Troubles endocriniens

Nourries pendant douze semaines avec une alimentation dont 60 % des calories proviennent des graisses, 142 souris mâles sont rendues obèses avant même le début du protocole. Elles sont ensuite hébergées seules en cage, pesées soixante fois, traitées jusqu'à cent douze fois, saignées douze fois après des jeûnes de quatre à six heures, et soumises à des mesures de force d'agrippement. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance pour une espèce sociale et que l'obésité réduit leur capacité de mouvement, avant la mise à mort sous anesthésie et le prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le composé testé vise à contrer la fonte musculaire provoquée par le tirzépatide, et l'étude sur animaux est décrite comme une "étape règlementaire incontournable" pour déposer un dossier d'essai chez l'être humain.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Parmi ceux-ci, le Tirzépatide a obtenu récemment une autorisation de mise sur le marché. Le tirzépatide présente une efficacité impressionante, du niveau de celle de la chirurgie bariatrique, mais certaines inquiétudes émergent car la perte de poids résultatnte de son utilisation provient à la fois d'une perte de masse grasse mais également d'une perte de masse musculaire. Cette dernière s'avère problématique chez l'obèse qui est déjà un sujet à risque de de faiblesse musculaire. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisses. Le composé testé a pour intérêt majeur de cibler des voies de signalisation impliquées à la fois dans la régulation du poids corporel et dans la fonction musculaire. Des données préliminaires ont en effet permis de montrer que le composé testé était capable d'améliorer la fonction et la masse musculaire dans plusieurs pathologies musculaires et qu'il induisait une perte de poids chez des modèles obèses. Le composé testé sera ainsi testé en administration seule ou combinée avec le tirzépatide. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament seul sur le poids corporel du modèle d'obésité. Dans le cadre des administrations combinées avec le tirzépatide, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au tirzépatide seul, mais également d'étudier la capacité du composé testé à contrer les effets délétères du tirzépatide sur la fonction musculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, dont le tirzépatide qui est le plus efficace et le plus prescrit. Néanmoins, le tirzépatide présente un effet délétère sur la masse et la fonction musculaire lors d'administration chroniques. Le bénéfice attendu du présent projet est double car si les résultats sont concluants, le composé testé pourra venir compléter l'arsenal thérapeutique anti-obésité, en administration seule ou combinée avec le tirzépatide, et dans ce dernier cas, il pourrait en améliorer l'efficacité tout en contrant ses effets secondaires au niveau musculaire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (60 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des traitements (60 administrations pour 36 animaux et 112 administrations pour 106 animaux ; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (4 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (12 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Mesures de force d'agrippement (3 sessions de mesures de 5 minutes); 6) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel, les mesures de composition corporelle ainsi que les tests d'agrippement pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des traitements occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. La mise à jeun de 4h ou 6h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères. De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issus de l'étude.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans le tube de couleur rouge permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins via la veine de la queue seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages pharmacocinétiques ultérieurs et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Avant la mesure des dépenses énergétiques, les animaux seront également habitués à leur nouvel environnement durant 20h. Les animaux seront sous contrôle direct et permanent des expérimentateurs pendant les tests d'agrippement. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 21 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 12 semaines de régime enrichi en graisses chez le fournisseur.

Toutes tuées à l'issue pour des prélèvements d'organes, 30 souris rendues obèses et diabétiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit trente-sept pesées, six injections sous la peau et vingt-quatre piqûres au bout de la queue pour la mesure de sa glycémie. Le porteur teste trois formulations par animal, ce qui divise par trois l'effectif employé, et note que l'obésité réduit déjà la capacité de mouvement des souris. Il présente l'étude in vivo comme une "étape règlementaire incontournable" du dossier de demande d'essais chez l'humain, pour des formulations à libération prolongée d'un médicament déjà autorisé.

