Troubles endocriniens

4102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir une biopsie de la queue, douze semaines de régime gras, jusqu'à dix injections, des jeûnes de six à seize heures, des gavages et cinq à dix prélèvements de sang à la queue. L'obésité provoquée entraîne prise de poids et baisse d'activité, et le pancréas ainsi que d'autres organes sont prélevés après mise à mort. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules immunitaires du pancréas dans le diabète de type 2, une piste thérapeutique annoncée comme lointaine.

Objectifs

Le pancréas régule la glycémie grâce à des cellules spécialisées qui produisent de l’insuline. Il contient aussi des cellules immunitaires qui participeraient à cet équilibre, mais dont le rôle reste encore mal connu. Ce projet cherche à comprendre comment ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, en particulier dans le cas de consommation excessives de graisses, pouvant conduire au développement d’une obésité et d’un diabète.

Bénéfices attendus

Étudier la fonction des cellules immunitaires du pancréas est essentiel pour mieux comprendre comment le pancréas régule le sucre dans le sang et réagit aux déséquilibres métaboliques, comme ceux causés par une alimentation riche en graisses. Ces cellules immunitaires, longtemps considérées comme de simples défenseurs contre les infections, jouent en réalité un rôle plus complexe dans le soutien des cellules productrices d’insuline et dans le maintien de la santé métabolique. En comprenant les mécanismes par lesquels ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, ce projet pourrait révéler de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir ou traiter des maladies comme le diabète de type 2.

Procédures

1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras et en cholestérol (WD - 12 semaines), 1 régime riche en graisse (HFD - 12 semaines), 1 à maximum 10 injections (20s), 1 à 2 jeun (6h ou 16h), 1 à 2 gavages (1min), 5 à 10 prélèvements de sang à la queue (3s).

Impact sur les animaux

Injections : douleur légère due à la piqure. Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Coupure du bout de la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée. -Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de permettre le prélèvement du pancréas ainsi que d’autres organes d’intérêt. Ces prélèvements sont indispensables à la réalisation d’analyses visant à comprendre les mécanismes étudiés dans ce projet, notamment pour identifier les voies de régulation du métabolisme dans différentes conditions expérimentales et caractériser et localiser les différentes populations cellulaires.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier le rôle des cellules immunitaires du pancréas en condition normale et de surcharge lipidique. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux, réduit à son minimum, a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles pour les étudier. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) et 22 semaines (adultes).

8 800 souris vont être utilisées sur quatre ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées et 200 réutilisées dans d'autres projets. On remplace leurs cellules hépatiques par des cellules humaines pour tester des candidats médicaments, après des injections détruisant leurs propres hépatocytes. Le porteur présente ce modèle comme plus acceptable que le recours aux primates non-humains. Il reconnaît n'avoir mené aucun calcul statistique, l'effectif reposant sur le nombre d'études des années précédentes et sur un plan commercial de croissance.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.

Procédures

4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Pour évaluer si un médicament de l'hypercalcémie prévient la fragilité de l'émail dentaire, 48 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Elles reçoivent le produit par gavage quotidien, avec des prélèvements sanguins mensuels et des passages au microscanner sous anesthésie. Les gavages répétés exposent à un risque de fausse route et d'inflammation. Le porteur vise un intérêt clinique pour des patients pédiatriques atteints de la maladie, et tue les animaux pour analyses ex vivo.

Objectifs

La maladie génétique étudiée a pour conséquences une augmentation du taux de calcium dans le sang et une fragilité congénitale de l’émail. Un médicament, utilisé habituellement pour corriger l’augmentation du taux de calcium dans le sang, va être testé sur des souris qui présentent la même maladie. L’objectif de ce travail est d’évaluer l’efficacité du médicament sur la fragilité dentaire. Les souris vont recevoir ce médicament tous les jours par voie orale. La fragilité dentaire sera évaluée par scanner sur l'incisive à croissance continue. A terme, ce travail aurait un impact clinique direct car il permettrait de discuter l’intérêt de ce traitement chez des patients pédiatriques atteints de cette maladie.

Bénéfices attendus

Évaluer l’impact du médicament sur la prévention de la fragilité de l'émail dentaire et discuter l’intérêt du médicament chez des patients pédiatriques porteurs de la maladie génétique étudiée.

