Maladies animales

Tonte, abrasion de la peau à la bande adhésive puis au dermaroller, avant l'application de bactéries destinées à provoquer une infection cutanée : 224 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les lésions attendues sont des rougeurs, des papules, des pustules et des croûtes, avec des démangeaisons, certains prélèvements se faisant par introduction d'une aiguille dans la lésion. Chaque chien porte une collerette pour l'empêcher de se lécher et vit en box individuel jusqu'à vingt jours, le temps que l'infection provoquée guérisse d'elle-même, l'ensemble servant à tester des traitements vétérinaires présentés comme une réponse à l'antibiorésistance. Aucun de ces chiens n'est tué : ils rejoignent le "stock des animaux hébergés dans les locaux" de l'établissement et pourront être réutilisés dans une étude suivante après guérison complète et six semaines de repos.

Objectifs

La pyodermite canine représente l'un des motifs de consultation les plus fréquents en médecine vétérinaire. C’est une infection bactérienne cutanée généralement causée par des bactéries. Lorsque la barrière cutanée est altérée, les bactéries commensales de la peau peuvent proliférer de manière excessive, entraînant un déséquilibre bactérien et une réponse inflammatoire locale. La pyodermite peut être classée en plusieurs catégories selon la profondeur de l’infection et les couches de peau affectées (de surface, superficielle ou profonde). Les chiens atteints de pyodermite présentent une barrière cutanée altérée avec la présence de croûtes, de pustules, de papules et des zones d’alopécie. La qualité de vie de l’animal est affectée, il se gratte et se lèche, ce qui peut augmenter l’infection.Les traitements classiques actuels reposent l'utilisation de topiques antiseptiques et l'utilisation d'antibiotiques par voie systémique. Cependant, l'augmentation de l’émergence de la résistance aux antimicrobiens des bactéries limite considérablement les options thérapeutiques et le traitement de la pyodermite devient alors un défi. Ce projet s’inscrit dans une démarche de développement de nouveaux traitements vétérinaires, pharmaceutiques ou non. Il se décomposera en 2 procédures: mise en place d’un modèle expérimental de pyodermite superficielle imitant étroitement la maladie naturelle et évaluation de l’efficacité de nouveaux traitements de la pyodermite en vue d’optimiser et de réduire l’utilisation des antibiotiques lorsqu'ils s'avèrent nécessaires. Ces nouveaux traitements permettront également de limiter les conséquences de la maladie et amélioreront de façon notable le bien-être de l’animal. Le modèle de pyodermite sera mis en place d’après des modèles décrits dans la littérature. Les traitements seront testés chez l’espèce de destination et de ce fait une sélection préalable de solutions de traitement ne présentant pas de risque pour l’animal sera réalisée (excipient, volume à administrer…). Les traitements pourront être administrés par voie topique (sprays, mousses, gels, shampooings) ou par voie systémique (alternatives aux antibiotiques ou complémentaires aux antibiotiques)dans le strict respect des bonnes pratiques vétérinaires d’administration.

Bénéfices attendus

La pyodermite canine est due à la prolifération opportuniste de bactéries. Les traitements classiques actuels reposent sur l'administration d'antibiotiques systémiques et l'utilisation de topiques antiseptiques. Cependant, l'augmentation de l’émergence de la résistance aux antimicrobiens des bactéries limite considérablement les options thérapeutiques et le traitement de la pyodermite devient alors un défi. L’objectif de ce projet est de répondre à cette problématique d’antibiorésistance avec des solutions alternatives et/ou complémentaires aux traitements antibiotiques limitant ainsi leur utilisation tout en préservant l’environnement et la santé humaine. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de la pyodermite doit être évaluée sur l’espèce cible présentant les caractéristiques de la maladie. La mise en place et la maitrise d’un modèle de pyodermite superficielle induisant des signes cliniques similaires aux lésions cutanées observés chez les chiens souffrant de pyodermite spontanée, permettront d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions contrôlées, d’améliorer les phases de screening de nouvelles solutions alternatives aux antibiotiques et ainsi de sélectionner plus rapidement et de façon plus sûre, des solutions présentant une probabilité importante de succès de guérison sur un nombre optimisé d’animaux. Ainsi, ces traitements permettront d’améliorer l’état et le bien-être du chien (plus de grattage, ni léchage) tout en préservant son microbiome cutané. Ces nouveaux traitements participeront à améliorer le confort d'application et d'utilisation par rapport à l'existant (spot on, durée de traitement réduit...).

Procédures

- Préparation des zones de peau à infecter, tonte et légère abrasion avec une bande adhésive (« tape stripping ») puis au dermaroller - 1x par procédure – quelques minutes - Administration du (des) traitements : • Par voie topique par spray, shampooing - 1 à plusieurs applications par semaines pendant 1 à 4 semaines selon le traitement – maximum 5 mn • Par voie générale - 1 administration unique – 1 mn - Prélèvements • Microbiologiques – 1 prélèvement/zone testée - 1 fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction, puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à la guérison spontanée (maximum 20 jours) - 2 mn par prélèvement. • Cytologiques, – 1 prélèvement/zone testée - 1 fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction, puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à la guérison spontanée (maximum 20 jours) - 2 mn par prélèvement.

