Troubles endocriniens

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun jusqu'à treize heures, des gavages, des prélèvements sanguins à la queue avec incision, des injections et une chirurgie de prélèvement en veine porte, et pour certaines seize semaines d'alimentation grasse et sucrée induisant obésité et pré-diabète. À la fin, toutes sont mises à mort par dislocation cervicale pour prélever leurs organes. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace l'animal pour cette "physiologie intégrée" entre intestin, pancréas et foie.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique, c'est-à-dire par un taux trop élevé de glucose dans le sang. Cette maladie, qui survient généralement avec l’âge, touche davantage les personnes obèses. Elle se caractérise par une insulino-résistance et une perte progressive des capacités de sécrétion d’insuline par les cellules béta pancréatiques, l’hormone qui régule la glycémie. A l’heure actuelle, les traitements utilisés ciblent soit l’action de l’insuline soit sa sécrétion, alors qu’un ciblage des 2 composantes serait plus efficace. Par conséquent, il est crucial d’identifier de nouveau mécanismes contrôlant simultanément l’action et la sécrétion d’insuline pour mieux réguler l’hyperglycémie des patients diabétiques. Le projet vise à valider un nouveau mécanisme intracellulaire impliqué dans la régulation de la glycémie qui implique un dialogue entre l’intestin, le pancréas et le foie via la sécrétion d’une hormone intestinale appelée GLP1, qui est produite par les cellules intestinales après un repas et qui va réguler l’action et la sécrétion d’insuline. Ainsi, l’objectif est de valider chez la souris ce nouveau mécanisme intracellulaire en l’étudiant de manière concomitante dans l’intestin, le pancréas et le foie afin de définir s’il pourrait constituer à l’avenir une nouvelle piste de traitement préventif et/ou curatif de l’hyperglycémie chez les patients diabétiques.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet de recherche est de valider une nouvelle hypothèse mécanistique impliquée dans le contrôle de la glycémie et de mettre en évidence de futurs moyens de prévention et/ou traitement du diabète de type 2. Si nos hypothèses sont validées chez la souris, nous initierons ensuite des tests chez l’homme et tenterons d’identifier des molécules capables de réguler ce mécanisme intracellulaire.

Procédures

Au cours des 4 procédures décrites dans ce projet, les souris seront soumises à : - des mises à jeun (1 à 3 selon les procédures) d’une durée de 6h30 à 13h maximum. - un gavage unique sur animal vigile (durée: 30 secondes) - des prélèvements sanguins de petits volumes (entre 2 et 6 selon les procédures) à la queue des souris pour les mesures de glycémie et d’insuline, associés à une incision unique de la queue puis un grattage du coagulum pour les prélèvements successifs. - des injections (1 à 2 selon les procédures) sur animal vigile lors des tests métaboliques (durée: 30 secondes). - une chirurgie associée à une analgésie 30 minutes avant l’anesthésie générale afin de réaliser un prélèvement sanguin en veine porte. - une alimentation riche en graisse et en sucre durant 16 semaines consécutives qui va induire une prise de poids des souris sans altérer leur mobilité.

Impact sur les animaux

- une prostration, la présence de sang dans la canule ou un gonflement de l’œsophage potentiel suite au gavage. - une sensation de faim et une hypoglycémie suite à la mise à jeun de 12-13h. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsable d’un stress chez l’animal et d’une baisse d’activité les conduisant à nicher dans leur nid. - une douleur transitoire au point d’injection lors des injections au cours des tests métaboliques. - Une hyperglycémie transitoire au cours des test métaboliques. Ces variations de glycémie sont des réponses physiologiques transitoires qui n’affectent pas l’état général des souris. L’hyperglycémie provoquée lors des tests revient à la normale au bout de 90 minutes. - une obésité liée à l’alimentation riche en lipides et en sucrose et un pré-diabète associé à une hyperglycémie modérée. Nos études préalables démontrent que leur prise de poids ne les empêche pas de se mouvoir dans la cage et d’accéder et la mangeoire et que leur pré-diabète ne modifie pas de manière majeure leur prise hydrique ni leur besoin d’uriner.