Procédures

L’administration orale quotidienne du médicament par gavage peut induire un stress léger. Le prélèvement sanguin sur animal vigil peut induire un léger stress lié à la contention. L’imagerie des animaux réalisée sous anesthésie peut induire un stress léger.

Impact sur les animaux

Les animaux seront traités par gavage tous les jours par des expérimentateurs ayant l’habitude de ce geste qui reste néanmoins une source de stress. Les nuisances attendues sont donc principalement liées à la contention. Il existe également un risque de fausses routes ou d’inflammation causée par les gavages répétitifs. En l’absence de complication, le geste de gavage n’induit pas de douleur ou une douleur légère. L’administration orale du médicament ne devrait pas engendrer des effets secondaires au regard de la dose administrée. Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire pour mesure de la calcémie sera réalisé une fois par mois par des expérimentateurs ayant l’habitude de ce geste qui reste néanmoins une source de stress (3 prélèvements au total). Les nuisances attendues sont donc principalement liées à la contention. Le microscanner sera réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront anesthésiés pendant au plus 10 minutes pour la réalisation du microscanner. Les nuisances attendues sont donc principalement liées au stress lié à l’anesthésie.

Devenir

Mise à mort pour analyses ex vivo

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de tester cette hypothèse.

Réduction

A l’aide d’un test statistique approprié, il a été calculé que, pour obtenir un résultat exploitable, 16 souris seraient nécessaires par type de mutation génétique : 8 souris seraient traitées par le médicament et 8 souris recevraient un placebo. Parmi les souris, 4 seraient des mâles et 4 seraient des femelles, car la maladie génétique étudiée concerne autant les femmes que les hommes.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse. Le suivi régulier des animaux et la mise en place de points limites stricts et spécifiques permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur. Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs, pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress.

Choix des espèces

L’étude va porter sur des souris car il s’agit d’un bon modèle de la maladie génétique étudiée. Les souris seront traitées à l’âge adulte, soit à partir de l’âge de 2 mois, jusqu’à l’âge de 4 mois. L'incisive à croissance continue constitue un bon modèle de formation de l'émail.

864 souris subissent une neurochirurgie de 45 minutes et 288 une chirurgie viscérale, sous anesthésie et analgésie. Au total 1 792 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever le cerveau ou d'autres tissus. Cinq cent douze d'entre elles passent quatre semaines seules en cage pour un conditionnement opérant, 544 subissent un jeûne de 24 heures, et le régime gras est censé faire grimper leur poids jusqu'à 200 % du poids initial sur vingt semaines. Le porteur annonce des tests comportementaux sur 656 souris, d'une durée de dix à cent vingt minutes, sans préciser lesquels.