Impact sur les animaux

1/L’induction du modèle de pyodermite, la collecte d’échantillons et les études d’efficacité pharmacologique requièrent une contention légère et de très courte durée des animaux, pouvant induire un stress léger. 2/L’induction d’une pyodermite superficielle induira des lésions cutanées attendues au niveau des zones testées (ex: érythème, papules/pustules, croûtes). Ces lésions pourront entrainer du prurit et donc être source d'inconfort pour le chien. 3/Prélèvements cytologiques: certains prélèvements pourront se faire par aspiration, c'est-à-dire via l'introduction d'une aiguille dans la lésion cutanée observée, pouvant induire une légère douleur pour l'animal au moment de la ponction. 4/Mobilité réduite: pour éviter le léchage qui pourrait aggraver les symptômes infectieux, les chiens devront porter une collerette pouvant générer un léger stress et inconfort. 5/Afin d’éviter toute contamination croisée entre les chiens (contamination de la zone inoculée par la flore buccale et/ou par les germes de différentes souches qui pourront être appliqués sur les différents chiens), ils seront hébergés en box individuel au maximum 20 jours ce qui pourra induire du stress pour l'animal. L’hébergement collectif sera privilégié pour chaque étude qui le permettra.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront réintroduits dans le stock des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. Les études de ce projet seront conduites séquentiellement afin d’obtenir les informations scientifiques nécessaires tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux pourront être réutilisés dans chaque étude du projet après totale guérison et une période de repos de 6 semaines minimum. L’effet cumulatif est évalué par le vétérinaire de l’EU en collaboration avec le(s) directeurs(s) d’étude(s) selon le type de produits administrés. Les animaux peuvent être réutilisés après une période de repos suffisante entre 2 études pour s’assurer de l’élimination totale de l’organisme du dernier traitement administré ; cette durée ne peut être inférieure à 10 fois la demi-vie du produit si celle-ci est connue ou 1 mois si celle-ci n’est pas connue. De plus, tout animal réutilisé fait l’objet d’une visite du vétérinaire de l’EU qui certifie que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général et peut être ré-inclus dans une nouvelle étude sans dommage pour lui.

Remplacement

Conformément au principe de remplacement, des modèles non animaux (cultures cellulaires, peau reconstruite, systèmes ex vivo) ont été évalués. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la physiopathologie de la pyodermite superficielle canine, reposant sur l’altération de la barrière cutanée, sa colonisation par une bactérie et la réponse immunitaire cutanée de l’hôte. Seul un modèle in vivo permettra d’analyser simultanément et de façon standardisée, l’induction des lésions, la dynamique infectieuse, l’inflammation et la cicatrisation, ainsi que l’évaluation clinique des stratégies thérapeutiques. Des études in vitro pourront être réalisées en amont de chacune des études de cette procédure, comme : - Des études de microbiologie permettront de caractériser les agents infectieux utilisés lors du modèle et de sélectionner des souches adaptées en évaluant leur pathogénicité et leur sensibilité aux solutions de traitement à évaluer. - Des études de toxicité des solutions de traitement à évaluer permettront d’écarter les produits toxiques ou mal tolérés.

Réduction

Dans la mesure du possible, des approches in vitro seront réalisées préalablement afin de sélectionner les meilleurs candidats de traitement pour un passage in vivo et limiter le nombre d’animaux inclus dans la procédure. Les études réalisées dans le cadre de ce projet seront conduites séquentiellement afin d’obtenir les informations scientifiques nécessaires tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés et en préservant leur bien-être autant que possible. Dans chaque plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser leur utilisation et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre permettra d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettront de prendre une décision sur l’induction de la pyodermite et /ou le niveau d’efficacité de la/des solutions de traitement évaluées. Chaque animal sera son propre témoin. La littérature nous montre que pour ce modèle, un minimum de 6 chiens est nécessaire pour garantir des résultats exploitables. Les études de mise au point seront réalisées sur 6 à 8 chiens (dans le cas où différentes conditions devraient être étudiées, telles que l'application de germes différents). Lors des études d’évaluation de produits, 3 à 4 groupes de 6 à 8 chiens seront nécessaires (2 groupes contrôles, négatif et positif, 2 groupes traités). Les différentes études seront réalisées successivement, et les animaux pourront être réutilisés dans les études suivantes après totale guérison et une période de repos de 6 semaines minimum.

Raffinement

L’induction du modèle de pyodermite, la collecte d’échantillons et les études d’efficacité pharmacologique, requièrent une contention légère des animaux. Les animaux sont habitués à la contention et au contact des expérimentateurs en étant régulièrement manipulés. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’à la dernière observation, l’état de santé général des animaux sera observé a minima 2 fois par jour pour s’assurer qu’aucune réaction non attendue est observée. Des observations locales seront également prévues a minima une fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à guérison du chien. Les examens cliniques locaux pourront cependant être plus fréquents si les besoins de l’étude le justifient, par exemple, réalisés quotidiennement tout au long de la phase expérimentale. Le personnel de l’EU en charge des observations est expérimenté et formé à reconnaitre un état de santé ou comportement anormal devant être signalé au vétérinaire de l'étude. Des points limites seront définis et précisés dans chaque plan d'étude. Si un des points limites est atteint, le chien sera immédiatement retiré de la phase expérimentale et traité. Les chiens devant être hébergés en box individuel durant la phase expérimentale (maximum 20 jours), un enrichissement compensatoire avec des jeux spécifiques (tapis de léchage) leur sera fourni. Deux à trois jours après l’induction du modèle, les chiens pourront sortir faire de l’exercice, 2 à 3 fois par semaine, en individuel et sous surveillance. Les interactions avec le personnel qualifié de l’EU seront plus fréquentes qu’en hébergement collectif. Le temps en box individuel sera ajusté à chaque étude de mise en place afin de le réduire au maximum. Il sera discuté pour chaque étude avec la SBEA. L’hébergement collectif sera privilégié pour chaque étude qui le permettra. Dès qu’un animal sera guéri, il pourra de nouveau être placé en box collectif.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. L’espèce de destination des traitements contre la pyodermite étant le chien et l’absence d’alternative à l’utilisation d’animaux justifie l’utilisation des chiens dans ce projet. Les modèles seront à mettre en place chez des chiens adultes sains avec un système immunitaire mature soit des animaux de plus de 10 mois.

Jusqu'à deux injections sous-cutanées par jour, trois injections intraveineuses par semaine, et selon les protocoles une injection dans l'œil sous microscope chirurgical une à deux fois par semaine : 1 185 souris et 1 185 rats, soit 2 370 rongeurs, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une maladie auto-immune leur est provoquée par immunisation, avec des atteintes motrices progressives allant de la faiblesse de la queue à une paralysie partielle, une perte de poids et une baisse de la vision. Il s'agit de tester des candidats médicaments contre la sclérose en plaques et la névrite optique qui l'accompagne. Le porteur donne d'abord des raisons anatomiques et physiologiques au recours aux rongeurs, puis indique que "les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat".

