Troubles endocriniens

1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vecteurs viraux ciblant le tissu adipeux, par injection intrapéritonéale ou par chirurgie, certaines étant rendues lipodystrophiques par le tamoxifène ou obèses par un régime gras, puis subissent échographies, mesures de glycémie et tests de tolérance mensuels. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque d'infection et que les prélèvements répétés à la queue causent une douleur légère. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" pour observer les réponses physiologiques intégrées, les cibles ayant été identifiées en culture cellulaire.

Objectifs

L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que des altérations de la fonction du tissu gras dit tissus adipeux jouent un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. En effet, chez l'obèse, le tissus adipeux a dépassé sa capacité de stocker du gras, et ce gras va aller se déposer dans différents organes comme le coeur et le foie. Le tissu gras est composé de cellules spécialisées appelées les adipocytes. Notre équipe cherche à décrire les mécanismes qui font qu'un adipocyte en bonne santé devient malade. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé des adipocytes. Afin de moduler l’expression de ces cibles dans le tissu adipeux (TA) nous collaborons avec une équipe américaine qui a développé des vecteurs viraux spécifiques du tissu adipeux.

Bénéfices attendus

Le premier but de ce projet est de tester si les vecteurs viraux spécifiques du TA sont des bons moyens pour exprimer des protéines d’intérêt dans le TA dans une visée thérapeutique. D'autre part, plusieurs travaux s'intéresse à des structures qui se trouve dans les adipocytes et qui participe à la comunication intra cellules. Ces structures sont des points de contact entre deux organelles cellulaires majeurs, les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Ces structures sont appellées les MAM. Nous émettons l'hypothése que ces structures sont noeuds de comunications importants qui contôlent l'état de santé des adipocytes. Ainsi, le deuxième but est de savoir si la modulation des MAM peut être une cible thérapeutique contre les dysfonction métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

La lipodystrophie partielle est induite par 5 jours d’injection intrapéritonéale d'un agent pharmaceutique, le tamoxiféne. Pour les souris HFD nous commençons à nourrir des C57bl6 avec un régime gras à l’âge de 8 semaines. Nous nourrissons les souris pendant 1 mois puis nous démarrons les interventions génétiques. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, 100 µl d’une solution d’AAV sera injectée en intrapéritonéal. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, l’injection se fait directement dans le dépôt par une chirurgie. Cette procédure a lieu1 fois pendant et dure 20 minutes Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.

Impact sur les animaux

Pour l'induction de la lipodystrophie partielle, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour les souris HDFD, le régime gras entraîne une prise de poids mais n’a pas d’effet néfaste sur le bien être des souris. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, la chirurgie comporte un risque du fait des infections possibles. Pour les test de tolérance, les prélèvements multiples à la queue entraine une douleur légère. L'administration du glucose par gavage oral qui entrainne un léger stress sur les souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir le rôle physiopathologique des acteurs étudiés.

Remplacement

Le but de notre projet est de valider l’importance de certains acteurs protéiques dans le maintien de la bonne santé du tissu adipeux et de la bonne santé métabolique de l’animal au niveau systémique. Ces cibles ont été identifiées in vitro et ce travail est parallèle à des études cellulaires complémentaires. Cependant, une validation in vivo est indispensable, notamment pour l’étude des conséquences de la modulation de l’état du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les cibles testées ici ont toutes étaient identifier par des expériences réalisées sur des lignées de cellules. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement tester dans des lignées cellulaires. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 1120 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests non paramétriques de Mann and whitney pour tester la valeur statistique de nos données.

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se feront avec des anesthésiques, des analgésiques et en condition de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Les 3 modèles murins utilisés sont bien maîtrisés au laboratoire et ont été largement étudiés. Notamment, ces modèles permettent d’étudier les conséquences de la dysfonction adipocytaires sur d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Pour les BSCL2K0, nous utiliserons des souris de 8 semaines, âge auquel elles sont déjà sévèrement lipodystrophiques. Pour les iATSKO, nous utiliserons des souris de 8 semaines lors de l’induction de la délétion par le tamoxifène en accord avec nos résultats précédents. Pour les souris HFD, des souris sauvages seront mises sous régime gras à l’âge de 8 semaines.