Devenir

A la fin des procédures, toutes les souris seront mises à mort par dislocation cervicale pour le prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Ce projet vient compléter des données déjà obtenues in vitro dans des lignées cellulaires de chacun des tissus d’intérêt (colon, foie et pancréas). Néanmoins il s’agit ici d’aller plus loin et de montrer qu’il y a une co-régulation de notre nouveau mécanisme intracellulaire dans ces 3 organes suite à un repas et que cela est nécessaire pour un contrôle optimal de la glycémie. Il s’agit donc d’un projet de physiologie intégrée où aucune alternative non animale n’est disponible. D’autre part, on veut également déterminer si ce nouveau mécanisme physiologique est dépendant ou pas du sexe, et ce paramètre n’est pas analysable autrement que sur animal.

Réduction

Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, nous allons comparer différents traitements en même temps afin de n’avoir qu’un groupe de souris contrôle. Le nombre de souris est calculé au plus juste tout en offrant la puissance statistique nécessaire pour l’interprétation des résultats scientifiques. Les paramètres mesurés étant très variables d’une souris à l’autre, un nombre minimal de 12 souris par groupe est nécessaire. Nous envisageons de potentiellement répéter une fois les procédures afin de compléter les études si nécessaires (soit 24 souris/groupe au maximum en final).

Raffinement

Les souris sont surveillées individuellement 3 fois/semaine et nous utilisons des points limites adaptés à nos procédures. Les gavages seront réalisés par une personne expérimentée à l’aide d’une sonde de gavage adaptée à la taille des souris. Pour les souris soumises à une alimentation riche en lipides et en sucrose, le nombre de souris par cage est diminué pour qu’elles aient suffisamment de place pour se mouvoir. L’alimentation hypercalorique va induire une prise de poids qui ne gêne pas la motricité des souris qui peuvent toujours accéder à la mangeoire. Néanmoins, des croquettes seront rajoutées dans la litière. Pour les prélèvements en veine porte qui nécessite une chirurgie, les animaux sont analgésiés 30 minutes avant d’être anesthésiées.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car leur physiologie est « proche » de l’homme pour le contrôle de la glycémie. Selon les procédures, nous utiliserons soit des souris adultes de 10-12 semaines qui ont terminé leur croissance et ont un poids compatible pour la contention, les gavages et prélèvements sanguins, soit des souris de 5 semaines quand il s’agit de les nourrir avec une alimentation riche en graisse et sucre, dont les effets métaboliques sont plus marqués si débutée rapidement après le sevrage.

80 rats Wistar âgés de 18 mois vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent chaque jour une solution bactérienne et subissent quinze prélèvements de sang sur animal vigile, une restriction alimentaire entraînant environ 10 % de perte de poids et une mise en cage individuelle. Le porteur teste un probiotique censé limiter la fonte musculaire, présenté comme un futur produit à destination des séniors. Il affirme qu'évaluer l'effet sur le muscle rend "nécessaire" le passage par l'animal.

Objectifs

Le projet vise à valider in vivo la capacité d'un probiotique (Limosilactobacillus muscosae seul ou en association avec L. casei) à limiter la fonte musculaire chez des rats dénutris, animaux modèles du syndrome de fragilité de l'Homme.

Bénéfices attendus

Le projet participera au développement d'un nouveau probiotique à destination des séniors favorisant la sensibilité à l'insuline et améliorant la régulation de la glycémie. Cet effet santé du probiotique permettra de limiter la fonte musculaire liée à l'âge (sarcopénie) et donc de limiter la dépendance des personnes âgées fragiles.

Procédures

Les animaux recevront une solution bactérienne quotidiennement et subiront des mesures de composition corporelle, de mesure de leur métabolisme protéique et l'analyse de leur sensibilité à l'insuline. ceci impliquera au total 15 prélèvements de sang sur animaux vigiles répartis sur la durée du projet de 1 mois.

Impact sur les animaux

Perte de poids (environ 10%) associée à une restriction alimentaire. Stress associé à une mise en cage individuelle.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, des prélèvements d'organes devant être effectués pour analyses.

Remplacement

Ce projet vise à valider cette propriété in vivo et à tester son efficacité sur la masse musculaire. L'action d'un probiotique est à la fois directe (sur les cellules intestinales) mais aussi indirecte (sur d'autres organes via des médiateurs). Pour tester l'effet de ce probiotique sur le métabolisme musculaire, il est donc nécessaire de passer par une expérimentation sur animaux modèles.

