Troubles endocriniens

187 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit un diabète par streptozotocine, puis on implante par chirurgie cathéters, pompes et dispositifs de délivrance d'insuline, avec de nombreuses mesures de glycémie et prises de sang. Le porteur signale perte de poids, douleurs post-opératoires, risques d'infection et stress liés aux injections répétées. Le projet vise à valider la voie extrapéritonéale d'administration de l'insuline, et le porteur affirme que ces effets sur plusieurs organes ne peuvent être modélisés in vitro.

Objectifs

L’insuline sécrétée par les îlots de Langerhans du pancréas est la principale hormone permettant de réduire le taux de sucre dans le sang (appelée glycémie). Dans le cas du diabète de type 1 et dans certains stades avancés du diabète de type 2, sa sécrétion est trop faible pour obtenir une régulation correcte de la glycémie. De l’insuline est alors administrée aux patients pour palier à ce manque, par injection sous la peau (appelée voie sous-cutanée), ou dans certains cas directement dans l’abdomen (voie intrapéritonéale). Cependant, ces deux voies d’administration présentent des inconvénients notamment liés à diminution de l’efficacité de l’insuline, pour la sous-cutanée, et à des problèmes d’infection et d’adhésion tissulaire pour l’intrapéritonéal. La voie extra-péritonéale, correspondant à l’espace entre le péritoine (une fine membrane au qui recouvre les organes et qui comporte de nombreux vaisseaux sanguins) et les muscles abdominaux, semble être une alternative intéressante, en permettant un passage rapide de l’insuline dans le sang, tout en étant à distance des organes. Cependant, aucune étude n’a pour le moment été réalisée sur l’administration de l’insuline en continu en extra-péritonéal. Cette étude a donc pour objectif de montrer, chez le rat diabétique, les bénéfices d’une administration extra-péritonéale d’insuline par rapport aux voies sous-cutanée et intra-péritonéale.

Bénéfices attendus

Les seules données disponibles à ce jour sur la délivrance extrapéritonéale d’insuline concernent des injections uniques, afin d’évaluer une efficacité à court terme. Ce projet complèterait ces données en permettant d’évaluer les effets d’une adiministration chronique d’insuline en extrapéritonéale. Cela permettra ainsi d’étudier à la fois la régulation de la glycémie mais également d’autres marqeurs comme le niveau de stress oxydant ainsi que la réaction des tissus au site extrapéritonéal à un contact prolongé avec de l’insuline. Le principal bénéfice attendu est de démontrer que la voie extrapéritonéale peut constituer une réelle alternative aux voies sous-cutanée et intrapéritonéale, pour l’administration d’insuline aux patients diabétiques de type 1.

Procédures

[Gestes techniques réalisés : 1- Mesure de glycémie sur une goutte de sang (volume 6µL) sur animal vigile – Durée

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - perte de poids en lien avec l’état diabétique - des douleurs suite aux chirurgies réalisées pour la mise en place des cathéters, des pompes et du dispositif de délivrance d’insuline - risque d’infection suite aux implantations (pompe péristaltique, cathéter, dispositif de délivrance) - Un inconfort lié au positionnement de la pompe en sous-cutanée sur le dos de l’animal. - un stress en lien avec la répétition des injections d’insuline dans les cathéters ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi

Devenir

La justification du sort des animaux est commune aux 3 procédures. Les 3 procédures de ce projet nécessité l’utilisation d’animaux avec un niveau de diabète suffisament conséquents pour observer les effets d’insuline administrée selon différentes voies ou avec différents systèmes d’administration. Par conséquent les animaux avec une glycémie trop basse sont écartés de l’étude. Ayant reçu une injection de streptozotocine, qui agit sur différents organes en plus de détruites les cellules béta des îlots pancréatiques, ils ne peuvent être utilisés pour d’autres projets sans risque d’amener un biais expérimental. Ils sont donc mis à mort. Ensuite, la finalité de chacune des procédures est d’étudier l’impact sur les tissus d’une délivrance d’insuline répétée (procédure 1) ou continue via des cathéters (procédure 2) ou un dispositif de délivrance diffuse (procédure 3). Cela nécessite des prélèvements de différents tissus qui nécessitent la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les effets de l’administration chronique de l’insuline en extrapéritonéal mettant en jeu plusieurs tissus et organes, elle ne peut être modélisée in vitro. Ces deux paramètres sont évalués par des suivi de glycémie et des prises de sang qui ne sont pas réalisables in vitro.