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place un modèle de névrite optique chez le rongeur dans le but de tester des traitements potentiels. La névrite optique (NO) est une inflammation aiguë du nerf optique qui entraîne une altération de la transmission des signaux visuels entre la rétine et le cerveau, elle survient essentiellement chez les jeunes adultes. Les symptômes sont une perte visuelle chez le jeune adulte, des douleurs optiques modérées qui sont amplifiées par des mouvement oculaires, chez l’homme les symptômes ne touchent généralement qu’un seul œil. Dans la majorité des cas la névrite optique est une manifestation de la sclérose en plaque. C'est une maladie auto-immune inflammatoire du SNC, dans laquelle des lymphocytes T et B auto-réactifs dirigés contre des antigènes de la myéline sont activés, traversent la barrière hémato-encéphalique, et produisent une inflammation du nerf optique avec une démyélinisation prédominante. D’autres causes sont possibles comme des maladies infectieuses (virales ou bactériennes), maladies auto-immunes (lupus, sarcoïdoses), toxiques ou médicamenteuses (plomb, tabac, antibiotiques). L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour le développement préclinique de candidats médicaments destinés au traitement de la sclérose en plaques (SEP) et de la névrite optique associée en reproduisant de manière concomitante l’activation immune systémique, l’inflammation du SNC, la démyélinisation et la dégénérescence axonale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer au développement de traitements thérapeutiques destinés aux maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et les névrites optiques associées, en évaluant l’efficacité de candidats dans un contexte physiopathologique complexe intégrant inflammation, démyélinisation et atteinte neuro‑axonale.

Procédures

L'induction de la pathologie se fait par injection sous-cutanée en début d'étude, accompagnée de 2 injections intrapéritonéales sur animal vigile pour stimuler le système immunitaire et déclencher la maladie auto-immune. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Le nombre d’administration varie en fonction du traitement à tester et du mode d’injection, avec un maximum de 2 injections par jour en sous cutané, une administration orale ou intrapéritonéale par jour ou de 3 injections intraveineuses par semaine. Si le produit doit être administré par injection au niveau de l’œil, l’animal sera anesthésié de façon générale et locale. La fréquence sera plus limitée, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés à l’induction du modèle d’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale (EAE) et à l’évolution de la maladie. L’induction par immunisation induit un inconfort transitoire lié aux injections avec une réaction inflammatoire locale modérée au site d’injection. Au cours du développement de l’EAE, les animaux vont présenter des altérations motrices progressives, pouvant aller d’une faiblesse de la queue ou des membres postérieurs à une paralysie partielle, évaluée quotidiennement par un score clinique standardisé. Une diminution de l’activité spontanée et de la mobilité est observée, ainsi qu’une perte de poids liée à l’inflammation systémique et à la diminution de l’activité. La sévérité du projet est classée modérée, des points limites (score moteur, altération de l’état général, perte de poids excessive) permettront d’éviter l’apparition de cas sévères. Les animaux auront également une altération de la vision, d'après notre expérience pour d'autres modèles expérimentaux, les rongeurs qui ont une baisse de la vision, ont un comportement comparable aux animaux naifs, en terme de mobilité dans la cage, acces à la nourriture et l'eau.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procedure pour réaliser des évaluation ex vivo des tissus, histologie, immuno marquage, dosage de biomarqueurs.

Remplacement

L’étude de la pathologie et des effets de potentiels traitements nécessitent l’analyse intégrée et dynamique des interactions entre le système immunitaire, le système nerveux central, la barrière hémato‑encéphalique et les cellules gliales, ainsi que l’évaluation de conséquences fonctionnelles et structurelles au niveau du nerf optique et de la rétine. À ce jour, aucune méthode alternative non animale (modèles in vitro, ex vivo, organoïdes, approches in silico) ne permet de reproduire la complexité de la réponse auto‑immune systémique impliquée dans l’EAE, la migration des cellules immunitaires vers le système nerveux central, la démyélinisation inflammatoire in vivo, ni l’évolution temporelle des atteintes neuro‑axonales et visuelles. Les approches in vitro et ex vivo disponibles sont utiles pour l’étude de mécanismes cellulaires isolés ou pour le criblage préliminaire de composés, mais ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale et la tolérance d’un candidat médicament dans un contexte physiopathologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats. Une analyse de puissance, sera systématiquement réalisée en amont de chaque série expérimentale, afin de déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Un test statistique sera utilisé pour conclure sur la significativité des résultats. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum) dans des cages incluant des abris et des objets à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Si l’immobilité est requise pour un examen (confocal) une anesthésié légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation. L’induction de l’EAE repose sur un protocole standardisé et maîtrisé, largement validé dans la littérature et par l’expérience de l’équipe, afin de limiter la variabilité et la sévérité excessive du modèle. L’accès facilité à l’eau et à la nourriture sera facilité pour les animaux présentant des troubles moteurs (abreuvoirs et nourriture placés à hauteur accessible). La durée d’exposition à la maladie est strictement limitée aux temps nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques. Des points limites précoces et clairement définis sont appliqués (score moteur élevé, perte de poids excessive, altération marquée de l’état général). En cas d’atteinte sévère ou de dépassement des points limites, une mise à mort anticipée est réalisée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs qui seront dejà formés aux techniques de manipulations, d'injections ou d'administration de substances avant d'intervenir sur le projet, ainsi qu' à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, dans le contexte de l’étude de névrite optique. Les rongeurs sont bien caractérisés pour l’étude de l’encéphalomyélite auto‑immune expérimentale modèle de référence des maladies neuro‑inflammatoires et démyélinisantes du système nerveux central. Les mécanismes d’inflammation du système nerveux central, la démyélinisation et l’atteinte axonale secondaire du nerf optique est bien documentée. Les contraintes liées aux quantités disponibles des substances expérimentales détermineront le choix entre la souris et rat. Les rongeurs sont adaptés aux administrations systémiques, péri-oculaires et intra-oculaires, potentiellement utilisées dans les tests d’efficacité de traitement. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes. Les publications indiquent un âge de 8 à 10 semaines pour les souris et 8 à 12 semaines pour les rats au moment de l’induction. Le système immunitaire est alors pleinement mature pour obtenir une induction fiable et reproductible. Le système nerveux central est complètement développé et permet d’étudier la démyélinisation, d’inflammation et d’atteinte neuro‑axonale au niveau du nerf optique, de la rétine et de la moelle épinière. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.