Objectifs

L’obésité est problème majeur de santé publique. Cette maladie chronique touche presque 18% de la population française (quasiment la moitié des français.es si l’on compte aussi les personnes en surpoids). Elle s’accompagne de nombreuses comorbidités, notamment le diabète et les symptômes anxieux et dépressifs. On sait aussi que les bactéries de l'intestin (le microbiote) est déréglé dans l'obésité. Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour limiter les comorbidités associées à l’obésité, il est nécessaire de mieux comprendre comment le cerveau contrôle le poids corporel et les émotions, et comment l'intestin communique avec le cerveau. Nous voulons tester l'hypothèse selon laquelle certaines cellules du cerveau, appelées cellules gliales, sont sensibles à des molécules produites par le microbiote intestinal. Nous pensons que les animaux mâles et femelles ne répondront pas de la même façon à ces molécules.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre la communication entre l’intestin et le cerveau, notamment le rôle de certaines cellules gliales dans les dérèglements métaboliques et cognitifs en réponse à un régime riche en calories. Ce projet a une véritable portée translationnelle dans la mesure où s’ils supportent notre hypothèse, l’utilisation de ces molécules produites par le microbiote (également retrouvés dans le sang humain) pourrait éventuellement être proposée pour traiter des personnes souffrant d’obésité avec présence de diabète ou de symptômes anxieux. De plus, si nos résultats diffèrent entre les deux sexes, cela permettra de cibler une population donnée, ce qui participe à la mise en place d’une médecine de précision.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur animaux vigiles : 5 min, entre 1 et 5 fois. Nombre d’animaux : 1492. 2) Chirurgie viscérale, sous anesthésie et antalgie, 20 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 288. 3) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 864. 4) Test de tolérance au glucose et à l’insuline sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min. Nombre d’animaux : 560. 5) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : 16 jours en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 144. 6) Mise à jeun, 24h, entre 1 et 2 fois, espacée d’une semaine. Nombre d’animaux : 544 (1 fois), 48 (2 fois). 7) Tests comportementaux. Durée : entre 10 et 120 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de minimum 1 jour. Nombre d’animaux : 656. 8) CONDITIONNEMENT OPERANT. DUREE : 4 SEMAINES en HEBERGEMENT INDIVIDUEL. NOMBRE D’ANIMAUX : 512.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la mesure des apports et des dépenses énergétiques individuels (calorimétrie indirecte) ou une tâche d’apprentissage avec accès individuel contrôlé aux mangeoires (conditionnement opérant) sont nécessaires. Durée maximum : 4 semaines. Légère perte de poids initiale (5 %) sur les deux premiers jours avant reprise de la croissance normale (basée sur nos observations antérieures). 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD (sur 20 semaines maximum). La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (4h ou 24h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau et soit le périoste, soit la paroi péritonéale devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins de 2h, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue). 7. Les complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation, hémorragie) devraient rester bien en dessous du seuil de 20% du nombre total d’animaux (d’après nos études antérieures). 8. Stress induit par des prélèvements sanguins répétés (maximum 6 prélèvements consécutifs en 2h). 9. Stress métabolique suite à des variations importantes de la glycémie (hyper ou hypoglycémies pendant 2h maximum).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Ce projet et notre hypothèse sont basés sur des résultats d’études cliniques chez l’Homme (variation de concentration sanguine des molécules du microbiote chez des populations obèses). Le but de ce projet est de comprendre le rôle de l’axe intestin-cerveau dans la mise en place des désordres métaboliques et cognitifs induits par l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (notamment l’intestin où réside le microbiote intestinal). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Les variables métaboliques (poids, composition corporelle, régulation de la glycémie) et le comportement intégré (anxiété) nécessite l’utilisation d’un modèle animal. En effet, des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés cités plus haut nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe pas encore de modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance statistique) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différents tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal décrites précisément dans les procédures. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec des mesures conservatoires prévues pour chaque critère.

Choix des espèces

LLes caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche. 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) possibilité d’obtenir des animaux génétiquement modifiés 5) comportement alimentaire et émotionnel depuis longtemps étudiés chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui permet l’utilisation d’une cartographie de référence du cerveau (atlas stéréotaxique) pour les neurochirurgies.