Réduction

L’effectif des différents groupes prend en compte les sources de variabilité importantes de l’étude, telles que l’induction du diabète, les implantations de cathéter, pompes péristaltiques et de dispositifs de délivrance. Cela permettra d’avoir, selon l’expérience acquise par le laboratoire, suffisamment d’animaux pour réaliser des analyses statistiques sur les différents marqueurs étudiés (glycémie, poids, insulinémie). La plupart des groupes expérimentaux de ce projet combinent au moins deux des sources de variabilité cité plus haut, c’est pour cette raison que les effectifs ont été fixés à 12 animaux par groupe. Pour les animaux contrôles, sur lesquels aucune chirurgie n’est pratiquée, la variabilité est moins importante et l’effectif des groupes est réduit à 8 animaux. Le test statistique utilisé sera l’ANOVA pour des données ayant une distribution suivant une loi normale ou Kruskal-Wallis dans le cas contraire. Les groupes composés d’animaux diabétiques et non diabétiques sont répétés dans les deux phases du projet impliquant l’implantation de pompes péristaltiques. Cela obéit à une logique de rigueur scientifique, qui invite à ce que les cages hébergent des animaux des différents groupes, pour une meilleure représentativité des contrôles.

Raffinement

Le raffinement intervient au niveau Il intervient au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress. Pour l’ensemble des 3 procédures, où interviennent des chirurgies pour l’implantation des cathéters (procédure 1), de pompes péristaltiques (procédure 2 et 3) et de dispositif de délivrance (procédure 3) le raffinement intervient lors de l’anesthésie, réalisée au gaz pour un réveil plus rapide et de la prise en charge post-opératoire par l’administration d’un anti-inflammatoire et anti-douleur. Afin de réduire les risques d’infection, les chirurgies sont réalisées sous hotte à flux laminaire, avec l’utilisation d’un protocole de désinfection de la peau spécifique, ainsi que des champs opératoires stériles et une désinfection des instruments par chaleur humide. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. En accord avec cette grille d’évaluation, des points limites prédictifs ont été déterminés afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales en cours d’étude, tels qu’une persistance de l’état diabétique (perte de poids, hyperglycémie) malgré l’administration d’insuline, une infection post-opératoire non traitable.

Choix des espèces

Le choix du rat est d’abord justifié par de fortes similitudes avec l’Homme sur le plan métabolique, au niveau de la régulation de la glycémie. Ce choix est également motivé par la capacité des rats à bien supporter les chirurgies, et par la possibilité d’accéder à la même voie d’administration de l’insuline que chez l’Homme (sous-cutanée, intra-péritonéale, extra-péritonéale) Enfin, nous avons également choisi d’utiliser le rat pour les premières études précliniques, pour limiter autant que possible le nombre de gros animaux (porcs et primates) nécessaires pour les études suivantes. Les rats Wistar seront de jeunes adultes, âgés de 7 semaines, coïncidant avec un poids de 200g environ. C’est à ce poids que le protocole d’induction du diabète présente le meilleur taux de succès. En effet, avec des âges/poids inférieurs la mortalité est plus élevée, tandis qu’à des âges/poids supérieurs le taux de réussite diminue. De plus, à cet âge, le système immunitaire est suffisamment mature pour que les animaux puissent subir des chirurgies sans risques accrus d’infections.