184 souris vont être utilisées, 120 tuées à l'issue et 64 réutilisées ou écartées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par un régime riche en graisses, elles subissent des gavages quotidiens pendant quatre semaines et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec coupure de la queue et injections, pour évaluer des bactéries et un métabolite comme futur complément alimentaire. Le porteur indique un stress lié à l'isolement en cage individuelle et aux contentions répétées, et fixe une perte de poids de 20 % comme point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de souches bactériennes commensales du groupe Streptococcus salivarius inactivées par la chaleur, et d’un métabolite dérivé de la sérine (sécrété par les bactéries et les plantes) dans un modèle murin de prédiabète (définit pas une glycémie à jeun > 1.26g/L) induit par un régime riche en graisse. L’objectif de notre projet est de déterminer les mécanismes par lesquels ces souches bactériennes naturellement présentes dans l’intestin et ce métabolite exercent cet effet anti-hyperglycémiant dans un modèle de souris pré-diabètique . Le prédiabète désigne une glycémie, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang, plus élevée que la normale. Il est réversible s’il est traité avant son évolution vers le diabète qui lui est un état irréversible. Pour ce faire, plusieurs souches bactériennes ainsi que ce métabolite dérivé de la sérine seront administrées à un modèle de souris rendues prédiabétiques via un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

L’objectif final de ces recherches est de déterminer si les bactéries commensales étudiées et le métabolite bactérien dérivé de la sérine permettent la réversion du prédiabète c’est à dire de réduire l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance induites par des régimes déséquilibrés. Si tel est le cas, ceux-ci pourraient servir de traitements pour prévenir le développement du diabète de type 2 chez l’homme. En effet, ce projet de maturation vise à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir des bactéries et/ou de ce métabolite.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention régulière nécessaire lors des gavages quotidiens (quelques secondes) sur une période de 4 semaines et au cours des tests de tolérance au glucose et de tolérance à l’insuline. Pour ces deux tests (réalisés deux fois sur chaque animaux) les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes) et à une piqûre (5 secondes) lors de l’injection de l’insuline en intrapéritonéal . Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure 2 avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure et à un stress au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des prélèvements et des injections quotidiens sur une période de 4 semaines D’après les résultats préliminaires du laboratoire, le gavage des souris avec ces différents composés tests, n’induit pas de perte de poids ni d’effets négatifs sur les souris. La prise de poids associée au régime riche en graisses et la période de jeune necessaire au test de tolérance oral au glucose (OGTT) et au test de tolérance à l'insuline (ITT) génèreront des stress faibles à modérés.

Devenir

En procédure 1 environ 64 souris non répondeuses au régime seront euthanasiées ou mutualisées et 120 souris seront utilisées pour la procédure 2. A la fin de la procédure 2 les 120 souris seront euthanasiées pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus endocrines (stimulation de la sécrétion d’insuline) et intestinaux (tissus producteurs d’incrétine) ainsi que des organes impliqués dans la régulation de cette homéostasie glucidique (foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que ce nombre est nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés deux fois par semaine (surveillance visuelle) au moment de la mesure du poids et le prise alimenaire mesurée (par pesée de l’aliment) une fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de trois jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie . Au moment du test de tolérance oral au glucose (OGTT) et du test de tolérance à l'insuline (ITT), les animaux seront placés dans la salle d’expérimentation (differente de celle d’élevage) 1h avant le test afin de limiter le stress dû à un environnement nouveau.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et ce travail fait suite à des travaux conduits depuis 2018 sur ce modèle. Nous avons choisi de travailler sur des animauxde 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour pendant dix jours un gavage ou une injection intrapéritonéale, subissent deux tests de tolérance au glucose, une coupure d'un à deux millimètres au bout de la queue et un prélèvement sanguin, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet vise à comprendre l'effet anti-hyperglycémiant de paraprobiotiques en vue d'un complément alimentaire pour l'homme. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "nécessaire", aucun modèle in vitro ne simulant selon lui les interactions entre organes qui règlent la glycémie.