Objectifs

En 2021, 537 millions de personnes dans le monde étaient touchées par le diabète de type 2 tandis que 800 millions d’adultes souffraient d’obésité. Ces chiffres alarmants concernent deux “maladies du siècle” qui dépendent de plusieurs facteurs génétiques, environnementaux ou alimentaires. Cette prévalence inquiétante s'accompagne en outre d'une mortalité importante : on attribut directement à l'obésité et au diabète de type 2 associé environ 3,5 millions de décès par an au niveau mondial. Face ce contexte, les options thérapeutiques s'avèrent particulièrement pauvres. Récemment, une nouvelle génération de médicaments a été autorisée sur le marché afin de traiter à la fois l'obésité et le diabète de type 2. Néanmoins, bien que très efficaces, ces traitements s'administrent par injection et des recherches actives sont en cours afin de les améliorer afin de réduire la fréquence des injections. L’étude décrite dans le présent dossier vise à tester une forme à libération prolongée de ce médicament car il est connu que, dans ce cas, cela permet une réduction drastique des prises pour le patient (une administration par mois) améliorant ainsi largement son confort de vie. Par ailleurs, avec une diffusion plus lente du médicament, il est possible d’en améliorer l’efficacité. Au total, 9 formulations différentes à libération prolongée du médicament ont été développées et l'objectif du présent projet vise ainsi à démontrer que, sous ces nouvelles formes, le médicament X conserve ou améliore son efficacité malgré une fréquence d’administration réduite. .

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus sont positifs, les nouvelles formulations du médicament testées pourront entrer en phase d'étude clinique et être ensuite mise sur le marché en tant que traitements anti-obésité et antidiabétiques et dont la posologie serait bien moins contraignante pour les patients traités. Par ailleurs, un meilleur contrôle de la disponibilité du médicament dans le corps du fait de la libération prolongée pourrait également en améliorer son efficacité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (37 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Injection des traitements (6 administration; durée : 1 minute); 3) Prélèvements d'une goutte de sang pour mesure de la glycémie (24 prélèvements; durée du prélèvement : 1 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et les injections des traitements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les injections des traitements et les prélèvement d'une goutte de sang à la pointe de la queue occasioneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la glycémie dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 6 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du faible nombre de traitements (1 par formulation testée) et du caractère faiblement invasif des procédure employées, nous avons choisi de tester 3 formulations par animal, en laissant entre chaque administration une pèriode de repos suffisante (minimum deux semaines). Cette précaution nous permet de réduire par 3 le nombre d'animaux employés pour atteindre les objectifs du projet.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront injectés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages de glycémie (un seule goutte de sang prélèvée en bout de queue). Une pèriode de repos d'au minimum 2 semaines sera appliquée entre deux séries de traitements afin de laisser les animaux récupérer. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris obèses nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

60 souris rendues obèses par onze semaines d'un régime dont 60 % des calories viennent des graisses vont recevoir soixante-quatorze injections quotidiennes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent quinze pesées, deux mesures de composition corporelle et une session de soixante-douze heures en cage individuelle pour mesurer leurs dépenses énergétiques, isolement que le porteur reconnaît comme une nuisance pour une espèce sociale. Toutes sont tuées pour des prélèvements d'organes. Le projet teste le candidat médicament d'un client à un stade précoce de développement, et le porteur rappelle que plusieurs molécules anti-obésité autorisées ces vingt dernières années ont été retirées du marché pour effets secondaires graves.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus d'1 milliard de personnes en 2022, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un véritable fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (15 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Injection quotidienne de traitements ou du composé de référence ou véhicule (74 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Mesure de dépenses énergétiques (1 session de mesures de 72h)

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les injections de traitement ou véhicule seront source de douleurs légères de courte durée et de stress. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude pour prélèvements d'organes nécessaires à des dosages biochimiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris soumis à une alimentation enrichie en graisses. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par un test statistique adapté.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte âgés de 17 semaines (souris obèses) et de 18 semaines (souris non obèses). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de préconditionnement de 11 semaines de régime enrichi en graisse réalisée chez notre fournisseur.