Déjà utilisées dans un autre protocole, 6 vaches laitières taries sont reprises pour tester un vaccin nasal contre la besnoitiose, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tête bloquée au cornadis, chacune subit quatre prises de sang de trente millilitres, quatre écouvillonnages nasaux, trois instillations du vaccin et jusqu'à vingt-huit prises de température rectale. L'effectif tient à la disponibilité de ces six vaches, le porteur indiquant qu'il n'est pas modulable puisqu'elles proviennent d'un protocole antérieur. Toutes seront mises à mort à l'issue, au motif qu'elles auront été soumises à des produits expérimentaux.

Objectifs

La besnoitiose, caus?e par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), repr?sente une menace significative pour l??levage bovin. Maladie r?-?mergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites pr?sents dans la peau peuvent ?tre transmis par l?interm?diaire d?insectes ou d?aiguilles avec une progression jusqu?? 20% de nouveaux animaux infect?s par an dans les troupeaux touch?s. La phase f?brile est caract?ris?e par un larmoiement, un jetage nasal, une congestion des muqueuses, de la fi?vre ; puis la phase des ?d?mes touche toutes les r?gions du corps rendant les d?placements difficiles ; puis vient la phase de d?pilation et scl?rodermie accompagn? d?amaigrissement. La mort, spontan?e ou provoqu?e, peut atteindre jusqu?? 10 % des animaux infect?s. Cette maladie est ?galement une cause d?infertilit? des m?les pouvant impacter des taureaux de grande valeur g?n?tique. Aucun traitement curatif n?est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limit?s au d?pistage et ? l??limination des animaux malades, ce qui est difficile pour les animaux asymptomatiques, ou au contr?le des insectes. Le d?veloppement d?un vaccin efficace offrirait aux ?leveurs une meilleure strat?gie de contr?le de cette maladie. Le but de ce projet est d??valuer l?immunog?nicit? et l?efficacit? d?un vaccin sous-unitaire ? administration nasale contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitu? de prot?ines de B. besnoiti associ?es ? un muco-excipient ? base d?amidon. Les vaches seront immunis?es par voie intranasale pour d?clencher une r?ponse immunitaire muqueuse et syst?mique. Ces r?ponses seront ?valu?es par le suivi de l?apparition d?anticorps muqueux et s?riques sp?cifiques de B. besnoiti et par la production de mol?cules inflammatoires par les cellules sanguines. Le vaccin sera test? sur 6 vaches r?utilis?es et h?berg?es conform?ment aux directives europ?ennes, avec un enrichissement appropri? aux bovins. Toute m?dication interf?rant avec la r?ponse immunitaire est ? ?viter.

Bénéfices attendus

Les b?n?fices attendus sont la mise en ?vidence du d?veloppement d?une immunit? contre Besnoitia besnoiti, ? l?aide d?un vaccin nasal. Ces r?sultats sont essentiels pour envisager le d?ploiement de la vaccination de bovins dans les zones end?miques en France. Cet outil de lutte est attendu par les acteurs du secteurs (?leveurs impact?s, groupement de d?fense sanitaire qui soutient les ?leveurs dans la gestion de la besnoitiose).

Procédures

Les animaux seront soumis ? des pr?l?vements sanguins sous contention de la t?te au cornadis (environ 5 minutes par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des pr?l?vements nasaux par ?couvillonnage sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; d?instillation du vaccin par voie intranasale sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 3 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des prises rectales de la temp?rature (environ 5 minutes par animal, entre 16 et 28 fois avec un maximum de 2 fois par jour pendant 3 jours apr?s vaccination).

Impact sur les animaux

Les prises de sang peuvent ?tre source de stress et de douleur mod?r?e. Au total, 4 prises de sang de 30 mL chacune, ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. L??couvillon dans la narine peut provoquer une sensation de d?mangeaison limit?e ? la dur?e du geste. Au total, 4 ?couvillonages ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. La prise rectale de la temp?rature peut occasionner une g?ne passag?re. Le pr?l?vement de sang au niveau de la veine jugulaire n?cessite une contention de la t?te ? l?aide d?un cornadis et d?un licol. Le pr?l?vement nasal se fera ? la suite pour profiter de l?immobilisation de la t?te de l?animal.

Devenir

A l'issue de la proc?dure 1, les 6 animaux seront mis ? mort ?tant donn? qu?ils auront ?t? soumis ? des produits exp?rimentaux.

Remplacement

Il n?existe ? ce jour aucune alternative non animale permettant d??tudier les r?ponses immunitaires. L??tude des r?ponses immunitaires n?cessite d?immuniser et de faire des pr?l?vements sur des animaux vivants. Le bovin est l?h?te de B. besnoiti. C?est donc la seule esp?ce pertinente pour ?tudier les r?ponses immunitaires d?un vaccin ? destination des bovins.

Réduction

Il s?agit d?une ?tude exploratoire sur des animaux r?utilis?s issus d?un autre protocole afin de ne pas en utiliser d?autres (r?duction). Le nombre d?animaux n?est donc pas modulable. Le fait que chaque animal soit son propre t?moin n?gatif permet d?avoir un lot unique et d?augmenter la robustesse des r?sultats. Pour les dosages de cytokines produites par les cellules sanguines stimul?es ex vivo, le test statistique non param?trique (2 ?chantillons appari?s) pourra ?tre utilis? pour d?terminer si la diff?rence entre le point avant vaccination (J0) et chaque point apr?s vaccination (J14, J28, J47) est significative. Une simulation r?alis?e avec l?outil de calcul de puissance de ce test indique que 6 individus sont n?cessaires pour atteindre 95 %, sans tenir compte de la grande variabilit? individuelle d?j? observ?e avec les cellules bovines et pour une augmentation attendue d?au moins 50 % de cytokines produites.

Raffinement

Les animaux ayant d?j? ?t? utilis?s, ils resteront dans leur environnement habituel. Ils ont d?j? ?t? acclimat?s et habitu?s aux pr?l?vements sanguins. Les prises de sang et les immunisations intranasales ne n?cessiteront qu?une contention minimale (au cornadis). Dans leur pr?cedent ?levage, les animaux ont d?j? ?t? habitu?s ? l?alimentation au cornadis. Un renforcement positif (granul?s pour vaches par exemple) sera appliqu? apr?s chaque immunisation et pr?l?vements. La vaccination ne devrait pas entrainer d?effet ind?sirable grave et toute m?dication pouvant interf?rer avec les r?ponses immunitaires (tels que les anti-inflammatoires) est proscrite. Enrichissement du milieu par : des brosses de grattage, des blocs de sels min?raux et de la paille r?guli?rement chang?e pour le couchage. Enrichissement social : les animaux seront h?berg?s en groupes stables et auront au minimum deux visites quotidiennes des animaliers.