Jusqu'à 63 injections quotidiennes, quatorze prélèvements sanguins à la queue et soixante-dix jours d'hébergement individuel : 40 souris rendues obèses par un régime à 60 % de graisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'objet est de tester un candidat médicament seul ou combiné à la sémaglutide, dont le porteur reconnaît qu'elle fait perdre de la masse musculaire en même temps que de la graisse. Il décrit l'isolement en cage comme une nuisance pour un animal social, les mises à jeun de quatre à six heures comme une source de faim, et l'obésité imposée comme un inconfort réduisant les capacités de mouvement. L'étude ne portera que sur des mâles, une expérience chez les femelles étant conditionnée à une efficacité d'abord observée chez le mâle.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Parmi ceux-ci, la sémaglutide a obtenu récemment une autorisation de mise sur le marché. La Sémaglutide présente une excellente efficacité mais certaines inquiétudes émergent car la perte de poids résultante de son utilisation provient à la fois d'une perte de masse grasse mais également d'une perte de masse musculaire. Cette dernière s'avère problématique chez l'obèse qui est déjà un sujet à risque de faiblesse musculaire. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament donné seul ou en combinaison avec un composé de référence sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Dans le cadre des administrations combinées avec le composé de référence, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au composé de référence seul, mais également de contrer les effets délétèrres de ce dernier sur la fonction musculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, dont la sémaglutide qui est la plus efficace et la plus prescrite. Néanmoins, la sémaglutide présente un effet délétère sur la masse et la fonction musculaire lors d'administration chroniques. Le bénéfice attendu du présent projet est double car si les résultats sont concluants, le composé testé pourra venir compléter l'arsenal thérapeutique anti-obésité, en administration seule ou combinée avec la sémaglutide, et dans ce dernier cas, il pourrait en améliorer l'efficacité tout en contrant ses effets secondaires au niveau musculaire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Hébergement individuel (max. 70 jours) ; 2) Injection quotidienne de traitements ou véhicule (max. 63; durée : env. 1 minute) ; 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (max. 22 mesures; durée : env. 1 minute) ; 4) Analyse non invasive de composition corporelle (3 mesures, durée de la mesure : 2 minutes) ; 5) Mise à jeun en présence d'eau (5 fois, durée : 4h à 6h) ; 6) Injection de glucose (1 fois, durée : env. 1minute); 7) Injection d'insuline (1 fois, durée : env. 1minutes); 8) Prélèvements sanguin à la queue (max. 14 prélèvements, durée du prélèvement : 2 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. La mise à jeun (de 6h ou de 4h) pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée à la souris mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux sexes. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux sexes.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux réceptionnés seront âgés de 18 semaines correspondant au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par le composé testé, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de préconditionnement de 11 semaines de régime enrichi en graisse réalisée chez notre fournisseur.

Tester l'appétence et l'effet sur le poids d'un ingrédient alimentaire mis au point par un client industriel : 40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe soixante-trois jours seule en cage, subit dix-huit pesées, deux prises de sang à la queue et deux injections de solution saline. Le porteur reconnaît que l'isolement pèse sur une espèce sociale et précise que les souris gardent un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Il décrit l'étude in vivo comme une "étape règlementaire incontournable" pour constituer un dossier d'essais chez l'être humain, alors que le produit évalué est une formulation destinée à enrichir l'alimentation.

Objectifs

Le client a mis au point une nouvelle formulation destinée à enrichir l’alimentation standard. L’objectif du présent projet est d’évaluer l'efficacité de ce composé à des doses élevées, en mesurant son impact sur le poids corporel et la consommation alimentaire chez la souris. Une attention particulière sera portée à l’appétence du régime enrichi, afin de déterminer si la nouvelle formulation influence le comportement alimentaire des animaux exposés.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, les sources alimentaires sont relativement variées et accessibles. Cependant, un enjeu majeur réside dans le fait que nombre de produits disponibles sont fortement transformés, ce qui entraîne une perte significative en nutriments. Notre client, acteur engagé dans le secteur agroalimentaire, adopte une approche novatrice en valorisant une source nutritionnelle plus durable et respectueuse de l’environnement. L’étude préclinique que nous menons s’inscrit dans la continuité de plusieurs recherches préliminaires réalisées in vitro. Elle a pour objectif de démontrer l’efficacité de cette nouvelle formulation. En cas de résultats favorables, une évaluation en conditions cliniques sera envisagée. À terme, cette approche pourrait permettre de développer une ressource nutritionnelle à la fois riche en nutriments, dotée de qualités texturales intéressantes, et capable d’améliorer sensiblement la qualité nutritionnelle des produits.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Hébergement individuel (63 jours) ; 2) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (18 mesures ; durée : env. 1 minute) ; 3) Prélèvements sanguin à la queue (2 prélèvements, durée du prélèvement : 2 minutes). 4) Administration d’une solution saline (2 administrations ; durée : 1 minute).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel ainsi que le placement en boîte de contention lors des prélèvements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de courte durée. Enfin, l’administration d’une solution saline occasionnera également une douleur de faible intensité et de courte durée pour les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après mise à mort pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la consommation en eau sur le comportement alimentaire. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris soumis à une alimentation standard. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

La souris est l'un des modèles murins les plus classiquement utilisés et les mieux documentés dans le cadre d'études précliniques menées dans le secteur agroalimentaire. A la réception, les 40 animaux seront âgés de 8 semaines (17 semaines à l'issue de l'étude). Le stade de développement de ces animaux correspond à la population cible du composé développé.