Pour savoir dans quels organes s'accumule un candidat médicament contre le diabète de type 2, quatre macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois reçoivent le produit par injection lente dans une veine de la jambe, isolée de la circulation générale par un garrot, sous anesthésie et pendant une heure environ. Ils subissent ensuite seize prises de sang sur dix-sept semaines et quatre biopsies sur chaque quadriceps, avec des œdèmes, des hématomes et une boiterie aiguë parmi les effets attendus, puis sont mis à mort cent treize jours après l'injection pour que leurs organes soient prélevés. Le quatrième, dit "pilote", sert uniquement à roder la technique d'injection et reste en vie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de comprendre comment un nouveau candidat médicament contre le diabète de type 2 agit dans le corps : comment il circule, combien de temps il reste actif, quels effets il produit et dans quels organes il s’accumule. Le candidat médicament testé bloque sélectivement avec certains gènes impliqués dans la résistance à l’insuline, mécanisme central du diabète de type 2. Contrairement aux traitements qui contrôlent principalement la glycémie, ce candidat médicament vise donc à corriger la cause physiopathologique sous-jacente de la maladie. L’hypothèse est qu’une administration unique de ce médicament permettra d’induire une amélioration durable de la sensibilité à l’insuline des patients et, par conséquent, un meilleur contrôle métabolique. Cette étude préliminaire sur primate est nécessaire pour déterminer les caractérisitiques principales du produit une fois administré dans un organisme entier, avant de futurs études précliniques et cliniques. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de ce candidat médicament. L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, les dosages utilisés dans ce projet sont efficaces mais a priori non toxiques (d’après des études toxicologiques préliminaires).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont à terme la validation et la mise sur le marché d’un traitement innovant pour le diabète de type 2, qui pourrait être administré en une seule injection et offrir des effets durables. Ce médicament pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients en réduisant les contraintes liées aux traitements chroniques.

Procédures

Après plus un mois d’acclimatation et d’habituation, 3 animaux recevront une seule fois le candidat médicament par injection intra-veineuse sur membre isolé (injection lente du produit dans une veine sur une jambe coupée de la circulation sanguine générale à l’aide d’un garrot). L’intervention durera environ une heure et sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun de moins de 16h). Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration du candidat médicament sur animal vigile afin d'étudier sa concentration dans le sang au cours du temps et de mesurer certains paramètres physiologiques des animaux (16 prélèvements sanguins seront réalisés sur une période de 17 semaines). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. 4 biopsies de muscles seront réalisées sur chaque quadriceps (à minimum un mois d’intervalle). L’intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie (après mis à jeun) durera environ 30 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée sera réalisée chaque semaine. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x le jour de l’administration, et 1x/jour 3 jours après administration. Le projet prendra fin 113 jours après administration de du candidat médicament et les 3 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes. Un 4eme animal sera utilisé uniquement pour la mise au point technique et au raffinement de la procédure d’administration de du candidat médicament (l’animal ne subira aucun prélèvement ou autre manipulation au cours du projet). Cet individu recevra une injection de solution physiologique inerte et ne sera pas exposé au du candidat médicament. L’animal bénéficiera d’une période d’acclimatation et d’un suivi clinique rapproché au même titre que les 3 animaux du projet principal. Il sera gardé en vie à l’issue du projet.

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux. L’administration du candidat médicament (sous anesthésie et analgésie) peut provoquer une douleur légère, un œdème aigue (durant environ 24h maximum), des hématomes et une boiterie aigue (se résorbant en quelques heures). Les biopsies de muscles sous anesthésie et analgésie pourront provoquer des douleurs légères ainsi que des réactions locales au niveau du site de ponction ou une infection post-opératoire. L'anesthésie des animaux dans le cadre de ces interventions (biopsies et administration) pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

Les 3 animaux qui recevront une injection du candidat médicament seront mis à mort afin de récolter leurs organes pour déterminer dans quels tissus le produit s’accumule. Seul l’animal « pilote » n’ayant pas reçu le candidat médicament sera gardé en vie.