Choix des espèces

Le bovin est l?esp?ce cible du vaccin test? dans cette exp?rimentation. Les vaches laiti?res sont au stade adulte et taries qui correspond au stade majoritairement infect? par B. besnoiti. En effet, le risque est li? aux piq?res d?insectes et il augmente avec l??ge des animaux.

Quinze séances de prélèvement par porcelet, dont treize écouvillons nasaux et treize prélèvements de fèces : 48 cochons sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever poumons et ganglions. Une partie est vaccinée, puis tous sont exposés au virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin ou à un tampon témoin, exposition qui peut provoquer chez 10 à 50 % d'entre eux une fièvre dépassant 40 °C pendant un à trois jours, de la toux, des éternuements et une baisse d'appétit. Trois échographies pulmonaires sont réalisées sous anesthésie, et le porteur envisage d'en tenter quelques-unes sans anesthésie pour en évaluer la faisabilité. Le bénéfice annoncé à court terme est d'informer éleveurs et vétérinaires "d'un effet (ou non) d'une supplémentation alimentaire en algues sur la réponse vaccinale anti-SDRP", une supplémentation que le porteur décrit comme "peu chère et facile à mettre en place en élevage".

Objectifs

Le syndrome dysg?n?sisque et respiratoire porcin (SDRP) est une maladie virale tr?s fr?quente chez les porcs en ?levage intensif dans le monde, avec des impacts ? la fois ?conomiques et sur le bien-?tre des animaux. Il provoque des troubles de la reproduction chez les femelles adultes, des troubles respiratoires qui peuvent ?tre l?taux chez les porcelets allait?s, et augmente la sensibilit? aux infections bact?riennes secondaires, conduisant ? une surutilisation des antibiotiques. Il existe des vaccins qui r?duisent les sympt?mes sans emp?cher la transmission du virus. Depuis une dizaine d'ann?es, les extraits d'algues, utilis?s dans les traitements ? court terme ou lors de la vaccination, sont empiriquement reconnus par les ?leveurs pour leurs effets positifs sur la sant? des porcs. Ce projet a pour objectif d??valuer l?effet d?une suppl?mentation alimentaire en extraits d?algues sur l?am?lioration de l?efficacit? des vaccins anti-SDRP chez le porc : les r?sultats auront une port?e ? la fois clinique (avec l?am?lioration potentielle de l?efficacit? des vaccins commerciaux par une suppl?mentation alimentaire) et plus fondamentale (avec l??tude de la stimulation immunitaire par le vaccin et par les algues). Notre ?tude pr?c?dente a montr? qu?une suppl?mentation en extrait d?algues des porcs pendant 3 jours autour de la vaccination anti-SDRP induisait des changements globaux du syst?me immunitaire, comme observ? dans le sang. De plus, cette suppl?mentation a ?galement augment? la r?ponse vaccinale, mesur?e par le taux d?anticorps totaux dirig?s contre le virus. Ces r?sultats encourageants ne permettent cependant pas d??valuer l?effet de la suppl?mentation en algue sur la protection r?elle contre la maladie. Pour cela il nous faut infecter les animaux vaccin?s afin de mesurer si les animaux suppl?ment?s en algues pr?sentent moins de sympt?mes (protection clinique) et moins de virus (protection viral) que les animaux non-suppl?ment?s en algues. Ce projet permettra de r?pondre ? ces questions. En plus d??valuer l?efficacit? du vaccin avec ou sans suppl?mentation en algues pour prot?ger sp?cifiquement contre la maladie SDRP, nous ?tudierons l?impact des algues et du vaccin sur les r?ponses immunitaires non-sp?cifiques, appel?es r?ponses inn?es. Ce ph?nom?ne pourrait ?tre induit par les extraits d?algues ou le vaccin att?nu?, et permettre une meilleure protection g?n?rale contre toutes les maladies respiratoires rencontr?es par les animaux.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet informera les ?leveurs et v?t?rinaire d?un effet (ou non) d?une suppl?mentation alimentaire en algues sur la r?ponse vaccinale anti-SDRP. Une suppl?mentation alimentaire sur 3 jours autour de la vaccination est peu ch?re et facile ? mettre en place en ?levage ? certains ?levage utilisant d?j? de telles suppl?mentations au quotidien ? certaines p?riodes de vie ? et pourrait ?tre recommand?e. L?am?lioration de la vaccination anti-SDRP ?tant un enjeu majeur en ?levages porcin. A moyen terme, les r?sultats concernant l?immunit? entra?n?e seront un premier pas ? la compr?hension de ce m?canisme chez le porc. Si le vaccin en lui-m?me ou la suppl?mentation en algues induisent un entra?nement b?n?fique des monocytes et/ou des macrophages cela permettrait d?am?liorer les protocoles vaccinaux en ?levage. Il serait alors ?galement int?ressant d??valuer ce m?canisme lors d?autres vaccinations contre d?autres pathog?nes et avec diff?rents types de vaccins. A long terme, ces donn?es participeront ? une meilleure compr?hension du fonctionnement de ce vaccin et de la suppl?mentation en algues, participant au corpus de donn?es n?cessaire ? l?am?lioration de la pr?vention du SDRP et de la conduite d??levage porcin face aux pathog?nes respiratoires.

Procédures

Les animaux seront pr?lev?s 15 fois sur la totalit? de l?exp?rimentation, avec au minimum un pr?l?vement de sang. Parmi ces 15 dates de pr?l?vements, 13 d?entre elles comporteront ?galement un ?couvillon nasal (en alternant les narines entre 2 pr?l?vements) et 13 d?entre elles comporteront des f?ces (dur?e entre 1 et 3 min). Une partie des animaux sera vaccin?e ? J0. Tous les animaux seront expos?s, soit ? un tampon, soit au virus SDRP. Trois ?chographies pulmonaires seront r?alis?es au cours de l?exp?rimentation sur animal anesth?si? (au maximum 20 minutes). Nous pourrons tester l??chographie sans anesth?sie (comme fait sur l?homme) sur quelques animaux pour en ?valuer la faisabilit?.