Objectifs

Des résultats préliminaires ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de bactéries non pathogènes naturellement présentes dans l’intestin, inactivées par la chaleur (appelé paraprobiotiques) et d’un métabolite dérivé de la sérine (présent chez les bactéries et les plantes) dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse mais également dans un modèle de souris saine. Un des objectifs de notre projet est de déterminer le mécanisme biologique impliqué dans cet effet anti-hyperglycémiant. Ce projet a pour objectif final le développement d’un complément alimentaire pour prévenir le prédiabète et ainsi le développement du diabète. Pour ce faire, plusieurs paraprobiotiques ainsi que des métabolites dérivés de la sérine seront administrées par gavage ou injection intrapéritonéale à un modèle de souris saines afin d’élucider le mécanisme d’action et les tissus cibles mis en jeu.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de determiner le mécanisme mis en jeu par les bactéries sélectionnées ou le métabolite bactérien dérivé de la sérine pour obtenir cet effet anti-hyperglycémiant. La mise en evidence de ce mécanisme est incluse dans un projet de maturation qui vise, à terme, à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir de ces paraprobiotiques et/ou de ce métabolite. Ce complément alimentaire jouerait un rôle anti-hyperglycémiant au stade de pré-diabète et permettrait ainsi de prévenir le développement du diabète.

Procédures

Les animaux seront gavés ou recevront une injection en intra-péritonéale quotidiennement pour une durée totale de 10 jours (deux fois 5 jours). Les animaux seront soumis également à deux tests de tolérance au glucose (test de tolérance orale (gavage oro-gastrique du glucose, de quelques secondes) ou test de tolérance avec injection de glucose en intra-péritonéale (de quelques secondes). Pour ces tests de tolérance au glucose les souris subiront une petite coupure unique à l’extrémité de la queue de 1 à 2mm (1 seconde). Un prélèvement de sang sera effectué sur animaux vigiles, au niveau de la veine submandibulaire une seule fois avant de l’euthanasie (15 secondes). Les animaux seront mis à jeun des animaux avant les tests (6h) en période diurne.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur un temps très court (moins de 10 secondes) au cours de la contention nécessaire lors des gavages et à de l’injection en IP sur une période de 5 jours. Les gavages et l’IP seront réalisés par du personnel expérimenté. D’après les résultats préliminaires du laboratoire, ces gavages avec les différents composés n’induisent pas de perte de poids. Le poids des souris sera de plus contrôlé deux fois par semaine. Comme nous devrons mettre les souris à jeun avant les tests de tolérance orale au glucose, afin d’éviter une période de jeûne trop drastique, celui-ci ne sera pas réalisée durant la phase nocturne mais en phase diurne durant 6h.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de chaque procédure et certains de leurs organes et tissus seront prélevés pour des analyses, ncessaires au projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans la régulation de la gycémie d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus du système digestif (l’intestin) et des organes internes impliqués dans la régulation des taux de glucose dans le sang (pancréas, foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80%) compte-tenu de la variabilité connue du paramètre « glycémie » mesuré. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris contrôles et de souris traitées avec la metformine pour les deux expériences de la procédure 1 et le même groupe de souris contrôles pour les deux expériences de la procédure 2 afin de réduire le nombre d’animaux utilisés : au total 2 groupes de 12 souris contrôles et 2 groupes de12 souris traitées avec de la metformine sur les deux procédures = 48 souris au lieu de de 4 groupes de 12 souris contrôles et 4 groupes de souris 12 traitées avec de la metformine sur les deux procédures, soit 96 souris (nombre divisé par 2). Des études de biochimie sur des bactéries disponibles au laboratoire nous ont permis d’identifier des protéines de la surface des paroies bactériennes potentiellement intéressantes dans le contexte de la régulation de la glycémie (ces protéines ont des structures proches d’une autre protéine bactérienne connue pour ses effets améliorateurs de la glycémie). Ces protéines sont présentes sur huit souches d’intérêt (alors que nous disposons d’une collection de 40 souches donc cela nous a permis de réduire le nombre de paraprobiotiques à tester). Des points limites ont été définis pour chaque procédure.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d’un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés 2 fois par semaine (surveillance visuelle plus suivi du poids). Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limites entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie. Les souris seront 3 par cage pour éviter l'isolement et réduire le stress.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques en raison de ses réponses reproductibles due à une moins grande variabilité individuelle. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons choisi de travailler sur des animaux de 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.

12 rats vont être utilisés, tous tués sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un jeûne de 24 heures, chaque rat subit une chirurgie de pose de trois cathéters dans une veine, une artère et la veine mésentérique, puis reçoit du malate radiomarqué au carbone 14 pendant près de trois heures d'anesthésie avant la mise à mort, pour mesurer la production de sucre par l'intestin. Le porteur indique des risques d'hypoglycémie, de saignements, de détresse respiratoire et d'hypothermie. Il affirme que cette mesure n'est pas réalisable sur des cellules ou des organoïdes en culture et que seul le rat convient à la technique.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique qui est un facteur de risque majeur du développement de nombreuses complications. Dans ce contexte, la production intestinale de glucose (PIG) (qui correspond à la capacité qu’à l’intestin de produire du sucre (glucose) en dehors des périodes de repas), est une fonction qui exerce des effets anti-obésité et anti-diabète. De plus, les régimes riches en protéines et en fibres, sont responsables d’effets bénéfiques impliquant la PIG. De plus, les fibres alimentaires peuvent être digérées par l’intestin et les bactéries intestinales en différentes molécules, susceptibles d’activer la PIG. De ce fait, dans un projet précédent, nous avons émis l’hypothèse que d’autres molécules issues de la digestion des aliments pourraient induire la PIG. Les résultats issus de ce projet ont permis d’identifier le malate comme un activateur de la PIG (molécule qui active la production de glucose par l’intestin). En effet, l’apport de 5% de malate à une alimentation riche en gras et en sucres de souris contrôles pendant 4 semaines, limite la prise de poids alors que la prise alimentaire reste inchangée. De plus, nous observons également des effets bénéfiques protecteurs du malate sur la glycémie (taux de sucre dans le sang) et l’accumulation de graisses dans le foie (stéatose hépatique). De façon intéressante, l’ensemble de ces effets bénéfiques ont déjà été décrits lors d’une activation génétique de la PIG chez la souris. Enfin, alors que le niveau d’expression des protéines clés dans la production de glucose est augmentée, ces effets ne prennent pas place chez des souris où la PIG est non fonctionnelle. Montrant ainsi le rôle crucial de la PIG dans l’obtention des effets bénéfiques du malate. Néanmoins, ces travaux ne nous permettent pas de comprendre comment le malate active la PIG, et donc la production de glucose (sucre) par l’intestin. Ainsi, l’objectif de ce projet est donc de déterminer si le malate agit en tant que substrat de la PIG (s’il est directement transformé en glucose). Plus précisément, nous souhaitons déterminer si les carbones du malate sont intégrés dans le glucose produit par l’intestin. Grâce à ces résultats, le malate pourra alors être envisagé comme une nouvelle cible de traitement de l’obésité et ses complications.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet nous permettrons de compléter nos travaux sur les capacités de molécules à activer la PIG et ses effets bénéfiques. En effet, nos travaux issus d’un projet précédent ont permis de montrer que le malate exerce des effets bénéfiques sur l’obésité, le diabète (trop de sucre dans le sang) et la stéatose hépatique (trop de graisses dans le foie). De façon intéressante, ces effets bénéfiques ne prennent pas place chez des ayant une PIG non fonctionnelle. Néanmoins ces travaux n’ont pas permis de montrer précisément les mécanismes impliqués. Plus précisément, nous ne savons pas si le malate est directement transformé en glucose (sucre) par l’intestin. Ce projet, qui viendra finaliser notre projet précédent, nous permettra de comprendre les mécanismes mis en jeu dans l’activation de la PIG par le malate. Ainsi, grâce à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, l’activation de la PIG par le malate pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.