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont hébergées seules et soumises à un régime gras et sucré pauvre en fibres pendant dix semaines, avec des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces sur près de deux ans, pour étudier l'effet d'une rupture de la symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement et la descendance. Le porteur surveille la perte de poids pour qu'elle ne dépasse pas 20 %, seuil au-delà duquel les souris seraient mises à mort. Les retombées annoncées pour l'humain restent renvoyées à une compréhension future, et il affirme que le recours à l'animal s'impose faute de pouvoir modéliser cette dynamique.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles (obésité, diabète, asthme, cancer, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à une mauvaise alimentation. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres dans la composition du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Cette altération de la symbiose microbiote-hôte est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Cette symbiose altérée est associée à différentes maladies chroniques et a été décrite chez l’animal et l’humain. Elle se caractérise souvent par une diminution de la richesse du microbiote et de ses fonctionnalités. L’objectif de notre projet est d’évaluer la possibilité d’une rupture de la symbiose microbiote-hôte par l’utilisation d’un régime dit « occidental », riche en gras, en sucre et appauvri en fibre, qui chez l’animal induit une perméabilité intestinale et une inflammation intestinale et globale. Au travers de ce projet, nous souhaitons évaluer l’impact de la rupture de symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement des animaux et sa transmission à la descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’homme et permettront d’indentifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée et en partie associées à une mauvaise alimentation. De nombreux travaux en lien avec un régime alimentaire déséquilibré témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal associée à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance d’un déséquilibre dans la symbiose microbiote-hôte conduit souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire déséquilibré et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et riche en gras et en sucre d'une durée de 10 semaines susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout au long de l'expérimentation excepté lors des périodes de reproduction et de sevrage. Les cages seront transparentes et sans couvercle filtrant afin de maintenir des contacts visuels, olfactifs et sonores entre congénères. Des prélèvements de sang (n=24) pendant 96 semaines seront effectués sur toute la durée de la procédure. Nous effecturons aussi des gavages (n=30) et prélèvements de fécès (n=150) tout au long de l’étude. La durée d'un prélèvement de sang est d'une trentaine de secondes de même que celle d'un gavage . Les fèces seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle en fonction des différentes périodes établies dans la procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition au régime. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé hebdomadairement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les contentions, les prises de sang et le gavage des animaux avec des solutions neutres pour leur santé pratiqués par un expérimentateur confirmé constitueront un stress modéré et limités dans le temps (quelques secondes).

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nous proposons d’étudier l’impact d’un régime nutritionnel de type occidental à la fois sur la longévité de l’animal et sa descendance. D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 168 animaux, pour le groupe expérimental et 124 animaux pour le groupe controle, sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les animaux hébergés individuellement auront des contacts visuels, olfactifs et sonores. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris C57Bl6. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une maladie rénale chronique leur est induite par un régime à l'adénine pendant quatre semaines, suivie de prélèvements sanguins répétés sur animal vigile et de tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour comparer des régimes carencés en acides aminés. Le porteur indique que le dosage final des toxines urémiques exige un millilitre de sang, soit la quasi-totalité du volume sanguin, ce qui justifie la mise à mort de toutes les souris. Il affirme qu'une étude in vivo est "nécessaire", un éventuel essai chez les patients restant conditionnel.

Objectifs

La maladie rénale chronique correspond à une perte irréversible du fonctionnement des reins. Elle touche 3 millions de personnes en France et est associée à une augmentation de la mortalité en partie liée à l’accumulation de déchets. Actuellement un régime pauvre en protéines est proposé aux patients afin de ralentir la progression de la maladie rénale chronique. Les mécanismes à l'origine de cette protection rénale par les régimes pauvres en protéines restent méconnus. Des études récentes ont démontré qu’une diminution sélective en certains acides aminés (les composants des protéines) pouvait préserver le fonctionnement des reins de façon similaire aux régimes en protéines. Par exemple la réduction sélective des acides aminés aromatiques (phénylalanine, tyrosine et tryptophane) chez la souris ayant une maladie rénale chronique était associée à une amélioration de la fonction rénale similaire à celle observée à la diminution de l'ensemble des protéines. Cependant, ce régime n’a pas été comparé à la réduction sélective d’autres familles d’acides aminés. Ainsi notre projet aura pour but de déterminer de façon formelle quelle(s) réduction(s) de quel(s) groupes d’acides aminés en particulier est responsable de la protection rénale. Nous cherchons à étudier, chez la souris ayant une maladie rénale chronique, l’effet de régimes alimentaires sélectivement carencés en certaines familles d’acides aminés sur la fonction rénale, l’accumulation des déchets, le microbiote intestinale et différents paramètres métaboliques : taux de sucre et de lipides dans le sang, état nutritionnel.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes et notamment quels réduction d'acides aminées en particuliers sous tendent l’effet « protecteur» des régimes pauvres en protéines proposés aux patients atteints de maladie rénale chronique afin de préserver leurs reins. Si les résultats sont positifs, ce projet pourra faire l’objet d’un essai thérapeutique (intervention nutritionnelle) chez les patients atteints de maladie rénale chronique.