Remplacement

Les études pharmacocinétique, pharmacodynamie et de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer combien de temps un médicament reste actif, son efficacité et sa localisation dans les tissus. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, les paramètres étudiés dans ce projet dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 4 animaux seront utilisés, 3 pour le projet principal qui subiront l’ensemble des manipulations et 1 animal « pilote » utilisé uniquement pour la mise au point technique du modèle d’administration du médicament. Concernant les 3 premiers animaux : Chaque animal recevra une dose différente du candidat thérapeutique (faible, intermédiaire, élevée). Cette approche permet de tester l’ensemble des doses potentiellement efficaces chez l'Homme, sans multiplier les groupes. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, elle ne nécessite pas d’utiliser de grands groupes d’animaux pour réaliser des tests statistiques. En amont de l’utilisation de ces 3 animaux, un 4eme animal sera utilisé uniquement pour la mise au point technique de la procédure d’administration du médicament. L’ajout de cet animal « pilote » permet de sécuriser et d’optimiser la procédure avant l’administration du candidat thérapeutique, évitant ainsi toute perte ou souffrance inutile. En fonction des résultats obtenus à partir de cet animal, l’administration du médicament pourra donc être adaptée pour raffiner la procédure.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant un mois avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les biopsies et l’administration du candidat médicament seront réalisées sous anesthésie et analgésie et un traitement analgésique post-opératoire sera mis en place. L’animal « pilote » bénéficiera d’un programme d’enrichissement, d’une période d’acclimatation et d’un suivi clinique rapproché au même titre que les 3 animaux du projet principal. En fonction des résultats obtenus à partir de cet animal, l’administration du candidat médicament pourra être optimisée afin de raffiner la procédure. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les primates sont utilisés comme modèle de recherche avant de tester certains traitements chez l’Homme. Leur système immunitaire réagit de façon très semblable au nôtre, ce qui permet de prévoir d’éventuelles défenses du corps contre le traitement. Leur grande proximité génétique et physiologique avec l’Homme les rend aussi très utiles pour étudier combien de temps le traitement reste actif, comment il agit et dans quels organes il se diffuse. Ainsi, son emploi est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. À ce stade de développement, les animaux présentent un système immunitaire pleinement fonctionnel, comparable à celui d’un patient adulte, ce qui est indispensable pour évaluer la réponse du corps vis-à-vis du candidat médicament testé. Leur organisme a atteint la maturité physiologique et métabolique, mais ne subit pas encore de variations néfastes liées au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes permet de réduire les facteurs associés à des pathologies liées à l’âge qui pourraient interférer dans l’analyse des résultats et la qualité des échantillons prélevés. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Les souris dont l'état moribond persiste malgré les soins sont tuées pour abréger leur agonie, seuil que le porteur inscrit noir sur blanc dans ses points limites. 972 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent d'abord deux à quatre semaines d'un régime alimentaire qui déclenche une fibrose du foie, atteinte dont le porteur chiffre lui-même la durée à une à six semaines, puis certaines reçoivent une pompe implantée par chirurgie et passent 24 heures seules sur une grille pour qu'on recueille leurs urines. L'objectif est un test urinaire de diagnostic de la fibrose hépatique, dont le bénéfice pour les malades est renvoyé au long terme, quand la maladie induite chez les souris, elle, est immédiate.

Objectifs

La fibrose du foie est un problème de santé publique en France et dans le monde car elle concerne un grand nombre de malades. Elle est la conséquence de toutes les maladies chroniques du foie et aboutit inéluctablement à la cirrhose en l’absence de traitement, voire au cancer du foie. Cette maladie implique directement des composants biologiques appelés les métalloprotéases matricielles (MMP) qui sont produites par presque toutes les cellules du foie. Les MMP jouent ainsi un rôle dans l’initiation, la progression et la résolution de la fibrose du foie. L’expression et l’activation de ces MMP varient en fonction du stade pathologique, ce qui en fait des marqueurs biologiques potentiellement pertinents pour le diagnostic précis de la fibrose du foie et le suivi de sa régression potentielle ou de sa progression vers des formes sévères. De plus, certains inhibiteurs de MMP pourraient permettre de guérir certaines formes de fibrose du foie. Ainsi, ce projet a pour objectif de développer et valider de nouveaux outils de diagnostic de la fibrose hépatique qui permettent de détecter l’activité des MMP de manière non-invasive dans des échantillons urinaires. Ce projet a aussi pour but de tester in vivo l’effet de certains inhibiteurs de MMP sur l’évolution de la maladie.

Bénéfices attendus

Les études réalisées dans ce projet vont permettre de valider de nouveaux outils pour le diagnostic plus précis de la fibrose du foie, de son évolution et de la réponse des malades aux traitements. C’est donc la prise en charge même des malades qui devrait bénéficier de ces travaux à terme. De plus, le projet devrait conduire à l’identification de composés aux effets thérapeutiques. A terme, c’est donc le pronostic des malades qui pourrait bénéficier de ce projet.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à un régime alimentaire particulier pendant 2 à 4 semaines qui permet le développement de la fibrose du foie. Certains animaux recevront une seule dose du composé de diagnostic étudié (1 min), tandis que d’autres animaux auront une seule intervention chirurgicale courte de 5-10 minutes pour placer une pompe permettant de diffuser en continu un inhibiteur de MMP testé comme traitement de la maladie. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus lors de l’étude sont une souffrance occasionnée par le développement de la fibrose du foie (qui s’étendra sur 1 à 6 semaines), une éventuelle douleur et/ou une potentielle légère infection au niveau du point d’administration du composé de diagnostic étudié (qui durera quelques minutes à quelques heures), un stress dû aux manipulations des animaux pendant les procédures expérimentales (qui ne durera que de brèves minutes) et un stress lié à l’hébergement individuel sur une grille pendant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines.

Devenir

L’étude de nouveaux composés pour le diagnostic et le traitement de la fibrose du foie nécessite de connaitre exactement le stade de développement de la fibrose au moment du diagnostic et/ou du traitement. Pour cela, il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin de récupérer leur foie et de procéder à son analyse.

Remplacement

Etudier les propriétés de diagnostic et de traitement des composés nécessite le recours à des organismes entiers, pour suivre les effets locaux et systémiques. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les composants biologiques qui entrent en jeu dans la fibrose du foie.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux : - les doses des composés qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum (deux doses par composé); - chaque procédure expérimentale sera réalisée sur le plus petit nombre d’animaux par groupe déterminé via l’utilisation d’une application calculant les tailles d'échantillons minimales nécessaires pour qu’elles soient valables sur le plan statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi comprenant des maisons et des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoir en papier pour leur nid, et des bâtonnets en bois à ronger. Les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue tout au long du déroulement des expériences. Afin de détecter et de limiter la souffrance et/ou la détresse des animaux, une surveillance de leur état général et leur comportement sera réalisée grâce à une grille de suivi utilisant un ensemble d’indicateurs suffisamment prédictifs et spécifiques au projet. Si un état moribond persiste malgré l’application de soins appropriés, les animaux concernées seront mis à mort pour arrêter leurs souffrances au plus vite. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs à l’administration unique de l’outil de diagnostic, un collyre sera appliqué localement sur le site d’injection et l’injection sera réalisée dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par la chirurgie permettant de placer une pompe qui diffuse en continue le traitement, une analgésie locale sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse. Pendant toute la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis au chaud à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Enfin, pour réduire ou supprimer le stress lié à l’hébergement individuel sur grille durant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines, les animaux maintiendront un contact visuel, olfactif et auditif car les cages sont transparentes, semi-ouvertes et localisées sur le même portoir dans la même pièce. De plus, des bâtonnets à ronger et des jeux suspendus seront ajoutés dans ces cages.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour l’étude des maladies du foie. Il s’agit d’un mammifère dans lequel le modèle de fibrose de foie utilisé dans cette étude est bien validé. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte entre 8 et 14 semaines car la pathologie étudiée se développe essentiellement chez les adultes. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des modifications des fonctions du foie dues à l'âge qui pourraient interférer avec nos résultats.