Réduction

Pour ce projet 80 animaux seront utilisés. Ils seront répartis en 5 groupes de 16 animaux. Le nombre d'animaux a été limité au nombre minimum nous permettant d'avoir des résultats significativement différents entre les groupes, ce nombre a été déterminé par test statistique et grâce à l'expérience du laboratoire sur l'utilisation de ce modèle animal.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un enrichissement de leur milieu de vie et seront observés quotidiennement, y compris le week-end et les jours fériés, par des animaliers expérimentés. En cas d’apparition d’un point limite l’animalier alertera les responsables de l’étude. Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous utiliserons l’arbre décisionnel afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des rats Wistar âgés de 18 mois. Notre laboratoire possède une forte expérience d'utilisation du rat âgé en tant que modèle de la sarcopénie humaine. Le rat est un animal de choix pour les études sur le vieillissement, son espérance de vie étant de 24 mois.

104 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés seuls pendant dix-sept jours, reçoivent des administrations orales quotidiennes puis un composé anti-obésité, et passent en cage à calorimétrie avant d'être tués pour prélever le foie et le tissu adipeux. Le porteur qualifie l'isolement d'"incontournable" au nom de la "nécessité" de mesurer individuellement les dépenses énergétiques, alors que le rat est un animal social. Les composés testés relèvent d'un développement commercial visant une éventuelle mise sur le marché.

Objectifs

Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de composés développés en tant que traitements anti-obésité sur le métabolisme énergétique chez le rat sauvage.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur les dépenses énergétiques, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux recevront des administrations quotidiennes de véhicule pendant 7 jours avant traitement pour les habituer à la procédure d'administration. Le traitement en lui-même est aigu et donc limité à une seule administration. Le poids corporel des animaux sera mesuré 7 fois au cours de l'étude. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d'un système de mesure par calorimétrie indirecte pendant 72h (24h d'habituation suivies de 48h de mesure).

Impact sur les animaux

L'hébergement individuel peut induire une nuisance chez les rats qui sont des animaux sociables, mais il s'avère incontournable de par la nécessité de mesurer les dépenses énergétiques, l'activité locomotrice et la prise alimentaire individuels lors du passage dans les cages métaboliques. Si les animaux n’étaient isolés que pendant les mesures en cages métaboliques, cet isolement soudain pourraient induire un stress sur les animaux et perturber la validité des mesures. C’est pourquoi nous préférons isoler les animaux dès réception, et les laisser s’habituer à cet état pendant ls 14 jours que précèdent la mesure en cages métaboliques. . Il est à noter que pour ces dernières, les méthodes d'enregistrement employées sont totalement non-invasives. Les traitements par voie orale et les mesures de poids corporel à l'état vigile peuvent être source de stress ou de nuisances. Enfin, à l'issue de l'étude, les rats seront mis à mort par administration d'Euthasol (Virbac).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes prélevés (tissus adipeux, foie) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur les dépenses énergétiques, le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant les 17 jours de l'étde du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de tubes en carton et de briquettes spécifiques pour rongeurs. Les expérimentateurs en charge de la manipulation des animaux et des administrations orales sont rodés à ce type de pratique. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Dans ce cadre, en cas de besoin, une analgésie sera mise en place par administration de buprénorphine.

Choix des espèces

Le modèle rat Sprague Dawley a été choisi afin de conserver le même modèle que celui employé dans des études précédentes réalisées par le client, notamment des études préalables de pharmacocinétiques. Les animaux seront utilisés à l'âge jeune adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'une alimentation riche en graisses, elles subissent des prélèvements sanguins et des injections intrapéritonéales destinées à provoquer une fibrose du foie, avant la mise à mort. Le porteur décrit une perte de poids et des lésions possibles au site d'injection, rougeur, infection ou nécrose. Il indique mener des travaux in vitro en parallèle, mais affirme l'expérimentation in vivo "nécessaire" pour reproduire les interactions entre organes.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour inactiver le gène CD44 dans toutes les cellules de l’organisme (CD44 Knock Out (KO) systémique), et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non-paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.

160 souris d'une lignée génétiquement modifiée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant huit semaines pour supprimer leur microbiote, toutes subissent des jeûnes de six heures, des prélèvements sanguins répétés à la queue et des gavages, avant mise à mort pour trier les cellules intestinales. Le porteur étudie l'effet des bactéries intestinales sur les hormones digestives, avec une application humaine dans l'obésité et les maladies inflammatoires présentée comme lointaine. Il indique que la déplétion du microbiote produit "a priori peu d'effets indésirables" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre bactéries et intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bacteries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des produits (hormones) qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines. Ces cellules jouent le rôle de senseurs, libérant les hormones en réponse à des modifications de leur environnement Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous éliminerons les bactéries intestinales par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment les cellules produisant les hormones intestinales sont impactées lors de la suppression du microbiote intestinal. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées. Compte tenu du rôle important de ces hormones, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux lorsque les fonctions de ces hormones sont altérées, dans le but à terme de prévenir et/ou guérir des maladies.