Impact sur les animaux

La suppl?mentation en algue et la vaccination ne devraient engendrer aucun effet ind?sirable, elles sont d?j? largement utilis?es en ?levage et nous avons d?j? test? ces techniques dans une ?tude pr?c?dente sans observer d?effet sur les animaux. L?exposition ? une souche peu virulente de virus SDRP peut induire chez 10 ? 50% des animaux une hyperthermie courte et mod?r?e (>40?C, mais atteignant rarement plus de 41?C pendant 1 ? 3 jours, alors que la temp?rature corporelle normal d?un porc est de 39?C). Une possible toux et des ?ternuements, avec ?ventuellement une respiration rapide et une l?g?re baisse d?app?tit peuvent ?tre observ?s jusqu?? 2 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasi?s pour pouvoir collecter diff?rents organes d?int?r?t : les poumons, les ganglions.

Remplacement

Des exp?riences pr?liminaires ont ?t? r?alis?es in vitro pour tester diff?rents lots d?extraits d?algues et leur effet sur les cellules immunitaires. Cependant, l?effet d?une mol?cule in vitro et son effet apr?s ingestion et passage par le syst?me digestif in vivo ne sont ?videmment pas similaires. De plus, il est impossible de pr?dire l?effet des extraits d?algues sur la mise en place des r?ponses immunitaires adaptatives (anticorps) ? l?aide d?exp?rimentation in vitro car cette r?ponse immunitaire d?pend d?un trop grand nombre de param?tres incluant l?immunit? de la m?re pendant la gestation et l?allaitement, le d?veloppement embryonnaire, le processus de production des cellules immunitaires dans la moelle osseuse et le thymus, et des param?tres de stimulation du syst?me immunitaire inn? qui ne sont pas encore connus.

Réduction

Le nombre d?animaux d?fini pour l??tude a ?t? d?termin? en tenant compte de la variabilit? inter-individuelle chez le porc, en nous basant sur nos exp?riences pr?c?dentes et la litt?rature Ainsi, le nombre d?animaux par groupe nous permettra de comparer ? l?aide d?ANOVA ou de t-tests les param?tres mesur?s (taux d?anticorps neutralisants et charge virale notamment) entre les groupes. De plus, avant de r?aliser cette ?tude, une premi?re ?tude in vivo avait ?t? r?alis?e en ?levage porcin conventionnel avec des pr?l?vements de sang et de fluides nasaux, sans euthanasies des animaux. Ces premi?res donn?es nous ont permis d?affiner le protocole et de r?duire le nombre d?animaux n?cessaires.

Raffinement

Les animaux seront h?berg?s en lots de 6 animaux stables au cours de toute la dur?e d??tude (3 m?les et 3 femelles). Les lots peuvent se voir et se sentir. Ils seront aliment?s ? volont? et auront acc?s ? discr?tion ? l?eau. Le confort thermique sera assur? par des lampes chauffantes ou par la temp?rature de l?animalerie. Il y aura un ballon et un nunchaku ou/et cha?nes dans chaque lot pour permettre les jeux. L?exp?rimentation commencera par 2 semaines d?acclimatation pour que les porcelets s?habituent ? leur nouvel environnement. Cette p?riode permet ?galement aux animaliers de ? conna?tre ? les animaux. Un renforcement positif sera mis en place avec des fraises tagada ou du pop-corn ou autres. Les porcelets seront ?galement entra?n?s ? recevoir la suppl?mentation orale en algue avec une ? deux premi?res sessions avec du jus de pomme. Certains pr?l?vements (animaux dont le poids est sup?rieur ? 30 kg) et expositions au virus seront r?alis?s sur animaux anesth?si?s. Le suivi des animaux sera fait en partie par t?l?m?trie (syst?me Plexx) gr?ce ? des puces de temp?ratures. La prise de temp?rature se prendra avec un lecteur et l?animalier viendra biper les animaux. Les puces seront administr?es par l??leveur.

Choix des espèces

Le porc est l?esp?ce cible de la maladie cible (SDRP) ainsi que des traitements (suppl?mentation alimentaire en algue et vaccination) ?tudi?s. Les animaux seront utilis?s apr?s le stade sevrage ce qui correspond ? la p?riode o? il y a transfert entre ?levage et potentiellement contamination. Le stress g?n?r? par ces transferts rend les animaux plus sensibles aux maladies. Un m?lange de m?les et de femelles (50/50) sera fait dans les groupes. La vaccination en ?levage a ?galement lieu ? la p?riode d?finie dans l??tude afin d??tre au plus pr?s des conditions des ?leveurs.

Produire en série un parasite génétiquement modifiable : 115 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs cæca, y mesurer la charge parasitaire et y noter les lésions. Chacun reçoit Eimeria tenella par la bouche ou par le cloaque, à une dose que le porteur dit calculée pour ne pas déclencher de symptômes, la coccidiose clinique donnant sinon perte d'appétit, soif intense, crête décolorée, prostration et diarrhées sanglantes. Le rendement attendu est de dix millions d'oocystes par poulet infecté, et il faut recommencer régulièrement pour "préserver l'infectiosité de la nouvelle souche transgénique générée". Le porteur écrit avoir publié une culture in vitro qui "permet d'accéder à la totalité des stades du cycle parasitaire", puis qu'elle "ne reproduit que la 1ere multiplication asexuée" et "ne couvre pas la fin du cycle".

Objectifs

Les coccidioses représentant un problème majeur en élevage aviaire, elles entraînent de lourdes pertes économiques. Ces parasitoses sont causées par des apicomplexes intracellulaires obligatoires dont Eimeria tenella. Face au coût élevé des vaccins et l’émergence de parasites résistants aux anticoccidiens, il devient urgent d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. La possibilité de modifier génétiquement le parasite serait un outil précieux pour nos recherches portant sur la compréhension du parasite et la mise en place de nouvelles stratégies de contrôle : suivi de l’infection in vitro et in vivo, identification de facteurs de virulence, génération de mutants ou de vaccins, test d’efficacité de nouveaux traitements. Ce projet a pour but de créer une souche d’Eimeria tenella génétiquement modifiable par des systèmes tels que CRISPR/Cas9 pour réaliser de l’édition de génome dite « propre » et servira de souche de base pour la génération des souches transgéniques pour les recherches futures de l’équipe.

Bénéfices attendus

Le développement d’une souche d’E. tenella génétiquement modifiable permettra d’accélérer les recherches conduisant à l’identification de nouvelles molécules. En effet, cette nouvelle souche premettra de rendre diverses applications possibles (ex : génération de mutants ou de vaccins, identification et caractérisation de facteurs de virulence parasitaires par génétique inverse) plus aisées, robustes et rapides au laboratoire (ex : criblage et test d’efficacité de nouveaux traitements, suivi d’infection in vitro). Des multiplications régulières sur animaux sont nécessaires pour préserver l’infectiosité de la nouvelle souche transgénique générée et ainsi permettre la continuité des études au laboratoire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration par voie orale ou cloacale du parasite Eimeria à une dose qui ne cause pas de morbidité et qui n’induit pas de signes cliniques proches du point limite. L’objectif est de générer une souche d’Eimeria tenella génétiquement modifiable. L’inoculation est réalisée au fond de la cavité buccale de l’animal et n’est pas invasive comme le serait un gavage dans lequel l’embout serait inséré jusqu’à l’oesophage. L’inoculation est de courte durée (20s maximum). De même l’inoculation par voie cloacale n’est pas invasive et est de courte durée (10s). Aucune douleur n'est attendue suite aux deux types d’inoculations. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Elle est effectuée par du personnel expérimenté.

Impact sur les animaux

En coccidiose aviaire, on ne parle pas de virulence mais plutôt de pouvoir pathogène des parasites car la gravité de l’infection est dépendante de la dose infectieuse. La coccidiose clinique est très symptomatique, avec une perte d’appétit, une perte de poids, une soif intense, une crête décolorée, des modifications du comportement (oiseaux prostrés, ailes pendantes), et des diarrhées sanglantes. Ces signes impactent fortement la croissance des jeunes et le taux de ponte des poules. En élevage, la plupart des cas de coccidiose sont des infections subcliniques, qui impactent les performances zootechniques des oiseaux, sans symptômes visibles. Dans le cadre de nos travaux, les doses inoculées aux poulets sont faibles et n’induisent pas de symptômes cliniques. La contention lors des inoculations peut engendrer un stress estimé comme léger et de très courte durée.

Devenir

Pour chaque procédure de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever différents tissus (caeca) et de pouvoir analyser la charge parasitaire contenue et le scoring des lésions.

Remplacement

L’équipe a publié une méthode de culture in vitro qui permet d’accéder à la totalité des stades du cycle parasitaire. Il s’agit là d’une preuve de concept et en aucun cas d’une méthode de production de parasites en grande quantité. La culture in vitro ne reproduit que la 1ere multiplication asexuée (production de mérozoïtes) et ne couvre pas la fin du cycle, c’est-à-dire, les 2 autres multiplications asexuées puis la reproduction sexuée (qui génère les oocystes). Nous avons publié une preuve de concept : avec une souche vaccinale (qui ne fait qu’une seule multiplication asexuée) et sur culture primaire de cellule de rein de poulet, on a réussi à produire in vitro quelques oocystes. Mais la manipulation des Eimeria nécessite la reproduction de 10e7 oocystes (c’est le rendement obtenu pour chaque poulet infecté).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dépend de la prolificité de la souche et du nombre de parasites requis. Pour la souche sauvage utilisée au laboratoire, le rendement en parasites produits peut être déterminé. En revanche pour la souche recombinante à générer, nous n’avons aucune donnée sur sa prolificité.

Raffinement

Chaque inoculum fait l'objet d'une attention particulière pour administrer des doses définies et adaptées à l’espèce présente et ainsi éviter toute pathogénicité. Pour un rendement optimal, la muqueuse intestinale ne doit pas être trop abîmée. Il est donc inutile d’inoculer une dose trop forte de parasites qui pourrait induire des effets pathogènes et donc provoquer de la douleur. Même si la dose inoculée est calculée de manière à ne pas induire de pathogénicité, nous restons vigilants à l’état de santé des animaux : après inoculation de l’agent infectieux, deux visites quotidiennes sont réalisées dans la salle expérimentale afin de surveiller l’éventuelle apparition des premiers symptômes liés à la maladie : plumes ébouriffées, prostration. Ils sont hébergés par groupe de 3 à 20 animaux en parquet, sur litière de miscanthus pour éviter les poussières ou bien en cage, selon les disponibilités des salles d’expérimentation. Ils ont à disposition aliment et eau ad libitum. Pour le raffinement des conditions d’hébergement, des petites plateformes triangulaires ont été placées pour permettre aux poulets de se percher à l’intérieur des parquets.

Choix des espèces

A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative suffisamment efficace (in vitro) pour multiplier les parasites, en routine et en grande quantité. Le poulet est l’espèce hôte exclusive chez laquelle se multiplient les parasites. Des poulets de statut sanitaire contrôlé seront utilisés. L’étroitesse du spectre d’hôtes des parasites du genre Eimeria empêche toute tentative de manipulation d’une espèce parasitaire aviaire sur un modèle animal autre que la poule. Les animaux sont utilisés entre 3 et 7 semaines d’âge, considéré comme l’âge optimum pour un meilleur rendement en parasite.

Les souris infectées par le virus de l'encéphalite à tiques sont mises à mort dès l'apparition de signes neurologiques. 3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune porte sur le dos une capsule remplie de larves, de nymphes ou de tiques femelles qui se gorgent de son sang, ce qui provoque des démangeaisons, et 2 250 d'entre elles subissent trois prélèvements de sang par le sinus rétro-orbitaire, aux sixième, dixième et quatorzième jours, avant que sang, oreille et organes soient prélevés après la mort. L'effectif se déduit du nombre de tiques gorgées récupérables sur chaque souris, le porteur précisant qu'aucune analyse statistique ne sera réalisée sur le nombre de souris utilisées.