Procédures

La maladie rénale chronique sera induite chez les souris de façon pharmaceutique en nourrissant les souris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire contenant 0,25% d’adénine. Au cours de la procédure les animaux auront plusieurs prélèvements réalisés en condition vigile grâce à une micro-incision longitudinale sur la veine de la queue. L'incision sera désinfectée par une solution iodée et le saignement sera arrêté par un coton hémostatique. Un premier prélèvement (15 μL) réalisé avant la mise en place de régimes spécifiques et réitéré 3 semaines après afin permettra d'effectuer un dosage de l'urée plasmatique. A 11 semaines, nous réaliserons un test de tolérance au glucose après 6 heures de jeûne. Le glucose sera injecté en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min (total 6 prélèvements). A 12 semaine, nous réaliserons un test de tolérance à l’insuline après 6 heures de jeûne. L’insuline sera injectée en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. Au cours de ces tests, une seule incision permettra de recueillir tous les prélèvements en grattant la croûte formée. A 13 semaine, les souris seront placées 2 par 2, pendant 24 h en cage à diurèse pour collecter l’urine. 48 h après les souris seront mises à mort: une ponction intra-cardiaque sera effectuée après anesthésie profonde, pour évaluer l’accumulation des déchets de la maladie rénale.

Impact sur les animaux

Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n’induit qu’un ralentissement de la croissance pondérales liée à une diminution de la prise alimentaire (sans doute lié au goût de l'aliment enrichi en adénine). S’il s’avère que les animaux perdent trop de poids pendant l’induction de la MRC, le régime Adénine pourra être discontinué pendant 2 jours afin de restaurer une croissance pondérale (5 jours de régime adénine – 2 jours de régime standard). Quoiqu’il en soit, les animaux reprennent rapidement du poids à l'issu du régime. L’utilisation de régimes pauvre en protéines ou de modification des apports en AAs ne sont pas responsables d'une perte d'appétit. Ils peuvent cependant induire une agressivité chez les animaux. Au cours des tests de GTT et ITT, les souris auront des prélèvements sanguins réalisés grâce à une incision à l'extrémité de la queue qui peut générer un stress. Préalablement à ces tests métaboliques les souris seront mises à jeun pendant 6 heures. La mise à mort à la fin de l'étude ou en cas d'atteinte d'un point limite sera effectuée sous anesthésie générale.

Devenir

Le dosage des toxines urémiques (les déchets de la maladie rénale) nécessite 200 microlitres de sérum soit 1 ml de sang. Chez une souris, ce volume correspond à une spoliation de la quasi totalité du volume sanguin et justifie donc la mise à mort de toutes les souris à la fin de l'étude soit 140 animaux.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans la production de déchets urémiques et le développement du syndrome urémique sont multifactoriels. La maladie rénale chronique et les déchets urémiques ont un effet délétère sur l’ensemble des tissus de l’organisme comme le rein, la régulation de la glycémie et les paramètres nutritionnels. Ces éléments ne sont pas modélisables sur un modèle cellulaire. Il est donc nécessaire de recourir à une étude in vivo pour étudier l’impact des différent régimes alimentaires sur l’ensemble de ces paramètres étant donné l’impact globale de la maladie rénale chronique. De plus nous voulons étudier en autre les modifications de la structure l’intestin et du rein qui nécessite des examens trop invasifs pour être réalisé chez l’homme. A ce stade de développement, il est impossible de supprimer un ou plusieurs acides aminés dans l’alimentation humaine. Ainsi toute expérimentation dans des modèles cellulaire ou chez l’homme est impossible à ce stade.