Procédures

Les rats seront soumis à une mise à jeun pendant 24h, puis recevront un traitement antidouleur adapté 30 minutes avant le début de la chirurgie. Ensuite ils seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) afin de mesurer l’incorporation du malate [qui a été modifié pour contenir du carbone 14 (C14), qui est une forme radioactive du carbone], dans le glucose (sucre produit par l’intestin). Lors de la privation de nourriture de 24h, les rats conserveront un accès à l’eau, leur enrichissement et l’hébergement en groupe. Les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, le foie, les reins et l’intestin vont produire du glucose et maintenir un taux de sucre dans le sang stable. La mise à jeun est effectuée à 9h du matin, soit 3h après la fin de la phase nocturne, qui est la phase pendant laquelle les animaux consomment 80% de leur ration quotidienne. La mesure de l’incorporation du malate radiomarqué (C14) dans le glucose produit par l’intestin de rats nécessite une chirurgie d’environ 45 min afin d’insérer 2 cathéters dans une veine (jugulaire) et une artère (carotide). Ensuite, le malate C14 est perfusé en veine pendant 90 minutes, puis un cathéter est introduit dans la veine mésentérique supérieure (point de convergence du sang provenant des différentes veines de l’intestin) afin de collecter simultanément du sang provenant de l’intestin et de la circulation sanguine générale. Au total, le temps d’anesthésie par rat est d’environ 2h45 à 3h. A la fin de la procédure, les rats sont mis à mort par injection intraveineuse d’une dose létale d’un euthanasiant chimique (sans réveil de l’animal).

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite une mise à jeun (privation de nourriture, mais pas de l’eau de boisson) des rats pendant 24h avant la chirurgie et la perfusion de malate radiomarqué (C14) pour la mesure de la production de sucre par l’intestin. Pendant cette phase de privation de nourriture, les rats peuvent avoir des épisodes d’hypoglycémie (taux de sucre trop bas), une modification de leur comportement (absence de déplacement dans la cage, absence de toilettage, grimaces). Néanmoins, les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, l’activation de la production de sucre par le foie, les reins et l’intestin, va permettre de maintenir un niveau de sucre dans le sang suffisant (glycémie). De plus, la participation de l’intestin et du rein au maintien de la glycémie augmente lorsque la privation alimentaire se prolonge. A l’issu de ces 24h de privation alimentaire, les animaux recevront un traitement anti-douleur adapté à la chirurgie et seront anesthésiés (anesthésie gazeuse). Lors de la pose des cathéters, il est possible de provoquer des saignements. De plus, l’anesthésie est susceptible de provoquer une détresse respiratoire ou une hypothermie. Des moyens seront mis en place afin de prévenir ces nuisances.

Devenir

Dans ce projet, la procédure comporte une chirurgie et une injection de traceurs radioactifs (malate C14). La chirurgie doit permettre l’implantation de 3 cathéters (en veine jugulaire, en artère carotide et en veine mésentérique supérieure). Il n’est pas possible, ni nécessaire de réveiller les rats ayant subi l’implantation de 3 cathéters et l’injection de composés radioactifs. D’autre part, à l’issu de la procédure (tout de suite après la mise à mort des rats), le contenu intestinal sera prélevé. Ces prélèvements nous permettrons de déterminer si une partie du glucose-C14 produit par l’intestin (qui est issu du malate-C14) a pu être libéré dans la lumière intestinale (et non dans la circulation sanguine).

Remplacement

La PIG exerce un contrôle sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. La mesure de l’incorporation des carbones radioactifs du malate (C14) dans le sucre (glucose) produit par l’intestin dépend de plusieurs paramètres, dont le déstockage du glucose, la production de glucose par le rein, et la consommation de glucose par l’ensemble des tissus de l’organisme. Ainsi, cette mesure nécessite de reproduire les conditions physiologiques d’un jeûne de 24h (nécessaire à l’activation de la PIG) et une circulation sanguine préservée. En effet, la mesure de la production de glucose à partir du malate nécessite des prélèvements de sang simultanés dans l’artère carotide et la veine porte. Cette mesure n’est donc pas réalisable avec des cellules ou des organoïdes d’intestin en culture (groupement de cellules en culture qui modélise un tissu et donc les interactions entre cellules).

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dont nous avons besoin, nous avons calculé le nombre de rats au plus juste à partir de notre connaissance de la technique utilisée, soit au maximum 12 rats. Néanmoins, pour limiter au maximum le nombre de rats nécessaires, l’étude sera menée avec une première cohorte de 6 rats, et en fonction des résultats obtenus, nous augmenteront l’effectif pour atteindre 12 rats au maximum. Ainsi, cette étude nécessitera au minimum 6, et au maximum 12 rats. D’autre part, le principe de réduction a été appliqué dès la conception de ce projet. En effet, nous avions choisi de réaliser ce projet en plusieurs étapes (les 2 premières faisant partie d’un projet précédent, actuellement terminé): - Etape 1 : Afin de déterminer si les molécules d’intérêt (dont le malate) exercent des effets bénéfiques chez des souris sauvages/contrôles, nous les avons ajoutés à l’alimentation des souris. - Etape 2 : Seulement pour les molécules ayant montré des effets bénéfiques chez les souris sauvages, nous avons cherché à déterminer si ces effets étaient médiés par la PIG. Pour cela, les métabolites ont été ajoutés à l’alimentation de souris chez lesquelles la PIG est non fonctionnelle . L’absence d’effets, traduisait alors de l’importance de la PIG dans ces effets bénéfiques. - Etape 3 : Lors des étapes 1 et 2, nous avons montré que le malate est capable d’induire des effets bénéfiques via la PIG. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre les mécanismes impliqués. Plus précisément, nous souhaitons déterminer si le malate est transformé en glucose par l’intestin. Grâce à cette stratégie, l’étude de molécules qui paraissaient intéressants au départ, mais qui n’ont pas induits d’effets bénéfiques lors de l’étape 1, a été abandonné et a donc limité le recours à l’animal lors des étapes 2 et/ou 3. D’autre part, à l’issu de la procédure (tout de suite après la mise à mort des rats), le contenu intestinal sera prélevé. Ces prélèvements nous permettrons de déterminer si une partie du glucose-C14 (radioactif) produit par l’intestin (issu du malate-C14) a pu être libéré dans la lumière intestinale (et non dans la circulation sanguine). Dans ce cas, nos travaux montreraient pour la première fois que la PIG est capable de fournir du sucre/glucose aux bactéries du microbiote intestinal. Enfin, il n’est malheureusement pas possible de constituer une banque de tissus radioactifs pour une utilisation ultérieure.

Raffinement

Les rats seront commandés à l’âge de 5 semaines et une phase d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début de la procédure. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisés et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les rats seront hébergés par groupe de 2, dans des cages adaptées et avec un enrichissement adapté dans la cage. Lors de la mise à jeun (pour 24h), les rats conserveront un accès à l’eau, leur enrichissement et l’hébergement en groupe. La surveillance des animaux et de leur comportement permettra de déceler toute souffrance de façon précoce. Néanmoins, les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, l’activation de la production de sucre par le foie, les reins et l’intestin, va permettre de maintenir un niveau de sucre dans le sang suffisant (glycémie). De plus, la participation de l’intestin et du rein au maintien de la glycémie augmente lorsque la privation alimentaire se prolonge. Concernant la mesure de la production de glucose à partir du malate C14, les animaux recevront une analgésie adaptée 30minutes avant la chirurgie. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Au cours de l’opération, nous surveillerons les paramètres cardio-respiratoires et la température de l’animal (maintenue stable par une couverture chauffante thermorégulée). Les chirurgies seront réalisées par des personnes qualifiées, et l‘intérieur des cathéters seront recouverts d’un anticoagulant pour éviter la formation d’un caillot sanguin. Les cathéters utilisés sont en matériaux biocompatibles et de diamètre adapté. A la fin de l’anesthésie ou en cas d’arrêt de la procédure pour souffrance (ils ne seront pas réveillés à l’issu de la procédure), les rats seront mis à mort par injection par injection d’une dose léthale d’un euthanasiant chimique.

Choix des espèces

Le rat, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de sa taille, il s’agit d’un animal où la chirurgie est facile et adaptée à la pose de cathéters. De plus, la mesure de l’incorporation du malate radioactif C14 dans le sucre produit par l’intestin est une technique qui n’est fiable que chez le rat. En effet, contrairement à la souris, le rat est peu sensible à la perturbation des flux de glucose qui peut intervenir lors du prélèvement de sang en simultané dans 2 cathéters. Sachant que la perturbation des flux de glucose est susceptible de moduler la fiabilité de la mesure. Les rats (mâles) seront commandés à l’âge de 5 semaines (environ 200-220g) et la procédure sera réalisée 2 semaines plus tard, soit à l’âge de 7 semaines (environ 300g). Les rats adultes sont sevrés et ont donc une alimentation indépendante, ce qui justifie leur utilisation comme modèle en nutrition humaine.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rendues obèses et insulino-résistantes par un régime gras de huit semaines, avec des prélèvements de sang hebdomadaires, la moitié subissant en plus la pose chirurgicale d’un cathéter dans la veine jugulaire, pour comparer l’effet d’une huile interestérifiée de l’industrie agroalimentaire sur le métabolisme du glucose. Le porteur situe la retombée du côté d’une meilleure compréhension de cet additif alimentaire. Il indique explorer des approches in vitro de type organe sur puce, tout en jugeant le modèle animal encore nécessaire.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l'effet d'un apport en graisse interestérifiée sur le métabolisme glucidique chez la souris. Les graisses interestérifiées. Les graisses interestérifiées sont issues de l'industrie agro-alimentaires et ont été développées par de nombreux fabricants d’aliments transformés pour trouver un substitut approprié lorsque des études scientifiques ont exposé les dangers inhérents aux acides gras trans pour la santé publique. Les industriels de l'agro-alimentaires devaient trouver une forme de graisse qui offrirait toujours la durée de conservation prolongée des huiles partiellement hydrogénées, mais qui ne contiendrait pas d’acides gras trans. Les graisses interestérifiées ont donc été développées. Il s'agit d'un produit entièrement hydrogéné avec bon nombre des mêmes caractéristiques que les graisses trans, mais chimiquement plus proche des graisses saturées. La graisse interestérifiée est produite par un processus appelé interestérification, qui réorganise la structure moléculaire des huiles végétales grasses. Des données chez l'animal et l'Homme montre cependant qu'un apport de graisse interestérifiée pourrait avoir un effet délétère sur l'homéostasie énergétique (prise de poids, intolérance au glucose voire insulino-résistance). Notre projet a pour but d'étudier l'effet des graisses interestérifiées sur l'homéostasie du glucose par rapport à un régime hyperlipidique n'en contenant pas chez des souris.

Bénéfices attendus

L'ensemble de cette étude permettra de mieux comprendre les effets d'une supplémentations en huile de palme interestérifié sur le métabolisme glucidique dans un modèle préclinique d'insulino-résistance.

Procédures

Quarante souris du lot 1 et quarante souris du lot 2 animaux seront soumises à un régime hyperlipidique pendant 8 semaines qui entraînera une prise de poids et la mise en place d'une insulino-résistance. De plus les animaux subiront des prélèvements sanguins une fois par semaine (10 microlitres) et 30 microlitres la semaine 7 pour le lot 1 un pendant le test de tolérance au glucose (qui dure 120 min, 3 prélévements de 10 microlitres aux temps 0, 15 et 120 min ). Pour le lot 2, un cathéter sera implanté dans la veine jugulaire à la semaine 7 (pour les 80 souris de ce lot 2) et 30 microlitres de sang seront également prélevés à la semaine 8 pendant le clamp hyperinsulinémique euglycémique (la durée du clamp est de 120 min, et les prélèvement s ont lieu aux temps 90, 100 et 120).

Impact sur les animaux

L'étude étant limitée à 8 semaines, nous n'attendons pas de nuisances ou d'effets indésirables. Hormis l'apparition d'une prise de poids et d'une insulino-résistance qui sont les effets attendus du régime hyperlipidique. Siur la base de notre expérience de trente ans d'utilisation des régimes obésogènes, il faut noter que la prise de poids attendue n'induit pas une obésité massive (environ 5 grammes pour une souris de 30 g). Il n'y aura pas donc d'effets délétères majeurs. En ce qui concerne la chirurgie, l’antalgie est assurée par du BUPRECARE (buprénorphine) en intra-péritonéale (1/100) que l'on administre en complément de l'isoflurane. Les outils sont désinfectées à l’alcool 70°, les animaux sont nettoyés à la vétadine afin de limiter le risque infectieux. En post opératoire, les souris reposent sur un tapis chauffant à 37°C, jusqu’au réveil. Pour poursuivre l’antalgie en post opératoire, dès la fin des sutures, du KETOPROFENE® (10%) est injecté en IP (0,15 à 0,3ml d’une dilution au 1/100 de KETOPROFENE® 10%) ainsi que le jour suivant l’opération si nécessaire. Le KETOPROFENE est un anti-inflammatoire, on l'administre après la chirurgie pour les douleurs post-opératoires. Le suivi post-chirurgical sera également effectué conformément aux bonnes pratiques. Le point limite est une perte de poids supérieure à 15% en suivi post-chirurgie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type "organ on chips" qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interestérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nos collègues brésiliens ont commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Ils ont aussi réalisé une étude in vivo pour trouver la bonne dose d'HPI à utiliser pendant les 8 semaines de l'expérience. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d’informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux donnees de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons sur des modèles de souris obèses depuis une 20aine d'années) nous avons estimé la taille des echantillons ( n=10 par groupe) permettant une analyse statistique efficace (test non paramétrique Mann-Whitney U). En effet les groupes de souris sont généralement très homogènes en terme de tolérance au glucose, des données physiologiques et biochimiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus avec leurs congénèes dans des milieux enrichis avec des morceaux de bois et des tubes en carton, ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 1 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance. En cas de perte de poids supérieure à 15 % l'animal sera euthanasié. Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, les prises de sang seront réduites au minimum pour permettre le dosage d'insuline par des kit Elisa ultrasensibles (nécessitant 5µl de plasma), et les tests eux-mêmes seront espacés d'une semaine. Pour la série desitnée à la réalisation des clamps euglyémqiues-hyperinsuliénmiques, l'implantation du cathèter sera réalisée dans des conditions strictes d'asseptie par du personnel hautement qualifié ayant l'habitude de ce type de chirurgie. Les animaux sont anesthésiés par inhalation à l’ISOFLURANE® en 2 temps : la phase d’endormissement pendant laquelle est délivré 3,5% d’ISOFLURANE® dans l’air à un débit de 2L/min puis la phase d’entretien de l’anesthésie avec de l’ISOFLURANE® à 1,5% d’air à un débit de 0,4L/min. L’ISOFLURANE® n’ayant pas de propriétés analgésiques, l’antalgie est assurée par du BUPRECARE (buprénorphine) en intra-péritonéale (1/100) que l'on administre en complément de l'isoflurane. Les outils sont désinfectées à l’alcool 70°, les animaux sont nettoyés à la vétadine afin de limiter le risque infectieux. Le cathéter est passé sous la peau et est externalisée au niveau interscapulaire. En post opératoire, les souris reposent sur un tapis chauffant à 37°C, jusqu’au réveil. Pour poursuivre l’antalgie en post opératoire, dès la fin des sutures, du KETOPROFENE® (10%) est injecté en IP (0,15 à 0,3ml d’une dilution au 1/100 de KETOPROFENE® 10%) ainsi que le jour suivant l’opération si nécessaire. Le KETOPROFENE est un anti-inflammatoire, on l'administre après la chirurgie pour les douleurs post-opératoires. Le suivi post-chirurgical sera également effectué conformément aux bonnes pratiques et le point limite est une perte de poids de 15%.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes, partagent avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique et de l’adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d’informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (30 jours) et seront nourris aux différents régimes pendant 8 semaines. La mise sous régime à un âge précoce permet d'avoir des résultats plus marquant qu'une mise sous régime qui se produirait à un âge plus avancé et mime l'apport excessif de calories pendant l'adolescence dans l'espèce humaine.