Objectifs

Les tiques sont les premiers vecteurs d’agents pathogènes en Europe et constituent un risque majeur pour la santé humaine et animale en transmettant la plus grande variété de microorganismes (bactéries, parasites et virus). La plupart des agents pathogènes transmis par les tiques sont zoonotiques (transmissibles de l’animal à l’Homme), certains ne touchent que les animaux mais avec un impact économique très important et d’autres sont découverts chaque année. Les principales maladies liées aux tiques en Europe sont la Borréliose de Lyme, l’Anaplasmose granulocytaire et l’Encéphalite à tiques, et leur vecteur est la tique Ixodes ricinus, qui présente une très large répartition géographique. Dans ce projet nous étudions la compétence vectorielle des tiques Ixodes ricinus vis-à-vis de différents agents pathogènes, en infection simple (un seul agent pathogène à la fois) et en co-infection (deux agents pathogènes à la fois). En effet la compétence vectorielle des arthropodes est un caractère sous contrôle génétique et peut varier selon la souche de tique, et la souche de l’agent de pathogène étudié. De plus, dans diverses études il a été mis en évidence que les co-infections dans les tiques (plusieurs microorganismes présents dans une même tique) pouvaient être très fréquentes. Chez l’Homme, des patients présentant une maladie de Lyme chronique rapportent également des co-infections par d’autres bactéries ou d’autres parasites. Enfin en laboratoire il a été démontré que chez des souris co-infectées par deux bactéries (Borrelia et Anaplasma) on constatait une différence de réponse immunitaire de la souris suite à l'infection, une différence de pathogénicité des bactéries chez la souris ainsi qu'un impact sur l'acquisition de ces bactéries par les tiques comparativement à des infections simples. Nos travaux visent à comparer la compétence vectorielle des tiques lors d’infection simple et de co-infection par des bactéries (Borrelia, Anaplasma) et des virus (différentes souches du virus de l’encéphalite à tiques). Pour étudier cette compétence vectorielle, il nous faut etudier 3 étapes clés en laboratoire : (i) l’acquisition de l’agent pathogène ; (ii) la transmission transstadiale de l’agent pathogène (c'est à dire la persistance de l’agent pathogène au fil des stades de développement) ; (iii) la transmission de l’agent pathogène de la tique infectée vers un hôté vertébré sain (souris naïve).

Bénéfices attendus

Les tiques sont d'importants vecteurs d'agents pathogènes qui provoquent des maladies graves chez l'Homme et les animaux. Les phénomènes de co-infections peuvent aggraver ces maladies mais ne sont pas étudiés en laboratoire. Notre projet vise à mieux comprendre le risque lié aux tiques pour l’Homme et l’animal, notamment en comparant les infections simples avec les co-infections.

Procédures

Pour 750 souris maximum, Pas de prélèvement durant l’expérimentation, uniquement récupération tiques gorgées. Pour 2250 souris maximum, a J6, J10, J14 = prélèvement de 10µL de sang par souris (sinus rétrorbital). Après mise à mort des animaux, récupération sang, biopsie oreille et organes souris.

Impact sur les animaux

Le gorgement des tiques induit une gêne modérée (grattement) pour les souris utilisées mais afin de limiter l’inconfort lié à une démangeaison trop intense due aux piqûres de tiques, le nombre de tiques(larves/nymphes/femelles) par animal est limité. Lorsqu’une douleur ou gêne trop intense est vue chez la souris, nous enlevons les tiques qui ne se sont pas encore gorgées ou réduisons celles déjà attachées afin de réduire l’inconfort de la souris. Pour les souris potentiellement infectées par les bactéries Borrelia et Anaplasma, pas de signes cliniques attendus. Pour les souris infectées par le virus TBE, signe neurologique attendu, les animaux seront mis à mort dès que les signes neurologiques seront observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Pour les tests de transmission des agents pathogènes, le sang des animaux et les organes sont nécessaire pour rechercher les agents pathogènes par amplification de leur matériel génétique afin de valider la transmission par les tiques.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un système de gorgement artificiel sur membrane a été développé, il peut être utilisé lors des essais d’acquisition ou de transmission des agents pathogènes. Ce système sera privilégié dès que possible mais ne fonctionne malheureusement pas pour tous les agents pathogènes (notamment ne fonctionne pas pour Borrelia et Anaplasma et donc ne fonctionne pas pour les coinfections utilisant une de ces bactéries). Les expérimentations de co-infection proposées dans cette saisine de peuvent malheureusement pas être réalisées sans l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé en fonction du nombre de tiques gorgées que l'on peut récupérer sur l'animal (maximum 50% des tiques déposées dans la capsule) et par rapport à nos besoins en tiques pour nos différentes expérimentations. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Dès que nous obtiendrons le nombre de tiques gorgées nécessaire aux analyses et à la suite des expérimentations, la répétition de l'expérimentation pour chaque modèle de co-infection sera stopée. Le nombre annoncé de répétition (10) est le nombre maximal annoncé. Nous espérons pouvoir réduire ce nombre à 5 ou 6 répétitions par type de co-infection. Il n'y aura pas d'analyses statistiques réalisées concernant le nombre souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont élevées dans les conditions naturelles d'élevage des souris avec une maison en plastique par cage, un support pour grimper (roue), des carrés de coton. Lors des manipulations, elles seront hébergées en condition individuelle car les souris auront chacune une capsule avec des tiques sur le dos et les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Les souris individuelles seront hébergées avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris, support pour grimper (roue)), et même si elles sont isolées elles pourront voir les souris des cages d’à côté. Les animaux sont isolés au maximum 21 jours.

Choix des espèces

Les souris (comparativement à d’autres modèles animaux) sont sensibles à l’infection par les 3 agents pathogènes que nous ciblons : Borrelia afzelii, Anaplasma phagocytophilum, Virus de l’Encéphalite à tiques. Les micromammifères étant notamment impliqués dans les cycles de transmission naturels de ces agents pathogènes, les souris représentent donc le modèle idéal en laboratoire. Dans les essais d'acquisition, les souris utilisées n'auront pas besoin d'être réceptives aux agents pathogènes, par contre, dans les essais de transmission, les souris utilisées devront être sensibles à l'infection par Anaplasma phagocytophilum, Borrelia et TBEV. Adultes. Minimum 4-5 semaines. Suffisamment grand pour pouvoir poser une capsule sur leur dos avec des tiques.