Réduction

Nous avons pris les dispositions nécessaires pour éviter le double emploi de notre procédure expérimentale. En effet, à notre connaissance, la question scientifique que nous posons ici n’a encore jamais été adressée. Il s’agit donc d’un projet totalement original et nous avons veillé, lors de l’élaboration de notre procédure, à éviter toute redondance dans les expérimentations. L'analyse statistique sera effectuée par ANOVA ou test non paramétrique de Kruskall-Wallis lorsque justifié. Ces tests seront complétés d'analyses post-hoc. Ainsi, le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Selon nos données précédente, le nombre de sujets par groupe est de 8. Il a donc été décidé de porter le nombre d’animaux à 10 par groupe afin de parer aux aléas expérimentaux : atteinte de points limites, décès liés à la maladie rénale, échec de l'induction de la maladie rénale par le régime. La procédure sera dans un premier temps réalisé que chez 70 souris mâles et nous renouvellerons l'experience dans les mêmes conditions chez des souris femelles pour évaluer l'impact du sexe sur ces régimes au cours de la maladie rénale chronique. Un total de 140 animaux est donc nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés 5 par cage (stabulation sociale) dans un environnement enrichi. Une surveillance appropriée permettra de repérer la survenue de points limites généraux: apathie, prostration, perte de poids, hypoglycémie profonde. La maladie rénale chronique sera induite chez nos souris par méthode pharmaceutique grâce à un régime en Adénine qui est bien toléré par les animaux. Il peut cependant être responsable d'un ralentissement de la prise pondérale à cause d'une diminution de la prise alimentaire (sans doute lié au goût de l'aliment enrichi en adénine). En cas de perte de poids trop importante, le régime sera suspendu pendant 48h ce qui permet habituellement un rapide rattrapage du poids normal. Au cours de l'étude, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront réalisés. Le volume d'injection de glucose et d'insuline a été adapté afin de limiter tout inconfort et la glycémie sera suivie toutes les 15 minutes. La survenue d'une hypoglycémie sévère sera suivie d'une injection de glucose et, en cas de peristance, constituera un point limite spécifique de ces tests. Les prélèvements sanguins réalisés au cours de l'étude seront effectués en condition vigile, grâce à une incision de moins de 1mm à l'extrémité de la queue. A la fin de l'étude, tous les individus seront mis à mort. La mise à mort des souris, indiquée par la fin de l'étude ou la survenue d'un point limite, sera réalisée sous anesthésie générale puis dyslocation cervicale.

Choix des espèces

Le présent protocole sera conduit sur des souris, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l'induction d'une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l'altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l'on peut observer chez l'homme (accumulation de toxines urémiques, hyperglycémie, modification du microbiote intestinale). Des souris âgées de 6 semaines ont été choisies correspondant à des jeunes adultes chez lesquels l'induction de la maladie rénale est bien tolérée (pas de signe de souffrance des animaux). Etant donnée que la fonction rénale s'altérè de façon physiologique avec l'âge des souris, nous choissisons des souris juvéniles afin de s'affranchir de ce biais.