Rendues obèses par quatorze semaines de régime enrichi en graisses chez leur fournisseur, 116 souris arrivent déjà malades dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent 91 administrations de sémaglutide et 14 du candidat médicament, subissent 25 pesées, deux prélèvements sanguins après quatre heures de jeûne, des mesures de force d'agrippement et deux séances de course forcée sur tapis roulant où quelques chocs électriques de faible intensité les relancent. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et la performance musculaire. Il ajoute que l'étude in vivo reste une "étape règlementaire incontournable" pour constituer le dossier de demande de premiers essais chez l'humain.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Parmi ceux-ci, la sémaglutide a obtenu récemment une autorisation de mise sur le marché. La Sémaglutide présente une excellente efficacité mais certaines inquiétudes émergent car la perte de poids résultante de son utilisation provient à la fois d'une perte de masse grasse mais également d'une perte de masse musculaire. Cette dernière s'avère problématique chez l'obèse qui est déjà un sujet à risque de faiblesse musculaire. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Le composé testé a pour intérêt majeur de cibler des voies de signalisation impliquées à la fois dans la régulation du poids corporel et dans la fonction musculaire. Des données préliminaires ont en effet permis de montrer que le composé testé était capable d'améliorer la fonction et la masse musculaire dans plusieurs pathologies musculaires et qu'il induisait une perte de poids chez des modèles obèses. Le composé testé sera ainsi testé en administration seule ou combinée avec la sémaglutide. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament seul sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité. Dans le cadre des administrations combinées avec le sémaglutide, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au sémaglutide seul, mais également de contrer les effets délétèrres de la sémaglutide sur la fonction musculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, dont la sémaglutide qui est la plus efficace et la plus prescrite. Néanmoins, la sémaglutide présente un effet délétère sur la masse et la fonction musculaire lors d'administration chroniques. Le bénéfice attendu du présent projet est double car si les résultats sont concluants, le composé testé pourra venir compléter l'arsenal thérapeutique anti-obésité, en administration seule ou combinée avec la sémaglutide, et dans ce dernier cas, il pourrait en améliorer l'efficacité tout en contrant ses effets secondaires au niveau musculaire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (25 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament (14 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de sémaglutide (91 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (7 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (2 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de force d'agrippement (2 sessions de mesures de 5 minutes); 7) Mesures de performance sur tapis roulant (2 mesures, durée: 35 minutes); 8) Mesures de la force musculaire in vivo v(2 mesures, Durée :20 minutes); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations, les mesures de composition corporelle, les administrations des traitements et les test d'agrippement pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée (Durée maximum des pesées : 2 minutes / Durée maximum de mesure de la composition corporelle : 2 minutes). Les administrations des traitements occasioneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, les mesure de performance sur tapis roulant occasionne un exercice forcé pour les animaux pouvant être source de stress, de fatigue et de douleur légère du fait de quelques chocs électriques de faible intensité. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim et les deux prélèvements sanguins seront source de douleurs légères. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyses biochimiques et histologiques

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, et les paramètres de performance musculaire dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Les animaux seront sous contrôle direct et permanent des expérimentateurs pendant les tests de course sur tapis roulant et pendant les tests d'agrippement. Les mesure de force musculaire in vivo seront réalisées sur animal anesthésié et une attention particulière sera apportée pendant la phase de réveil. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

Une fausse route pendant le gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et une perte de 20 % du poids déclenche la même issue. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Elles sont gavées une fois par jour pendant trois mois au maximum, subissent des prélèvements de sang derrière l'œil, des courses sur tapis roulant, un maintien en équilibre sur une roue en rotation, une heure trente d'IRM et vingt minutes d'échocardiographie. Le porteur affirme que le test chez la souris est un "requis obligatoire" avant le passage à l'homme, pour cinq composés déjà commercialisés dans d'autres indications.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.

Nés avec un déficit de poids d'environ 20 %, stériles chez les mâles, les souris modèles du syndrome de Barth ne représentent que 10 % des portées au lieu des 25 % attendus. 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur tapis roulant et sur roue en rotation, subissent des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, une IRM d'une heure trente, une échocardiographie, et un gavage quotidien pendant trois mois si le traitement dans l'eau de boisson ne suffit pas. Le porteur indique qu'une fausse route lors du gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et prévoit des transferts en voiture entre trois établissements. Toutes sont tuées pour prélever leur sang et leurs organes.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.

Les souris mâles utilisées portent une mutation qui les fait naître avec 20 à 30 % de poids en moins, les rend stériles et fait chuter leur proportion dans les portées à 10 % au lieu des 25 % attendus. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et organes. Elles sont gavées une fois par jour pendant trois mois au maximum, prélevées par ponction rétro-orbitaire, mises à courir sur tapis et à tenir sur une roue en rotation, passées en IRM pendant une heure trente et en échocardiographie, avec des transferts routiers entre trois établissements. Le porteur indique qu'une fausse route lors du gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et qu'une perte de poids de 20 % ou l'absence d'amélioration après 48 heures y conduit également.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.