le foie devient le siège d’une inflammation appelée hépatite. C’est la stéato-hépatite non alcoolique (NASH - Non Alcoolic Steato Hepatitis). L’inflammation ne disparait pas, elle va au contraire s’aggraver avec le temps. Il est possible qu’elle évolue vers la fibrose hépatique. Après plusieurs années, elle peut devenir une cirrhose, avec un risque élevé de cancer hépatique. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun traitement médicamenteux approuvé et montrant une efficacité certaine pour la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD - Non Alcoholic Fatty Liver Disease) ou la stéatohépatite non alcoolique (NASH - Non Alcoolic Steato Hepatitis). Le présent projet vise à tester l'efficacité d'un composé en développement visant à traité la stéatose hépatique dans un cadre préclinique. L'objectif est donc d'obtenir une preuve de concept de l'efficacité avant de pousser plus en avant le développement du composé, notamment vers les stades cliniques.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la stéatose hépatique, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché. Ils constitueraient ainsi les tout premiers traitements autorisés pour la prise en charge de la stéatose hépatique.

Procédures

Les souris gestantes seront mise à mort après sevrage des souriceaux. Aucune autre intervention n'est prévue. Les souriceaux recevront une administration de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) à deux jours postnatal (durée de la procédure : 2 minutes envron). Après sevrage, les femelles seront euthanasiées. En effet, il est bien connu que les souris femelles présentent un niveau de résistance élevé au développement de la stéatose comparativement aux souris mâles. Les mâles seront soumis à une alimentation classique (8-10 animaux) ou une alimentation enrichie en graisse (HFD 60% de l'énergie apportée par les lipides; 24-30 animaux) pendant 64 jours (D0-D63). Des prélèvements sanguins seront pratiqués via la veine caudale à D28, D35 et D49 Ces prélèvements ont rapides (durée < 5 minutes). A D63 les mâles seront euthanasiés et un prélèvement sanguin terminal et des prélèvements d'organes seront pratiqués.

Impact sur les animaux

Le modèle employé est un modèle de stéatose hépatique. Le développement de la stéatose est limité dans ce modèle et ne pousse pas jusqu'à la fibrose et aux carcinomes hépatique. Le stade de stéatose (dit "NASH") ne s'accompagne pas d'effet secondaires ni d'effets néfaste. C'est d'ailleurs une des raisons qui expliquent qu'en clinique humaine la stéatose est très mal diagnostiquée avant le stade de développement de cancers du foie. Les administrations de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) et les pélèvements sanguins sont susceptibles d'induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des anayses biochimiques et histologiques sur les foies (y compris femelles reproductrices et souriceaux femelles) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’efficacité réelle d’un composé sur la stéatose hépatique. Nous avons choisi un modèle utilisant l'espèce souris qui est parfaitement caractérisé dans la littérature scientifique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la stéatose hépatique. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les femelles gestantes seront hébergées individuellement, et ce jusqu'au sevrage des souriceaux. Un enrichissement sera apporté sous forme d'igloo et de matériel de nidification. Après sevrage, les mâles issus des portées seront hébergés en cages collectives (4 souris/cage) et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout d'igloos et de briquettes de bois spécifiques pour rongeurs. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis, notamment l'emploi d'analgésie pour soulager la douleur le cas échéant.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6 est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques et de la stéatose hépatique. C'est également ce modèle qui est classiquement utilisé pour l'obtention du modèle STAM. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux mâles seront utilisés entre leur naissance et 12 semaines d'âge. Il est nécessaire de partir de souriceaux puisque le modèle STAM demande une administration de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) deux jours après la naissance. Ce modèle se développe ensuite grâce à la mise sous alimentation enrichie en graisse à partir du sevrage (ici à 4 semaines) et jusqu'à la fin de l'étude.