40 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réutilisées d'un précédent projet, elles sont mises à jeun quelques heures puis placées de façon répétée en cage individuelle, pour les habituer à consommer des matrices alimentaires devant recevoir un actif régulant la glycémie. Le porteur indique que le jeûne et l'isolement répété peuvent générer un stress, et que ces souris sont mises à mort faute d'autre projet prévu. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer le choix et l'intégration de la nourriture par un être vivant.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’habituer des souris diabétiques à la consommation de différentes matrices alimentaires dans lesquelles il est envisagé d’incorporer un actif breveté et commercialisé, un dérivé de lait, permettant de réguler la glycémie en réduisant de manière significative la glycémie postprandiale (après un repas) pour les personnes en pré-diabète. Il faut cependant s’assurer au préalable que les souris consomment ces matrices alimentaires sans présence de l’actif, le plus rapidement possible, nécessitant une habituation à cette consommation d’un aliment différent de leur régime habituel pour lever la réticence et/ou le rejet à manger un aliment nouveau (néophobie alimentaire). Cette habituation sera effectuée en 2 phases successives : au cours de la 1ère phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées directement dans la cage des souris pendant plusieurs jours, en leur laissant accès à leur régime habituel et sans mise à jeun préalable, puis au cours de la 2ème phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées dans une cage d’isolement dans laquelle les souris seront mises individuellement après une période de mise à jeun préalable pour qu’elles s’habituent à consommer les matrices alimentaires qui leur seront proposées, le plus rapidement possible, pendant également plusieurs jours. Pour réaliser ce projet, nous réutiliserons des souris diabétiques issues d’un autre projet autorisé (validité toujours en cours) au cours duquel les souris auront été soumises à une procédure expérimentale de classe modérée, et après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 projets.

Bénéfices attendus

Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose dans le sang (hyperglycémie). Dans le cas du diabète de type 2 (90% des cas de diabète), ce phénomène provoqué par une perturbation du métabolisme glucidique apparaît progressivement et insidieusement. En France, en 2019, près de 4 millions de personnes étaient identifiées diabétiques par l'assurance maladie et prenaient un traitement médicamenteux pour leur diabète (soit 5,3% de la population). A cela, s’ajoutent les personnes diabétiques qui s’ignorent. Cette prévalence ne cesse d’augmenter en France, particulièrement chez les hommes, les jeunes (80 ans). Les personnes diabétiques doivent s’astreindre à un régime spécial, avec notamment un contrôle voire la limitation très stricte de la prise d’aliments sucrés, ce qui peut impacter leur moral. Elles vivent parfois des problèmes de santé mentale comme la dépression, l’anxiété et les troubles de l’alimentation, voire ce qui est maintenant appelé l’épuisement diabétique qui est une des complications psychologiques les plus graves de la maladie. Les personnes qui en sont atteintes ressentent une profonde impuissance et un désespoir intense. Les industriels des secteurs pharmaceutiques et agroalimentaires cherchent donc des molécules et ingrédients pouvant agir sur la limitation du passage dans le sang des sucres ingérés lors des repas. Cette étude préliminaire est donc la base d’un projet consistant à développer des aliments fonctionnels pouvant être consommés par toutes les personnes y compris et surtout les personnes diabétiques. Permettre en effet aux personnes diabétiques de consommer à nouveau yaourts, céréales, chocolat ou barres nutritionnelles lors d’activités physiques leur redonnerait un confort de vie plus important et limiterait la survenue de pathologies associées telles que celles décrites précédemment.

Procédures

Aucun prélèvement et aucune procédure chirurgicale ne sera réalisé sur les 40 souris diabétiques nécessaires à la réalisation de ce projet. Elles seront mises à jeun pendant quelques heures puis placées en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, ce qui pourra engendrer un stress. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des souris pendant quelques heures ainsi que le placement en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, pourra engendrer un stress pour les souris. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 40 souris diabétiques db/db nécessaires à la réalisation de ce projet, réutilisées d’un autre projet autorisé, seront mises à mort à l’issue des expérimentations, aucun autre projet n’étant envisagé sur ce lot de souris.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo mimant l’alimentation, c’est à dire le choix et l’intégration de la nourriture par un être vivant. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre de souris diabétiques minimum nécessaire et suffisant issues d’une expérimentation précédente, après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 études, afin d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base d’études précédentes réalisées chez le rat suivant le même protocole expérimental d’habituation qui sera suivi.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 2 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des modifications du comportement des animaux sont observées (cachexie, vocalises, convulsions…), celles-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des feuilles de papier absorbant seront placées dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être.

Choix des espèces

La souris diabétique est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser cette étude dans le cadre d’un projet visant à développer des aliments fonctionnels pour les personnes diabétiques. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur cette pathologie Les animaux seront des souris diabétiques âgées de 9 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur le diabète