Procédures

La moitié des animaux recevra un mélange d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 8 semaines, conduisant à la déplétion de leur microbiote intestinal. Pour mesurer les niveaux des hormones et les activités des cellules produisant ces hormones, trois tests métaboliques seront réalisés, espacés de 15 jours, sur tous les animaux. Un test métabolique permet de mesurer l’effet d’un stimulus particulier sur l’animal, notamment au niveau intestinal en comparant l’animal avant et après ajout du stimulus. Chaque test comporte une phase de jeun (6h), trois prélèvements sanguins, un avant l’administration du stimulus, et deux après, à 5 et 15 minutes respectivement après l’administration pour un volume total de 150µLet un gavage par voie orale ou une injection en intrapéritonéal, permettant de mesure la libération des hormones en réponse au stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas une heure entre la première prise de sang et la dernière. Des mesures de transit intestinal par gavage (au maximum trois par animal, deux au cours de l’expérience (avec un suivi pendant 48h) et un au moment de la mise à mort (gavage une heure avant) seront également réalisées pour mesurer les fonctions intestinales, ainsi que des prélèvements de sang avant la mise à mort et la récupération des tissus intestinaux.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux, les antibiotiques étant introduits séquentiellement pour éviter tout rejet par néophobie. Les animaux seront conservés en groupe et manipulés régulièrement. Le gavage oral et la prise de sang à la queue seront réalisés par des personnes compétentes, avec des temps de manipulations réduits. Les prises de sang séquentielles se faisant de manière rapprochées, une seule incision à la queue est nécessaire pour réaliser le prélèvement. Les jeûnes seront limités dans le temps, induisant une perte de poids réduite qui est en général rattrapée les jours suivants. Les souris seront suivies pendant l’heure qui suit l’administration des stimuli puis pendant le reste de l’expérimentation pour s’assurer qu’aucun n’induit d’effets indésirables, aucun n’effet étant attendu sur le type de stimuli testés.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin. La lignée de souris utilisée permettra d’étudier spécifiquement les fonctions des cellules entéroendocrines, ce qui n’est pas possible dans un autre modèle. Les intestins récupérés dans ces expérimentations serviront à la production de culture de cellules intestinales (organoïdes intestinaux) qui seront utilisés dans des projets ensuite pour étudier (1) le développement de l’épithélium intestinal issu de souris déplétées en microbiote et (2) la réponse des cellules entéroendocrines à des produits spécifiques, notamment produits par les bactéries.

Réduction

160 animaux au total répartis en 20 lots seront utilisés dans ce projet, répartis en 10 procédures. Chaque procédure incluera un lot de 8 souris traitées par antibiotiques et un lot contrôle de 8 souris non traitées et sera effectuée sur des animaux de même sexe pour tester l’effet de trois stimuli et récupérer les tissus pour un usage spécifique. 5 procédures différentes permettront de tester au total 15 stimuli de cellules entéroendocrines (par exemple, glucose, mélange d’acides aminés et protéines, acides gras, produits microbiens..), ainsi que pour récupérer les tissus intestinaux des souris pour différents usages, un seul tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage lors du tri cellulaire (transcriptomique, peptidomique, génération d’organoides, histologie…). Les procédures seront reproduites sur les femelles et les mâles.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage. L’hydratation, notamment lors de l’introduction des antibiotiques, sera surveillée et si nécessaire, l’ajout d’antibiotiques sera modifié pour permettre une meilleure tolérance. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés (ainsi que leur ingéré alimentaire) 2 fois par semaine. Une grille de décision (points limites) est établie et permet d’agir de façon appropriée en cas d’apparition de signes de souffrance chez un animal, Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux, avec un maximum de 10µL/g et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements. Les souris seront au moins 2 par cage pour éviter l'isolement. Une grille de score de bien être permettra de suivre régulièrement chaque animal individuellement en prenant en compte son aspect général, son poids et son comportement. En cas de hausse modérée du score, un suivi plus attentionné sera réalisé avec l’ajout de nourriture plus facilement accessible. Dans le cas d’une forte dégradation du score les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. Les procédures seront appliquées sur les femelles et les mâles avec un lot de souris traitées aux antibiotiques et un lot contrôle. Les procédures seront reproduites 5 fois pour tester différents stimuli et pour différents usages des tissus, chaque tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées.